pspa免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究(1)

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1、PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究(1)　　作者：胥文春，曹炬，许颂霄，罗进勇，朱旦，尹一兵　　【摘要】目的：获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值.方法：分离培养肺炎链球菌TIGR4，获取其染色体DNA，采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET32内，酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用WesternBlot鉴定，镍柱纯化并透析除盐.用重组蛋白免疫动物，观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用.结果：DNA序列与GenBank

2、中的数据相符，所表达纯化的蛋白经WesternBlot证实为PspA，其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用.结论：重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染，该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.　　【关键词】肺炎链球菌　　0引言　　肺炎链球菌是引起肺炎、脑膜炎和中耳炎的主要病原菌，疫苗侯选蛋白主要集中在其表面的毒力因子如肺炎链球菌表面蛋白A（PspA）和胆碱结合蛋白A（CbpA）等［1-2］.PspA是最早确定的肺炎链球菌毒力因子之一，它可以与乳铁蛋白结合而使乳铁蛋白丧失功能并抑制补体活化，降低C3b在

3、肺炎链球菌表面的沉淀从而干扰补体介导的调理吞噬作用，在肺炎链球菌引起的侵袭性感染中起着重要作用［3-4］.我们用基因重组技术表达纯化肺炎链球菌毒力因子蛋白PspA，并探讨其刺激产生的抗体对肺炎链球菌侵袭性感染的抵抗作用.　　1材料和方法　　材料血清4型肺炎链球菌TIGR4购自美国国家菌种保藏中心（ATCC）.大肠杆菌DH5α，BL21，质粒PET32为本室保存.质粒PMD18T载体、限制性内切酶EcoRI，KpnI，PrimeStarDNA聚合酶和T4DNA连接酶购自Takara（大连）公司.DNA提取试剂盒为上海华舜公司产品.IPTG，DAB，

4、丙烯酰胺，双丙烯酰胺，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂购于Sigma公司.HisTagMcAb，HisBindColumn柱及HRP标记羊抗鼠IgG为Novagen公司产品.Balb/c小鼠，雌性，6~8周龄，质量18~20g，购于重庆医科大学实验动物中心.　　方法　　PspA表达载体的构建将肺炎链球菌TIGR4在CY培养基中增菌到对数生长中后期，提取基因组DNA，以之为模板扩增PspA片段.上游引物：5′GGGGTACCATGATTTTAACAAGTCTAGCCAG3′，含KpnI位点；下游引物：5′CGGAATTCTTATTCTTCTTCAT

5、CTCCATC3′，含EcoRI位点，由上海生工生物技术公司合成.胶回收PCR产物并与PMD18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，蓝白筛选，PCR、酶切及测序鉴定.将测序正确的克隆载体和PET32表达载体分别用EcoRI，KpnI双酶切，胶回收目的片段，T4DNA连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，双酶切及PCR鉴定.重组质粒转化感受态表达菌株BL21，于氨苄青霉素平板上筛选.　　PspA重组载体的诱导表达将阳性克隆过夜培养，按1∶20接种至含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，250r/min振摇培养，A600nm=~时加IPTG（终浓

6、度为1mmol/L）诱导，37℃振摇1~4h，离心收集诱导菌，SDSPAGE分析目的蛋白表达情况.　　表达产物的纯化及鉴定低温离心收获诱导菌，冰上超声破菌，12000g低温离心1h，收集上清液，同时以相同体积的超声破碎缓冲液重悬沉淀，行SDSPAGE以明确蛋白是在上清液还是在包涵体.将上清液用μm滤膜过滤后转入镍层析柱内，用含不同浓度咪唑的缓冲液梯度洗脱，测定各洗脱管的A280nm，SDSPAGE监测各阶段目的蛋白情况.收集洗脱蛋白并以PBS透析除盐，Bradford法蛋白定量，冷冻真空干燥，-20℃保存.　　取诱导的全菌裂解物，经SDSPA

7、GE后用电转仪转膜，以HisTagMcAb（1∶1000稀释）为一抗，羊抗鼠HRPIgG（1∶3000稀释）为二抗，DAB为显色底物做WesternBlot检测.　　免疫动物将小鼠随机分为2组，每组12只.腹腔免疫小鼠，实验组方案为：①基础免疫：PspA10μg／只CFA，②加强免疫：每隔2wk加强1次，连续加强2次；对照组只注射佐剂，免疫方案同实验组.第3次免疫1wk后眼眶取血行ELISA检测免疫效果，用重组的PspA融合蛋白包被酶标板，加小鼠血清，再加入羊抗鼠HRPIgG，显色后读取各孔A450nm，以高于阴性对照组倍为阳性.　　免疫保护实验

8、①主动：肺炎链球菌TIGR4在CY培养基中增菌到对数生长中后期，于第3次免疫2wk后腹腔注射感染上述实验组和