川芎嗪对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用的论文

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　　川芎嗪对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用的论文作者：王汉民，谭华，赵洪雯，张鹏，黄朝晖，何丽洁，陈光磊，吴雄飞【摘要】目的:探讨川芎嗪对缺血/再灌注（i/r）损伤大鼠肾功能、肾脏组织形态学、细胞凋亡及相关基因表达的影响.方法:将大鼠随机分为假手术（s）组、i/r组、再灌注后给予川芎嗪（tmppost）组、再灌注前给予川芎嗪（tmppre）组，各组分别采用化学法测定血尿素氮和肌酐，光镜和电镜观察肾组织形态学变化，原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡指数，免疫组化和免疫印迹法检测肾脏bcl2和bax蛋白的表达.结果:tmppre组较i/r组血尿素氮和肌肝显著降低，肾小管损伤评分减轻，分别为［（21.8±5.2）vs(31.1±4.4)mmol/l，p＜0.01)］，［（196±55）vs（295±64）μmol/l，p＜0.01）］，［(372±46)vs（563±62），p＜0.01)］；肾小管上皮细胞损伤及超微结构改变明显减轻，肾组织凋亡细胞数明显减少［（13.6±2.9）vs（28.8±4.6），p<0.01）］；bcl2蛋白表达明显增强［（1.15±0.12）vs（0.88±0.12），p<0.05）］，bax表达明显减弱［（0.87±0.11）vs（1.15±0.09），p<0.05）］.结论:川芎嗪可明显减轻i/r肾损伤，其保护作用机制与bcl2蛋白表达增强和bax蛋白表达减弱介导的肾脏细胞凋亡有关.【关键词】川芎嗪；肾脏；再灌注损伤；细胞凋亡；保护　　【abstract】aim:toexploreligustrazine(tetramethylpyrazine,tmp)ontheeffectofinratsorphology,cellapoptosisandexpressionsofrelatedgenesinratsethods:fortylydividedinto4groups,operation(n=10),i/rmodel(n=10),tmppost(n=10,intraperitonealtmp32mg/kgper6hafterreperfusionfor30min)andtmppre(n=10,intraperitonealtmp32mg/kgat45min,8,16,24hbeforeischemia)groups.bloodureanitrogenandcreatinineicalmethod.renalcellapoptoticindexinedbymeansofterminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddutpnickendlabeling(tunel).theexpressionsofbcl2andbaxinkidneymunohistochemicallyevaluatedandquantifiedbyicroscope.results:paredppregroup, thebloodureanitrogen［（21.8±5.2）vs(31.1±4.4)mmol/l，p＜0.01］,thecreatinine［（196±55）vs（295±64）μmol/l，p＜0.01）］andthescoreofinjuryinrenaltubules［(372±46)vs（563±62），p＜0.01)］ppregroup.bytetramethylpyrazinepretreatment,theapoptoticindex(13.6±2.9vs28.8±4.6,p<0.01)andtheexpressionofbax(0.87±0.11vs1.14±0.09,p<0.05)ethylpyrazinecanattenuatekidneyi/rinjury,andprotectivemechanismmaybepartlythroughinhibitionofcellapoptosisbyregulatingtheexpressionsofapoptosisrelatedgenesbcl2andbax.　　【keyethylpyrazine;kidney;reperfusioninjury;apoptosis;protection　　0引言　　川芎嗪是从伞形科植物川芎根茎中分离提纯的一种生物碱单体，其基本化学结构为四甲基吡嗪，具有扩张血管、改善微循环等作用，临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗，并取得较好疗效.川芎嗪对肾脏缺血/再灌注（i/r）损伤的保护作用已被大量研究证实［1-2］，但这种保护作用的机制尚不完全清楚，我们通过观察川芎嗪对i/r损伤大鼠肾功能、肾组织形态学、细胞凋亡及bcl2和bax蛋白表达的影响，进一步探讨川芎嗪对肾i/r损伤的保护作用机制.　　1材料和方法　　1.1材料健康成年ab、兔抗βactin（santacruz公司）；免疫组化试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；原位细胞凋亡(tunel)试剂盒（美国roche公司）；细胞裂解液（美国bdbiosciences公司）；bca试剂盒（美国pierce公司）；sds聚丙烯酰胺凝胶（美国invitrogen公司）；硝酸纤维素膜（美国lifescience公司）；血尿素氮（bun）、血肌酐（cr）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；川芎嗪注射液（无锡第七制药厂，批号02081911）.jem100sx型透射电镜（日本jeol公司），凝胶图像分析系统（美国kodak公司）等.　　1.2方法 　　1.2.1分组及动物模型制备将40只大鼠随机分为4组，每组10只.s组：假手术对照组；i/r组：缺血再灌注模型组；tmppost组：在i/r模型的基础上，再灌注30min后腹腔注射川芎嗪，32mg/kg，每6h1次，共4次；tmppre组：在制备i/r模型前24，16，8h，45min腹腔注射川芎嗪,32mg/kg，i/r造模后不再注射川芎嗪.i/r模型制作参照basile等方法进行［3］，用30g/l戊巴比妥钠30～50mg/kg腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，游离肾蒂，用无损伤动脉夹同时钳夹双侧肾动脉，阻断45min后松开动脉夹.假手术组仅游离双侧肾脏，暴露60min后再关闭腹腔切口.24h后再用戊巴比妥钠麻醉大鼠，采血并摘取左肾，血标本以4000r/min离心10min，分离血清，置-20℃保存用于测定bun和cr.取部分肾组织分别用40g/l甲醛和30ml/l戊二醛固定以制备石蜡切片和电镜切片，另取部分肾组织迅速置入液氮中，然后于-80℃冰箱保存，用于提取蛋白.　　1.2.2肾功能测定测定血bun采用二乙酰一肟显色法，测定血cr采用碱性苦味酸比色法，应用721分光光度计测定.　　1.2.3肾组织学观察石蜡切片行he和pas染色，光镜下观察肾组织形态学改变，参照paller等方法进行评分［4］，每只大鼠肾组织随机选择10个视野（×200），每个视野下随机选择10处肾小管，共按100个肾小管计分，分数越高表示肾小管损伤程度越严重.电镜切片行醋酸铀和枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察肾组织的超微结构变化.　　1.2.4肾组织细胞凋亡检测采用tunel检测细胞凋亡指数，参照tunel试剂盒说明书进行，显色采用dab试剂盒进行.光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞.于阳性表达分布区域、光镜200倍下随机选择5个无重叠视野，计数阳性细胞，以凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比作为细胞凋亡指数（ai）.　　1.2.5肾组织bcl2，bax免疫组化染色采用兔抗鼠bcl2和baxmab，参照抗bcl2和bax试剂盒进行，显色采用dab试剂盒进行.光镜观察胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞.　　1.2.6in变性后，用sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，用丽春红染液染膜，脱脂奶粉于室温封闭，与bcl2，bax抗体37℃孵育4℃过夜. 摇洗并加入二抗室温孵育，再次洗涤，滴加显色液至硝酸纤维素膜上，x光胶片感光，用kodak凝胶图像分析系统进行灰度扫描.　　统计学处理：计量资料用x±s表示，多组样本均数之间比较采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用多个均数间的多重比较（duntt检验），应用spss13.0统计软件，p＜0.05为差异有统计学意义.　　2结果　　2.1肾功能的变化各组血bun和cr变化见表1.　　表1各组血bun和cr、凋亡指数及肾小管损伤程度评分的比较（略）　　ap＜0.05，bp＜0.01vsi/r组.s：对照组；i/r：缺血/再灌注组；tmppost：i/r造模后给予川芎嗪；tmppre：i/r造模前给予川芎嗪.　　2.2肾组织形态学改变各组肾小管损伤程度评分结果见表1.s组光镜观察肾组织无明显病变，电镜亦未见明显异常.i/r组光镜可见皮髓间有明显淤血带，肾小管上皮细胞刷状缘消失，出现空泡、滴状变性，严重者细胞脱落、坏死、基底膜裸露.tmppost组光镜改变较i/r组有所减轻，而tmppre组光镜改变较i/r组明显减轻，表现为部分肾小管上皮细胞刷状缘脱落、空泡及滴状变性少见、部分管腔扩张、可见少量管型.i/r组电镜可见部分肾小管上皮细胞核染色质致密，成团块状附在核膜上，出现染色质边集，上皮细胞空泡变性、刷状缘消失、线粒体减少或消失、内质网扩张.tmppost组肾小管细胞超微结构损伤较i/r组有所减轻.tmppre组肾小管上皮细胞超微结构损伤程度较i/r组明显减轻：表现为肾小管上皮细胞大部分结构相对完整，线粒体肿胀，少见空泡形成，核膜完整.　　2.3肾组织细胞凋亡的变化各组肾组织细胞凋亡指数见表1，tunel检测肾组织凋亡细胞结果见图1. 　　a：对照组；b：缺血/再灌注（i/r）组；c：i/r造模后给予川芎嗪；d：i/r造模前给予川芎嗪.　　图1各组tunel免疫组化染色sabc×400（略）　　2.4bcl2，bax蛋白表达在tmppre组肾小管上皮细胞中bcl2表达明显，而bax在i/r组肾小管上皮细胞中表达明显（图2，3）.ppre组表达最高，而bax在i/r组表达最高（图4，5）.　　3讨论　　肾脏i/r损伤是休克、严重创伤及肾移植过程中一种常见的病理生理现象，可以导致急性肾衰竭（arf）和移植肾功能丧失，在这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上皮细胞.研究表明［5］，肾脏i/r损伤后除发生细胞坏死外，细胞凋亡也是其重要的死亡形式.细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调控，bcl2家族就是其中之一，对细胞凋亡起着重要的调控作用［6］.大量的研究［7-8］证实缺血性arf时存在肾脏细胞凋亡，本研究得出了相似的结果：i/r组肾功能损伤明显，凋亡细胞数量增多，提示肾脏细胞凋亡数量与肾功能损伤程度密切相关.　　a：对照组；b：缺血/再灌注（i/r）组；c：i/r造模后给予川芎嗪；d：i/r造模前给予川芎嗪.　　图2各组bcl2免疫组化染色sabc×400（略）　　凋亡是缺血性损伤后细胞死亡的重要形式，细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调控，与凋亡相关的基因通常分为抗凋亡基因和促凋亡基因.bcl2是一种重要的抗凋亡基因蛋白，而bax为bcl2家族成员，其作用则与bcl2相反，具有促凋亡作用.reed［9］认为，bcl2高表达或bcl2/bax比值升高可抑制bax的活化，从而抑制细胞凋亡.本研究结果显示，应用川芎嗪能使肾脏i/r过程中细胞凋亡指数下降，bcl2蛋白表达增强，bax蛋白表达减弱，bcl2/bax比值增高.表明川芎嗪能抑制肾脏i/r过程中肾脏细胞凋亡的发生，且川芎嗪的肾脏保护作用与抑制bcl2/bax介导的细胞凋亡密切相关，提示在肾脏i/r损伤中，细胞凋亡是可以预防的. 　　大量的研究［10-11］证实川芎嗪对i/r损伤的肾脏有明显的保护作用.本研究结果表明，肾脏i/r前后应用川芎嗪均具有肾脏保护作用，在i/r前给予川芎嗪效果更明显，表现在tmppre组肾功能明显好转，肾小管上皮细胞超微结构损伤明显减轻.我们推测：早期应用川芎嗪能在肾脏缺血期及再灌注早期对抗细胞损伤因子，稳定线粒体膜，从而更好地保护肾脏细胞，而晚期给药则难以在短期内缓解细胞已遭受的严重损伤.　　a：对照组；b：缺血/再灌注（i/r）组；c：i/r造模后给予川芎嗪；d：i/r造模前给予川芎嗪.　　图3各组bax的免疫组化染色sabc×400（略）　　图4iareperfusioninjuryinmurinekidney［j］.transplantproc,2004,36(7):1949-1951.　　［2］王忠，翁国星，杜建.川芎嗪对缺血再灌注肾保护作用的研究［j］.福建中医学院学报，2005，15（2）：26-27.　　［3］basiledp,donohoed,caox,etal.resistancetoischemicacuterenalfailureinthebroodeltostudycytoprotection［j］.kidneyint,2004,65(6):2201-2211.　　［4］pallerms,hoidaljr,ferristf.oxygenfreeradicalsinischemicacuterenalfailureintherat［j］.jclininvest,1984,74(4):1156-1164.　　［5］nogaes,miyazakim,kobayashin,etal.inductionofapoptosisinischemiareperfusionmodelofmousekidney:possibleinvolvementoffas［j］.jamsocnephrol,1998,9(4):620-631.　　［6］devarajanp,mishraj,supavekins,etal.geneexpressioninearlyischemicrenalinjury:cluestoarkerdiscovery,andnoveltherapeutics［j］.molgenemetab,2003,80(4):365-376.　　［7］saikumarp,venkatachalamma.roleofapoptosisinhypoxic/ischemicdamageinthekidney［j］.seminnephrol,2003,23(6):511-521.　　［8］谭华，王汉民，潘龙，等. 缺血预处理对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡的影响［j］.第四军医大学学报，2004，25（9）：818-821.　　［9］reedjc.proapoptoticmultidomainbcl2/baxfamilyproteins:mechanisms,physiologicalroles,andtherapeuticopportunities［j］.celldeathdiffer,2006,13(8):1378-1386.　　［10］sunl,liy,shil,etal.protectiveeffectsofligustrazineonischemiareperfusioninjuryinratkidneys［j］.microsurgery,2002,22(8):343-346.　　［11］王汉民，吴雄飞，谭华，等.川芎嗪对缺血/再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及bcl2和bax表达的影响［j］.第四军医大学学报，2006，27（20）：1884-1887.