pspa免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究

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1、PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究胥文春，曹炬，许颂霄，罗进勇，朱旦，尹一兵【摘要】目的：获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值.方法：分离培养肺炎链球菌TIGR4，获取其染色体DNA，采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET32(a)内，酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用D18T载体、限制性内切酶EcoRI，KpnI，PrimeStarDNA聚合酶和T4DNA连接酶购自Takara（大连）公司.DNA提取试剂盒为上海华舜公司产品.IPTG，DAB，丙烯酰胺

2、，双丙烯酰胺，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)购于Sigma公司.HisTagMcAb，HisBindColumn(NiNTA)柱及HRP标记羊抗鼠IgG为Novagen公司产品.Balb/c小鼠，雌性，6~8周龄，质量18~20g，购于重庆医科大学实验动物中心.　　1.2方法　　1.2.1PETPspA表达载体的构建将肺炎链球菌TIGR4在C+Y培养基中增菌到对数生长中后期，提取基因组DNA，以之为模板扩增PspA片段(1329bp).上游引物：5＇GGGGTACCATGATTTTAACAAGTCTAGCCAG3＇，含KpnI位点；下游引物：5＇CGGAATT

3、CTTATTCTTCTTCATCTCCATC3＇，含EcoRI位点，由上海生工生物技术公司合成.胶回收PCR产物并与PMD18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，蓝白筛选，PCR、酶切及测序鉴定.将测序正确的克隆载体和PET32(a)表达载体分别用EcoRI，KpnI双酶切，胶回收目的片段，T4DNA连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，双酶切及PCR鉴定.重组质粒转化感受态表达菌株BL21(DE3)，于氨苄青霉素平板上筛选.　　1.2.2PETPspA重组载体的诱导表达将阳性克隆过夜培养，按1∶20接种至含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，250r/min振摇培养，A600n

4、m=0.6~1.0时加IPTG（终浓度为1mmol/L）诱导，37℃振摇1~4h，离心收集诱导菌，SDSPAGE分析目的蛋白表达情况.　　1.2.3表达产物的纯化及鉴定低温离心收获诱导菌，冰上超声破菌，12000g低温离心1h，收集上清液，同时以相同体积的超声破碎缓冲液重悬沉淀，行SDSPAGE以明确蛋白是在上清液还是在包涵体.将上清液用0.45μm滤膜过滤后转入镍层析柱内，用含不同浓度咪唑的缓冲液梯度洗脱，测定各洗脱管的A280nm，SDSPAGE监测各阶段目的蛋白情况.收集洗脱蛋白并以PBS透析除盐，Bradford法蛋白定量，冷冻真空干燥，-20℃保存.　　　　取诱导的全菌裂

5、解物，经SDSPAGE后用电转仪转膜，以HisTagMcAb（1∶1000稀释）为一抗，羊抗鼠HRPIgG（1∶3000稀释）为二抗，DAB为显色底物做WesternBlot检测.　　1.2.4免疫动物将小鼠随机分为2组，每组12只.腹腔免疫小鼠，实验组方案为：①基础免疫：PspA10μg／只+CFA，②加强免疫：每隔2，以高于阴性对照组2.1倍为阳性.　　1.2.5免疫保护实验①主动：肺炎链球菌TIGR4在C+Y培养基中增菌到对数生长中后期(A620nm=0.5)，于第3次免疫2entmechanismofthestreptococcuspneumoniaeproteinPspA〔

6、J〕.InfectImmun,1994,176(10):2976-2985.　　〔2〕HavaDL,CamilliA.Largescaleidentificationofserotype4streptococcuspneumonaievirulencefactors〔J〕.MolMicrobiol,2002,45(5):1389-1405.　　〔3〕ShaperM,HollingsheadSK,BenjaminieuxJ,CamilliA.Fromnosetolung:theregulationbehindstreptococcuspneumoniaevirulencefactors〔

7、J〕.MolMicro,2003,50(4):1103-1110.　　〔5〕BrilesDE,HollingsheadSK,NaborsGS,etal.Thepotentialforusingproteinvaccinestoprotectagainstotitismediacausedbystreptococcuspneumoniae〔J〕.Vaccine,2000,19:S87-S95.　　〔6〕BarilL,Dietemann