戊型肝炎病毒亚基因组RNA的研究.pdf

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1、!"卷#期微生物学报&’()!"0’)#$"""年%$月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,+-.+/$"""!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!戊型肝炎病毒亚基因组607的研究夏小兵"黄如统李德荣（军事医学科学院微生物流行病研究所北京%""89"）摘要：本文利用同位素代谢标记在:;&感染8<9!%"<9，#<9!2<9=分别检测到%及$个亚基因组607，而感染$%=后及在成熟的病毒颗粒内未能检测到亚基因组607。通过

2、杂交实验，发现:;&的亚基因组607具有典型的共4>端的半套式结构，且基因组607与亚基因组607的9>端不存在共同的引导序列。通过紫外转录图谱发现:;&的亚基因组607是通过独立转录的方式产生的。利用引物延伸反应发现两种亚基因组607的转录起始位点分别位于607聚合酶区及非结构区、结构区的基因间序列。关键词：戊型肝炎病毒，亚基因组607，紫外转录图谱中图分类号：6424文献标识码：7文章编号："""%5#$"1（$"""）"#5"#$$5$2许多正链607病毒的非结构基因位于基因组的9>部分，结构基因

3、位于基因组的4>部分，基因组由多个开放阅读框架（’?+@/+ABC@DE/A-+，F6G）组成。这些病毒在感染细胞内除合成基因组607外，还转录亚基因组607（HI.D+@’-C,607）［%］。基因组607用于翻译病毒的非结构蛋白，而亚基因组607主要用于指导病毒的结构蛋白的合成。通过亚基因翻译策略，使得正链607病毒可以在转录水平上独立地调节病毒结构蛋白与非结构蛋白在复制不同阶段的合成。戊型肝炎病毒（:+?AJCJCH;&C/IH，:;&）是一基因组长约2<9K.的正链607病毒，具有典型的能合成亚

4、基因组607的结构特征。LA-等［$］在感染:;&的食蟹猴肝组织中检测到了:;&亚基因组607，但利用动物实验研究病毒复制具有一定局限性，因此本研究利用:;&（827）能适应于细胞培养的特点，进一步探讨了:;&亚基因组607的结构及产生特征。!材料和方法!)!材料!)!)!病毒、细胞：:;&（827）毒株及79!1细胞系均为本室保存。!)!)"寡核苷酸探针（引物）：根据发表的:;&缅甸株序列，合成了三个寡核苷酸探针，序列分别为F(CD’7：9>7MMN7M7NN7N7L7LMLMMLNM7（%!$!@J

5、）F(CD’O：9>7LM77LLN7MMMNNNN77LLNLLNL（!82#!!891@J）F(CD’N：9>7M77MNLLNNMLMMNN7LL7L7LM（9##4!#88#@J）F(CD’*：9>NNMMLMLL7L777NLLNLMMMN7L（%$99!%$12@J）作者简介：夏小兵（%12%3），男，江西省永新县人，博士，现工作单位：解放军4"$医院基因治疗研究中心，助理研究员，主要从事微生物学及生物工程的研究收稿日期：%1115%"5%$，修回日期：$"""5"!5%"E期夏小兵等：戊型

6、肝炎病毒亚基因组%&’的研究E*)!!"方法)*!!"!!"#$%&’(的［+］掺入标记：’,-.细胞在培养皿上长成单层后，换成无磷/0#0培养基，过夜，接种病毒（121,034），)56吸附78，用无磷培养基洗)次，加入无磷的/0#0维持培养基，感染到所需时间后，向维持液内加入放线菌素/（终浓度为)*71!9／:;），作用78，倾去维持液，再加入含71!9放线菌素/与711<=>［+］正磷酸盐维持液7:;，继续培养7"*8。经以上过程处理的正常细胞，放射自显影基本检测不到核酸信号。!!"!"液相杂交：

7、正常及感染细胞的总%&’在03+?缓冲液中与标记的寡核苷酸探针.-6变性,:>@，于,16缓慢退火)8，在03+?缓冲液中进行非变性胶电泳，电泳结束后，干胶直接进行放射自显影分析。!!"!#紫外（A$）照射实验：经磷饥饿（即无磷酸盐培基）及放线菌素/处理的感染细胞，倒掉培养液并打开培养皿盖，在距)1B紫外灯71C:下照射后，加入含71／:;放线!9菌素/及711<=>／:;的［)*+］正磷酸盐的无磷维持液孵育7"*8。!!"!$蛋白合成抑制实验：经过磷饥饿及放线菌素/处理的"#$（D5’）感染细胞，加入

8、终浓度为711／:;的放线菌酮、71／:;的放线菌素/作用78，继续补加711<=>／:;!9!9的［)*+］正磷酸盐培养78。!!"!%%&’的电泳：采用甲醛变性胶电泳，E16干胶，同时加入变性后的核酸分子量标准，电泳结束后切下分子量标准，溴化乙啶（#F）染色，将各条带所代表的大致分子量按7G7绘到白纸上，用于%&’放射自显影后分子量的大致观察。)*!!"!&引物延伸："#$特异引物经过［+］末端标记后，以总%&’为模板进行逆转录。用DH