杠板归提取物抗单纯疱疹病毒

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1、杠板归提取物抗单纯疱疹病毒张长城,黄鹤飞周志勇，袁丁【摘要】目的研究杠板归提取物体外抗单纯疱疹病毒-1(HSV-1)的作用，探讨杠板归抗疱疹病毒的药理作用与有效部位。方法利用溶剂法和色谱法从杠板归中提取分离出4个部位，MTT法检测杠板归各提取物的病毒抑制效果，以病毒抑制率和治疗指数(TI)为评价指标，比较各部位体外抗病毒的效果。结果杠板归醇提部位与大孔树脂醇洗部位抗病毒作用最强，药物浓度在8μg·ml-1以上时，对HSV的抑制程度可达50%以上.freelperfoliatumL.的新鲜或干燥全草，又名贯叶蓼，具有清热解毒、祛痰止咳、利湿消肿、散瘀止血等功效，主治

2、痈肿疔疮、丹毒等，始载于《万病回春》。民间习用杠板归鲜品或干品捣烂外敷治疗带状疱疹等疾病，具有良好的效果。现代药理研究表明，杠板归具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等活性1，2。目前对杠板归抗病毒活性的研究较少，其药理活性部分与活性成分尚不明确。本文通过研究杠板归各提取部位体外抗HSV-1活性研究，探讨杠板归抗疱疹病毒活性的主要活性部位与可能活性成分。1材料与仪器1.1药物杠板归鲜品采自湖北宜昌市，经三峡大学医学院中药学教研究室谭复成教授鉴定。阳性对照药物：阿昔洛韦(ACV,上海通用药业股份有限公司)。1.2试剂与仪器MTT(4，5二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物)为SI

3、GMA公司产品;RPMI1640培养基为GIBICO公司产品;二甲基亚砜(DMSO)购自上海菲达有限公司;小牛血清购自三利公司;所用化学试剂均为国产分析纯。超净工作台(美国Forma公司);TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);DG3022-A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)。1.3细胞与病毒Hep-2细胞为武汉大学典型培养物保藏中心提供。细胞生长液为RPMI-1640，加10%小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。细胞维持液中加2%新生小牛血清。单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)SM44株，武汉大学医学院病毒学研究所提供，经He

4、p-2细胞活化增殖，CPE达75%以上(+++～++++)收获，测定病毒滴度为TCID5010-5.6/0.1ml，分装后于-80℃冻存备用，实验用病毒浓度为1000TCID50。2方法2.1供试品的制备取杠板归干燥药材50g，用石油醚脱脂后，用20倍量75%乙醇微沸回流提取2次，每次2h，提取液减压浓缩、干燥，得醇提物(干燥后得醇提部位);醇提物加水溶解，通过D101大孔树脂，水洗后经75%乙醇溶液洗脱，得到水洗部位及醇洗部位;经乙醇提取后的药渣用水回流提取两次，每次2h，减压浓缩、干燥得水提部位。以芦丁(购于中国药品生物制品检定所)为标准对照品，采用硝酸铝络合

5、分光光度法3测得经大孔树脂纯化后的母液总黄酮含量达86.08%。过滤除菌分装，实验前用含2%的小牛血清的1640培养基稀释到所需浓度。2.2药物对细胞的毒性作用用胰酶将生长良好的Hep-2细胞消化分散成单个细胞悬液，按2×105/ml的浓度每孔100μl接种于96孔板。置37℃，5%CO2培养箱中培养24h。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换成不同浓度的含药维持液，每孔200μl，每种浓度重复4孔。同时设4个组，分别为空白细胞对照、病毒感染对照、ACV阳性对照、受试药物组，继续培养并于倒置显微镜下每日观察记录。采用MTT法4检测细胞存活率：上述药物作用的细胞继续培

6、养72h，弃培养液上清，每孔加入含5mg/mlMTT的无血清RPMI-1640培养基50μl，置CO2培养箱中继续培养2～3h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO∶乙醇体积比为1∶1)100μl，振荡5～10min，待结晶完全溶解，置酶标测定仪上，测定570nm波长处的光密度OD值，计算细胞存活率。实验重复3次。2.3药物抗病毒实验于已长成单层Hep-2细胞96孔板上，每孔接种100μl的1000TCID50/0.1ml的HSV-1病毒液，于37℃吸附2h，弃病毒上清并用PBS洗涤。根据细胞毒性实验的结果，在无细胞毒性浓度范围内，加入不同浓度的含

7、药维持液每孔200μl，每种浓度重复4孔。然后将HSV培养板置37℃、5%CO2培养，逐日观察细胞病变情况。当病毒对照CPE达“+++～++++”时，用MTT检测病毒抑制率。实验重复3次5，6。2.4统计学方法用统计软件SPSS11.5的Probit回归法计算药物半数毒性浓度TC50和半数抑制浓度IC50，得到药物治疗指数(TreatmentIndex,TI=TC50/IC50)。3结果3.1药物对细胞的毒性作用药物对Hep-1细胞毒性作用表现为:细胞粘连、变圆、壁厚、破碎脱落,胞质内颗粒增加,折光性增强并且吸光值明显下降。随着药物的浓度增加细胞存活率呈递减趋势。

8、结果见表1