德比沙门菌耐药性及分子流行病学特征研究

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学校代码：10564学号：2014307303分类号：S855.1密级：硕士学位论文德比沙门菌耐药性及分子流行病学特征研究丰舟第一指导教师：徐成刚高级实验师第二指导教师：学院名称：兽医学院专业学位类别：兽医硕士领域：无答辩委员会主席：中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：导师签名：日期： 摘要本研究从广东省的农贸市场共采集391份动物性食品，分离得到279株沙门菌，沙门菌在样品中的分离率为71.34%，德比沙门菌26株，占总体沙门菌的9.32%。并从上海市收集133株德比沙门菌，其中含有74株人源德比沙门菌，59株动物性食品源德比沙门菌。本研究共计使用159株德比沙门菌为本研究所使用。本研究对159株德比沙门菌进行16种抗生素的药敏试验检测，结果显示98.11%（156/159）的德比沙门菌对抗菌药物有耐药性。耐药率最高的是四环素、磺胺异恶唑及链霉素，分别为88.05%、78.62%及58.49%。不同来源及不同地域的德比沙门菌菌群对部分抗生素的耐药情况存在差异：动物性食品源德比沙门菌对于链霉素的耐药性显著高于人源德比沙门菌；广东省的德比沙门菌菌群对于磺胺异恶唑的耐药性达到100%，显著高于上海市的德比沙门菌。而多重耐药性统计显示，菌群有50个耐药模式，3重及3重以上耐药的菌株达到总体菌群比例的69.81%（111/159），耐药性最严重的菌株达到11重耐药，德比沙门菌菌群多重耐药性情况严重且复杂。本研究对159株德比沙门菌进行了10种毒力基因检测，检测结果显示毒力基因avrA、bcfC、ssaQ、siiD、mgtC、sopB、sopE、sodC1、gipA和spvC的携带率分别为100%、100%、99.37%、98.74%、98.11%、98.11%、96.86%、95.60%、4.40%和0.63%，总体菌群中毒力基因模式“avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC”携带率占84.91%（135/159）。存在上海德比沙门菌的毒力基因携带种类多于广东德比沙门菌菌群，毒力基因携带模式比广东德比沙门菌菌群复杂的情况，提示上海德比沙门菌的致病力可能强于广东德比沙门菌的。对159株德比沙门菌检测18个质粒不相容群，检测结果显示菌群携带有11个质粒不相容群，携带率最高的三个质粒不相容群为FIA、P和FIC，携带比例为50.94%、33.33%和28.30%。质粒不相容群携带模式统计结果显示，82.39%（131/159）的德比沙门菌携带质粒不相容群，无明显优势的携带模式，质粒不相容群携带数最多的菌株可达到6重。存在不同地域或不同来源对同一种质粒不相容群携带情况出现差异显著的情况，质粒不相容群HI1、HI2和P的携带率在不同来源的菌群中差异显著，质粒不相容群T、FIB和FrepB携带率在不同地域的菌群中差异显著，Y和FIIs只存在上海的动物性食品源德比沙门菌菌群中。159株德比沙门菌经XbaI酶切处理后进行脉冲场电泳，即PFGE分子分型，分型I 成功率为94.97%（151/159），共得到84个不同的PFGE基因型，德比沙门菌菌群PFGE分子分型相似度范围为65%-100%。按相似度85%进行PFGE基因分簇，得到11个基因簇，经统计可知存在不同地域、不同宿主、不同采集时间的菌株共享一个PFGE基因簇，乃至同一PFGE基因型的情况，说明德比沙门菌有跨时间、跨地域、跨宿主交叉传播的可能性。本研究毒力基因与质粒不相容群的携带情况与菌株相似度存在相关性，且所使用的毒力基因分型及质粒不相容群分型两种分型方法与作为标准的PFGE分子分型方法部分结果具有一致性，说明毒力基因分型方法及质粒不相容群分型方法有作为潜在分型方法的价值。德比沙门菌作为一种常见的沙门菌血清型，长期在各项关于沙门菌的研究中有前五位的分离率。但由于国内外对德比沙门菌的相关研究十分稀缺，导致德比沙门菌的耐药性、致病力及质粒携带等情况尚未明确。本研究对不同地域及不同来源的德比沙门菌菌群进行耐药性检测、毒力基因检测、质粒不相容群检测和PFGE分型，从结果分析并探究了德比沙门菌流行菌株的耐药性及分子流行病学特点。关键词：德比沙门菌；耐药性；毒力基因；质粒不相容群；PFGEII MolecularcharacterizationandAntimicrobialresistanceofSalmonellaDerbyFengZhou(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:Inthisstudy,atotalof391sampleswerecollectedfromretailmarketinGuangdongprovince,asaresult279Salmonellastrainswereobtained,andtheisolationrateofSalmonellainthesesampleswas71.34%.Andatotalof26(9.32%)SalmonellaDerbyisolateswereobtainedinallSalmonellaisolates.Ontheotherhand,133SalmonellaDerbyisolateswerecollectedfromShanghai,contains74humansourcestrainsand59foodsourcestrains.Atotalof159isolatesofSalmonellaDerbywereusedinthisstudy.Inthisstudy,159SalmonellaDerbyisolatesweretestedfortheantimicrobialsusceptibilitytestof16antibiotics,andtheresultsindicatedthatisolatesdisplayedahigh-levelandwidespectrumofantibioticresistance,98.11%(156/159)SalmonellaDerbyisolateswasresistanttoatleastoneantimicrobial,thehighestfrequencyofresistancewastotetracycline(88.05%)andsulfamethoxazole(78.62%)andstreptomycin(58.49%).DifferentsourcesanddifferentregionsoftheSalmonellaDerbyisolatesonthedrugresistanceexistsdifferences:thestreptomycinresistanceofSalmonellaDerbyisolatesfromfoodsourcewassignificantlyhigherthanthestreptomycinresistanceofSalmonellaDerbyisolatesfromhumansource;thesulfamethoxazoleresistanceofSalmonellaDerbyisolatesinGuangdongProvincewas100%,whichwassignificantlyhigherthanthatinShanghai.MultipledrugresistancestatisticsresultsindicatedthatSalmonellaDerbyisolatescontain50resistancepatterns,69.81%(111/159)isolateswereresistantto≥3antimicrobials,andexistisolateswithathirteen-drug-resistancepattern.Inthisstudy,159SalmonellaDerbyisolatesweretestedfor10virulencegenes,andtheresultsindicatedthatthevirulencegeneavrA(100%),bcfC(100%),ssaQ(99.37%),siiD(98.74%),mgtC(98.11%),sopB(98.11%),sopE(96.86%),sodC1(95.60%),gipA(4.40%)andspvC(0.63%)werepresentinflock,andthepredominantvirulencegenepatternwas"avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC"(84.91%,135/159)inflock.III ThetypesofvirulencegeneofShanghaiSalmonellaDerbyisolatesweremorethanthatoftheGuangdongSalmonellaDerbyisolates,itsuggestedthepathogenicityofSalmonellaDerbyinShanghaiwashigherthanthatinGuangdong.Inthisstudy,159SalmonellaDerbyisolatesweretestedfor18plasmidincompatibilitygroups,andtheresultsindicatedthat11plasmidincompatibilitygroupswerepresentinflock.ThehighestfrequencyofplasmidincompatibilitygroupsthatharboredbyflockwereFIA(50.94%),P(33.33%)andFIC(28.30%).Inplasmidincompatibilitygroupsprofiles,82.39%(131/159)SalmonellaDerbyisolatesharboredtheplasmidincompatibilitygroups,andtherewasnoobviouspredominantplasmidincompatibilitygroupspatterns,thenumberofplasmidincompatibilitygroupharboredbyonestrainreachthemaximumof6.DifferentsourcesanddifferentregionsoftheSalmonellaDerbyisolatesharboredplasmidincompatibilitygroupsexistdifferences:plasmidincompatibilitygroupsHI1,HI2andPharboredrateindifferentsourcesofSalmonellaDerbyisolatesflockweresignificantlydifferent,plasmidincompatibilitygroupsT,FIBandFrepBharboredrateindifferentregionsoftheSalmonellaDerbyisolatesflockinthedifferentregionsissignificant,plasmidincompatibilitygroupsYandFIIsonlyexistintheSalmonellaDerbyisolatesflockinShanghai.TheSalmonellaDerbyisolatesweredigestedwithrestrictionendonucleaseXbaIandanalyzedusingPFGE,theratewas94.97%(151/159),contain84PFGEpattern,therangeofsimilaritiesofPFGEpatternwas65%-100%.Theisolatesgroupedinto11clusterswith85%patternsimilarity,thestatisticsresultsshowedthattheisolatesfromdifferentsources,differenttimeofisolationanddifferentregionsofisolationweregroupedtogetherinacluster,moreoverinsomecasessharedidenticalpatterns.TheresultssuggestedthattheSalmonellaDerbystrainhaspotentialcross-contaminationbetweendifferentsources,timeandgeographicregions.Inthisstudy,therewasassociationbetweenvirulencegenesandsimilarityofstrain,betweenplasmidincompatibilitygroupsandsimilarityofstrain.Inaddition,therewasassociationbetweencertainPFGEmoleculartypingandvirulencegeneprofiles,certainPFGEmoleculartypingandplasmidincompatibilitygroupsprofiles,suggestingvirulencesubtypingandplasmidincompatibilitygroupssubtypingcanbeusefultypingtoolstoIV discriminateisolatesindifferentrequirements.SalmonellaDerbyasacommonserotypeofSalmonellaenterica,ranksamongthetopfiveoftheisolationrateininthevariousresearches.However,therelatedresearchesonSalmonellaDerbyisverylimited,asaresulttheresistance,pathogenicityandplasmidcarryingstatusofSalmonellaDerbyisnotclearsofar.Inthisstudy,SalmonellaDerbyrecoveredfromdifferentsourcesanddifferentregionswascharacterizedforantimicrobialsusceptibility,virulencegenes,plasmidincompatibilitygroupsandmolecularsubtypesusingpulsedfieldgelelectrophoresis,andinvestigatedthemolecularcharacterizationandantimicrobialresistanceofSalmonellaDerby.Keywords:SalmonellaDerby;resistance;virulencegene;plasmidincompatibilitygroups;pulsed-fieldgelelectrophoresis(PFGE)V 本研究常用缩写词缩写词英文全称中文全称BPWBufferedPeptoneWater缓冲蛋白胨水bpBasepair碱基对PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸gGram克hHour小时LLiter升molMolecule摩尔m/Lmole/Liter摩尔/升mgMilligram毫克minMinute分钟mLMilliliter毫升PFGEPulseFieldGelElectrophoresis脉冲场凝胶电泳pHpondushydrogeniipH值RVRappaport-VassiliadisRV肉汤sSecond秒rpmRotationperminute每分钟转数TTBTetrathionateBroth四硫磺酸盐煌绿增菌液Taq酶TaqDNAPolmeraseTaqDNA聚合酶µgMicrogram微克µLMicroliter微升µmol/LMicromole/liter微摩尔/升XLDXyloseLysineDesoxycholateMedium木糖赖氨酸脱氧胆酸钠培养基XLT4XLT4Agar木糖-赖氨酸-硫酸四癸钠琼脂TSATSAAgar胰蛋白胨大豆琼脂TSITripleSugarIronAgar三塘铁琼脂VI 目录1前言....................................................................................................................................11.1沙门菌概述.....................................................................................................................11.1.1沙门菌特性..................................................................................................................11.1.2沙门菌的宿主范围及污染情况..................................................................................11.1.3沙门菌流行与危害......................................................................................................11.2沙门菌的耐药性现状概述.............................................................................................21.3沙门菌毒力因子概述.....................................................................................................31.4质粒不相容群分型概述.................................................................................................31.5脉冲场凝胶电泳技术概述.............................................................................................41.6研究目的及意义.............................................................................................................51.7技术路线.........................................................................................................................72材料与方法........................................................................................................................82.1材料.................................................................................................................................82.1.1样品采集与菌种来源..................................................................................................82.1.1.1采样采集....................................................................................................................82.1.1.2上海市德比沙门菌菌株............................................................................................92.1.2标准菌株....................................................................................................................112.1.3培养基........................................................................................................................122.1.4主要试剂....................................................................................................................122.1.5实验耗材....................................................................................................................122.1.6试剂的配制................................................................................................................132.1.7主要仪器....................................................................................................................142.1.8药敏纸片....................................................................................................................142.1.9引物............................................................................................................................152.1.9.1沙门菌鉴定引物.....................................................................................................152.1.9.2毒力基因引物.........................................................................................................162.1.9.3质粒不相容群引物.................................................................................................172.2方法...............................................................................................................................18VII 2.2.1沙门菌分离鉴定........................................................................................................182.2.1.1样品的采集及预增菌处理.....................................................................................182.2.1.2沙门菌的分离.........................................................................................................192.2.1.3沙门菌分离株的生化试验.....................................................................................202.2.1.4沙门菌分离株的血清型鉴定.................................................................................202.2.1.5沙门菌的保存.........................................................................................................212.2.2德比沙门菌的药敏实验............................................................................................212.2.3德比沙门菌毒力基因及质粒不相容群的PCR检测..............................................212.2.3.1DNA模板的制备....................................................................................................212.2.3.2毒力基因的PCR检测...........................................................................................222.2.3.3质粒不相容群的PCR检测...................................................................................222.2.4PFGE分子分型..........................................................................................................232.2.4.1细菌培养.................................................................................................................232.2.4.2凝胶块的制备.........................................................................................................232.2.4.3细菌的裂解.............................................................................................................242.2.4.4洗胶块.....................................................................................................................242.2.4.5限制性酶切.............................................................................................................242.2.4.6加样.........................................................................................................................242.2.4.7脉冲场电泳.............................................................................................................252.2.4.8图像的获取.............................................................................................................252.2.4.9图像的数据分析.....................................................................................................252.2.5统计学数据分析........................................................................................................253实验结果及分析..............................................................................................................273.1细菌分离鉴定结果.......................................................................................................273.2德比沙门菌药敏试验结果及分析...............................................................................283.2.1德比沙门菌菌株耐药情况........................................................................................283.2.2德比沙门菌菌株耐药结果分析................................................................................403.2.3德比沙门菌多重耐药统计及分析............................................................................413.2.4德比沙门菌耐药情况小结........................................................................................46VIII 3.3德比沙门菌毒力基因检测结果...................................................................................463.3.1毒力基因携带情况.....................................................................................................463.3.2毒力基因检测结果分析.............................................................................................563.3.3毒力基因模式统计.....................................................................................................573.3.4毒力基因检测情况小结.............................................................................................583.4德比沙门菌质粒不相容群检测结果...........................................................................593.4.1质粒不相容群检测结果.............................................................................................593.4.3质粒不相容群携带模式统计....................................................................................703.4.4质粒不相容群携带模式分析....................................................................................733.4.5质粒不相容群检测小结.............................................................................................743.5德比沙门菌的PFGE分型结果及分析.......................................................................743.5.1PFGE分型结果图谱..................................................................................................743.5.2PFGE分子分型结果分析..........................................................................................783.5.3PFGE分子分型小结..................................................................................................783.6德比沙门菌的分子流行病学相关性研究...................................................................783.6.1整理PFGE分子分型、毒力基因及质粒不相容群图谱结果................................783.6.2毒力基因相关性分析.................................................................................................803.6.3质粒不相容群相关性分析.........................................................................................813.6.4德比沙门菌的分子流行病学相关性研究小结........................................................814讨论..................................................................................................................................824.1德比沙门菌耐药结果讨论...........................................................................................824.2德比沙门菌毒力基因检测及毒力基因模式分型结果讨论.......................................834.3德比沙门菌质粒不相容群检测及携带模式分型结果讨论.......................................854.4德比沙门菌PFGE分子分型结果讨论.......................................................................864.5PFGE分子分型及本研究中的毒力基因分型、质粒不相容群分型方法关系探究讨..............................................................................................................................................874.5.1PFGE分子分型方法、毒力基因分型及质粒不相容群分型方法图谱对比..........874.5.2德比沙门菌PFGE分型与毒力基因分型关系探究................................................874.5.3PFGE分子分型和质粒不相容群分型关系探究......................................................88IX 4.5.4PFGE分子分型方法与本研究中毒力基因分型及质粒不相容群分型方法的关系探究小结..................................................................................................................................905结论..................................................................................................................................91致谢......................................................................................................................................93参考文献..............................................................................................................................94附录......................................................................................................................................99X 1前言1.1沙门菌概述1.1.1沙门菌特性沙门菌（Salmonella）属于常见的革兰氏阴性肠杆菌，大小约为1.1μm×3.5μm散在存在的两端为钝圆的无荚膜和无芽孢细菌，除少数血清型（鸡白痢和鸡伤寒两种沙门菌）外大多具有鞭毛，具有运动力，大多有菌毛，具有吸附在宿主细胞表面的能力。属兼性厌氧菌，营养需求不高，在普通固体琼脂培养基上能获得良好的生长，培养24小时之后能形成的菌落大小均匀适中、表面呈圆润光滑，半透明无色，大部分菌株能产硫化氢。沙门菌具有较复杂的抗原结构，一般来说，菌体具有四种抗原：菌体抗原（O），鞭毛抗原（H），表面抗原（Vi）和菌毛抗原。沙门菌其本身不产外毒素，然而会产内毒素（在菌体裂解时产生），此毒素毒性强，是引起宿主疾病的主要因素（朱奇等，2015）。1.1.2沙门菌的宿主范围及污染情况沙门菌广泛的存在于自然界中，是一种重要的人畜共患病病原微生物，能通过食物链从动物向人传染。作为沙门菌宿主的动物种类范围极广，几乎临床常见的动物均能作为宿主，甚至部分水产动物及爬行类动物同样能作为沙门菌的宿主，且绝大多数的沙门菌对人具有一定程度的致病性（G.Mead等，2011；Zhangetal.,2015）。此外，在一定环境条件情况下可增加易感动物发生沙门菌并的几率，如卫生状况差、拥挤、气候恶劣、疲劳、分娩等。而在日常生活中，大量的食物存在沙门菌。肉类、海产品、蛋类等许多食品几乎都与沙门菌存在关联，其原因是食品本身含有丰富的营养成分，使沙门菌快速生长繁殖，当人类及其他动物大量摄入含有沙门菌的食物时，导致细菌性感染，从而引发食物中毒（Foleyetal.,2008）。1.1.3沙门菌流行与危害沙门菌感染是导致人类肠胃炎的主要原因，持续作为重大公共卫生问题长期存在（Burnsetal.,2016）。世界上最大的一起沙门菌中毒是1953年于瑞典由污染的猪肉1 引起的沙门菌中毒，7717人食物中毒，其中死亡率为1.17%（90人死亡）（王毳等，2007）。美国疾病防控中心统计，沙门菌在引起食物中毒的病原菌中长居前两位，每年在美国超过约12,000,000例，其中超过23,000例住院，450例死亡（Scallanetal.,2011）。而就我国而言，经沙门菌引起的食物中毒长期排在世界第一位。据统计，在我国国内由细菌引起的食物中毒其中70%-80%是由沙门菌所引起（赵贵等，2004）。沙门菌的血清型数量极多，目前已检测出的血清型在2500种之上，我国已有超过290种血清型报道（彭海滨等，2006；Brenneretal.,2000）。其中，德比沙门菌是几种最常见的血清型之一。在国外，美洲地区（如危地马拉，西班牙洪都拉斯等地）德比沙门菌（SalmonellaDerby）常在沙门菌感染病例中数量位列前五（Jarquinetal.,2015；Maradiagaetal.,2015）。在我国上海市黄浦区2008到2011年间收集的沙门菌病例中，德比沙门菌更是数量前三的血清型，仅次于肠炎型沙门菌和鼠伤寒沙门菌（沈福杰等，2012）。然而，在国内乃至世界各国，对于德比沙门菌的相关研究十分稀少，甚至与德比沙门菌相关的研究数据和信息非常匮乏。1.2沙门菌的耐药性现状概述目前在人类临床及畜牧业生产中，抗菌药物仍是应对病原细菌的首选。长期以来由于抗菌药物在各业中的泛滥及过度使用，具有抗菌药物耐药性的菌株开始不断出现，且耐药谱不断增宽，致使耐药性沙门菌已成为了主要的致病细菌（赵玉林等，2012）；更为严重的是多重耐药菌存在通过食用动物将耐药性传递给人类的可能性（吴云凤等，2012）。在2003年至2005年期间，对地处美国威斯康星州发生沙门菌感染的病人进行调查，结果表明多重耐药的沙门菌菌株比例在显著的递增（Karonetal.,2007）。据美国国际抗生素耐药性监测系统（NARMS）统计，同血清型的沙门菌对于9重或9重以上抗生素耐药的菌株从1996年的0%，1998年的1%猛增到了2001年的25%（CDC，2003）。而在加拿大也有类似报道，2000年以前采集的49株沙门菌菌株中没有菌株对超过3中抗生素有耐药性，而2000-2002年采集的70株同血清型的菌株中，对知道11种抗生素耐药的沙门菌菌株猛增到50%（Poppeetal.,2006）。且EgualeTadesse等人（2016）在其研究中明确说明频繁出现的多重耐药型沙门菌菌株对人类的潜在危害已经到了必须受到应有的控制和干预的程度（Egualeetal.,2016）。而在我国沙门2 菌的耐药性增长率更是位居世界第一（平均增长率高达22%）（马婧嘉等，2014）。根据吴云凤等（2012）研究，2012年分离自江苏省苏北地区的71株沙门菌中，几乎所有的沙门菌都对3中以上的抗生素产生了耐药性，耐3-7重药物的菌株占33.8%，对8-12种抗生素耐药的菌株占26.8%，对高达13-16种抗生素耐药的菌株占36.6%，分离的菌株群对高达16种抗生素有耐药情况，最严重的几种为萘啶酸，氨苄青霉素，磺胺嘧啶，复方磺胺甲恶唑和四环素几乎全部为100%（吴云凤等，2012）。而YinMingyuan等人（2016）在2013-2014年间新疆市肉类零售市场分离的99株沙门菌中，耐药性同样十分严重，耐药情况最严重的几种为甲氧苄啶（100%），其次为氯霉素（88.9%）、四环素（63.6%）、萘啶酸（58.6%）、磺胺异恶唑（57.6%），且整体菌群均对至少一种抗生素耐药，多重耐药型（3重以上）菌株高达70%（Yinetal.,2016）。可见，国内对于抗生素滥用问题已经非常严重，采取监管措施刻不容缓。1.3沙门菌毒力因子概述沙门菌的诸多毒力因子（肠毒素、细胞毒素、脂多糖与毒力蛋白等）本身的存在及其相互间的作用是致使沙门菌具备致病能力的原因，而能够编码产生毒力因子的基因即为毒力基因（黄冠军等，2013；陈冬平等，2012）。跟据刘芳萍等人（2013）研究发现，携带毒力基因少的菌株表现出的致病性较弱，而同时携带多种毒力基因或携带特定毒力基因（spvC）的沙门菌菌株表现出来强致病力（刘芳萍等，2013）。毒力基因主要在毒力岛和携带毒力基因的质粒上（曹恬雪等，2014）。而这些毒力基因的携带情况也一定程度上的影响着沙门菌菌体的致病力，不同来源和不同血清型的沙门菌对动物乃至对人的致病力都存在着差异。因此，研究不同血清型及不同来源的沙门菌的毒力基因携带情况及分析对于下一步探究沙门菌致病机制，正确认识沙门菌致病性都提供了基础数据。1.4质粒不相容群分型概述质粒本身是一种独立于染色体以外稳定存在的遗传因子，为双链的闭环式结构，基因片段长度范围在几个kp到几百kp之间不等，且在于细胞中以超螺旋状体存在。质粒本身通过自主复制和转录能力可在子代细胞中保有稳定的拷贝数，且其所携带的遗传信息有表达能力。质粒可能会携带有介导耐药、毒力的基因及移动遗传原件（如插入序列、转座子等），所以其可能在遗传基因的同源重组或非同源重组方面以及在细菌之间的遗传信息水平交换方面具有着举足轻重的作用，即极大的增加了基因水平3 传递的复杂性（冯建昆等，2012）。质粒的分类是基于其不相容性（Incompatibility，Inc），即亲缘关系相近或同类的多种质粒不能在同一细胞内同时稳定存在的质粒本身特性。当细胞内进入了一种之前不存在的质粒时，若其已经含有与该质粒亲缘关系相近或相同的质粒时，那么这两种质粒就会存在竞争关系，竞争直至其中一方被彻底消除。质粒的不相容分群（incompatibilitygroup）根据PCR的质粒不相容群复制子分型（PCR-basedreplicontyping）方法，是对细菌体内质粒的一种分类标准，有较高的特异性及灵敏性，并方便快捷，该方法通常用于跟踪质粒赋予的性状的流行病学调查（李静怡等，2014）。肠杆菌科细菌所携带的质粒通常分为18个不相容群，分别是：IncHI1,IncHI2,IncX,IncI1,IncL/M,IncN,IncFIA,IncFIB,IncY,IncW,IncP,IncFIC,IncA/C,IncT,IncFrepB,IncK/B,IncB/O和IncFII（Carattolietal.,2005）。质粒不相容群目前是研究质粒扩散的重要工具，目前该方法在国外高频率应用于临床上，对于大肠杆菌质粒的不相容群分型。但国内罕见关于沙门菌质粒不相容群分型报道，有关于德比沙门菌的质粒不相容群分型至今未见。1.5脉冲场凝胶电泳技术概述细菌的分子分型在常规监测和疫情调查以建立流行病学联系中起着至关重要的角色。但细菌分型的方法必须满足许多要求，如需要具有高度的分辨力，具有容易操作性，国际标准化的清晰解释能力（Lienemannetal.,2015）。传统的分型方法只能从细菌表型上（如血清型、耐药谱、噬菌体等方面）进行区分，无法涉及分子水平上的遗传关系信息，不能满足流行病学调查的需要。而目前，脉冲场电泳凝胶技术（PFGE，pulse-fieldgelelectrophoresis）就成为了细菌分子分型的国际标准，即分型研究的金标准，且PFGE是唯一的通用适合所有血清型沙门菌的分子生物学方法（Michelonetal.,2015；Lienemannetal.,2015）。同时，PFGE因为其极高的分辨能力也同样被使用在了其他诸多的致病细菌（如：大肠杆菌，李斯特菌，空肠弯曲杆菌等）的分子分型上（Michelonetal.,2015；Silvaetal.,2016）。脉冲场电泳凝胶技术（PFGE）本身是基于DNA分子结构研究的一种细菌的分子分型方法，其原理是在琼脂糖凝胶上外加一个时间、电流大小及方向一直在交替改变着的正交的交变脉冲电场，将先前特异性酶切散开的DNA片段按分子量不同通过电泳分离开，分离到的DNA分子以片段大，兼具稳定和谱型简易清晰，且分辨率极高4 为特点。目前，PFGE技术在国内外应用十分广泛，例如，Balleste-DelpierreClara等（2014）对2007-2008期间在西班牙巴塞罗那医院分离到的41株沙门菌临床菌株进行了PFGE分子分型，发现期间所有的肠炎沙门菌PFGE基因型相似，除两株外其余均为同一克隆（Ballesté-Delpierreetal.,2014）。2013年FendriImen等人对从地中海南部和突尼斯斯法克斯等地从食品中分离到的45株沙门菌进行了PFGE分子分型，发现存在不同地域的几株沙门菌相似程度高于同一样品分离到的几株沙门菌的情况，说明了PFGE基因型的多样性跟来源地与血清型之间的关系（Fendrietal.,2013）。在国内，KuangDai等（2015）对上海2007-2011分离到的79株纽波特沙门菌进行了PFGE分子分型及毒力等其他分型，发现同一基因簇的纽波特沙门菌与来源、地域、分离时间等联系都不大，但与毒力分型类似的关系（Kuangetal.,2015）。YangBaowei等对2007-2008年间从超市不同肉类中分离到的肠炎沙门菌，鼠伤寒沙门菌，舒勃拉沙门菌及印第安纳沙门菌共210株进行了PFGE分子分型，发现来源不同的肠炎沙门菌若被分到了同一基因簇上，其耐药谱会存在相似性，这说明了沙门菌的PFGE分子分型可能与耐药谱存在的关系（Yangetal.,2010）。随着现代生物科学研究技术的发展，脉冲场电泳凝胶技术已经越来越多的被提及和使用到，其本身可表明菌株之间相关遗传进化关系，与沙门菌的分型研究已经密不可分，是研究沙门菌分子特点常用工具。1.6研究目的及意义近年来德比沙门菌在各沙门菌的感染病例及经污染环境的分离率中均是位列前几的血清型，在如此高的分离率下，已经是一种血清型较为常见的沙门菌，其在我国动物、食品及感染病人中流行情况如何目前还不十分清楚，尤其是不同地区、不同来源菌株之间在传播途径、致病性及遗传演化中是否存在一定关系也不清楚。且国内外亦缺乏德比沙门菌的相关研究。本研究从不同地域（上海及广东两地）与来源（人源及动物性食品源）的德比沙门菌菌群入手，对其进行耐药性检测、毒力基因检测、质粒不相容群检测和PFGE分型进行研究，揭示德比沙门菌的耐药表型特点、毒力基因携带特点、质粒不相容群携带特点及PFGE分子分型特点，表明不同来源的德比沙门菌流行菌株的耐药性及分子流行病学特点及它们之间的相关性，为调查该血清型菌株跨地域污染情况调查、耐药5 性、致病力及质粒相关研究提供数据支持和理论依据。6 1.7技术路线样品采集沙门菌预增菌处理沙门菌选择性增殖及筛选培养二次选择性增PCR鉴定殖培养生化鉴定血清型鉴定质粒不相容群药敏实验毒力基因检测PFGE分子分型检测德比沙门菌耐药性及分子流行病学特征7 2材料与方法2.1材料2.1.1样品采集与菌种来源2.1.1.1采样采集2015年5月至2015年9月，从广东省广州市、深圳市、韶关市、云浮市、河源市、佛山市及清远市收集到的鸡肉、猪肉样品，共计391份。其中鸡肉样品263份，猪肉样品128份，样品具体信息如表1所示。本研究中广东采集的所有样品为市场肉类样品（猪肉及鸡肉）。表1广东省样品采集信息表时间样品数量地点时间样品数量地点2015.5.16鸡肉7广州2015.7.21猪肉8广州2015.6.7鸡肉2广州2015.8.4猪肉8广州2015.6.14鸡肉25广州2015.8.14猪肉12广州2015.6.27鸡肉21广州2015.8.24猪肉10广州2015.7.21鸡肉21广州2015.9.12猪肉16深圳2015.8.4鸡肉23广州2015.9.13猪肉16韶关2015.8.14鸡肉11广州2015.9.19猪肉16云浮2015.8.24鸡肉13广州2015.9.20猪肉16河源2015.9.12鸡肉30深圳2015.9.21猪肉26广州2015.9.13鸡肉30韶关2015.9.19鸡肉30云浮2015.9.20鸡肉30河源2015.9.21鸡肉30广州8 2.1.1.2上海市德比沙门菌菌株本研究中来源于上海市的133株德比沙门菌均由2014年到2015年上海交通大学收集和提供，具体菌株信息如表2所示。该菌群采集自三类样品，分为市场肉类样品（包括市场所售猪肉、鸡肉、鸭肉、羊肉、禽蛋及牛肉），动物来源（活禽市场所售活鸡）的肛拭子及腹泻病人的粪便样品。表2上海市133株德比沙门菌菌株信息菌株编号来源采样地采样时间菌株编号来源采样地采样时间SH14G0067人源上海2014.5SH14G0854人源上海2014.8SH14G0068人源上海2014.5SH14G0856人源上海2014.8SH14G0097人源上海2014.5SH14G0891人源上海2014.8SH14G0098人源上海2013.12SH14G0908人源上海2014.9SH14G0109人源上海2014.1SH14G0918人源上海2014.1SH14G0120人源上海2014.4SH14G0959人源上海2014.12SH14G0123人源上海2014.5SH14G0972人源上海2014.7SH14G0139人源上海2014.5SH14G0975人源上海2014.7SH14G0139人源上海2014.5SH14G1028人源上海2014.8SH14G0141人源上海2014.5SH14G1052人源上海2014.9SH14G0142人源上海2014.5SH14G1063人源上海2014.9SH14G0143人源上海2014.5SH14G1125人源上海2014.1SH14G0147人源上海2014.6SH14G1170人源上海2014.1SH14G0148人源上海2014.6SH14G1180人源上海2014.1SH14G0180人源上海2014.6SH14G1205人源上海2014.9SH14G0208人源上海2014.6SH14G1206人源上海2014.9SH14G0268人源上海2013.12SH14G1232人源上海2013.9SH14G0295人源上海2014.2SH14G1235人源上海2013.9SH14G0320人源上海2014.4SH14G1242人源上海2013.119 菌株编号来源采样地采样时间菌株编号来源采样地采样时间SH14G0331人源上海2014.5SH14G1248人源上海2013.12SH14G0341人源上海2014.5SH14G1263人源上海2014.5SH14G0406人源上海2014.6SH14G1296人源上海2014.8SH14G0425人源上海2014.7SH14G1320人源上海2014.12SH14G0480人源上海2014.7SH14G1391人源上海2014.1SH14G0483人源上海2014.8SH14G1393人源上海2014.1SH14G0564人源上海2014.6SH14G1404人源上海2014.9SH14G0573人源上海2014.8SH14G1470人源上海2014.12SH14G0593人源上海2014.8SH14G1484人源上海2014.1SH14G0603人源上海2014.8SH14G1492人源上海2015.4SH14G0615人源上海2014.2SH14G1493人源上海2014.5SH14G0726人源上海2014.6SH14G1498人源上海2014.5SH14G0756人源上海2014.7SH14G1545人源上海2014.5SH14G0784人源上海2014.7SH14G1548人源上海2014.5SH14G0807人源上海2014.7SH14G1568人源上海2014.6SH14G0815人源上海2014.7SH14G1571人源上海2014.6SH14G0834人源上海2014.8SH14G1587人源上海2014.9SH14G0848人源上海2014.8SH14G1608人源上海2014.12SH14SF004食品源上海2014.5SH14SF274食品源上海2014.8SH14SF024食品源上海2014.6SH14SF279食品源上海2014.9SH14SF025食品源上海2014.6SH14SF281食品源上海2014.1SH14SF048食品源上海2014.7SH14SF282食品源上海2014.1SH14SF059食品源上海2014.6SH14SF283食品源上海2014.1SH14SF064食品源上海2014.6SH14SF284食品源上海2014.1SH14SF065食品源上海2014.6SH14SF285食品源上海2014.1SH14SF069食品源上海2014.7SH14SF287食品源上海2014.110 菌株编号来源采样地采样时间菌株编号来源采样地采样时间SH14SF116食品源上海2014.8SH14SF291食品源上海2014.1SH14SF117动物源上海2014.8SH14SF293食品源上海2014.1SH14SF118动物源上海2014.8SH14SF295食品源上海2014.1SH14SF139食品源上海2014.8SH14SF296食品源上海2014.11SH14SF142食品源上海2014.9SH14SF297食品源上海2014.11SH14SF154食品源上海2014.9SH14SF300食品源上海2014.5SH14SF156食品源上海2014.9SH14SF304食品源上海2014.5SH14SF207食品源上海2014.9SH14SF306食品源上海2014.5SH14SF208食品源上海2014.9SH14SF307食品源上海2014.5SH14SF209食品源上海2014.9SH14SF308食品源上海2014.5SH14SF210食品源上海2014.9SH14SF333食品源上海2014.7SH14SF241食品源上海2014.3SH14SF334食品源上海2014.7SH14SF242食品源上海2014.4SH14SF354食品源上海2014.8SH14SF243食品源上海2014.4SH14SF357食品源上海2014.8SH14SF249食品源上海2014.5SH14SF359食品源上海2014.8SH14SF255食品源上海2014.6SH14SF360食品源上海2014.8SH14SF257食品源上海2014.7SH14SF361食品源上海2014.9SH14SF258食品源上海2014.7SH14SF362食品源上海2014.9SH14SF260食品源上海2014.7SH14SF369食品源上海2014.1SH14SF261食品源上海2014.7SH14SF375食品源上海2014.11SH14SF264食品源上海2014.7SH14SF379食品源上海2014.11SH14SF272食品源上海2014.82.1.2标准菌株用于PCR鉴定的标准鸡白痢沙门菌标准株C79-13和大肠杆菌ATCC2592为在中国兽医药品监察所购得；脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型所用的标准菌株H981211 由本实验室保藏。2.1.3培养基缓冲蛋白胨水（BPW）、RV肉汤、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、XLT4琼脂、沙门菌显色培养基、LB营养琼脂、LB肉汤、MH培养基、半固体营养琼脂均购自青岛海博生物技术有限责任公司；SBG沙门菌增菌液购自上海科马嘉生物技术有限责任公司。2.1.4主要试剂DNAMarkerDL1000、rTaqDNA聚合酶（PremixTaq）、蛋白酶K、限制性内切酶XbaI均购自TaKaRa公司；Goldview核酸染料、丙三醇（甘油）购自天根生化科技有限公司；细菌微量生化反应管葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、尿素、枸橼酸盐、吲哚、V-P试验、甲基红、赖氨酸脱羧酶、L-阿拉伯糖、水杨苷、D-山犁醇、L-鼠李糖和棉子糖等微量发酵管均购自杭州天和微生物试剂有限公司；琼脂糖、PFGE电泳级琼脂糖（SeaKemGoldAgarose）购自Bio-Rad公司；0.5mol/LEDTA(pH8.0)、1mol/LTris-HCl(pH8.0)、5×TBE、50×TAE购自上海索莱宝生物科技有限公司；Gelred核酸染料购自美国Biotium公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、氯化钠、NaOH购自Sigma公司。沙门菌属诊断血清(60种)，包括Vi因子血清、O多价A-F群血清；O复合因子血清3种：O4,12、O9,12、O3,19，O单因子血清15种：O2、O4、O5、O7、O8、O9、O10、O11、O14、O15、O19、O20、O27、O34、O46，H多价血清4种：H多价血清1（a，b，c，d，I）、H多价血清2（e,h；e,n,x；f,g；g,m,s；g,p；m,t）、H多价血清3（k；l,v；r；y；z；z10）、H多价血清4（1,2；1,5；1,6；1,7；z6）；H复合因子血清5种：He,h、He,n,x、Hl,v、Hg,p、H1,2,3,5，H因子血清31种Ha、Hb、Hc、Hd、Hf、Hg、Hh、Hi、Hk、Hm、Hn、Hp、Hr、Hs、Ht、Hu、Hv、Hw、Hx、Hy、Hz、Hz6、Hz10、Hz13、Hz15、Hz28、Hz29、H2、H5、H6、H7均购自宁波天润生物药业有限公司。2.1.5实验耗材无菌采样袋，50mL无菌离心管，固体培养基平皿，PCR8孔排管，一次性接种环，10cm灭菌棉签，2mL冻存管，Falcon2054管均购自广州辉鼎生物实验耗材有限公司。12 2.1.6试剂的配制20%SDS：称取20g分析纯SDS，使用超纯水充分溶解并定容至100mL，121℃灭菌30min。TE缓冲液（pH8.0）：1mol/LTris-HcL，pH8.0；2mL0.5mo1/L的EDTA，pH8.0；用无菌超纯水稀释至1000mL。0.5×TBEBuffer：200mL5×TBE用纯水稀释到2000mL。细胞悬浮缓冲液（CSB）（pH8.0）：10mL的1mo1/LTris（pH8.0）；20mL0.5mo1/L的EDTA（pH8.0），稀释至100mL。细胞裂解液缓冲液(CLB)：25mL1mo1/L的Tris，pH8.0；50mL0.5mo1/L的EDTA，pH8.0；50mL10%的Sarcosyl（钠盐），稀释至500mL。凝胶块琼脂糖(1%SeaKemGold:1%SDS)：称0.5g（或0.25g）SeaKemGold（SKG）琼脂糖凝胶到250mL螺帽瓶中；加入47.0mL（或23.5mL）TE缓冲液，轻旋转瓶以分散SKG胶；取下瓶盖，用干净膜盖住瓶口，微波加热，直到胶完全熔化；把瓶放到55～60℃水浴保温5min；加入2.5mL（或1.25mL）预热至55℃的20%SDS，混匀。盖好瓶口，保温于55～60℃水浴备用。电泳胶(1%SeaKemGold，以0.5×TBE配制)：14cm宽电泳胶框（10-15加样孔）：1.0gSKG胶溶于100mL0.5×TBE中；21cm宽电泳胶框（≥15加样孔）：1.5gSKG胶溶于150mL0.5×TBE中；微波加热，直到胶完全熔化。盖好瓶口，保温于55-60℃水浴备用。Gelred染液：用无细胞毒性的核酸染料Gelred替代EB，配制500mL的方法是在450mL纯水中加入50mL的1MNaCL和150μL的Gelred染料。40%甘油LB肉汤：配制120mL的LB肉汤，加入80mL丙三醇（甘油），用玻璃棒搅匀，121℃高压灭菌15min。沙门菌酶切预缓冲体系的配制见表3。13 表3沙门菌酶切预缓冲体系配制试剂预酶切体系(µL)酶切体系(µL)纯水3960385010×Mbuffer2202200.1%BSA220220XbaI0110总体积440044002.1.7主要仪器PTC-200型PCR扩增仪（美国MJReSearch公司）、PowerPacuniversalTM核酸电泳仪（美国Bio-Rad公司）、JY2001电子天平（上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂）、手提式高压蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂生产）、HH-S4数显双列四孔水浴锅（国立常州实验设备研究所）、YJ-1450型超净工作台（苏州净化设备厂）、5430R离心机（Eppendof公司）、SHP-250生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、Elix100纯净水装置（美国Millipore公司）、DESICHECK比浊仪（法国BioMerieux公司）；TS-110X30往复式水浴摇床（上海捷呈实验仪器有限公司）、CHEFMAPPERII脉冲场电泳仪（美国Bio-Rad公司）、GelDocXR凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。2.1.8药敏纸片本研究所有药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。药敏纸片种类及药敏实验判定标准见表4。14 表4药敏纸片种类及判定标准判定标准(mm)类别中文名缩写耐药中敏敏感青霉素类氨苄西林AMP≤1213-17≥18头孢类头孢噻肟CTX≤2122-26≥27头孢吡肟CFP≤1314-18≥19头孢他啶CAZ≤1314-18≥19碳青霉烯类亚胺培南IMP≤1314-15≥16氨基糖甙类庆大霉素GEN≤1112-15≥16链霉素STR≤1011-15≥16四环素类四环素TET≤1011-15≥16酰氨醇类氯霉素C≤1112-18≥19喹诺酮类萘啶酸NA≤1213-19≥20环丙沙星CIP≤1415-21≥22氧氟沙星OFX≤1112-16≥17磺胺类甲氧苄啶TMP≤910-16≥17磺胺异恶唑SIZ≤1112-17≥18复方奥格门丁AMC≤1213-18≥19复方新诺明SXT≤910-16≥172.1.9引物2.1.9.1沙门菌鉴定引物根据文献（刘红玉等，2011）设计1对以沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因为扩增对象的特异性引物（表5），由生工生物工程上海（股份）有限公司合成。15 表5引物序列目的基因引物名称引物序列产物大小invA-F5’-GTTCGTCATTCCATTACCTACC-3’invA424bpinvA-R5’-GGCATCCGCATCAATAATACC-3’2.1.9.2毒力基因引物根据文献（Kuangetal.,2015）设计10对以沙门菌毒力基因为扩增对象的特异性引物（表6），由生工生物工程上海（股份）有限公司合成。表6毒力基因引物目的基因所在位置引物名称引物序列(5′–3′)大小(bp)avrA-FGTTATGGACGGAACGACATCGGavrA毒力岛385avrA-RATTCTGCTTCCCGCCGCCssaQ-FGAATAGCGAATGAAGAGCGTCCssaQ毒力岛677ssaQ-RCATCGTGTTATCCTCTGTCAGCmgtC-FTGACTATCAATGCTCCAGTGAATmgtC毒力岛655mgtC-RATTTACTGGCCGCTATGCTGTTGSiiD-FGAATAGAAGACAAAGCGATCATCsiiD毒力岛1231SiiD-RGCTTTGTCCACGCCTTTCATCsopB-FGATGTGATTAATGAAGAAATGCCsopB毒力岛1170sopB-RGCAAACCATAAAAACTACACTCAgipA-FGCAAGCTGTACATGGCAAAGgipA噬菌体212gipA-RGGTATCGGTGACGAACAAATsodC1-FCCAGTGGAGCAGGTTTATCGsodC1噬菌体460sodC1-RGGTGCGCTCATCAGTTGTTCsopE-FACACACTTTCACCGAGGAAGCGsopE噬菌体398sopE-RGGATGCCTTCTGATGTTGACTGG16 目的基因所在位置引物名称引物序列(5′–3′)大小(bp)SpvC-FACTCCTTGCACAACCAAATGCGGAspvC质粒571SpvC-RTGTCTTCTGCATTTCGCCACCATCAbcfC-FACCAGAGACATTGCCTTCCbcfC菌毛467bcfC-RTTCTGATCGCCGCTATTCG2.1.9.3质粒不相容群引物根据文献（Carattolietal.,2005），设计了18对质粒不相容群复制子为扩增对象的特异性引物（表7），由生工生物工程上海（股份）有限公司合成。表7质粒不相容群引物目的基因引物名称引物序列(5′–3′)大小(bp)HI1-FGGAGCGATGGATTACTTCAGTACHI1471HI1-RTGCCGTTTCACCTCGTGAGTAHI2-FTTTCTCCTGAGTCACCTGTTAACACHI2644HI2-RGGCTCACTACCGTTGTCATCCTI1-FCGAAAGCCGGACGGCAGAAI1139I1-RTCGTCGTTCCGCCAAGTTCGTX-FAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATX376X-RTGAGAGTCAATTTTTATCTCATGTTTTAGCL/M-FGGATGAAAACTATCAGCATCTGAAGL/M785L/M-RCTGCAGGGGCGATTCTTTAGGN-FGTCTAACGAGCTTACCGAAGN559N-RGTTTCAACTCTGCCAAGTTCFIA-FCCATGCTGGTTCTAGAGAAGGTGFIA462FIA-RGTATATCCTTACTGGCTTCCGCAGFIB-FGGAGTTCTGACACACGATTTTCTGFIB702FIB-RCTCCCGTCGCTTCAGGGCATT17 目的基因引物名称引物序列(5′–3′)大小(bp)WC-FCCTAAGAACAACAAAGCCCCCGW242W-RGGTGCGCGGCATAGAACCGTY-FAATTCAAACAACACTGTGCAGCCTGY765Y-RGCGAGAATGGACGATTACAAAACTTTP-FCTATGGCCCTGCAAACGCGCCAGAAAP534P-RTCACGCGCCAGGGCGCAGCCFIC-FGTGAACTGGCAGATGAGGAAGGFIC262FIC-RTTCTCCTCGTCGCCAAACTAGATA/C-FGAGAACCAAAGACAAAGACCTGGAA/C465A/C-RACGACAAACCTGAATTGCCTCCTTT-FTTGGCCTGTTTGTGCCTAAACCATT750T-RCGTTGATTACACTTAGCTTTGGACFIIs-FCTGTCGTAAGCTGATGGCFIIs270FIIs-RCTCTGCCACAAACTTCAGCFrepB-FTGATCGTTTAAGGAATTTTGFrepB270FrepB-RGAAGATCAGTCACACCATCCK/B-FGCGGTCCGGAAAGCCAGAAAACK/B160K/B-RTCTTTCACGAGCCCGCCAAAB/O-FGCGGTCCGGAAAGCCAGAAAACB/O159B/O-RTCTGCGTTCCGCCAAGTTCGA2.2方法2.2.1沙门菌分离鉴定2.2.1.1样品的采集及预增菌处理样品为市场肉类样品（鸡肉及猪肉），肉类样品为取25g置于含BPW的225mL的无菌采样袋中，均匀搓揉约1min后样品放入BPW后均放入恒温摇床中以37℃100rpm震荡8h。18 2.2.1.2沙门菌的分离向含有10mLTTB和RV增菌液的离心管中各加入1mLBPW增菌液，42℃培养养24h，再分别取适量TTB和RV增菌液分别接种到XLD和XLT4培养基上并于37℃培养24h。培养结束后，从XLD和XLT4培养基上挑取疑似沙门菌菌落（光滑黑点状或透明针孔大小状），进行革兰氏染色，并用显微镜观察，选取两端钝圆的革兰氏阴性菌，转接至沙门菌显色培养平板上及接入含有LB肉汤的1.5mL无菌离心管中，放入37℃温箱培养12h-18h。培养结束后，对LB肉汤增菌过后的菌液进行PCR鉴定，PCR扩增体系详见表8。表8PCR扩增体系试剂用量（μL）PremixTaq12.5LB肉汤菌液2引物invA-F（10μmol）1引物invA-R（10μmol）1无菌水8.5总体积25PCR程序：预变性94℃5min，94℃变性30s，55℃变性30s，72℃45s，35个循环，72℃延伸3min。电泳：用1×TAE电泳缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶，微波炉熔胶至澄清透明，冷却至不烫手时向每100mL琼脂糖凝胶中加入4μLGoldView，轻轻摇匀，倒入插有梳子的模具中，待琼脂糖凝胶完全凝固后拔出梳子，将胶块放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中。以DNAMarkerDL1000作为分子质量标准，取10μLPCR产物于120V电压下电泳25min，用凝胶成像系统观察并分析结果。结合PCR鉴定结果及沙门菌显色平板鉴定结果，初步判断是否为疑似沙门菌并使用生化方法进一步确认。19 2.2.1.3沙门菌分离株的生化试验将可疑沙门菌的细菌分别接种三糖铁琼脂斜面，37℃培养24~48h后观察斜面和底部颜色变化以及产气情况（斜面为红色，底部变黑并产气），按文献报道方法测定分离菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、侧金盏花醇、吲哚、M.R、V-P和枸橼酸盐等10项生化指标的反应，对疑似菌株进行生化鉴定。并确定是否为沙门菌。2.2.1.4沙门菌分离株的血清型鉴定主要按照宁波天润生物药业有限公司提供的沙门菌诊断血清操作步骤和说明进行，具体如下：将待测沙门菌纯种培养物划线接种在半固体营养琼脂斜面，37℃培养过夜，备用；用胶头滴管吸取适量沙门菌A-I群多价抗O血清，滴加于干净的载玻片表面，同时用生理盐水做对照；用接种环从斜面顶部取适量菌体（抗原），将其充分分散于抗血清中，在1min之内观察抗血清中是否有凝集现象发生；选择能被A-I多价O抗血清凝集的沙门菌，再依次用O21、O28、O30、O35、O39、O40、O41、O48、O61等沙门菌O群抗血清因子进行凝集试验，判定O群；再用O1、O2、O4、O5、O61、O62、O7、O8、O9、O10、O12、O14、O15、O19、O20、O22、O23、O25、O27、O34和O46等O单因子血清进行定型；对于不被A-I多价血清凝集者，先用沙门菌因子血清中的9种多价O血清检查，如果一种血清凝集，则用包含的O群血清逐一检查，以确定O抗原。使用同O血清型鉴定相同的方法确定沙门菌的H抗原。使用的H相抗血清共12种,包括:Ha、Hb、Hc、Hd、Hi、Hk、Hr、Hy、Hz、Hz6、Hz10和Hz29等；沙门菌H单因子抗血清共19种,包括:Hf、Hg、Hh、Hm、Hnx、Hp、Hs、Ht、Hu、Hv、Hw、Hx、H2、H5、H6、H7、Hz13、Hz15和Hz28等。如H项抗原无凝集反应者，取少量该菌点接种于含有H抗原诱导相抗血清（诱导抗血清的类型由该菌O抗原的抗原型确定）的半固体营养琼脂培养基中，37℃培养过夜后就可得到只暴露有另一相鞭毛的菌株，再进行H项单因子凝集试验以确定H相抗原型；查阅该公司沙门菌抗血清诊断结果表格或沙门菌检验国家标准，根据测定得到的抗原式确定沙门菌的血清型。20 表9本研究中德比沙门菌血清群及抗原式H抗原群型菌名拉丁菌名O抗原第1相第2相A群德比沙门菌S.derby1,4,[5],12f,g[1,2]注：“__”是指溶原状态下O因子可以并存；“[]”是指O或H因子有存在或不存在的可能性。2.2.1.5沙门菌的保存将纯化并确定为沙门菌的细菌在LB营养琼脂平板上密集划线，培养16～18h后，向每个长有沙门菌的培养皿中加入5mL40%甘油LB肉汤，用灭菌三角玻璃棒将细菌菌落从琼脂平板上刮下来，并在甘油LB肉汤中混匀，用移液器吸取4.5mL混有沙门菌的甘油LB肉汤加入冻存管中，管壁上标清菌株编号，保存于-20℃冰箱。2.2.2德比沙门菌的药敏实验按照美国临床实验室标准化委员会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）推荐的操作规程，采用改良K-B法进行，并根据抑菌圈直径判断敏感(S)、中度耐药(I)、耐药(R)，药敏纸片种类及药敏实验判定标准见表2。具体操作如下：挑取1个德比沙门菌菌落接种于2mL的LB肉汤中，37℃培养3-6h。菌液浓度达到0.5麦氏比浊浓度以上时即可。用灭菌棉签蘸取菌液，并在管壁内轻轻挤出多余菌液，涂布在MH琼脂平板上，交叉涂布3次，每次将平皿旋转60°，保证涂布均匀覆盖表面。然后将平板静置约5min晾干，贴药敏纸片，每个纸片中心至少相距24mm，并用镊子轻压纸片，确保纸片与MH平板表面完全贴合。贴完纸片后，将平板倒置，置于37℃恒温培养箱内，培养16-18h取出。观察结果，并用游标卡尺测量抑菌圈的直径。2.2.3德比沙门菌毒力基因及质粒不相容群的PCR检测2.2.3.1DNA模板的制备用煮沸法提取疑似德比沙门菌的DNA，将菌落接入含1mLLB肉汤的1.5mL离心管培养18h，取出后，12000rpm离心5min，弃上清液，加入200μL超纯水重悬，置沸水中煮沸10min，立刻冰浴10min，再以12000rpm离心5min，取上清液即为模板，分装，-20℃保存备用。21 2.2.3.2毒力基因的PCR检测毒力基因的PCR检测目的扩增对象为10个毒力基因：avrA,ssaQ,mgtC,siiD,sopB,gipA,sodC1,sopE,spvC,bcfC。所以，毒力基因的PCR检测实验为10个独立的PCR体系。以提取的德比沙门菌的DNA为模板，PCR扩增体系均参照表10所示反应体系。表10毒力基因的PCR扩增体系试剂用量（μL）PremixTaq13DNA模板2上游引物（25μmol）0.5下游引物（25μmol）0.5无菌水去离子水9总体积25PCR反应程序为：（1）94℃预变性5min；（2）94℃变性60s；（3）58℃退火30s；（4）72℃延伸60s；（2）~（4）重复34个循环；72℃延伸5min；4℃终止反应。电泳：用1×TAE电泳缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶，微波炉熔胶至澄清透明，冷却至不烫手时向每100mL琼脂糖凝胶中加入4μLGoldView，轻轻摇匀，倒入插有梳子的模具中，待琼脂糖凝胶完全凝固后拔出梳子，将胶块放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中。以DNAMarkerDL1000作为分子质量标准，取10μLPCR产物于120V电压下电泳25min，用凝胶成像系统观察并分析结果。2.2.3.3质粒不相容群的PCR检测质粒不相容群的PCR检测目的扩增对象为18个质粒不相容群（IncHI1,IncHI2,IncX,IncI1,IncL/M,IncN,IncFIA,IncFIB,IncY,IncW,IncP,IncFIC,IncA/C,IncT,IncFrepB,IncK/B,IncB/O和IncFII）的复制子。该PCR检测实验为5个三重PCR体系和个单一PCR体系。3个单一PCR分别为：K/B,B/O和FrepB。5个三重PCR体系分别为：HI1、HI2和I1；X、L/M和N；FIA、FIB和W；Y、P和FIC；A/C、22 T和FIIs（Carattolietal.,2005）。以提取的德比沙门菌的DNA为模板，PCR扩增体系均参照表11所示反应体系。表11毒力基因的PCR扩增体系单一PCR反应底物用量（μL）三重PCR反应底物用量（μL）PremixTaq13PremixTaq13DNA模板2DNA模板2上游引物（25μmol）0.5上游引物（25μmol）0.5×3下游引物（25μmol）0.5下游引物（25μmol）0.5×3无菌水去离子水9无菌水去离子水7总体积25总体积25PCR反应程序为：（1）94℃预变性5min；（2）94℃变性60s；（3）60℃退火30s；（4）72℃延伸60s；（2）~（4）重复30个循环；72℃延伸5min；4℃终止反应。除FrepB反应程序中（3）为54℃退火30s，其余均为此反应。电泳：用1×TAE电泳缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶，微波炉熔胶至澄清透明，冷却至不烫手时向每100mL琼脂糖凝胶中加入4μLGoldView，轻轻摇匀，倒入插有梳子的模具中，待琼脂糖凝胶完全凝固后拔出梳子，将胶块放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中。以DNAMarkerDL1000作为分子质量标准，取10μLPCR产物于120V电压下电泳25min，用凝胶成像系统观察并分析结果。2.2.4PFGE分子分型2.2.4.1细菌培养将冻存的沙门菌接种于接种于XLD平板培养24h，挑取典型的沙门菌单菌落，接种于LB琼脂上，可同时接种标准株H9812。37℃培养14～18h。2.2.4.2凝胶块的制备在Falcon2054管上标记样品名称，同时在1.5mL离心管上标记好对应样品的名称；移取1～2mL的细胞悬浊液（CSB）到已经标记的Falcon2054管中，用CSB湿23 润接种环从培养皿上刮取适量细菌，轻旋接种环使菌均匀悬浊于CSB中并减少气溶胶形成；用比浊仪测其OD值，通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细菌悬液浓度至4.0～4.5；转移400μL调整好浓度的细胞悬浮液到已标记好的1.5mL离心管中，每管添加20μL的蛋白酶K（20mg/mL的储存液），蛋白酶K要置于冰上；加400μL备好的1%SeaKemGold:1%SDS到400μL细胞悬浮液中，用移液枪轻轻混合几次，快速将混合物灌注到胶块模具中，避免气泡产生，在室温下凝固10～15min或4℃冰箱凝固5min，1%SeaKemGold:1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。2.2.4.3细菌的裂解在50mL的离心管上做好标记，每个管子加入5mL细胞裂解液（CLB）和25µl蛋白酶K（20mg/mL）；打开模具，用小铲将胶块移入相应的离心管中，保证胶块在液面下而不在管壁上；将管子放在54℃水浴摇床孵育1.5～2h，转速150～170r/min。2.2.4.4洗胶块从水浴摇床中拿出50mL离心管，盖上绿色滤帽，轻轻倒掉CLB，在实验台上轻磕管底使胶块落在管底；每管中加入15mL预热的灭菌纯水，放回50℃水浴摇床中，摇10～15min，弃掉水，用纯水再洗1次；然后用10～15mL预热的TE，50℃的水浴摇床中洗涤10～15min，重复3次；弃去最后一次的TE，将凝胶块转移到2mL的离心管中加入1mL新鲜室温TE，放在4℃冰箱保存备用。2.2.4.5限制性酶切在1.5mL离心管上标记好相应的样品名称，每管中加入按表1配置的200µL预酶切液；用小铲从TE中取出胶块放在干净的培养皿上，用刀片切下2～2.5mm宽的胶块，放入相应的1.5mL离心管中，确保胶块在液面下面；将管子放在37℃水浴中孵育5～10min，弃去预酶切液；按表1配制酶切液，每管加入200µL酶切液，确保胶块在液面的下面，在37℃水浴中至少孵育2h。2.2.4.6加样限制性酶切后，将胶块从37℃水浴锅中取出，移去酶切缓冲液，加入200μL的24 0.5×TBE，室温平衡5min；将胶块从离心管中取出，加在梳子齿上，把标准菌株H9812加在第1、5、10、15个齿上，其余沙门菌样本胶块按顺序放好；吸掉过多的剩余缓冲液，在室温下风干约3min；把梳子放入胶槽，确保胶块正确放在梳子齿底部，且胶块与胶槽的底面相接触；缓慢将备好的1%SKG电泳胶倒入模具中，避免气泡的生成，如果有，用枪头消除，在室温下凝固30min。2.2.4.7脉冲场电泳检查电泳槽是否水平，如果不水平则调整电泳槽底部的旋钮。向电泳槽中加入2～2.2L0.5×TBE到，关上盖子；打开主机和泵的开关，打开冷凝机，设置温度为14℃；打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子；设置电泳参数：分离的片段范围为30～700Kbp，初始转换时间(initialswitchtime)为2.16s，终末转换时间(finalswitchtime)为63.8s，斜度(gradient)为6V/cm，角度(includedangle)为120°，电泳在0.5×TBE中持续18～19h，待电泳缓冲液冷却至14℃时开始电泳。记录电泳初始电流，通常为145～155mA；电泳结束后，取出凝胶，放掉电泳槽中0.5×TBE，用1～2L的超纯水清洗电泳槽，并倒掉液体，关闭PFGE电泳仪，关机顺序为冷凝机-泵-主机。2.2.4.8图像的获取取出凝胶，放在盛放400mLGelred染液的托盘内，染色20～30min；然后以500mL纯水脱色60～90min，每20～30min换一次纯水；最后用GelDocXR凝胶成像系统拍摄图像。2.2.4.9图像的数据分析以UPGMA方法（Unweightedpair-groupmeanarithmetic，UPGMA）进行聚类分析，菌株之间的差异程度用DICE相似性系数来确定。根据BioNumerics5.1分析软件绘制的菌株间关系的树状图，判定菌株间的亲缘关系。2.2.5统计学数据分析本研究数据需统计学分析，由GraphPad.Prism.v5.0进行处理，按照软件使用说明25 进行操作。26 3实验结果及分析3.1细菌分离鉴定结果本研究中采集的共计391份市场零售肉类样品（263份鸡肉样品及128份猪肉样品）按照方法中2.2.1.1-2.2.1.4所述操作，经预增菌处理、选择性增殖、显微镜观察、PCR扩增鉴定、生化实验及血清学鉴定等实验后，得到了共计279株沙门菌，其中26株为本研究所需的德比沙门菌，详细信息如表12所示。表12广东26株食品源德比沙门菌菌株信息菌株编号来源采样地采样时间菌株编号来源采样地采样时间SH15SF439食品源广州2015.9SH15SF296食品源云浮2015.9SH15SF194食品源广州2015.8SH15SF301食品源云浮2015.9SH15SF203食品源广州2015.8SH15SF302食品源云浮2015.9SH15SF204食品源广州2015.8SH15SF303食品源云浮2015.9SH15SF223食品源广州2015.8SH15SF133食品源广州2015.6SH15SF226食品源广州2015.8SH15SF136食品源广州2015.6SH15SF416食品源广州2015.9SH15SF137食品源广州2015.6SH15SF352食品源深圳2015.9SH15SF169食品源广州2015.8SH15SF354食品源深圳2015.9SH15SF170食品源广州2015.8SH15SF388食品源韶关2015.9SH15SF427食品源广州2015.9SH15SF389食品源韶关2015.9SH15SF212食品源广州2015.8SH15SF293食品源云浮2015.9SH15SF284食品源云浮2015.9SH15SF294食品源云浮2015.9SH15SF326食品源深圳2015.9由上述信息可知。本研究中在广东省的沙门菌在样品中的分离率为71.34%，而德比沙门菌占总体沙门菌的9.32%。因此，本研究中德比沙门菌菌株可分为三部分：从2014-2015年间上海分离的74株人源德比沙门菌；从2014-2015年间上海分离的59株动物性食品源德比沙门菌（57株食品源，2株动物源）；从2015-2016年间广东省分离到的26株动物性食品源德比沙门菌（26株食品源）。共159株德比沙门菌菌株详细27 信息如表1，表12所示；经详细信息统计结果如表13所示。表13共159株人源德比沙门菌菌株信息统计菌株编号来源采样地采样时间数量SH14G0067-SH14G1608人源上海市2013.9-2014.1274SH14SF004-SH14SF379动物性食品源上海市2014.1-2014.1159SH15SF133-SH15SF439动物性食品源广东省2015.6-2015.9263.2德比沙门菌药敏试验结果及分析3.2.1德比沙门菌菌株耐药情况本研究共对159株德比沙门菌进行16种抗生素的药敏试验检测，159株德比沙门菌经药敏试验后所得耐药性结果如表14所示；159株德比沙门菌经药敏试验后所得耐药性结果经统计后如表15所示。28 表14159株德比沙门菌药敏试验结果编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH14G0067rssrsrsissrsssrsSH14G0068rssssssssssssirsSH14G0097rirririrssrsrrrsSH14G0098rirrsisissrssrisSH14G0109rssssisissssssisSH14G0120rirririrssrsrrrsSH14G0123rirririrssrsrrrsSH14G0139rssssssssssssrrsSH14G0141rirririrsirsrrrsSH14G0142rirririrssrsrrrsSH14G0143rirririrssrsrrisSH14G0147rirririrssrsrrrsSH14G0148rirririrssrsrrrsSH14G0180rirrsrsssissirrsSH14G0208rirririrssrsrrrsSH14G0268rssssssssssssrrsSH14G0295rssssssssisssrrs29 编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH14G0319rssssssssssssrrsSH14G0320rssssssssssssrrsSH14G0331rssssssssssssrrsSH14G0341rssssssssisssrrsSH14G0406rssssssssisssrrsSH14G0425rsrrsrsssssssrrsSH14G0480rssssssssssssrrsSH14G0483rssssisisssssrisSH14G0564rssssssssssssrrsSH14G0573ssrrssssssrssrisSH14G0593rsssssssssssssisSH14G0603rsssirsrssssssrsSH14G0615rssssssssssssrrsSH14G0726rssssssssssssrrsSH14G0756ssssssssssssssisSH14G0784rssssisissssssisSH14G0807rssssisisisssrrsSH14G0815riirrsrisirsrrrs30 编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH14G0834sssssssisrssirisSH14G0848sirririrsirsrrrsSH14G0854rirririrssrsrrrsSH14G0856rirririrssrsrrrsSH14G0891rsrririrssrssrrsSH14G0908rssrsrsssirsirrsSH14G0918rrrrrrrrsirsrrrsSH14G0959rirrrrirsirsrrrsSH14G0972sirsirsissssrrrsSH14G0975rssssssrsssssrrsSH14G1028rssssisisssssiisSH14G1052rssssisssssssrrsSH14G1063rssssisisssssrisSH14G1125rssssssssssssrrsSH14G1170rssssrsisssssrisSH14G1180rsssssssssssiirsSH14G1205rssrsrssssrssrrsSH14G1206rssssssssssssirs31 编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH14G1232rssssssssssssrrsSH14G1235rirssssssisrsrrsSH14G1242sssssssssssssrisSH14G1248rirrssssssrssrisSH14G1263rssssssssssssiisSH14G1296rirrrrirssrsrrrsSH14G1320rssssssssisssrrsSH14G1391rssssisissssssrsSH14G1393rssssisisisssiisSH14G1404ririsisisssssrrsSH14G1470sirririrssrrsrrsSH14G1484rssssisisssssiisSH14G1492rirririrsirsrrrsSH14G1493rirrirsrsirsrrrsSH14G1498rssssssssssssrrsSH14G1545ssrrsrsrrrrirrrsSH14G1548sirrsrssrrrisrrsSH14G1568rrrsissisisssiis32 编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH14G1571rrrririrsirsrrrsSH14G1587rssssssssssssrrsSH14G1608rirrirsissrsrrrsSH14SF0004rssssssssssssirsSH14SF0024sssssssssssssrrsSH14SF0025sssssssssssssrrsSH14SF0048srrrrrrrsissrrrsSH14SF0059rrrrrrirsirsrrrsSH14SF0064rssssssssssssrrsSH14SF0065rssssssssssssrrsSH14SF0069rssssisisissiirsSH14SF0116ririirsrssssrrrsSH14SF0117ssssssssssssssisSH14SF0118ssssssssssssssisSH14SF0139rssssssssssssrrsSH14SF0142rssssssisssssrrsSH14SF0154rrrririrsrrrrrisSH14SF0156rssssssssssssrrs33 编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH14SF0207rirrirsrssrsrrrsSH14SF0208rsrrsiirsssssrrsSH14SF0209rssssisisssssrisSH14SF0210rirririrssrsrrisSH14SF0241sssrsrsrssssrsisSH14SF0242rssssisisssssrisSH14SF0243rsssssssssssssrsSH14SF0249rsssssssssssssisSH14SF0255rssssisisssssrisSH14SF0257rirririrssrsrrisSH14SF0258rirrirsrssssrrisSH14SF0260siriirirssssrrrsSH14SF0261rsssssssssssssisSH14SF0264rssssisisssssiisSH14SF0272rirririrssrsrrisSH14SF0274rssssssssssssrrsSH14SF0279rssssssrssssssisSH14SF0281rirririrssrsrris34 编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH14SF0282rsrriiirsssssrrsSH14SF0283rirririrssrsrrisSH14SF0284rirririrssrsrrisSH14SF0285rssssisisssssiisSH14SF0287rssssssrsssssrisSH14SF0291rsrrsrsrssrssrrsSH14SF0293rssssisrsssssiisSH14SF0295rsrssssisisssrrsSH14SF0296rssssisissssssisSH14SF0297rssssisrssssssisSH14SF0300rssrsisiisrssrisSH14SF0304rssssssssirsssisSH14SF0306rssssisissssssisSH14SF0307rssssisisssssiisSH14SF0308rssssisisssssiisSH14SF0333rssssssssisssrrsSH14SF0334rirrsisissrssrrsSH14SF0354sirrssssssrssris35 编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH14SF0357rssssisisssssiisSH14SF0359rssssrsisssssrisSH14SF0360rssssssisssssrrsSH14SF0361rirrrrrrsirsrrrsSH14SF0362rssssisisssssrisSH14SF0369rirriiirsssssrrsSH14SF0375rirrrrirssrsrrrsSH14SF0379rirrrrirssrsrrrsSH15SF439rirririrsissrrrsSH15SF194rirririrssissrrsSH15SF203rssssssrsssssrisSH15SF204rssssssrsssssrssSH15SF223rssssssisssssrrsSH15SF226rirririrssrsrrisSH15SF416rsriiiirssissrrsSH15SF352rirririrssrsrrrsSH15SF354rsrririrssrsrrrsSH15SF388rsrrsisissrssris36 编号TETAMCAMPSXTCIPCOFXNACFPCTXTMPCAZGENSIZSTRIMPSH15SF389rssssisississrisSH15SF293rsrrsrssssrssrisSH15SF294rssssisisisssrisSH15SF296rsrrsrssssrssrisSH15SF301rssisssssssssrisSH15SF302rirririrssrsrrisSH15SF303rsrrsrssssrssrisSH15SF133rssrsisrssrssrisSH15SF136sssssssisssssrisSH15SF137rssssssssssssrisSH15SF169rssssssssssssrrsSH15SF170rssssssssssssrrsSH15SF427rssssisssssssrisSH15SF212ssssississsssrrsSH15SF326rirririrssisirrsSH15SF284rssssssssssssris注：“r”是指药敏试验结果判定为耐药；“i”是指药敏试验结果判定为中度敏感；“s”是指药敏试验结果判定为敏感。表中抗生素简写对应为：青霉素类的氨苄西林“AMP”；头孢类的头孢噻肟“CTX”、头孢吡肟“CFP”、头孢他啶“CAZ”；碳青霉烯类的亚胺培南“IMP”；氨基糖苷类的庆大霉素“GEN”、37 链霉素“STR”；四环素类的四环素“TET”；酰氨醇类的氯霉素“C”；喹喏酮类的环丙沙星“CIP”、萘啶酸“NA”、氧氟沙星“OFX”；磺胺类的甲氧苄啶“TMP”、磺胺异恶唑“SIZ”；复方药物复方新诺明“SXT”、奥格门丁“AMC”。表15德比沙门菌耐药情况统计抗生素类别抗生素名称德比沙门菌耐药比例（%）缩写上海人源上海动物性食品源广东动物性食品源整体(n=74)(n=59)(n=26)(n=159)β-内酰胺类氨苄西林AMP43.2438.9846.1542.14（青霉素类）β-内酰胺类头孢噻肟CTX4.051.6902.52（头孢类）头孢吡肟CFP2.70001.26头孢他啶CAZ2.701.6901.89β-内酰胺类IMP000亚胺培南0.00（碳青霉烯类）氨基糖甙类庆大霉素GEN29.7328.8119.2327.67链霉素STR75.6845.7638.4658.49四环素类四环素TET87.8486.4492.3188.05酰氨醇类氯霉素C41.8932.2038.4637.7438 德比沙门菌耐药比例（%）抗生素类别抗生素名称缩写上海人源上海动物性食品源广东动物性食品源整体(n=74)(n=59)(n=26)(n=159)喹诺酮类萘啶酸NA31.0842.3742.3137.11环丙沙星CIP5.418.4705.66氧氟沙星OFX03.3901.26磺胺类甲氧苄啶TMP40.5428.8134.6235.22磺胺异恶唑SIZ79.7367.8010078.62复方奥格门丁AMC4.055.0803.77复方新诺明SXT43.2437.2946.1541.5139 由表15可知，德比沙门菌总体而言，耐药性最高的是四环素（88.05%）和磺胺异恶唑（78.62%），其次是链霉素（58.49%），氨苄西林（42.14%），复方新诺明（41.15%），氯霉素（37.74%），萘啶酸（37.11%），甲氧苄啶（35.22%），庆大霉素（27.67%），环丙沙星（5.66%），奥格门丁（3.77%），头孢噻肟（2.52%），头孢他啶（1.89%），氧氟沙星（1.26%），头孢吡肟（1.26%）。其中，159株德比沙门菌未有一株对亚胺培南耐药。其中，来自上海的133株德比沙门菌耐药性由高到低依次是：四环素（87.22%），磺胺异恶唑（74.44%），链霉素（62.41%），氨苄西林（41.35%），复方新诺明（40.60%），氯霉素（37.59%），萘啶酸（36.09%），甲氧苄啶（35.34%），庆大霉素（29.32%），环丙沙星（6.77%），奥格门丁（4.51%），氧氟沙星（3.01%），头孢噻肟（3.01%），头孢他啶（2.26%），头孢吡肟（1.50%）。人源部分耐药程度由高到低依次为：四环素（87.84%），磺胺异恶唑（79.73%），链霉素（75.68%），氨苄西林（43.24%），复方新诺明（43.24%），氯霉素（41.89%），甲氧苄啶（40.54%），萘啶酸（31.08%），庆大霉素（29.73%），环丙沙星（5.41%），头孢噻肟（4.05%），奥格门丁（4.05%），头孢吡肟（2.70%），头孢他啶（2.70%）氧氟沙星和亚胺培南未见耐药；而动物性食品源部分由高到低为为：四环素（86.44%），磺胺异恶唑（67.80%），链霉素（45.76%），萘啶酸（42.37%），氨苄西林（38.98%），复方新诺明（37.29%），氯霉素（32.2%），庆大霉素（28.81%），甲氧苄啶（28.81%），环丙沙星（8.47%），奥格门丁（5.08%），氧氟沙星（3.39%），头孢噻肟（1.69%），头孢他啶（1.69%），头孢吡肟和亚胺培南未见耐药。来自广东的26株德比沙门菌耐药性由高到低依次是：磺胺异恶唑（100%），四环素（92.31%），氨苄西林（46.15%），复方新诺明（46.15%），萘啶酸（42.31%），链霉素（38.46%），氯霉素（38.46%），甲氧苄啶（34.62%），庆大霉素（19.23%），头孢噻肟，头孢吡肟，头孢他啶，亚胺培南，环丙沙星，氧氟沙星和奥格门丁菌未见耐药情况。3.2.2德比沙门菌菌株耐药结果分析经统计，对比广东省德比沙门菌菌群及上海市德比沙门菌菌群的耐药性可得知：广东省德比沙门菌菌群对所检测的16种抗生素中的9种有耐药性，而上海市的菌群对15种抗生素有耐药性，其中头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶、环丙沙星、氧氟沙40 星和奥格门丁这6种抗生素在广东省菌群中不具有耐药性，而上海市的菌群中却具有耐药性；而广东省菌群对于磺胺异恶唑的耐药性（100%）显著高于上海市菌群对于磺胺异恶唑的耐药性（74.44%），但对于链霉素的耐药性（38.46%）却显著低于上海市菌群对于链霉素的耐药性（62.41%）（经t-检验均为p<0.05，差异显著）。在检测的16种抗生素中，广东的德比沙门菌菌群及上海的德比沙门菌菌群对其中8种抗生素的耐药性存在明显差异，说明这两个菌群的耐药性差别较大，上海整体的德比沙门菌对于大多数抗生素的耐药性比广东德比沙门菌的耐药性更强。德比沙门菌菌群中存在不同来源的菌群对同种抗生素耐药情况有差异的情况。对不同来源（即上海市人源与动物性食品源）德比沙门菌的同种抗生素产生耐药性的菌株比例进行统计学t-检验（有16种抗生素，共检验16次），得到存在差异的结果为：同为上海的德比沙门菌菌群，人源相比动物性食品源菌群在链霉素上差异较大，对两个菌群的链霉素耐药性比例进行分析，差异极显著（p<0.01）。德比沙门菌菌群中同样存在不同地域的菌群对同种抗生素耐药情况有差异的情况。对不同地域（即上海动物性食品源与广东动物性食品源）德比沙门菌的同种抗生素产生耐药性的菌株比例进行统计学T-检验（有16种抗生素，共检验16次），得到存在差异的结果为：磺胺异恶唑两地同源菌株耐药性存在差别，广东动物性食品源菌群磺胺异恶唑耐药性（100%）相比于上海动物性食品源菌群磺胺异恶唑耐药性（67.80%）差异较大，根据T-检验对两个菌群的磺胺异恶唑抑菌圈直径大小进行分析，差异极显著（p<0.01）；且相比于上海的动物性食品源德比沙门菌菌群在本研究中对14种抗生素存在耐药性，广东的动物性食品源菌群在环丙沙星、奥格门丁、氧氟沙星、头孢噻肟、头孢他啶这四种抗生素上尚未见耐药情况，仅对9种抗生素存在耐药性，广东菌群对抗生素产生耐药性的种类比同源的上海菌群少。3.2.3德比沙门菌多重耐药统计及分析得出德比沙门菌耐药性结果后，进而由每株菌对不同抗生素的耐药性情况可归纳出德比沙门菌的耐药模式谱，具体统计结果如表16，表17和表18所示。表16为上海74株人源德比沙门菌经归纳统计后得到的耐药模式谱。表17为上海59株动物性食品源德比沙门菌经归纳统计后得到的耐药模式谱。表18为广东26株动物性食品源德比沙门菌经归纳统计后得到的耐药模式谱。41 表16上海人源德比沙门菌（n=74）耐药模式谱耐药模式重数菌株数耐药模式型空01无SIZ11R1ATET17R1BCTX-SIZ21R2ASIZ-TET22R2BSTR-TET24R2CAMC-AMP-TET31R3AC-SIZ-TET31R3BSIZ-STR-TET319R3CAMP-SIZ-STR-TET41R4AAMP-SXT-TMP-SIZ41R4BC-NA-STR-TET41R4CNA-SIZ-STR-TET41R4DAMP-CAZ-SIZ-STR-TET51R5AAMP-C-GEN-SIZ-STR51R5BAMP-SXT-TMP-SIZ-TET52R5CSXT-C-TMP-STR-TET51R5DAMP-SXT-C-SIZ-STR-TET62R6ASXT-C-TMP-SIZ-STR-TET62R6BAMP-SXT-C-NA-TMP-CAZ-SIZ-STR81R8AAMP-SXT-C-CFP-CTX-TMP-SIZ-STR81R8BAMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR81R8CAMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-TET81R8DAMP-SXT-C-NA-TMP-SIZ-STR-TET81R8EAMP-SXT-C-TMP-GEN-SIZ-STR-TET81R8FSXT-CIP-OFX-TMP-GEN-SIZ-STR-TET81R8GAMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET912R9A42 AMC-AMP-SXT-CIP-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET101R10AAMC-AMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET103R10BAMP-SXT-C-NA-CFP-CTX-TMP-GEN-SIZ-STR101R10C注：表中抗生素简写对应为：青霉素类的氨苄西林“AMP”；头孢类的头孢噻肟“CTX”、头孢吡肟“CFP”、头孢他啶“CAZ”；碳青霉烯类的亚胺培南“IMP”；氨基糖苷类的庆大霉素“GEN”、链霉素“STR”；四环素类的四环素“TET”；酰氨醇类的氯霉素“C”；喹喏酮类的环丙沙星“CIP”、萘啶酸“NA”、氧氟沙星“OFX”；磺胺类的甲氧苄啶“TMP”、磺胺异恶唑“SIZ”；复方药物复方新诺明“SXT”、奥格门丁“AMC”。表17上海动物性食品源德比沙门菌（n=59）耐药模式谱耐药模式重数菌株数耐药模式型空02无TET19R1ANA-TET23R2DSIZ-STR22R2ESIZ-TET24R2BSTR-TET23R2CTMP-TET21R2FC-SIZ-TET31R3BNA-SIZ-TET31R3DSIZ-STR-TET38R3CAMP-SIZ-STR-TET41R4AAMP-SXT-TMP-SIZ41R4BSXT-C-NA-GEN41R4ESXT-TMP-SIZ-TET41R4FAMP-C-NA-GEN-SIZ-STR61R6CAMP-SXT-NA-SIZ-STR-TET63R6DAMP-SXT-TMP-SIZ-STR-TET61R6EAMP-C-NA-GEN-SIZ-STR-TET71R7AAMP-SXT-C-NA-GEN-SIZ-TET71R7B43 AMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-TET86R8DAMP-SXT-C-NA-TMP-SIZ-STR-TET81R8EAMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET91R9AAMC-AMP-SXT-CIP-C-OFX-NA-GEN-SIZ-STR101R10CAMP-SXT-CIP-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET102R10DAMC-AMP-SXT-CIP-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET111R11AAMC-AMP-SXT-C-NA-CTX-TMP-CAZ-GEN-SIZ-TET111R11BAMP-SXT-CIP-C-OFX-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET111R11C注：表中抗生素简写对应为：青霉素类的氨苄西林“AMP”；头孢类的头孢噻肟“CTX”、头孢吡肟“CFP”、头孢他啶“CAZ”；碳青霉烯类的亚胺培南“IMP”；氨基糖苷类的庆大霉素“GEN”、链霉素“STR”；四环素类的四环素“TET”；酰氨醇类的氯霉素“C”；喹喏酮类的环丙沙星“CIP”、萘啶酸“NA”、氧氟沙星“OFX”；磺胺类的甲氧苄啶“TMP”、磺胺异恶唑“SIZ”；复方药物复方新诺明“SXT”、奥格门丁“AMC”。表18广东动物性食品源德比沙门菌（n=26）耐药模式谱耐药模式重数菌株数耐药模式型SIZ11R1ASIZ-STR21R2ETET-SIZ26R2BTET-NA-SIZ32R3DTET-SIZ-STR33R3CTET-SXT-TMP-SIZ-AMP51R5CTET-SXT-NA-TMP-SIZ51R5ETET-NA-SIZ-STR-AMP51R5FTET-SXT-C-TMP-SIZ-AMP63R6FTET-SXT-C-NA-SIZ-STR-AMP72R7CTET-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-AMP82R8DTET-SXT-C-NA-GEN-SIZ-STR-AMP81R8HTET-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-AMP92R9A注：表中抗生素简写对应为：青霉素类的氨苄西林“AMP”；头孢类的头孢噻肟“CTX”、头孢44 吡肟“CFP”、头孢他啶“CAZ”；碳青霉烯类的亚胺培南“IMP”；氨基糖苷类的庆大霉素“GEN”、链霉素“STR”；四环素类的四环素“TET”；酰氨醇类的氯霉素“C”；喹喏酮类的环丙沙星“CIP”、萘啶酸“NA”、氧氟沙星“OFX”；磺胺类的甲氧苄啶“TMP”、磺胺异恶唑“SIZ”；复方药物复方新诺明“SXT”、奥格门丁“AMC”。根据表16结果，上海市74株人源德比沙门菌中，有30个耐药模式，58株菌为多重耐药（Multidrug-resistance，MDR）菌株（对3种以上抗生素耐药），占78.38%，比例最高的多重耐药模式为“SIZ-STR-TET”共19株（25.68%）和“AMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET”共12株（16.22%），而多重耐药性最严重的菌株达到10重耐药。根据表17结果，上海市59株动物性食品源德比沙门菌中，有27个耐药模式，35株菌为多重耐药菌株，占59.32%，比例最高的多重耐药模式为“SIZ-STR-TET”共8株（13.56%）和“AMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-TET”共6株（10.17%），而多重耐药性最严重的菌株达到11重耐药。根据表18结果，广东省26株动物性食品源德比沙门菌中，有13个耐药模式，18株菌为多重耐药菌株，占69.23%，各耐药模式菌株分布较均衡，而多重耐药性最严重的菌株达到9重耐药。总体159株德比沙门菌而言，有156株菌株（98.11%）起码对一种抗生素具有耐药性，在有耐药性的菌株中总共有50个耐药模式，有111株为多重耐药菌株，占69.81%，比例最高的多重耐药模式为“SIZ-STR-TET”共30株（18.87%）其次几个较为常见的耐药模式为“TET-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-AMP”15株（9.43%），“TET-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-AMP”9株（5.66%）。而多重耐药性最严重的菌株达到11重耐药，为模式不同的三株，均来自上海动物性食品源德比沙门菌菌群，提示该菌群多重耐药情况最为严重且复杂。此外，上海市总体菌群（包括人源及动物性食品源）的优势耐药模式为“SIZ-STR-TET”和“AMP-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-TET”，而广东省菌群的优势耐药模式为“TET-SIZ”，且上述多重耐最严重的3个菌株均来自上海市，提示上海德比沙门菌菌群的多重耐药性比广东省菌群严重。45 3.2.4德比沙门菌耐药情况小结在耐药性方面，总体德比沙门菌菌群对四环素、磺胺异恶唑和链霉素具有很高的耐药比例，且绝大多数菌株对至少一种抗生素有耐药性；其中，来自广东的菌群对磺胺异恶唑的耐药情况尤为严重，达到100%。上海及广东两个菌群的耐药性差别较大，上海整体的德比沙门菌对于大多数抗生素的耐药性比广东德比沙门菌的耐药性更强。德比沙门菌菌群中存在不同地域或不同来源的菌群对同种抗生素耐药情况有差异的情况，提示不同地域或不同来源可能对菌群的耐药情况有影响。而在多重耐药性放面，3重及3重以上耐药的菌株达到总体菌群比例的69.81%，出现频率最高的多重耐药模式为“SIZ-STR-TET”、“TET-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-STR-AMP”和“TET-SXT-C-NA-TMP-GEN-SIZ-AMP”；上海德比沙门菌菌群的多重耐药性比广东省菌群严重，其中来自上海市的动物性食品源德比沙门菌菌群多重耐药情况最为严重且复杂。3.3德比沙门菌毒力基因检测结果3.3.1毒力基因携带情况本研究对159株德比沙门菌进行了毒力基因检测，共检测10种基因，分别为毒力岛基因avrA、ssaQ、mgtC、siiD、sopB，噬菌体源毒力基因gipA、sodC1、sopE，质粒源毒力基因spvC和编码菌毛的毒力基因bcfC。全部159株经PCR扩增检测后所得毒力基因检测结果如表19所示；而经统计后的结果如表20所示。46 表19毒力基因检测结果菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH14G0067+++++-++-+SH14G0068+++++-++-+SH14G0097+++++-++-+SH14G0098+++++-++-+SH14G0109+++++-++-+SH14G0120+++++-++-+SH14G0123++-+++++-+SH14G0139++++++++-+SH14G0141+++++-++-+SH14G0142+++++-++-+SH14G0143+++++-++-+SH14G0147+++++-++-+SH14G0148++-++-++-+SH14G0180+++++-++-+SH14G0208+++++-++-+SH14G0268+++++-++-+SH14G0295+++++-++-+47 菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH14G0319++++--++-+SH14G0320+++-+-++-+SH14G0331+++++-++-+SH14G0341+++++-++-+SH14G0406+++++-++-+SH14G0425+++++-++-+SH14G0480+++++-++-+SH14G0483+++++-++-+SH14G0564+++++-++-+SH14G0573+++++-++-+SH14G0593+++++-++-+SH14G0603+++++-++-+SH14G0615+++++-++-+SH14G0726+++++-++-+SH14G0756+++++-++-+SH14G0784+++++-++-+SH14G0807+++++-++-+SH14G0815+++++-++-+48 菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH14G0834+++++--+-+SH14G0848+++++-++-+SH14G0854++++++++-+SH14G0856+++++-++-+SH14G0891+++++-++-+SH14G0908+++++--+-+SH14G0918+++++-++-+SH14G0959+++++-++-+SH14G0972+++++-++-+SH14G0975+++++-++-+SH14G1028+++++-++-+SH14G1052++-++-++-+SH14G1063++++++++-+SH14G1125++++++++-+SH14G1170+++---++-+SH14G1180+++++-++-+SH14G1205+++++-++-+SH14G1206+++++-++-+49 菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH14G1232+++++-++-+SH14G1235+++++-++-+SH14G1242+++++-++-+SH14G1248+++++-++-+SH14G1263+++++-++-+SH14G1296+++++-++-+SH14G1320+++++-++-+SH14G1391+++++-++-+SH14G1393+++++-++-+SH14G1404+++++-++-+SH14G1470+++++-++-+SH14G1484+++++-++-+SH14G1492+++++-++-+SH14G1493+++++-++-+SH14G1498+++++-++-+SH14G1545+++++-++-+SH14G1548+++++-++-+SH14G1568+++++-+--+50 菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH14G1571+++++-++-+SH14G1587+++++-++-+SH14G1608+++++-++-+SH14SF0004+++++-++-+SH14SF0024+++++-++-+SH14SF0025+++++-++-+SH14SF0048+++++-++-+SH14SF0059+++++-++-+SH14SF0064+++++-++-+SH14SF0065+++++-++-+SH14SF0069+++++-++-+SH14SF0116+++++-++-+SH14SF0117+++++--+-+SH14SF0118+++++-++-+SH14SF0139+++++-++-+SH14SF0142+++++--+-+SH14SF0154+++++-++-+SH14SF0156+++++-++-+51 菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH14SF0207+++++-++-+SH14SF0208+++++-++-+SH14SF0209+++++-++-+SH14SF0210+++++-++-+SH14SF0241+++++-++-+SH14SF0242+++++-++-+SH14SF0243+++++-++-+SH14SF0249+++++-++-+SH14SF0255+++++-++-+SH14SF0257++++--++-+SH14SF0258+++++--+-+SH14SF0260+++++-++-+SH14SF0261+++++-++-+SH14SF0264+++++-++-+SH14SF0272+++++-++-+SH14SF0274+++++-++-+SH14SF0279+++++-++-+SH14SF0281+++++-++-+52 菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH14SF0282+++++-++-+SH14SF0283+++++-++-+SH14SF0284+-+++-+--+SH14SF0285+++++-++-+SH14SF0287+++++++-++SH14SF0291+++++-++-+SH14SF0293+++++-++-+SH14SF0295+++++-++-+SH14SF0296++++++++-+SH14SF0297+++++-++-+SH14SF0300+++++-++-+SH14SF0304+++++-+--+SH14SF0306+++++-++-+SH14SF0307+++++--+-+SH14SF0308+++++-++-+SH14SF0333+++++-++-+SH14SF0334+++++--+-+SH14SF0354+++++-++-+53 菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH14SF0357+++++-++-+SH14SF0359+++++-++-+SH14SF0360+++++-++-+SH14SF0361+++++-++-+SH14SF0362+++++-++-+SH14SF0369+++++-++-+SH14SF0375+++++-++-+SH14SF0379+++++-++-+SH15SF439+++++-++-+SH15SF194+++++-++-+SH15SF203+++++-++-+SH15SF204+++++-++-+SH15SF223+++++-++-+SH15SF226+++++-++-+SH15SF416+++++-++-+SH15SF352+++++-++-+SH15SF354+++++-++-+SH15SF388+++++-++-+54 菌株编号avrAssaQmgtCsiiDsopBgipAsodC1sopEspvCbcfCSH15SF389+++++-++-+SH15SF293+++++-++-+SH15SF294+++++-++-+SH15SF296+++++-++-+SH15SF301+++++-++-+SH15SF302+++++-++-+SH15SF303+++++-++-+SH15SF133+++++-++-+SH15SF136+++++-+--+SH15SF137+++++-++-+SH15SF169+++++-++-+SH15SF170+++++-++-+SH15SF427+++++-++-+SH15SF212+++++-++-+SH15SF326+++++-++-+SH15SF284+++++-++-+注：“+”是指检测结果为阳性，即携带；“-”是指检测结果为阴性，即不携带。其中，所检测的毒力基因分别为毒力岛基因“avrA”、“ssaQ”、“mgtC”、“siiD”、“sopB”，噬菌体源毒力基因“gipA”、“sodC1”、“sopE”，质粒源毒力基因“spvC”和编码菌毛的毒力基因“bcfC”。55 表20毒力基因携带情况统计德比沙门菌毒力基因携带率目的基因所在位置上海人源上海动物性食品源广东动物性食品源整体(n=74)(n=59)(n=26)(n=159)avrA毒力岛100.00%100.00%100.00%100.00%ssaQ毒力岛100.00%98.31%100.00%99.37%mgtC毒力岛95.95%100.00%100.00%98.11%siiD毒力岛97.30%100.00%100.00%98.74%sopB毒力岛97.30%98.31%100.00%98.11%gipA噬菌体6.76%3.39%0.00%4.40%sodC1噬菌体97.30%91.53%100.00%95.60%sopE噬菌体98.65%94.92%96.15%96.86%spvC质粒0.00%1.69%0.00%0.63%bcfC菌毛100.00%100.00%100.00%100.00%由表20结果可知，德比沙门菌整体菌群携带毒力基因比例最高的为avrA（100%）和bcfC（100%），其次为ssaQ（99.37%）、siiD（98.74%）、mgtC（98.11%）、sopB（98.11%）、sopE（96.86%）、sodC1（95.60%）、gipA（4.40%），携带率最低的是spvC（0.63%）。3.3.2毒力基因检测结果分析avrA，ssaQ，mgtC，siiD，sopB，sodC1，sopE，bcfC这8个毒力基因在德比沙门菌菌群中携带率均在94%-100%之间，携带率极高，携带情况非常普遍。其中，存在值得注意的是广东省德比沙门菌菌群和上海市德比沙门菌菌群在噬菌体源gipA基因上存在差异，上海德比沙门菌菌群人源（6.76%）与动物性食品源（3.39%）均有少量携带，但广东的菌群携带率为0%；此外，上海德比沙门菌菌群还出现了一株携带质粒源spvC基因的菌株。上述情况提示上海德比沙门菌的毒力基因携带种类多于广东德比沙门菌菌群，可能导致上海德比沙门菌菌群致病力相比于广东菌群更加强与复杂。56 3.3.3毒力基因模式统计得出德比沙门菌毒力基因携带结果后，进而可由每株菌携带的不同毒力基因情况归纳统计出德比沙门菌的毒力基因模式谱，具体如表21，表22和表23所示。表21为归纳统计出的上海74株人源德比沙门菌毒力基因携带模式谱。表22为归纳统计出的上海59株动物性食品源德比沙门菌毒力基因携带模式谱。表23为归纳统计出的广东26株动物性食品源德比沙门菌毒力基因携带模式谱。表21上海人源德比沙门菌（n=74）毒力基因模式谱毒力基因模式菌株数毒力基因模式型avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC61VHavrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-gipA-sodC1-sopE-bcfC4VB2avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sopE-bcfC2VCavrA-ssaQ-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC2VEavrA-ssaQ-siiD-sopB-gipA-sodC1-sopE-bcfC1VB1avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-bcfC1VD1avrA-ssaQ-mgtC-sopB-sodC1-sopE-bcfC1VF1avrA-ssaQ-mgtC-sodC1-sopE-bcfC1VF2avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sodC1-sopE-bcfC1VG1注：所检测的毒力基因分别为毒力岛基因“avrA”、“ssaQ”、“mgtC”、“siiD”、“sopB”，噬菌体源毒力基因“gipA”、“sodC1”、“sopE”，质粒源毒力基因“spvC”和编码菌毛的毒力基因“bcfC”。表22上海动物性食品源德比沙门菌（n=59）毒力基因模式谱毒力基因模式菌株数毒力基因模式型avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC49VHavrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sopE-bcfC5VCavrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-gipA-sodC1-spvC-bcfC1VAavrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-gipA-sodC1-sopE-bcfC1VB2avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-bcfC1VD1avrA-mgtC-siiD-sopB-sodC1-bcfC1VD2avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sodC1-sopE-bcfC1VG157 注：所检测的毒力基因分别为毒力岛基因“avrA”、“ssaQ”、“mgtC”、“siiD”、“sopB”，噬菌体源毒力基因“gipA”、“sodC1”、“sopE”，质粒源毒力基因“spvC”和编码菌毛的毒力基因“bcfC”。表23广东动物性食品源德比沙门菌（n=26）毒力基因模式谱毒力基因模式菌株数毒力基因模式型avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC25VHavrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-bcfC1VD1注：所检测的毒力基因分别为毒力岛基因“avrA”、“ssaQ”、“mgtC”、“siiD”、“sopB”，噬菌体源毒力基因“gipA”、“sodC1”、“sopE”，质粒源毒力基因“spvC”和编码菌毛的毒力基因“bcfC”。由表21可知，上海人源德比沙门菌毒力基因模式型存在数量由高到低依次为VH、VB2、VC、VE、VB1、VD1、VF1、VF2及VG1。由表22可知，上海动物性食品源德比沙门菌毒力基因模式型存在数量由高到低依次为VH、VC、VA、VB2、VD1、VD2、VG1。由表23可知，广东动物性食品源德比沙门菌毒力基因模式型存在数量由高到低依次为VH、VD1。3.3.3德比沙门菌毒力基因模式统计分析上海人源德比沙门菌毒力基因模式有9种，动物性食品源德比沙门氏毒力基因模式有7种，而广东的德比沙门菌菌群毒力基因模式相对较少，仅有2种。总体统计，159株德比沙门菌中VH型携带模式“avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC”占绝大部分，数量为135株，比例为84.91%。上海德比沙门菌菌群毒力基因模式更为复杂，但优势毒力基因模式型与广东一致。3.3.4毒力基因检测情况小结总体菌群而言，绝大多数菌株都携带有毒力岛基因avrA、siiD、mgtC、sopB及ssaQ，噬菌体源基因sodC1、sopE和菌毛编码基因bcfC。其中上海德比沙门菌的毒力基因携带种类多于广东德比沙门菌菌群，可能导致致病力差异更加复杂。在毒力基因携带模式方面，总体菌群中VH型携带模式“avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC”占绝大部分；其中，上海德比沙门菌菌群毒力基因模式更为复杂，但优势毒力基因模式型与广东一致。58 3.4德比沙门菌质粒不相容群检测结果3.4.1质粒不相容群检测结果本研究在159株德比沙门菌上共检测18个质粒不相容群，分别为：IncHI1,IncHI2,IncX,IncI1,IncL/M,IncN,IncFIA,IncFIB,IncY,IncW,IncP,IncFIC,IncA/C,IncT,IncFrepB,IncK/B,IncB/O和IncFII。经PCR扩增检测后得到如表24所示的159株德比沙门菌18个质粒不相容群检测结果；及经统计后如表25所示的质粒不相容群携带情况统计。59 表24PCR扩增质粒不相容群检测结果菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH14G0067--+--------+------SH14G0068------+-----------SH14G0097------+------+----SH14G0098------+----+------SH14G0109------+----+------SH14G0120------++--+--+----SH14G0123------++--+-------SH14G0139------+---+-------SH14G0141------+-----------SH14G0142------------------SH14G0143------------------SH14G0147------------------SH14G0148------+---+-------SH14G0180------+-----------SH14G0208------+-----------SH14G0268----------+-------SH14G0295----------+-------60 菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH14G0319------+---+-------SH14G0320--+-------+-------SH14G0331----------+-------SH14G0341----------+-------SH14G0406------+---+-------SH14G0425------+---+-------SH14G0480------+---+-------SH14G0483------++---+------SH14G0564----------+-------SH14G0573----------+-------SH14G0593------+-----------SH14G0603-----------+------SH14G0615----------+----+--SH14G0726----------+-------SH14G0756------+---+-------SH14G0784------+----+------SH14G0807------+----+------SH14G0815------+-----------61 菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH14G0834------++--++------SH14G0848------++----------SH14G0854------++----------SH14G0856------------------SH14G0891----------+-------SH14G0908------------------SH14G0918------++--+--+----SH14G0959----------+-------SH14G0972------++----------SH14G0975-----------+------SH14G1028--+---+----+------SH14G1052------+---+-------SH14G1063------+----+------SH14G1125------+---+-------SH14G1170-----------+------SH14G1180------------------SH14G1205------+-----------SH14G1206------++--+----+--62 菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH14G1232----------+----+--SH14G1235--+---+---+----+--SH14G1242------------------SH14G1248------++---+------SH14G1263------------------SH14G1296------+-----------SH14G1320------++--+----+--SH14G1391-----------+------SH14G1393-----------+------SH14G1404++----++--+-------SH14G1470----------+-------SH14G1484-----------+------SH14G1492----------+-------SH14G1493------++----------SH14G1498----------+-------SH14G1545--+---------------SH14G1548--+--------+------SH14G1568++---------+------63 菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH14G1571------++----------SH14G1587------++--+-------SH14G1608------++--+-------SH14SF0004------++---+------SH14SF0024------------------SH14SF0025------++----------SH14SF0048------------------SH14SF0059------++----------SH14SF0064----------+-------SH14SF0065----------+-------SH14SF0069-----------+------SH14SF0116------------------SH14SF0117------------------SH14SF0118------++----------SH14SF0139------++--+-------SH14SF0142------++----------SH14SF0154--+---------------SH14SF0156------++--+-------64 菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH14SF0207------++----------SH14SF0208+++---++--+-------SH14SF0209-----------+------SH14SF0210------------------SH14SF0241++----------------SH14SF0242-----------+------SH14SF0243----------+-------SH14SF0249------------------SH14SF0255-----------+------SH14SF0257------------------SH14SF0258++----+-----------SH14SF0260------------------SH14SF0261------+--------+--SH14SF0264--+---++---+------SH14SF0272------+---+-------SH14SF0274------+---+-------SH14SF0279-----------+------SH14SF0281------+-----------65 菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH14SF0282++----------------SH14SF0283------------------SH14SF0284------++--+-------SH14SF0285++---------+------SH14SF0287------++--+---+---SH14SF0291------------------SH14SF0293------+----+------SH14SF0295++----------------SH14SF0296------+----+------SH14SF0297-----------+------SH14SF0300------+----+------SH14SF0304---------+--------SH14SF0306------+----+------SH14SF0307-----------+------SH14SF0308------++---+------SH14SF0333----------+-------SH14SF0334------+----+------SH14SF0354------------------66 菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH14SF0357--+---+----+------SH14SF0359--+--------+------SH14SF0360-+----------------SH14SF0361------+---+-------SH14SF0362------+----+------SH14SF0369++----------------SH14SF0375------+---+-------SH14SF0379------------------SH15SF439----------+-------SH15SF194--+---+---+-------SH15SF203++----+----+------SH15SF204++--------+------SH15SF223------+---+-------SH15SF226------------------SH15SF416++----------------SH15SF352------------------SH15SF354------------------SH15SF388------+----+------67 菌株编号HI1HI2I1XL/MNFIAFIBWYPFICA/CTFIIsFrepBK/BB/OSH15SF389------+----+------SH15SF293------+-----------SH15SF294------+----+------SH15SF296-----------------SH15SF301------+----+------SH15SF302-----------------SH15SF303------+-----------SH15SF133------+----+------SH15SF136------+-----------SH15SF137------------------SH15SF169----------+-------SH15SF170----------+-------SH15SF427------------------SH15SF212------++--++------SH15SF326------------------SH15SF284------+-----------注：“+”是指检测结果为阳性，即携带；“-”是指检测结果为阴性，即不携带。68 表25质粒不相容群携带情况质粒不相容群携带率a+b.上海整体a.上海人源b.上海动物c.广东动物性b+c.整体动物a+b+c.整目的基因（n=133）(n=74)性食品源食品源性食品源体(n=59)(n=26)（n=85）(n=159)HI16.77%2.70%11.86%11.54%11.76%7.55%HI27.52%2.70%13.56%11.54%12.94%8.18%I18.27%8.11%8.47%3.85%7.06%7.55%X0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%L/M0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%N0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%FIA51.13%55.41%45.76%50.00%47.06%50.94%FIB21.80%21.62%22.03%3.85%16.47%18.87%W0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%Y0.75%0.00%1.69%0.00%1.18%0.63%P35.34%45.95%22.03%23.08%22.35%33.33%FIC27.82%24.32%32.20%30.77%31.76%28.30%A/C0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%T2.26%4.05%0.00%0.00%0.00%1.89%FIIs0.75%0.00%1.69%0.00%1.18%0.63%FrepB4.51%6.76%1.69%0.00%1.18%3.77%K/B0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%B/O0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%由表25可知，德比沙门菌总体统计可知，159株菌的菌群携带有11个质粒不相容群，携带情况从高到低依次为：FIA(50.94%)，P(33.33%)，FIC(28.30%)，FIB(18.87%)，HI2(8.18%)，HI1(7.55%)，I1(7.55%)，FrepB(3.77%)，T(1.89%)，Y(0.63%)，FIIs(0.63%)，其余质粒群尚未发现。上海人源德比沙门菌菌群携带有8个质粒不相容群，情况从高到低依次为：69 FIA(55.41%)，P(45.95%)，FIC(24.32%)，FIB(21.62%)，FrepB(6.76%)，T(4.05%)，HI1(2.70%)，HI2(2.70%)，其余质粒不相容群均未发现携带情况。上海动物性食品源德比沙门菌菌群携带有9个质粒不相容群，携带情况从高到低依次为：FIA(45.76%)，FIC(32.20%)，FIB(22.03%)，P(22.03%)，HI1(11.86%)，I1(8.47%)，Y(1.69%)，FIIs(1.69%)，FrepB(1.69%)，其余质粒群均未发现携带情况。广东动物性食品源德比沙门菌菌群携带有7个质粒不相容群，携带情况从高到低依次为：FIA(50.00%)，FIC(30.77%)，P(23.08%)，HI1(11.54%)，HI2(11.54%)，I1(3.85%)，FIB(3.85%)，其他质粒群均未发现有携带情况。3.4.2德比沙门菌质粒不相容群携带情况统计分析对比三个菌群后发现，上海人源菌群主要携带质粒不形容群为：FIA，P，FIC，FIB；上海动物性食品源菌群主要携带质粒不形容群为：FIA，FIC，FIB，P，HI1，I1；而广东动物性食品源德比沙门菌菌群主要携带质粒不形容群为：FIA，FIC，P，HI1，HI2。这三个菌群主要携带的质粒群存在差别。其中，值得注意的是，存在不同源或不同地域的质粒不相容群携带率有差别的情况。不同源影响：广东动物性食品源菌群HI1（11.54%），HI2（11.54%）质粒不相容群携带率与上海动物性食品源菌群相近（HI1为11.86%，HI2为13.56%），但却是人源HI1（2.70%），HI2（2.70%）携带率的约4倍，经T-检验，差异均显著（p<0.05）；广东动物性食品源菌群P（23.08%）质粒不相容群携带率与上海动物性食品源菌群相近（P为22.03%），但却是人源P（45.95%）携带率的约1/2，经T-检验，差异极显著（p<0.01）；广东动物性食品源菌群与上海动物性食品源菌群均不携带T质粒群，但上海人源的T质粒群存在携带的情况（3株，4.05%）。不同地域影响：上海的人源与动物性食品源菌群对于FIB质粒群的携带情况相近，为21.62%与22.03%，均为广东菌群携带率3.85%的约7倍，经T-检验，差异显著（p<0.05）；上海的人源与动物性食品源菌群对于FrepB质粒群均有携带的情况，但在广东菌群却未发现携带。此外，还发现Y和FIIs只存在上海的动物性食品源德比沙门菌菌群中的情况。3.4.3质粒不相容群携带模式统计得出德比沙门菌质粒不相容群携带结果后，进而可由每一株菌株质粒不相容群的携带情况归纳统计出德比沙门菌的质粒不相容群携带模式谱，具体如表26，表27和表28所示。表26为归纳统计出的上海74株人源德比沙门菌质粒不相容携带模式谱；70 表27为归纳统计出的上海59株动物性食品源德比沙门菌质粒不相容携带模式谱。表28为归纳统计出的广东26株动物性食品源德比沙门菌质粒不相容携带模式谱。表26上海人源德比沙门菌（n=74）质粒不相容群携带模式谱质粒不相容群携带模式重数模式型菌株数空0PL8I11PG32FIC1PI26FIA1PJ28P1PK12FIA-T2PC11P-FrepB2PD12I1-FIC2PG12I1-P2PG21FIA-FIB2PH25FIA-FIC2PI15FIA-P2PJ19HI1-HI2-FIC3PE21FIA-FIB-P3PH13FIA-FIB-FIC3PH32FIA-FIB-P-T4PC22FIA-FIB-P-FrepB4PD22I1-FIA-P-FrepB4PD31FIA-FIB-P-FIC4PH41HI1-HI2-FIA-FIB-P5PE1171 表27上海动物性食品源德比沙门菌（n=59）质粒不相容群携带模式谱质粒不相容群携带模式重数模式型菌株数空0PL12Y1PA1HI21PF1I11PG32FIC1PI27FIA1PJ21P1PK4FIA-FrepB2PD41HI1-HI22PE44I1-FIC2PG11FIA-FIB2PH25FIA-FIC2PI16FIA-P2PJ14HI1-HI2-FIC3PE21HI1-HI2-FIA3PE51FIA-FIB-P3PH13FIA-FIB-FIC3PH32FIA-FIB-P-FIIs4PB1I1-FIA-FIB-FIC4PG41HI1-HI2-I1-FIA-FIB-P6PE3172 表28广东动物性食品源德比沙门菌（n=26）质粒不相容群携带模式谱质粒不相容群携带模式重数模式型菌株数空0PL8P1PK3FIA1PJ24FIA-P2PJ11HI1-HI22PE41FIA-FIC2PI15I1-FIA-P3PM11HI1-HI2-FIC3PE21FIA-FIB-P-FIC4PH41HI1-HI2-FIA-FIC4PM21由表26可知，上海人源德比沙门菌携带质粒不相容群模式型由高到低依次为PK、PJ1、PL、PJ2、PI2、PH2、PI1、PH1、PG3、PD1、PG1、PH3、PC2、PD2、PC1、PG2、PE2、PD3、PH4、PE1。由表27可知，上海动物性食品源德比沙门菌携带质粒不相容群模式型由高到低依次为PL、PI2、PI1、PH2、PK、PE4、PJ1、PH1、PG3、PH3、PA、PF、PJ2、PD4、PG1、PE2、PE5、PB、PG4、PE3。而由表28可知，广东动物性食品源德比沙门菌携带质粒不相容群模式型由高到低依次为PL、PI1、PJ2、PK、PJ1、PE4、PM1、PE2、PH4、PM2。3.4.4质粒不相容群携带模式分析从总体而言，159株德比沙门菌中有131株德比沙门菌至少携带一种质粒不相容群，比例达到82.39%，在携带质粒不相容群的菌群中，共有30个携带模式，优势的携带模式是PK型（P，19株，11.95%），PI1型（FIA-FIC，16株，10.06%）和PJ1型（FIA-P，14株，8.81%），其中，质粒不相容群携带数最多的菌株可达到6重（HI1-HI2-I1-FIA-FIB-P）。在菌群总体中，最常见的是携带2重（53株，33.33%）和1重（51株，32.08%）质粒不相容群的菌株，其次是0重（28株，17.61%），3重（15株，9.43%），4重（10株，6.29%），5重（1株，0.63%）和6重（1株，0.63%）。在三个菌群中，上海的人源和动物性食品源菌群各有20种质粒不相容群携带模73 式，而广东地区菌群仅10种，在这10种携带模式中，有8种模式同样存在与上海菌群中，提示地域可能对质粒不相容群的携带模式存在影响，不同地区菌群的质粒群复杂程度不同。3.4.5质粒不相容群检测小结德比沙门菌总体统计可知，159株菌的菌群携带有11个质粒不相容群；其中，上海人源菌群、上海动物性食品源菌群和广东动物性食品源菌群这三个菌群主要携带的质粒群存在差别；且存在不同地域或不同来源对同一种质粒不相容群携带情况出现差异显著的情况。而在质粒不相容群携带模式方面，大多数菌株携带有质粒，优势的携带模式是PK型（P，19株，11.95%）、PI1型（FIA-FIC，16株，10.06%）和PJ1型（FIA-P，14株，8.81%），质粒不相容群携带数最多的菌株可达到6重（HI1-HI2-I1-FIA-FIB-P），且地域可能对质粒不相容群的携带模式存在影响，不同地区菌群的质粒不相容群复杂程度不同。3.5德比沙门菌的PFGE分型结果及分析3.5.1PFGE分型结果图谱159株德比将菌体内全部DNA包埋进胶块，使用XbaI对其进行酶切后，进行脉冲场电泳，可得图1类型结果。由图可知，被XbaI酶切处理过的DNA片段被分离开，每株菌被分成14-18个片段。74 图1部分德比沙门菌PFGE电泳结果图在159株德比沙门菌中，成功分型151株德比沙门菌，有8株为不可分型菌株，分型率为94.97%，不可分型菌株编号为SH14G319、SH14G834、SH14SF117、SH14SF118、SH14SF142、SH14SF242、SH15SF212和SH15SF301。将电泳结果图谱进行聚类分析，按照85%的相似度进行基因分簇，得图2。75 图2151株德比沙门菌聚类结果图谱（附录A为此大图）76 由图2可知，图中151株德比沙门菌存在84个PFGE基因型，本研究将聚类结果按照85%相似度进行对比分析，得到11个基因簇与14个不在基因簇内的单一基因型。将11个基因簇标记为A-K后，可知A基因簇由20株菌组成，含有9个基因型；B基因簇由37株菌组成，含有11个基因型；C基因簇由6株菌组成，含有3个基因型；D基因簇由2株菌组成，含有2个基因型；E基因簇由7株菌组成，含有6个基因型；F基因簇由39株菌组成，含有19个基因型；G基因簇由4株菌组成，含有4个基因型；H基因簇由13株菌组成，含有10个基因型；I基因簇由5株菌组成，含有3个基因型；J基因簇由2株菌组成，含有1个基因型；K基因簇由2株菌组成，含有2个基因型。经统计可知，F基因簇，B基因簇，A基因簇为菌群中的优势基因簇：包含菌株数达到菌群的24.53%，23.27%和12.58%；包含的基因型达到菌群基因型总数的22.62%，13.10%，10.71%。而在在总共的84个PFGE基因型中，B4和F2为其中优势基因型，占菌群综述的10.69%（17株）和5.03%（8株）。其中，在来自上海并成功分型的72株人源德比沙门菌中：8株位于A基因簇，含6种PFGE基因型；22株位于B基因簇，含9种基因型；2株位于C基因簇，含2种基因型；2位于E基因簇，含2种基因型；19株位于F基因簇，含11种基因型；3株位于G基因簇，含3种基因型；8株位于H基因簇，含6种基因型；3株位于I基因簇，含3种基因型；1株位于K基因簇；另外，有4株菌为不属于基因簇的单个PFGE基因型型。在来自上海并成功分型的55株动物性食品源德比沙门菌中：11株位于A基因簇，含6种PFGE基因型；10株位于B基因簇，含4种基因型；1株位于C基因簇；2位于D基因簇，含2种基因型；4位于E基因簇，含4种基因型；12株位于F基因簇，含6种基因型；1株位于G基因簇；4株位于H基因簇，含4种基因型；2株位于I基因簇，含2种基因型；2株位于J基因簇，含1种基因型；1株位于K基因簇；另外，有5株菌为不属于基因簇的单个PFGE基因型型。在来自广东并成功分型的24株动物性食品源德比沙门菌中：1株位于A基因簇；5株位于B基因簇，含4个基因型；3株位于C基因簇，仅1个基因型；1株位于E基因簇；8株位于F基因簇，含7个基因型；1株位于H基因簇；另外，有5株菌为不属于基因基因簇的单个PFGE基因型型。77 3.5.2PFGE分子分型结果分析值得注意的是，在德比沙门菌菌群中，存在不同地域、不同来源、不同采集时间的菌株共享一个PFGE基因簇（相似度达85%以上的菌群），乃至同一基因型的情况。例如：在A5基因型的4株菌均来自上海市，1株为人源菌株，3株为动物性食品源菌株，采集时间从2014年5月至2014年9月，说明PFGE基因型为A5的菌株一直分布于2014年5月至2014年9月上海市的人与动物性食品中，提示基因型为A5的菌株有跨时间及跨宿主传播的可能性，同样的情况还存在于其他基因簇甚至其他PFGE基因型（如：A2，C1，B6等基因型）中。在B4基因型的17株菌中，含10株上海人源菌株、6株上海动物性食品源菌株和1株广东动物性食品源菌株，且采样时间从2013年9月至2015年8月，地点包含广东及上海两地，这说明PFGE基因型为B4的德比沙门菌分布于2013年9月至2015年8月的上海及广东两地的人及动物源性食品中，提示PFGE基因型为B4的这一菌株有跨时间、跨地域、跨宿主交叉传播的可能性，同样的情况还存在其他基因簇甚至其他PFGE基因型（如：B11，F11，F6等基因型）中，说明德比沙门菌很可能具有跨时间，跨地域，跨宿主交叉传播的能力。3.5.3PFGE分子分型小结总体菌群的PFGE聚类结果按照85%的相似度进行基因分簇后，加以统计后，可知：即使不同来源、不同采集时间及不同采集地点的菌株仍可具有在高达85%以上甚至是100%的相似度的情况，德比沙门菌有跨时间，跨地域，跨宿主交叉传播的可能性。3.6德比沙门菌的分子流行病学相关性研究3.6.1整理PFGE分子分型、毒力基因及质粒不相容群图谱结果PFGE是细菌分子分型的国际标准，即分型的金标准。所以，从PFGE分子分型结果可得知本研究中德比沙门菌的相关性，为探究德比沙门菌菌株间的分子流行病学相关性，本研究以PFGE聚类结果作为基本标准，对聚类结果对应的菌株进行了所检测的毒力基因及质粒不相容群图谱关联，得到结果如图3所示，该图为PFGE聚类结果对应菌株所关联的毒力基因和质粒不相容群图谱。78 图3151株德比沙门菌PFGE分型，毒力基因和质粒不相容群图谱（附录B为此大图）79 由图3可知，基于151株德比沙门菌聚类结果的所关联毒力基因谱和质粒不相容群谱中：毒力基因型为“avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC”的菌株占绝对优势，携带其余独立基因型的菌株分散在其中；而质粒不相容群未见明显优势的质粒不相容群携带型。3.6.2毒力基因相关性分析毒力基因型为“avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC”的菌株有131株，比例为86.75%，占有绝对优势，即该毒力基因型为德比沙门菌中的最常见毒力基因型。而其余表现不同毒力基因型的菌株仅为20株，分散在以PFGE聚类结果为排列顺序的菌群中。在检测的10个毒力基因中，与优势毒力基因型不同的毒力基因型差异之处表现在毒力岛基因ssaQ、mgtC、siiD、sopB，噬菌体源毒力基因gipA、sodC1、sopE及质粒源毒力基因spvC上。其中，有3株菌在毒力岛基因mgtC上与优势毒力基因型表现不同（即不携带mgtC基因），从PFGE聚类结果分析不携带mgtC基因的德比沙门菌菌株发现此3株不携带该基因的菌株PFGE分子分型相似度在83%以上，有2株菌的相似度甚至达到96%，该结果远高于65%的德比沙门菌菌群相似度底线，提示相似度较高的菌株在毒力岛基因mgtC上存在高度相关性。在2株菌在毒力岛基因siiD上与优势毒力基因型表现不同（即不携带siiD基因），从PFGE聚类结果分析不携带siiD基因的德比沙门菌菌株发现此2株不携带该基因的菌株PFGE分子分型相似度在81%以上，同样远高于65%的德比沙门菌菌群相似度底线，提示相似度较高的菌株在毒力岛基因siiD上也存在高度相关性。而2株菌在毒力岛基因sopB上与优势毒力基因型表现不同（即不携带sopB基因），从PFGE聚类结果分析不携带sopB基因的德比沙门菌菌株发现此2株不携带该基因的菌株PFGE分子分型相似度为77%，稍高于65%的德比沙门菌菌群相似度底线但差别并不明显，提示相似度较高的菌株在sopB基因上相关性并不强。噬菌体源基因gipA、sodC1及sopE则经分析发现在相似度较高的菌株上相关性较弱，可能与噬菌体源毒力基因在可移动遗传载体上导致在基因组中不稳定存在有关。而毒力岛基因ssaQ与质粒源毒力基因spvC则因各仅一株菌携带，无法分析相关性。经分析发现，存在于染色体上的毒力基因（毒力岛基因及菌毛基因）大多数情况下其相关性与菌株的相似度成正相关关系。80 3.6.3质粒不相容群相关性分析在质粒不相容群图谱中未发现有明显优势的质粒不相容群型，携带各种不同的质粒不相容群型的菌株均匀分布于PFGE聚类结果为排列顺序的菌群当中。本研究从高度相似（PFGE分子分型相似度85%以上，即各基因簇）的菌株入手，探究菌株携带质粒不相容群的相关性是否与菌株相似度有关。A基因簇内，携带FIC质粒不相容群的菌株占A基因簇菌株的85%（17/20），对比菌群总体质粒不相容群FIC携带率28.30%，差异极显著（P<0.0001），提示在部分高度相似的菌株中质粒不相容群FIC的携带情况表现出了显著相关性。B基因簇中质粒不相容群P携带率为72.97%（27/37），与菌群总体携带率33.33%相比，差异极显著（P<0.0001），与其余基因簇相比，差异均极显著（P<0.01），而就B基因簇之内，B4基因型菌株（相似度达100%）的质粒不相容群P携带率为100%（17/17），与B基因簇其他菌株（50%，10/20）相比，差异显著（P<0.05），提示部分德比沙门菌菌株的质粒不相容群P的携带情况相关性在相似度较高的菌株中表现极强且随着相似度升高相关性亦随之增强的情况；且质粒不相容群FrepB只存在于B基因簇的菌株中，在B基因簇中携带质粒不相容群FrepB的菌株PFGE分型相似度达到92%，提示质粒不相容群FrepB的携带情况相关性在高度相似的菌株上表现极强。经分析发现，菌群部分质粒不相容群携带情况相关性在高度相似的菌株上极强，且相关性随着菌株相似度的提高同样在增强，提示德比沙门菌部分质粒不相容群携带情况的相关性与菌株相似度成正相关关系。3.6.4德比沙门菌的分子流行病学相关性研究小结经统计及分析可知，德比沙门菌存在于染色体上的毒力基因（毒力岛基因及菌毛基因）大多数情况下其相关性与菌株的相似度成正相关关系；德比沙门菌部分质粒不相容群携带情况的相关性在相似度高菌株上极强，且与相似度成正相关关系。81 4讨论4.1德比沙门菌耐药结果讨论本研究中，对整体159株德比沙门菌进行了药敏试验，由结果可知，有156株德比沙门菌（98.11%）对至少1种抗生素有耐药性，且对四环素（88.05%）、磺胺异恶唑（78.62%）和链霉素（58.49%）有严重的耐药性，而对环丙沙星（5.66%）、奥格门丁（3.77%）、头孢噻肟（2.52%）、头孢他啶（1.89%）、氧氟沙星（1.26%）和头孢吡肟（1.26%）也存在少量菌株耐药。此耐药情况远严重于HauserElisabeth等人（2011）研究的于德国分离的德比沙门菌菌群，该菌群72%对抗生素敏感，且菌群存在耐药性的几种抗生素耐药比例均在不高于20%（Hauseretal.,2011）。而其耐药性反而接近于RuddatI.等人（2012）研究的同为德国分离的鼠伤寒沙门菌（S.Typhimurium），该菌群同样绝大多数菌株对抗生素有耐药性，对四环素类（75%）和链霉素（77%）高度耐药（Ruddatetal.,2012）。而相比于同为国内的杨保伟等人（2010）的陕西省沙门菌菌群耐药性研究，耐药情况存在差距，例如：本研究的德比沙门菌菌群对于四环素（88.05%）和链霉素（58.49%）的耐药性远高于陕西沙门菌菌群的四环素（56%）和链霉素（29%）耐药性；而在复方药奥格门丁（3.77%）和复方新诺明（41.51%）和头孢类抗生素（均不高于3%）的耐药性方面却低于陕西省菌群（复方新诺明经58%，奥格门丁32%，头孢类药物8%-16%）（杨保伟等，2010；Yangetal.,2010）。而相比于同为上海沈海燕等人（2014）研究的沙门菌菌群，本研究中来自上海的德比沙门菌菌群对四环素（87.22%）和复方新诺明（40.60%）的耐药性显著高于该菌群（四环素38.6%，复方新诺明22.9%），但在萘啶酸（36.09%），环丙沙星（6.77%），氧氟沙星（3.01%），头孢类药物（均低于3%）的耐药性上，却显著低于该菌群（萘啶酸75.7%，环丙沙星17.1%，氧氟沙星18.6%，头孢类药物10%-18%）（沈海燕等，2014）。而相比同为广东省LiangZhaoming等人（2015）研究的德比沙门菌菌群，除本研究中广东地区德比沙门菌菌群的四环素（92.31%）和磺胺异恶唑（100%）的耐药性显著高于该菌群（60.42%，45.83%）外，其余的抗生素耐药比例均十分接近（Liangetal.,2015）。上述注明差异显著部分，均为经由T-检验，P<0.05。本研究结果说明，不同来源及不同地域的德比沙门菌菌群对部分抗生素的耐药情况可能存在差异，例如：同为上海的德比沙门菌菌群，人源相比动物性食品源菌群在链霉素上差异显著；广东动物性食品源菌群磺胺异恶唑耐药性与上海动物性食品源菌82 群磺胺异恶唑耐药性差异极显著。且上海地区菌群对大多数抗生素的耐药性强于广东地区菌群。这种情况可能是由抗生素长期在不同地区与不同宿主上使用的种类或剂量差异所引起的，对此，HauserElisabeth等人（2011）持相同看法，在其研究讨论中也提到与其他国家菌群耐药性的差异可能与抗生素的使用习惯有关（Hauseretal.,2011）。BaltazarMurielle等人（2015）和KaronAmyE.等人（2007）研究结果均表明，沙门菌的多重耐药性正逐年快速增长（Baltazaretal.,2015；Karonetal.,2007）。本研究结果显示，整体德比沙门菌菌群中达到多重（3重及以上）耐药的菌株占到69.81%，且几种优势耐药模式型为3重耐药、9重耐药和8重耐药，还出现了高达11重耐药的菌株。本研究中德比沙门菌菌群（主要来自2014-2015年）的多重耐药情况远比HauserElisabeth等人（2011）所研究的德比沙门菌菌群严重（2006-2008年，13.41%多重耐药，最高6重耐药）（Hauseretal.,2011）。所以，德比沙门菌菌群所表现出的多重耐药现状及其多重耐药继续增长的可能也同样值得关注。上述数据说明本研究中的广东及上海两地的德比沙门菌菌群对于多种抗生素有较严重的耐药情况，上海地区尤为严重，值得引起社会各界及政府监管部门注意，并应加强抗生素使用监管力度。4.2德比沙门菌毒力基因检测及毒力基因模式分型结果讨论本研究中所检测的10个毒力基因在产肠毒素、侵袭和致病宿主方面都扮演着重要的角色（Osmanetal.,2014）。BorrielloGiorgia等人（2012）研究中有说明：avrA，ssaQ，mgtC，siiD和sopB是1-5号毒力岛存在的标志基因，而毒力岛与沙门菌致宿主肠炎的能力有密切关系（1-5号毒力岛的存在不能完全代表整个毒力岛的存在）。gipA，sopE和sodC1为噬菌体源毒力基因；spvC为质粒携带的毒力基因；而bcfC为编码与表面黏附作用和对宿主的肠道定植有关的菌毛的毒力基因（Borrielloetal.,2012）。本研究结果说明，在德比沙门菌菌整体群中普遍存在的毒力基因为：毒力岛基因avrA、ssaQ、mgtC、siiD、sopB，菌毛编码基因bcfC，噬菌体源基因sopE和sodC1，携带率在94%-100%之间，本研究中的个菌群携带率差异并不显著。而上海市德比沙门菌菌群携带的毒力基因种类对比广东省德比沙门菌菌群差异主要体现在噬菌体源基毒力基因gipA上，上海德比沙门菌菌群人源（6.76%）与动物性食品源（3.39%）83 均有少量携带，但广东的菌群携带率为0%，根据OsmanK.M等人（2014）的研究可知，噬菌体源毒力基因gipA是针对派尔淋巴结（该淋巴结为小肠粘膜内的一组淋巴滤泡，肠黏膜免疫系统重要组成之一）的特异性毒力因子的编码基因，gipA基因的存在可能会影响派尔淋巴结功能，进而增加了携带该基因的菌体的致病能力，提示上海市的德比沙门菌在gipA基因的影响下致病能力有强于广东省德比沙门菌的可能。上海的德比沙门菌菌群中还出现了一株携带质粒源基因spvC的菌株，该基因根据OsmanK.M等人（2014）的研究可知能够促进菌体增殖及促进菌体在宿主体内存活，增加了菌体对于宿主的感染机会，且考虑到质粒的传播能力，携带这一毒力基因的菌株值得引起重视。本研究中的德比沙门菌菌群的毒力岛基因avrA、ssaQ、mgtC、siiD和sopB携带率均接近100%（98%-100%）；菌毛编码基因bcfC携带率为100%；噬菌体源毒力基因sopE（98.86%）和sodC1（95.60%）携带率也接近100%；但噬菌体源毒力基因gipA（4.40%）和质粒源毒力基因spvC（0.63%）携带率较低。与BorrielloGiorgia等人（2012）研究中的鼠伤寒沙门菌相比，毒力基因avrA、ssaQ、mgtC、siiD、sopB和bcfC携带率相似（均为100%或接近100%），但毒力基因sopE的携带情况却与其研究中的鼠伤寒沙门菌菌群相反（0%），且与其菌群存在差异的毒力基因还有spvC（54%）和gipA（46%）；而其研究中的明斯特沙门菌（S.Muenster）与基夫沙门菌（S.Give）又呈现与前两者不同的毒力基因携带情况。相比本研究的德比沙门菌菌群，明斯特沙门菌5个毒力岛毒力基因携带率偏低（avrA为57%，ssaQ为100%，mgtC为29%，siiD为43%，sopB为29%），毒力基因bcfC和sopE携带率很相近（均为100%），毒力基因gipA和spvC均不携带但和本研究菌群相差不大，而sodC1携带情况与本研究相反（0%）。同样相比于本研究的德比沙门菌菌群，基夫沙门菌的毒力岛基因avrA（86%）稍低，mgtC（71%）稍低，siiD（71%）稍低，ssaQ（100%）类似，但sopB（0%）相反；菌毛编码基因bcfC携带情况相同（100%）但噬菌体源毒力基因sodC1和sopE相反（均为0%）；其与毒力基因gipA和spvC（均为0%）也与本研究的德比沙门菌菌群存在差异（Borrielloetal.,2012）。而就毒力基因的携带模式分型来说，与KuangDai等人（2015）研究的纽波特沙门菌（S.Newport）菌群也存在差异，该研究中纽波特沙门菌菌群毒力基因模式以“avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-bcfC”为主（53.2%），而这种毒力基因携带模式型是本研究中的德比沙门菌菌群没有的，而本研究中德比沙门菌菌群的最优势毒力基因模式型84 “avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC”（占菌群84.91%）同样出现在其纽波特菌群中，但比例仅为19.0%（Kuangetal.,2015）。由上述数据可以看出，德比沙门菌格菌群在大部分毒力基因携带情况差异不大，上海市的小部分德比沙门菌在gipA基因的影响下致病能力有强于广东省德比沙门菌的可能，且值得重视的是出现了携带可传播的质粒源毒力基因spvC菌株。不同沙门菌血清型的毒力基因携带情况及菌群中的毒力基因模式分型也很可能是不同的，而毒力基因本身又与菌株致病力密切相关，所以，沙门菌各血清型的致病力差异很可能受各血清型的毒力基因及携带模式差异所影响较大。4.3德比沙门菌质粒不相容群检测及携带模式分型结果讨论细菌体内的质粒本身可能携带诸如耐药基因和毒力基因等可遗传的信息，很大程度上增加了细菌的可遗传信息水平传递的复杂性（Franciaetal.,2004）。对于细菌体内的质粒不相容群进行检测并进行携带模式分型，能更好的了解这种细菌的可移动遗传元件的存在特征，为后续质粒相关的研究提供数据基础。本研究中，159株德比沙门菌菌群携带有11个质粒不相容群，82.39%的菌株携带有质粒不相容群，携带情况从高到低依次为：FIA(50.94%)，P(33.33%)，FIC(28.30%)，FIB(18.87%)，HI2(8.18%)，HI1(7.55%)，I1(7.55%)，FrepB(3.77%)，T(1.89%)，Y(0.63%)，FIIs(0.63%)，其余质粒群尚未发现。而且，本研究结果经分析后可知，存在不同源或不同地域对质粒不相容群携带率有影响的可能性，MezalEzatH等人（2013）的研究持相同观点，在其研究中认为，质粒不相容群携带分析及模式分型有助于区分不同来源的细菌（Mezaletal.,2013）。李静怡等人（2014）研究的鼠伤寒沙门菌与本研究中的德比沙门菌相比，携带质粒群种类稍少（10种），但携带有质粒群的菌株数更多（93.1%），鼠伤寒沙门菌菌群携带的质粒群种类与本研究也有差别，该菌群携带有本研究菌群中未发现的质粒不相容群N，而本研究携带有该研究菌群中未发现的质粒不相容群T与FIC，且单个质粒不相容群携带率与本有就都存在差异，鼠伤寒沙门菌菌群中携带率最高的两种分别是FIA（60%）、P（58%）和HI1（40%），除FIA外都显著（P<0.01）高于本研究中的P（33.33%）和HI1（7.55%）（李静怡等，2014）。而MezalEzatH.等人（2013）研究的爪哇沙门菌（S.Javiana）与本研究的德比沙门菌相比，其质粒不相容群携带量极少，仅10%的菌株携带有质粒不相容群，与本研85 究的质粒不形容群携带率82.39%差异极显著（P<0.0005）；仅携带两种质粒，未发现携带超过1重质粒不相容群的菌株，6%携带有质粒不相容群FIIs，4%携带有质粒不相容群I1；总体而言，与本研究德比沙门菌菌群差异极大（Mezaletal.,2013）。由以上数据可以可知，不同血清型的德比沙门菌之间质粒不相容群携带存在极大的差异，从携带种类到携带率都不同，且同种血清型内存在不同源或不同地域对质粒不相容群携带率有影响的可能性。所以，质粒不相容群的携带率分析及模式分型有可能成为一种分析细菌血清型及来源的可靠工具。4.4德比沙门菌PFGE分子分型结果讨论脉冲长凝胶电泳技术（PFGE）因为其兼具极高的分辨能力和良好的重复性等优点被使用在了细菌的分子分型上，被称作细菌分型方面的“金标准”（孟庆峰等，2012）。PFGE作为一种成熟的分子分型技术，所以，本研究以其作为德比沙门菌的核心分型方法进行相关分析及讨论。本研究选用XbaI酶切处理德比沙门菌整体菌群，并进行PFGE分子分型，成功分型率94.97%。按照85%的相似程度对PFGE聚类图谱划分了A-K共计11个基因簇和14个基因簇间的单一PFGE基因型。从基因分簇结果可知，各基因簇（相似85%以上）乃至各基因型（相似100%）中存在不同来源的菌株均匀分布的情况，也有各基因簇乃至各基因型中参杂各地域和各采样时间的菌株情况。而从另一个角度看，同一地域、同一采集时间或同一采集样品分离到的菌株也存在散布于各基因簇乃至各基因型的情况。YangXiaowei（2015）的研究中同样得到了样品来源分布在PFGE各基因簇的情况，而YangBaowei（2010）的研究中也存在不同时间不同地域的菌株分布在同一PFGE基因型中的情况（Yangetal.,2010；Yangetal.,2015）。提示所研究的沙门菌具有跨地域、跨时间及跨宿主传播的能力，且本研究中德比沙门菌同样具有在不同时间、不同地域和不同宿主之间交叉传染的能力。而且考虑到沙门菌有持续存在于环境中的能力（Winfieldetal.,2003），结果同样说明德比沙门菌这一血清型有可能是通过长期存在于环境中对不同宿主持续造成感染乃至跨区域扩散，所以，应得到足够的重视，防止德比沙门菌大规模跨地域和跨宿主传播的情况出现。86 4.5PFGE分子分型及本研究中的毒力基因分型、质粒不相容群分型方法关系探究讨论经实验结果及统计分析可知，部分毒力基因的携带情况及部分质粒不相容群携带情况在PFGE分子分型后的高度相似菌株上表现出相关性极强的情况，进而，本研究从PFGE分子分型及本研究中的毒力基因分型、质粒不相容群分型方法入手，讨论三种分型方法之间可能存在的关系，验证毒力基因分型及质粒不相容群分型的可靠性。4.5.1PFGE分子分型方法、毒力基因分型及质粒不相容群分型方法图谱对比目前，PFGE成为了细菌分子分型的国际标准，即分型的金标准，且PFGE是唯一的通用适合所有血清型沙门菌的分子生物学方法。本研究，以脉冲场电泳凝胶技术（PFGE）分子分型为对德比沙门菌的核心分型方法，比对毒力基因分型和质粒不相容群分型后，探究这三种方法可能存在的关系。三种分型方法图谱见图3，该图为PFGE成功分型的151株德比沙门菌所对应的PFGE分型，毒力基因分型和质粒不相容群分型图谱。4.5.2德比沙门菌PFGE分型与毒力基因分型关系探究毒力基因分型本身是一种独特的分型方法，是基于细菌体内独特的毒力基因携带模式的检测手段。这种分型方法的主要优点是，它可以反映毒力基因的分布，提高人类对感染潜在风险可能性的理解，而致病菌的毒力本身在食源性疾病中都起着至关重要的作用（Khooetal.,2009；Osmanetal.,2013）。然而，即使毒力基因分型在先前的研究中已经被证明了是一种有用的沙门菌分离鉴定的工具（Grazianietal.,2011；Huehnetal.,2010），但这种分型方法的可靠性仍缺乏足够的实验依据和缺乏支撑，缺少与其他常用且可靠的食源性病原菌的分子分型方法比较。所以，本研究以PFGE分型为基本分型方法，比对与毒力基因分型的差异，探究德比沙门菌PFGE分型和毒力基因分型可能存在的联系。由图3可知，151株PFGE成功分型的德比沙门菌中，其最优势毒力基因模式为VH，该模式菌株数达131株，比例为86.75%，即大多数图谱中的德比沙门菌为VH毒力基因模式型，其余毒力基因模式型散在。值得注意的是：其一；PFGE分型结果基因分簇（相似度85%以上）所得的C基87 因簇含6株菌，毒力基因模式均为VH毒力基因模式型，同样的情况也出现在G基因簇，I基因簇内部。其二，缺失毒力基因mgtC的菌株有3株（SH14G123，SH14G148和SH14G1052），比例仅为1.99%，但这3株菌中，两株（（SH14G123和SH14G148）在PFGE分型相似度上高达96%，而SH14G1052与上述两株PFGE分型相似度也达到83%，远高于德比沙门菌菌群底线相似度（65%）。其三，菌株SH14SF287是唯一一株携带毒力基因spvC的菌株，其所携带的毒力基因模式（avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-gipA-sodC1-spvC-bcfC）与优势毒力基因模式型VH（avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC）存在3个毒力基因（共检测10个毒力基因）的差别，是与优势毒力基因模式VH相差最大的毒力基因模式，而该菌株在PFGE分型上不属于任何基因簇（相似度85%），与其PFGE分型最相似的是SH14SF304，与其和优势毒力基因模式VH存在共同差异，缺失sopE基因，毒力基因模式为avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-bcfC，相似度71%，除SH14SF304外，SH14SF287与其余149株德比沙门菌的差异均为65%，即德比沙门菌菌群相似度底线。上述三点的毒力基因分型差异均与PFGE分子分型有相似之处，提示毒力基因分型和PFGE分子分型这两种分型方法可能存在联系。本研究结果经分析表明，毒力基因分型与PFGE分子分型有相似之处，提示毒力基因分型和PFGE分子分型这两种分型方法存在联系。KuangDai等人（2015）的研究中也提出了毒力基因分型与PFGE分子分型结果存在联系的观点。结果说明，毒力基因分型很可能是一种可靠的基于致病力相关毒力基因的分型方法。4.5.3PFGE分子分型和质粒不相容群分型关系探究基于复制子的质粒不相容群分型本身对于致病细菌分型而言也同样拥有可取之处，因为特定的质粒类型能与毒力或耐药性联系到一起，而在国外该分型方法也有被用于临床大肠杆菌的研究（Shinetal.,2015；Johnsonetal.,2007）。但在国内外的研究中却罕见用于沙门菌的分型研究，且其可靠性同样缺乏足够的实验依据支撑，缺乏与可靠的分子分型手段进行对比。所以，本研究以PFGE分型为基本分型方法，比对与质粒不相容群分型的差异，探究PFGE分型和质粒不相容群分型可能存在的联系。由图3可知，151株PFGE成功分型的德比沙门菌中，质粒不相容群携带模式无明显优势模式，各质粒不相容群模式散在。88 值得注意的是：其一，存在PFGE分子分型上高度相似且在质粒不相容群分型也高度相似的情况，如：PFGE分子分型的H7基因型，包含SH14G848和SH14SF207两株菌（PFGE分型相似度100%），这两株菌的质粒不相容群模式均为PH2（FIA-FIB）；PFGE分子分型基因型A6，包含SH14G784，SH14G807，SH14SF306和SH14SF307，这4株菌的质粒不相容群携带模式3株为FIA-FIC，1株为FIC，仅一株相差一个质粒不相容群；PFGE分子分型基因型J1含SH14SF357和SH14SF359（相似度100%），质粒不相容群分型为I1-FIA-FIC和I1-FIC，仅相差一个质粒不相容群；同样的情况也出现在PFGE分子分型基因型A2，B8，C1和C2等基因型上其二，就单个质粒不相容群携带情况也与PFGE分子分型存在相似性，如：在PFGE分子分型基因分簇（相似度85%）后的B基因簇中质粒不相容群P携带率为72.97%（27/37），与菌群总体携带率33.33%相比，差异极显著（P<0.0001），与其余基因簇相比，差异均极显著（P<0.01）；而就B基因簇之内，B4模（内部相似度达100%）的质粒不相容群P携带率为100%（17/17），与B基因簇其他菌株（50%，10/20）相比，差异显著（P<0.05）。类似的情况也出现在A基因簇中，质粒不相容群FIC在A基因簇携带率为85%（17/20），对比菌群总体质粒不相容群FIC携带率28.30%，差异极显著（P<0.0001）。其三，出现一种质粒不相容群只出现在一个PFGE分型基因簇的情况，菌群中携带质粒不相容群FrepB的菌株均位于B基因簇（相似度85%以上），B基因簇菌群中质粒不相容群FrepB携带率16.22%，且在B基因簇中携带质粒不相容群FrepB的菌株PFGE分型相似度达到92%，而其余基因簇均不携带质粒不相容群FrepB。其四，出现了与上述毒力基因分型相似的因带个基因携带差异引起的单株菌与菌群差异极大的情况。质粒不形容群Y与质粒不形容群FIIs为仅有的两个只一株菌携带的质粒不相容群，4.5.2中提到的SH14SF304（携带spvC毒力质粒基因）与SH14SF287两株菌，一株携带有质粒不相容群Y，另一株携带有质粒不相容群FIIs，这两株菌在PFGE分型上与149株菌相似性仅为65%，即本研究中德比沙门菌菌群PFGE分型相似度的底线。上述4点的质粒不相容群分型差异均与PFGE分型差异存在相似之处，提示质粒不形容群分型和PFGE分子分型这两种分型方法同样有存在一致性之处，可能存在联系，提示质粒不相容群分型也很好可能是一种可靠的基于质粒的分型方法。其中，也存在数据（第4点，存在于质粒的毒力基因spvC）提示毒力基因分型和质粒不相容群89 分型也可能存在联系。4.5.4PFGE分子分型方法与本研究中毒力基因分型及质粒不相容群分型方法的关系探究小结本研究通过探究发现，PFGE分子分型方法与本研究中毒力基因分型及质粒不相容群分型方法存在一致性部分，存在明显联系，提示本研究中所进行的毒力基因分型及质粒不相容群分型很可能成为一种对细菌不同侧重点行之有效的快速分型方法，这亦是本研究中的新发现。90 5结论为调查德比沙门菌耐药性和分子流行病学特征，本实验对不同来源及不同地域德比沙门菌的耐药性、毒力基因、质粒不相容群进行了检测，并完成了PFGE分子分型，得到了以下结论：广东及上海两地的德比沙门菌菌群对于多种抗生素有严重的耐药情况，98.11%（156/159）的德比沙门菌对抗菌药物有耐药性，耐药率最高的是四环素、磺胺异恶唑及链霉素，分别为88.05%、78.62%及58.49%，且上海市德比沙门菌菌群对大多数抗生素的耐药性强于广东省菌群。结果表明德比沙门菌菌群对部分抗生素产生了耐药性且不同地区、不同宿主来源的菌株耐药性存在差异，检测毒力基因avrA、bcfC、ssaQ、siiD、mgtC、sopB、sopE、sodC1、gipA和spvC的携带率分别为100%、100%、99.37%、98.74%、98.11%、98.11%、96.86%、95.60%、4.40%和0.63%，总体菌群中优势毒力基因模式“avrA-ssaQ-mgtC-siiD-sopB-sodC1-sopE-bcfC”携带率占84.91%（135/159）。上海德比沙门菌的毒力基因携带种类多于广东德比沙门菌菌群，毒力基因携带模式比广东德比沙门菌菌群复杂，结果显示可能不同地区流行的德比沙门菌菌株特性存在一定的差异。本研究德比沙门菌菌群携带有11个质粒不相容群，携带率最高的三个质粒不相容群为FIA、P和FIC，携带比例为50.94%、33.33%和28.30%。质粒不相容群携带模式统计结果显示，82.39%（131/159）的德比沙门菌携带质粒不相容群，无明显优势的携带模式，质粒不相容群携带数最多的菌株可达到6重。存在不同地域或不同宿主对同一种质粒不相容群携带情况出现差异显著的情况，结果显示可能不同地区流行的德比沙门菌菌株特性存在一定的差异。本研究德比沙门菌分型成功率为94.97%（151/159），共得到84个不同的PFGE基因型，德比沙门菌菌群PFGE分子分型相似度范围为65%-100%。经统计可知存在不同地域、不同宿主、不同采集时间的菌株共享一个PFGE基因簇，乃至同一PFGE基因型的情况，提示德比沙门菌存在跨地域、跨时间和跨宿主传播的情况，不排除大规模爆发的风险。本研究德比沙门菌的分子流行病学相关性在部分相似度较高的菌株上表现极强，且随着相似度提高相关性亦在提高。还发现本研究中所使用的毒力基因分型及质粒不91 相容群分型两种分型方法与作为标准的PFGE分子分型方法部分结果具有一致性，提示毒力基因分型和质粒不相容群分型对于沙门菌有作为潜在分型方法的价值。92 致谢时光荏苒，岁月如梭，在毕业论文即将完成之际，首先要向我敬爱的导师徐成刚老师致以最崇高的敬意和最挚诚的感谢！导师渊博的学识、丰富的临床经验、踏实做事的精神和宽厚待人的作风都对值得我好好学习。徐老师在我的论文撰写及修改方面给予了我指导和帮助，同时在生活中也给了我无私的关怀，在此再次表示诚挚的谢意！感谢廖明教授提供了禽病教研室，让我能在这一平台下进行实验研究。廖明老师敏锐的科学洞察力，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，对我影响深远，是我终身学习的榜样。衷心感谢张建民副教授在我论文的选题、试验方案的确定和实施和试验结果的分析等方面给与我的指导和帮助，张老师踏实严谨的做事风格和与人为善的品质都值得我学习。本论文的完成同样离不开上海交通大学和上海科玛嘉微生物技术有限公司的旷代师兄、杨筱薇老师和石薇敏女士给予的指导和帮助，在此向他们表示最衷心的谢意。在兽医学院禽病教研室这一温暖的教研室中，感谢冯赛祥博士，硕士生任行星、洪艳芬、张丽娜、符颖、林一村和李苗，本科生詹泽强、林嘉特和梁德媚，实验员张红霞等在本实验中对我提供无私的帮助和热情的支持，对他们表示真诚的感谢！此外，我还要特别感谢我的父母和兄长，感谢他们多年来对我的教育、理解和支持！没有你们就没有我的今天，你们是我的精神后盾。同样感谢我的舍友，在我生活中陪伴着我，在我需要帮助的时候伸出无私的援手，让我度过愉快的研究生生活。衷心的感谢你们为我做的一切。感谢参加论文答辩的各位专家教授，你们辛苦了！本研究得到动物源性沙门菌病防控技术研究与示范，公益性行业（农业）科研专项（201303044）、农业科研杰出人才及其创新团队-重大动物疫病防控，公益性行业（农业）科研专项（201403054）、动物源和人源沙门菌流行相关性及分子遗传变异研究，广东省科技计划项目（2009B030803050）、国家肉鸡产业技术体系疾病控制研究室岗位科学家，国家肉鸡产业技术体系项目（CARS-42-G09）、现代农业人才支撑计划项目(农财发（2012）160号)、广东省家禽重大传染病控制技术研究，广东省科技计划项目（2012A020100001）的资助，特此表示感谢。93 参考文献曹恬雪,蒋文灿,何文成,等.沙门氏菌毒力因子的研究进展[J].中国预防兽医学报,2014(04):331-334.陈朝喜,杜雄伟,师志海.不同来源沙门氏菌的分离鉴定及其耐药谱型比较[J].湖北农业科学,2012(21):4834-4837.陈冬平,罗薇.沙门氏菌毒力相关因子研究进展[J].西南民族大学学报(自然科学版),2012(05):770-775.陈俊,蒋文灿,谭天,等.沙门氏菌毒力岛及Ⅲ型分泌系统研究进展[J].中国人兽共患病学报,2015(04):371-376.陈玲,张菊梅,杨小鹃,等.南方食品中沙门氏菌污染调查及分型[J].微生物学报,2013(12):1326-1333.冯彩峰,林居纯,张飞,等.食品动物源沙门氏菌血清型及对β-内酰胺类耐药性调查[J].食品科学,2015(07):101-104.冯飞,谢振文,曾慕衡.鼠伤寒沙门氏菌多重PCR检测方法的研究[J].中国生物工程杂志,2011(01):65-69.冯建昆,韩志华,吴华,等.携带四环素耐药基因的鸭源大肠杆菌质粒不相容群分析[J].江西农业学报,2012(01):131-133.G.Mead,A.M.Lammerding,N.Cox,等.全球禽肉生产和贸易中的沙门菌风险评估与控制[J].中国家禽,2011(05):34-43.黄冠军,刘天强,杨晓玲,等.沙门氏菌入侵基因研究进展[J].亚太传统医药,2013(11):65-67.李静怡,崔可琦,冯赛祥,等.不同源鼠伤寒沙门氏菌耐药性质粒不相容性分群的初步研究[J].中国畜牧兽医,2014(03):54-58.刘芳萍,王德宁,李昌文,等.鸡源沙门氏菌耐药性的分析及毒力基因的检测[J].中国兽医科学,2013(12):1236-1239.刘桂华,赵薇,王艳秋.沙门菌血清及脉冲场凝胶电泳分型[J].中国公共卫生,2013(02):235-238.刘红玉,李岩,崔洪斌.肉中4种致病菌的PCR快速检测方法的建立[J].食品科学,2011(06):213-216.马婧嘉,施春雷,李可,等.沙门氏菌耐药谱及质粒耐药基因的筛查[J].中国食品学报,2014(04):184-190.孟庆峰,潘乐,王伟利.脉冲场凝胶电泳技术的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2012(13):26-28.彭海滨,吴德峰,孔繁德,等.我国沙门菌污染分布概况[J].中国国境卫生检疫杂志,2006(02):125-128.沈福杰,宿飞,王宇,等.上海市黄浦区沙门氏菌感染特征及主要血清型分析[J].中华疾病控制杂志,2012(11):958-961.沈海燕,郭慧霞,许学斌,等.上海市零售禽肉制品和活禽中沙门氏菌血清型与耐药性研究[J].中94 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附录9999 100100