皱瘤海鞘抗单纯疱疹病毒i型的实验的研究

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1、硕士学位论文皱瘤海鞘抗单纯疱疹病毒I型的实验研究硕士研究生：梁华娟指导教师：万新祥教授摘要目的：海鞘类动物(Ascidians)属脊索动物门的尾索动物亚门，广泛分布于世界各个海域中，自沿海水域至深海海底皆有其栖息，种类繁多，在自然界中已知有1500余种。海鞘在进化上所处的特殊地位，受到动物学者、进化论学者和内分泌学者的高度关注，已成为科学工作者竞相研究的热点之一。20世纪80年代以来，人们已发现海鞘类生物中含有肽类、生物碱类、聚醚类、大环内酯类、萜类等多种化合物，它们大部分具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物以及免疫调节、生物催化等生理活性。我国南海有

2、着丰富的海鞘资源，目前已发现有66种，皱瘤海鞘[Styelaplicata(1esueur)】是其中的一种。皱瘤海鞘是一种可以食用的海鞘，国内外有关其营养成分研究的报道很多，如氨基酸、多糖等。近年来，我们已经对其进行了基础的抗病毒实验研究，实验结果表示其在体内外对乙肝病毒都有良好抑制作用，提示其具有一定的抗病毒活性。为了进一步研究皱瘤海鞘的抗病毒药效，我们研究了皱瘤海鞘醇提取物对同是DNA病毒的单纯疱疹病毒I型(herpessimlexvirustypes．I，HSV-I)的抗病毒作用，并对其作用机理进行初步研究，为新型的抗HSV-I药物的开发

3、提供理论依据。方法：本课题可分为以下三个部分：1皱瘤海鞘醇提物体外抗HSV-I型药效学研究本研究以HSV-I感染非洲绿猴肾细胞(VetO细胞)为细胞模型，探讨了皱瘤海鞘醇提物体外抗HSV-I活性的药效学作用。首先是应用MTT法检测皱瘤海中文摘要鞘醇提物对细胞的毒性作用，将对数生长期veto细胞消化计数后接种于96孔培养板，培养24h，形成单层细胞后弃培养液，加入对倍稀释成6个浓度的皱瘤海鞘醇提物(10，5，2．5，1．25，0．63，0．32mg／mL)，每浓度4个复孔，同时设4个正常对照孔，每天使用倒置显微镜观察细胞病变情况，继续培养3d后，

4、记录细胞病变情况。每孔加入MTT溶液20ttL，于37℃继续培养4h后，每孔加二甲基亚砜150ttL，充分混匀后用酶联免疫检测仪于波长570nm处测定各组细胞的吸光度，以反映皱瘤海鞘醇提取物对vero细胞增殖活性的影响；然后以不同浓度的皱瘤海鞘醇提物与病毒混合后直接感染细胞，每一浓度设4个复孔，同时设阳性药ACV对照组、正常细胞对照组及病毒对照组，置37℃，5％C02培养箱培养72h，每天使用倒置显微镜观察细胞病变情况，当病毒对照病变达75％"100％时，记录细胞病变情况，并使用用MTT法测定波长570nm处各组细胞的吸光度，按Reed-Mue

5、nch法分别计算皱瘤海鞘醇提物和ACV对vcro细胞的半数毒性浓度(TC50)、皱瘤海鞘醇提物和ACV的半数抑制病毒有效剂量0C50)和治疗指数(17)。2皱瘤海鞘醇提取物体内抗HSV-I的实验研究本实验通过研究皱瘤海鞘醇提物对实验动物单纯疱疹病毒局部感染和全身感染的治疗效果，探讨了其在体内抗HSV-I药效作用。局部感染模型为单纯疱疹性角膜炎，选用健康豚鼠20只，按角膜划痕方法，以l％戊巴比妥钠生理盐水腹腔注射7．5ml／kg麻醉，用lml注射器针头井字划痕(深度为角巩缘微有渗血为度)，滴加1滴HSV-I病毒培养液，闭眼按摩15_30秒，2天后

6、以1％荧光素钠生理盐水溶液染色，裂隙灯显微镜下观察角膜病变(角膜上皮点状、树枝状、地图状着色及基质混浊)范围。按病变的深浅、形态、严重程度搭配分为3组，每组6对(12只眼)，分别给予生理盐水、阿昔洛韦、皱瘤海鞘醇提物滴眼处理，3组均每天5次滴眼，每次1滴，连续15天，每隔3天用l％荧光素钠生理盐水溶液染色，裂隙灯显微镜下观察记录病情变化，以角膜病变评分作为指标；全身感染模型为腹腔注射病毒滴度为100TCID5do．1ml的病毒稀释液0．4ml，分别给予皱瘤海鞘醇提物或阿昔洛韦进行治疗，另设正常对照组和病毒Ⅱ硕士学位论文对照组。持续给药7天，以死

7、亡率、体重、肝脏组织病理形态学为指标，评价了皱瘤海鞘醇提物对HSV-I全身感染小鼠的治疗作用。3皱瘤海鞘醇提物抗HSV．I作用机理的初步研究运用veto细胞体外药效筛选模型，采用细胞病变效应CPE法和MTT两种测定方法，三种不同的加药方式在细胞水平上探讨皱瘤海鞘乙醇提取物抗HSV-I的作用机理。以不同剂量的皱瘤海鞘乙醇提取物作用于病毒复制周期的不同环节，探索其在宿主细胞内影响病毒复制过程的作用机理，揭示了皱瘤海鞘醇提物对HSVoI的直接杀伤作用、对HSV-I吸附的影响和对HSV-I生物合成的抑制作用。结果：采用MTT法测得皱瘤海鞘醇提物对ver

8、0细胞的半数毒性浓度(TC50)为6．868mg／ml，而ACV对vero细胞的半数毒性浓度(TCso)为0．254mg／ml，药效学实验选择皱瘤海鞘