ny-eso-1的原核表达、抗体制备及其鉴定

《ny-eso-1的原核表达、抗体制备及其鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。．．F’簟一’，’≥_≯。-∥：．‘¨，j?·。。-．．'■j◆j．=』。o．’j．●j一研究生签名：啭导师签毫』扣I獭蘸磐导箨毒

2、≥o。0一年簟月o‘日．～。’二t．一。．’一j‘‘。。：，．．．f‘+；’0■：．：、j．，／0．，，’河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：导师签章：／匆、二跃．>沙l中年，2-月弓日如嘭沙1万方数据目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6研究论文NY-ESO一1的原核表达、抗体制备及其鉴定前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8日Ⅱ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯33讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38综述肿瘤／睾丸抗原NY-ESO．1的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50万方数据中文摘要NY-ESO．1的原核表达、抗体制备及其鉴定摘要目的：构建肿瘤．睾丸抗原NY-ESO．1与G

5、ST融合基因的原核表达载体，制备其单克隆抗体及多克隆抗体并进行初步鉴定，通过Westen．blot检测其特异性，利用免疫组化研究其在肿瘤治疗上的应用价值。方法：l目的基因的获得及重组表达载体的构建设计针对NY也SO．1的特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从睾丸组织的eDNA文库扩增NY-ESO．1基因片段，经上下游引物所引入的EeoRI和XhoI双酶切后克隆入原核表达载体pGEX．4T1中GST标签的下游，构建重组表达载体pGEX．4T1-NY-ESO．1。2细菌培养将载体pGEX．4T1-N

6、Y-ESO．1转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，进行细菌培养。3目的蛋白的诱导表达、纯化及鉴定用IPTG诱导表J送NY-ESO．1／GST融合蛋白，经不同浓度尿素洗脱纯化后，表达产物通过SDS．PAGE和Westernblot法鉴定获得NY-ESO．1／GST融合蛋白。4单克隆抗体制备用NY-ESO．1／GST融合蛋白免疫BALB／c小鼠，采用传统方法制备抗NY-ESO．1单克隆抗体，通过细胞融合，’HAT选择，有限稀释法克隆扩增，获得NY-ESO．1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。5多克隆抗

7、体制备将NY-ESO．1／GST融合蛋白免疫家兔制备NY-ESO．1多抗血清，获得N孓ESO．1多克隆抗体。6抗体的鉴定及免疫组化通过间接ELISA法测定抗体效价，Westem．blot检测其的特异性。利用免疫组化技术研究其在正常睾丸组织和癌组织检测中的应用价值。结果：重组质粒经限制性内切酶勖叔I和XhoI双酶切鉴定和万方数据中文摘要IPTG诱导表达NY-ESO．1／GST的SDS—PAGE分析表明，表达产物的相对分子质量(M0为44000，与理论值相符，并主要以包涵体形式存在，Westernbl

8、ot结果证实该NY-ESO．1／GST可与抗GST单克隆抗体(mab)发生特异性结合反应，提示为融合蛋白。通过单克隆抗体的制备，免疫获得了1株抗NY-ESO．1单克隆抗体细胞株，经过间接ELlSA检测，抗体效价为10～，经Westemblot和免疫组化等鉴定，抗体的特异性良好，与载体蛋白GST无交叉反应。免疫家兔后获得高效价NY-ESO．1抗血清，Westemblot检测证实该血清特异性较好。通过免疫组化技术检测结果显示可见其目的基因在正常睾丸组织和癌组织中均有表达。结论：成功构建