hv单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白1a8 scfv-cκ-p的构建和表达的论文

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1、HV单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1A8ScFv/Cκ/P的构建和表达的论文作者：陈锐，杨洁，张芳琳，秦炜炜，王涛，张瑞，孟艳玲，胡刚，徐志凯，杨安钢【摘要】目的：构建汉坦病毒（hantavirus，hv）单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1a8scfv/cκ/p基因的原核表达载体，蛋白经表达后纯化并进行1a8scfv/cκ/p融合蛋白的功能活性鉴定.方法：采用pcr的方法，扩增单链抗体基因1a8scfv和1a8scfv/cκ，将鱼精蛋白片段的编码序列设计入扩增引物，获得hv单链抗体/鱼精蛋白片段的融合蛋白基因1a8sc

2、fv/cκ/p.将获得的重组基因克隆入原核表达载体pet32a，并在大肠杆菌bl21中表达.表达产物经sdspage和ine，p）是一种碱性蛋白，截短至22个(8～29)富含碱性氨基酸片段仍然保留着核酸结合功能.单链抗体（singlechain，scfv），分子小，穿透力强，免疫原性低，有导向载体功能.我们构建和表达一种由汉坦病毒（hantavirus，hv）核蛋白的单链抗体（1a8scfv）和鱼精蛋白片段组成的融合蛋白1a8scfv/cκ/p，以期获得具有抗原结合活性和核酸结合活性的1a8scfv/cκ/p融合蛋

3、白.1材料和方法1.1材料1a8vhlgl/ega公司），质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；hitrapninta螯合层析介质(invitrogen公司)；hrp6histagantibody（abcam公司）；ecl化学发光试剂盒、bca蛋白定量试剂盒（pierce公司）.1.2方法1.2.1pcr引物和鱼精蛋白片段序列设计扩增1a8scfv和1a8scfv/cκ基因的引物，同时将鱼精蛋白片段的序列设计入3′端引物.扩增1a8scfv的引物，s5:5′tttgaattccaggt

4、ccagctgcaggagtc3′；s3：5′tttgtcgacacgtttgatctcgagct3′；扩增1a8scfvcκ序列的引物，cκ3：5′tttgtcgacacactctcccctgttgaagc3′；采用引物二次延伸的办法在cκ之后引入编码鱼精蛋白片段的寡核苷酸序列（双下划线部分），其引物如下：p1：5′ttgtctctggcggtaatatctgctccggctctggctgcgacactctcccctgttgaagc3′，p2：5′tttgtcgacgctccgcctccttcgt

5、ctgcgacttctttgtctctggcggtaatatc3′；在两端引物中分别引入ecori和sali酶切位点（单下划线部分），引物由北京奥科生物技术有限公司合成.1.2.21a8scfv/cκ/p融合基因重组表达载体的构建及鉴定分别以质粒1a8vhlgl/达0.6左右，加入iptg终浓度为0.2mmol/l，30℃诱导培养6h，取5ml未诱导及诱导菌液离心收集菌体，以200mmol/ltris·hcl(ph8.0)重悬，超声裂菌后离心，取少量上清，加入等量2×sdsloadingbuffer，沉淀重悬于适

6、量1×sdsloadingbuffer，煮沸5min,离心后取上清进行sdspage分析，凝胶薄层扫描分析蛋白表达情况.同时对表达产物进行ab（1∶400稀释，4℃孵育过夜），hrp标记的山羊抗小鼠igg(1∶5000稀释，室温1h)，用化学发光试剂盒于暗室条件下x光片感光显影.1.2.4表达产物的分离纯化取100ml诱导菌收集菌体，用200mmol/ltris·hcl(ph8.0)重悬，冰浴中超声6次（每次2min，间隔10s），4℃，12000g离心20min，用镍次氨基三乙酸(ni2+nta)螯合层析介质

7、4℃旋转结合过夜，咪唑洗脱缓冲液洗脱.各取少量洗脱液进行sdspage分析.1.2.5elisa检测融合蛋白的抗原结合活性胰酶消化veroe6细胞，调整细胞密度为2×108/l，以100μl/孔加入96孔细胞培养板，37℃，50ml/lco2培养箱中培养24h，加100μl汉坦病毒76~118株（107tcid50/l），37℃吸附90min.加入200μl/孔含20ml/l胎牛血清的dmem培养液，37℃，50ml/lco2培养箱中培养7d.待细胞长满孔板，去培养液，用2.5ml/l戊二醛固定10min.在孔中分

8、别加入100μl不同稀释梯度的蛋白样品，37℃孵育1h.加入鼠抗6hismab(1∶10000稀释)，37℃孵育1h.加入底物液100μl/孔，37℃，10min显色，终止反应后测定各孔a492nm值.1.2.6融合蛋白的核酸结合活性检测采用凝胶迁移阻滞实验.将1μg线性化质粒dna分别与不同量的1a8scfv/cκ/p融合蛋白于0.2mol/