江西部分医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染危险因素、分子流行病学及耐药基因研究.pdf

《江西部分医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染危险因素、分子流行病学及耐药基因研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

类号：密级：UDC：学号：416524115687南昌大学硕士研究生学位论文江西部分医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染危险因素、分子流行病学及耐药基因研究TheStudyonRiskFactors,MolecularEpidemiologyandDrugResistanceGenesofCarbapenem-resistantKlebsiellaPneumoniaeIsolatedfromJiangxiProvincialHospitals刘鹏培养单位（院、系）：公共卫生学院指导教师姓名、职称：曹先伟教授申请学位的学科门类：医学学科专业名称：公共卫生论文答辩日期：2018年05月答辩委员会主席：鲁元安评阅人：范义兵朱丽萍2018年6月 一、学位论文独创性声明＿：１木人Ａ明所７交的学位论文是木人在导帅指导卜进ｈ的研究：作及取得的，研究成米。据我所知ｆ除了文中恃别加以标注和致谢的地力外论文屮：Ｊｔ他人己经发表或撰Ｓ过的研究成汜，也不包含为获符由７４大学或其他教冇机？构的学位或证书而使川过的材料ｕ与我同工作的同忐对木研究所做的仃何貴献均匕在论文中作了明确的说明并表；ｊｍ学位论义作者签名（ｒ弓签字Ｈ期：年月Ｘ口丨ｇ６二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者究个了解雨Ｕ人学柯关保留、饳Ｗ学位论文的规记，Ｎ怠－？学校有权保留并向ｍ家打又部门或机构送交论文的复印件和电／版，允许沦文被ｍ划和借阅。木人授权南：吕人学｜以将学位论文的警部或部分内容编入办关？：、、数椐４进ｆｒ检索，可以采川影印缩印或扫描等Ｍ制ｆ段保存丨丨：编本Ｔ位论文＾同时授权北京万力数据股份有限公Ｍ和中国学术期刊〔光盘版）电了杂志社将本于位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《屮「有优杏博硕士学位“论文仝文数掂库》中仝文发表，并通过网络向社会公众提供倍总服务，Ｍ意按这程ｍ宁：受相义权益ｌＪ、ｒ－－（写学位论文作為签名（Ｔ写导师签名Ｔ）＇－１［签宇口期：６月分口签？丨期：年６月§ｒ：江分叹院耐碳卩丨霉烯类肺炎克语伯菌感染危睑闪衮、分子流行病学Ｍ翻」研究及耐药基Ｐ：４１姓名刘鹏学号６５２４丨】５６８７论文级別博Ｉ：□硕丨：０｜一々业公嫌ＩＥ备注ｍａｉｌｉ：￣□保密（向校学位办申＾获批准为“保密”，年片后公开） 摘要摘要目的：调查江西部分医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP）的感染危险因素、药敏、分子流行病学及耐药基因的携带，为指导临床实践提供理论依据。方法：1、收集2016年3月-2017年3月江西部分医院分离的CRKP80株，采用最低抑菌浓度（MIC）法测定肺炎克雷伯菌的药物敏感性。2、运用ERIC-PCR和多位点序列分析法（MLST）确定CRKP菌株的基因分型，分析江西部分医院临床分离CRKP菌株的主要型别。3、运用PCR扩增方法检测江西部分医院分离的CRKP耐药基因，耐药基因包括碳青霉烯酶基因，其他β-内酰胺酶基因（ESBLs），并对阳性结果测序确定。4、回顾性收集2016年3月-2017年3月期间入住江西部分医院病区的CRKP感染者的病例资料，通过单因素卡方检验和多因素logistic回归模型分析感染肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药物的危险因素。结果：1、入住ICU、进行手术、泌尿道插管是临床分离出耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的独立危险因素。2、从临床分离的CRKP菌株具有较强的耐药性，对头孢西丁全部耐药，对厄他培南、亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为77.5％、72.6％和29.5％。3、80株分离的CRKP菌株，主要基因型是ST11，占28.75%（23/80）。主要分布于重症医学科和烧伤整形科，其次较多的型别为ST375和ST15。4、CRKP临床分离检出碳青霉烯酶耐药基因主要为blaKPC和blaIMP；β-内酰胺酶耐药基因主要为blaTEM和blaSHV。结论：ST11型为江西部分医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌主要基因型；检出多种耐药基因，存在克隆传播；医护工作者在临床工作中需要改善的方面：泌尿道II 摘要插管、手术后护理、ICU住院者保护和抗菌药物的合理使用。关键词：肺炎克雷伯菌；碳青霉烯类药物；耐药基因；分子流行病学；危险因素III AbstractABSTRACTObjective:Tostudythemolecularepidemiologyofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae(CRKP)inhospitalsinJiangxiProvince,determinethemaingenotypesofCRKPisolatedinthisarea.DiscussthemechanismofCRKPresistanceinclinicalisolation.ToinvestigatethemainriskfactorsoftheKlebsiellapneumoniaeisolateswereresistanttocarbapenemMethods:1.80CRKPstrainsisolatedfromJiangxiProvincialHospitalfromMarch2016toMarch2017.Theantimicrobialsusceptibilitywasdeterminedbyminimalinhibitoryconcentration.2.ThemaingenotypewasdeterminedbyEric-PCRandMultipleLocusSequenceTyping.AnalysismainstreamgenotypesofCRKPisolatedfromJiangxiProvincialHospitalandthedistributionoftheirdepartments.3.Carbopeneaseandextended-spectrumβ-lactamase(ESBLs)resistantgenesweredetectedbypolymerasechainreactionandpositivegenotypeswereconfirmedbyDNAsequencing.4.WeretrospectivelycollecteddataonCRKP-infectedpersonslivinginthewardsofsomehospitalsinJiangxiProvincefromMarch2016toMarch2017.WeanalyzedtheinfectionofKlebsiellapneumoniaeisolateswereresistanttocarbapenembyunivariatechi-squaretestandmultivariatelogisticregressionmodel.Results:1.ICUadmission,surgery,andurinarycatheterizationareindependentriskfactorsfortheclinicalisolationofKlebsiellapneumoniaethatresistanttocarbapenemantibiotics.2.TheclinicallyisolatedCRKPstrainshaveseveredrugresistance,andtheresistanceratestoertapenem,imipenemandmeropenemare77.5%,72.6%and29.5%,respectively.Allofthemareresistanttocefoxitin.IV Abstract3.Themaingenotype80isolatesofCRKPisST11,accountingfor28.75%(23/80).Mainlydistributedinintensivemedicineandburnandplasticsurgery,andpresentsthetrendofcloning.ThesecondmostcommongenotypeisST375andST15.4.Thecarbapenemase-resistantgenesdetectedbyCRKPweremainlyblaKPCandblaIMP.Theβ-lactamase-resistancegenesweremainlyblaTEMandblaSHV.Conclusions:ST11typeisthemaingenotypeofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeinhospitalsinJiangxiProvince,anditsdrugresistanceisserious;multipledrugresistancegenesaredetectedandthereiscloningandtransmission;Weshouldpayspecialattentiontotheclinicalwork:urinarycatheterization,post-operativecare,ICUhospitalizationprotectionandrationaluseofanti-fungalantibiotics.Keywords:Klebsiellapneumoniae;Carbapenems;Drugresistancegenes;Molecularepidemiology;RiskfactorsV 目录目录前言...............................................................................................................................1第一部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染患者病例对照研究.........................31材料与方法.......................................................................................................31.1对象........................................................................................................31.2研究方法和过程....................................................................................32统计结果...........................................................................................................42.1病史资料................................................................................................42.2资料统计分析结果................................................................................43讨论...................................................................................................................8第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析.91材料...................................................................................................................91.1菌株来源.................................................................................................91.2质控菌株.................................................................................................91.3抗菌药物.................................................................................................91.4.药敏试验培养基和主要生化试剂.......................................................101.5肠杆菌基因间重复一致序列分析（ERIC-PCR）主要试剂.............101.6实验仪器..............................................................................................102方法.................................................................................................................102.1菌株鉴定..............................................................................................102.2琼脂稀释法测MIC...............................................................................102.3CRKP同源性分析................................................................................113实验结果.........................................................................................................123.1CRKP菌株的药敏试验........................................................................123.2CRKP同源性分析................................................................................134讨论.................................................................................................................17VI 目录4.1药物敏感性研究结果分析...................................................................174.2感染CRKP基因型分析.......................................................................17第三部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶研究.................................................................................................................................191材料与方法.....................................................................................................191.1实验材料.............................................................................................191.2实验方法.............................................................................................192实验结果.........................................................................................................222.1碳青霉烯酶的检测..............................................................................222.2其他β-内酰胺酶基因..........................................................................223讨论.................................................................................................................24第四部分结论...........................................................................................................25参考文献.....................................................................................................................27附录...........................................................................................................................33攻读学位期间的研究成果.........................................................................................34综述...........................................................................................................................35VII 中英文缩略词表中英文缩写词表英文缩写英文全称中文全称CRKPCarbapenem-ResistantKlebsiellapneumoniae耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应PFGEpulsedfieldgelelectrophoresis脉冲场凝胶电泳DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核苷酸MICminimuminhibitoryconcentrations最低抑菌浓度EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸TAETris-aceticacidTris乙酸KPCKlebsiellapneumoniaecarbapenemase肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶STSequencetype序列分型ESBLsExtendedspectrumbeta-lactamases超广谱β-内酰胺酶AmpCAmplerclassCβ-lactamase,AmpCC类β-内酰胺酶RResistent耐药SSusceptibility敏感ICUIntensiveCareUnit重症加强护理病房MLSTMultilocusSequenceTyping多位点序列分型KPCKlebsiellapneumoniaeCarbapenemase碳青霉烯酶DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸MDRMulti-drug-resistance多重耐药VIII 前言前言耐碳青霉烯类抗生素菌株检出最多的是革兰氏阴性细菌，包括鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，而肠杆菌科细菌较少，但近年来肠杆菌科细菌（CRE）感染的报道越来越多。感染的细菌中85%的CRE为碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌（CRKP），且有明显的上升趋势，给临床感控工作带来严峻挑战，因此CRKP感染问题越来越受重视。肺炎克雷伯菌是革兰氏阴性菌中的一个重要分类，该类细菌已经成临床感[1]染病例中最重要的致病菌之一。随着β-内酰胺类药物耐药菌株的大量增加，用于有效治疗革兰氏阴性杆菌的抗生素越来越少，特别是多重耐药性肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）。作为抗肺炎克雷伯菌感染的最后一道防线，碳[2]青霉烯类药物被广泛用于临床抗感染。肺炎克雷伯菌是一种机会致病菌，是引起院内感染的重要病原微生物，可以导致多种感染。当前，肺炎克雷伯菌的[3]耐药性问题日益突出，对临床感染的治疗影响严重。在美国、南美洲、欧洲[3-4]和地中海地区已检出大量产KPC酶或VIM金属酶的肺炎克雷伯菌，特别是新出现的一对含NDM-1质粒的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，在多个国家和地[5-7]区造成广泛的暴发。它已经引起了全世界的关注，并已成为医院感染管理上[8]的棘手问题。当前，碳青霉烯类药物引起耐药的主要三种方式：（1）产生碳青酶烯酶，全球报告较多的主要有KPC、NDM、IMP和VIM酶，而我国流行的主要为KPC[14]和NDM；（2）耐药机制是超广谱β内酰胺酶伴有孔道蛋白缺陷；（3）碳青霉烯药物作用位点异常。目前，前两种机制被学术界认为是主要的耐药机制。在产生碳青霉烯酶耐药机制中，其中以A类肺炎克雷伯型碳青霉烯酶（KPC型[15]酶）最为常见，主要为KPC-2型。目前该型在肠杆菌科菌、假单胞菌属和其他革兰阴性非发酵菌中都曾检出。KPC型酶属于A类，是在肠杆菌科中最先发[16]现的一个碳青酶烯酶基因型。目前，替加环素和多粘菌素是临床上治疗该类[17]细菌的首选药物，但多粘菌素的副作用不可忽视（神经毒性和肾毒性），在治疗选择时应谨慎；而替加环素价格高昂，患者使用意愿较差。因此通过预防措施是降低CRKP菌株感染及扩散的主要方法。1 前言细菌克隆研究需要使用分子流行病学研究技术。目前，研究细菌分子的流[18-19]行病学方法主要有ERIC-PCR和MLST。ERIC是肠杆菌基因间重复序列（Enterobacterialrepetitiveintergenicconsensus,ERIC）。使用有高度保守序列的引物进行PCR。通过扩增基因组DNA构建DNA指纹图谱，建立快速分子检测平台。该平台对底物序列差异敏感性高，具有生成图谱多态性丰富的优点，在细菌分型和分子微生态学研究中应用较多。2005年，多位点序列分型（MLST）应用于肺炎克雷伯菌的基因分型。MLST确定七个看家基因。数据库中的每个管家基因都对应一个序列号。在编号组合后，确定了最终ST型。这项技术的最大优势是MLST拥有标准化的基因库。不同菌属细菌的等位基因信息可以通过互联网进行全球标准化，并且可以平行比较来自不同地区的数据；且简单高效，重复性强，分辨率高。它已用于各种细菌的流行病学检测和进化研究，适用于细菌进化关系分析和长期细菌变异分析。近些年，全国CRKP菌株的检出率不断上升，而目前江西省对碳青霉烯类耐药肠杆菌科菌的耐药机制及危险因素的研究不多。因此，本课题拟采集江西省地区医院的CRKP菌株，利用分子生物学技术研究其耐药机制，并通过临床患者资料的分析以阐述引起碳青霉烯类耐药的相关高危因素和临床预后。为降低CRKP引起的感染风险、改善患者的预后和减轻患者医疗负担有一定的参考价值。2 第一部分碳青霉烯类耐药肠杆菌科菌的体外药物敏感性研究第一部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染患者病例对照研究1材料与方法1.1对象患者病例资料由南昌大学第一附属医院、景德镇市人民医院和新余市人民医院采集并送至南昌大学第一附属医院保存，查阅内容包括病人的性别、年龄等基础资料、主要疾病、入院治疗情况的全过程记录。将感染CRKP的80例患者作为病例组，在检出的同期医院选取80例碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌感染者作为对照组。病例组纳入标准：住院患者临床分离的菌株为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌；对照组纳入标准：住院患者临床分离的菌株为对碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌。1.2研究方法和过程1.2.1调查方法[20-21]采用病例对照研究方法，由参考文献显示的高危因素结合本地区情况调查感染CRKP的耐药危险因素。1.2.2调查内容病人基本信息：姓名、性别、年龄、入住病区、是否入住ICU、是否发生医院感染、预后情况等。侵入性操作情况：是否进行过气管切开、气管插管和泌尿道插管等侵入性操作。抗菌药物情况：β-内酰胺类药物、氨基糖苷类抗菌药物、碳青霉烯类抗菌药物、抗真菌类药物和喹诺酮类抗菌药物的使用情况。1.2.3数据整理及分析统计处理采用SPSS21.0软件，首先，单因素分析中采用卡方检验，将其中3 第一部分碳青霉烯类耐药肠杆菌科菌的体外药物敏感性研究有统计学意义（P＜0.05）的因素，再放入Logistic回归模型分析,检验水准定为P＜0.05。2统计结果2.1病史资料80株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌株中，对应80份病例资料保存完好。2.2资料统计分析结果2.2.1.标本来源检出耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的标本主要来源为痰液（28株）和血液（19株）；患者主要的病区分布为重症医学科病房（intensivecareunit，ICU）（30例，37.50%）和烧伤整形科（22例，27.50%）。其中ICU包括儿科监护病房、神经外科监护病房等。CRKP病人平均年龄为37.58±22.70，其中男性64例。2.2.2.治疗过程患者未检出细菌前的平均住院天数为18.49（7-28）天，总住院天数平均值为38.85（21-42）天。发生医院感染45例（56.25%）,住院期间有一次或以上手术者65例（81.25%）,住院期间更换床位平均次数为1.63±1.34次，其中更换床位一次或以上的患者为54例（67.5%）。72例进行了侵入性操作，如气管插管、胸腔穿刺、胃肠减压和气管切开等，其中52例（65.00%）进行过泌尿道插管。经治疗后15例病人未愈，1例病人死亡，其余均治愈或好转。4 第一部分碳青霉烯类耐药肠杆菌科菌的体外药物敏感性研究表1-1.感染CRKP菌株患者的病例资料临床特征例数（n=80）%基本资料平均年龄±SD(岁)37.58±22.70男性患者数64（80.00）患者床位更换平均次数±SD(次)1.63±1.34医院获得感染的患者数54（67.50）有手术史患者数45（56.25）进行创伤性操作的患者数72（90.00）泌尿道插管患者数52（65.00）气管切开患者数25（31.25）患者总住院天数38.85（21.00-42.00）病房重症监护病房30（37.50）烧伤整形科22(27.50)泌尿外科6(5.00)肿瘤科4（5.00）神经外科4（5.00）神经内科4（5.00）骨科4（5.00）肝胆外科3（3.75）儿科2（2.50）消化科1(1.25)主要标本来源痰28(35.00)血液19(23.75)尿液12(15.00)脓液8(10.00)胆汁7(8.75)其他6(7.50)预后：治愈23(28.75)好转41(51.25)未愈15(18.75)死亡1(1.25)5 第一部分碳青霉烯类耐药肠杆菌科菌的体外药物敏感性研究2.2.3．单因素分析结果结果显示CRKP感染的耐药高危因素包括年龄、入住ICU、泌尿道插管、进行手术、使用氨基糖苷类抗菌药物和使用抗真菌类抗菌药物。分析结果见下表1-2表1-2肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药物单因素分析结果2危险因素碳青霉烯类碳青霉烯类敏χP耐药例数感例数性别男64552.6560.103女1625ⅠⅠⅡⅢ年龄37.58±22.7049.28±19.833.4720.001是否入住ICU是30184.2860.038否5062是否发生医院感染是45480.2310.630否3532住院天数＞2040350.6270.428≤204045是否泌尿道插管是522616.9110.000否2854是否进行手术是653721.2040.003否1543有无并发症有38450.0250.874无42356 第一部分碳青霉烯类耐药肠杆菌科菌的体外药物敏感性研究2危险因素碳青霉烯类碳青霉烯类敏χP耐药例数感例数使用β-内酰胺类抗菌药物是55403.7670.052否3540使用氨基糖苷类抗菌药物是40830.4760.000否4072使用碳青霉烯类抗菌药物是42370.6250.429否3843使用抗真菌类药物是2086.2340.012否6072使用喹诺酮类抗菌药物是25200.7730.379否5560注：Ⅰ表示为各组均值，Ⅱ表示为Z值，Ⅲ表示为P值2.2.4.多因素logistic回归分析结果因变量定为以分离出肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物是否耐药（1=耐药，0=敏感），自变量为年龄、泌尿道插管、入住ICU、使用氨基糖苷类抗菌药物、抗真菌类药物，分别作多因素逐步logistic回归。结果显示泌尿道插管、入住ICU、进行手术是临床分离出肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的独立危险因素（见表1-3）。表1-3多因素logistic回归分析结果OR值的95%可信区间危险因素βSEOR下限上限泌尿道插管2.4800.99333.1576.280221.123入住ICU1.7630.8126.1521.18728.623进行手术1.6500.7125.9941.36125.5677 第一部分碳青霉烯类耐药肠杆菌科菌的体外药物敏感性研究3讨论本研究采用病例对照研究分析CRKP患者的资料以初步探讨其感染的危险因素，通过统计分析结果表明：进行手术、泌尿道插管、入住ICU是感染CRKP菌株的独立危险因素。[24]有研究表明入住ICU是CRKP菌株感染的一个重要危险因素，而本次调查中显示入住ICU为独立危险因素（OR=5.828，95%CI1.187-28.623），与前者的研究结果相符。80位CRKP感染患者主要分布在ICU，可能的原因为ICU患者病情较重，免疫力较差，造成反复感染。泌尿道插管是患者感染CRKP菌株的独立危险因素（OR=33.157，95%CI[23]6.280-221.123），与邓琼等研究结果相似。泌尿道插管在操作过程容易引起粘膜的损伤，导致周围组织充血，水肿，并为细菌侵入血液循环提供条件。同时，粘膜充血为细菌定植创造了有利的条件。在本研究中，在尿道插管过程中尿道粘膜可能受损，导致肺炎克雷伯氏菌感染或尿道定植。根据危险因素分析结果，在临床实践中，需要特别注意的环节是：入住ICU防护、泌尿道插管、手术护理和抗真菌类抗菌药物的合理使用。8 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析第二部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析1材料1.1菌株来源收集南昌大学第一附属医院、景德镇人民医院、新余市人民医院2016年3月-2017年3月各医院临床科室分离出的非重复CRKP。CRKP的判定依据参照[25]美国临床和实验室标准化协会推荐方法：肺炎克雷伯菌在亚胺培南、厄他培南和美罗培南的抑菌圈直径不大于19mm即认定碳青霉烯类耐药。对三种药物任一耐药的菌株为121株，经MIC法测其MIC（ETP、MEM和IMP）将CRKP菌株筛选至80株。所有菌株经Vitek2Compact自动化系统鉴定。每季度参加单位将本院分离的CRKP寄至南昌大学第一附属医院，由本院进行菌株分型和耐药性检测。1.2质控菌株药敏试验质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC138831.3抗菌药物：表2-1药敏实验所用抗菌药物的采购受试药物厂家厄他培南齐鲁制药有限公司亚胺培南辉瑞制药公司美罗培南日本Sumitomo公司头孢噻肟华北制药凯瑞特药业有限公司头孢西丁海口制药厂有限公司氨曲南北京第一制药有限公司替加环素惠氏制药有限公司阿米卡星瑞典ABBiodisk公司他唑巴坦海口制药厂有限公司哌拉西林齐鲁制药有限公司9 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析环丙沙星瑞典ABBiodisk公司头孢他啶辉瑞制药有限公司头孢哌酮辉瑞制药公司多粘菌素B美国Sigma公司头孢吡肟上海施贵宝有限公司1.4.药敏试验培养基和主要生化试剂1.实验室配制的15%甘油肉汤，购自上海生工生物有限公司的哥伦比亚基础琼脂干粉、中国蓝琼脂粉和药敏培养基。2.M-H琼脂平板的配置：称取M-H琼脂粉15.2g溶于400ml蒸馏水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压灭菌15分钟，冷却到50℃左右倾注平板，待平板凝固后放置4℃冰箱保存，两天内使用。1.5肠杆菌基因间重复一致序列分析（ERIC-PCR）主要试剂上海翊圣生物科技有限公司采购10mmol/L的dNTPMix、5U/μl的TaqDNA聚合酶、LodingBuffer)；北京美莱博医学科技有限公司采购扩增引物、琼脂糖、两种Marker分别为100～2000bp和100～600bp。1.6实验仪器Vitek2compact全自动微生物鉴定仪（法国梅里埃生物公司）、恒温培养箱（常州蒙特仪器制造有限公司）和漩涡振荡器（无锡沃信仪器制造有限公司）。2方法2.1菌株鉴定：菌株通过Vitek2compact仪器检测，确认的菌株保存在15%甘油肉汤管中置于-20℃冰箱备用。2.2琼脂稀释法测MIC制备浓度等于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，然后用生理盐水1:10稀释，移液枪吸取制备好的菌液（约1-2ul）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为410CFU，形成直径大约为5-8mm左右的菌斑，待菌液吸收后置35℃温箱孵育10 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析18h左右。将平板置于无反光物体表面上判断试验终点取抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。2.3CRKP同源性分析2.3.1引物设计与合成从PUBMLST网站中查找肺炎克雷伯菌多位点序列分型的7对管家基因及[26]其相对应的退火温度，Eric引物参照文献中引物序列设计，引物合成由上海捷瑞生物公司完成。相关引物序列见表2-2表2-2肺炎克雷伯菌MLST扩增管家基因的引物序列引物名称序列片段大小（bp）rpoBF:Vic35'-GGCGAAATGGCWGAGAACCA-3'501R:Vic25'-GAGTCTTCGAAGTTGTAACC-3'gapAF:1735'-TGAAATATGACTCCACTCACGG-3'450R:1815'-CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT-3'mdhF:1305'-CCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3'477R:8675'-CCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-3'pgiF:1R5'-GAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC-3'432R:1F5'-CGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT-3'phoEF:604.15'-ACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG-3'420R:604.25'-TGATCAGAACTGGTAGGTGAT-3'infBF5'-CTCGCTGCTGGACTATATTCG-3'318R5'-CGCTTTCAGCTCAAGAACTTC-3tonBF5'-CTTTATACCTCGGTACATCAGGTT-3'414R5'-ATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG-3'11 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析2.3.2PCR反应条件温度（℃）945min9430s5030s循环30次7260s7210min2.3.3Eric-PCR反应条件温度（℃）945min941min4045s循环45次722min7215min2.3.4结果分析将Eric-PCR分型不一致的PCR产物进行测序，得到的测序结果通过blast比对，得到各个管家基因的排序，将每个菌株的7对管家基因组合输入到MLST网站中比对得到每株菌株的序列分型号(ST)。2.3.5各病区基因型分布情况通过CRKP菌株的病区分布表，运用U检验分析各病区基因型分布的差异。3实验结果3.1CRKP菌株的药敏试验：研究结果表明：80株CRKP菌株对碳青霉烯类抗菌药物耐药率依次为厄他培南（77.5%）、亚胺培南（72.6%）、美罗培南（29.8%）；对于β-内酰胺类抗菌药物，耐药率依次为：头孢西丁（100.00%），头孢他啶（96.40%），头孢哌酮/舒巴坦(94.80%)，头孢噻肟（94.50%），氨曲南（90.80%），头孢吡肟（69.90%）；对于喹诺酮类药物耐药率为：环丙沙星（57.3%）；对于氨基糖苷类抗菌药物，12 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析耐药率为阿米卡星（23%）；对替加环素及多粘菌素B的耐药率相对较低，分别为23.5%及7.1%。药敏试验结果见表2-3所示。表2-3.抗菌药物对80株CRKP的MIC值MIC(ug/ml)%抗菌药物MICRMIC50MIC90敏感率耐药率亚胺培南（IPM）1-12883216.872.6厄他培南（ETP）2-2568322.5777.5美罗培南（MEM）1-25625625643.229.8头孢他啶（CAZ）0.125-5125125122.396.4头孢西丁（FOX）64-5125125120100头孢噻肟（CTX）0.125-5121285124.894.5头孢吡肟(FEP)0.125-512322567.169.9阿米卡星(AK)2-512451275.223环丙沙星(CIP)0.125-32323235.457.3哌拉西林/他唑巴坦16-25625625610.565.9(TZP)头孢哌酮/舒巴坦(SCF)32-256128256094.8氨曲南(ATM)2-2561285125.290.8多粘菌素B(PB)0.5-640.50.591.97.1替加环素(FDA)0.125-12821650.923.53.2CRKP菌株同源性分析3.2.1EricPCR扩增结果经EricPCR扩增，80株肺炎克雷伯菌可分为16个型别，编号分别为A-P，见图2-113 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析MABCDEFGHIJKLMNOPQRST图2-1.16株不同型别EricPCR电泳图3.2.2PCR扩增结果将Eric分型中A-P不同的16株菌株DNA再进行PCR扩增，引物分别为MLST中的七个管家基因，扩增效果见下图2-2。14 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析图2-2MLST7对管家基因PCR电泳图3.2.3测序比对结果上述16份PCR扩增产物进行序列分析，将7对管家基因对应的数字上传到MLST网站得到ST分型，其中ST11、ST23和ST15型各有2株，其余ST375、ST307、ST753、ST1031、ST219、ST709、ST2270、ST534、ST290和ST1087各1株，ST分型见下表2-5。15 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析表2-416株不同型别肺炎克雷伯菌ST分型菌株编等位基因谱ST分号gapAinfBmdhpgiphoErpoBtonB型1331111411643121104133757412521173072211111111521412113541275318211194122325182218231341351103131212327139219B7211194122316231206141332270852112614132534B812113710186290B8111111115B633111141191111114709B152111333810873.2.4确定每株肺炎克雷伯菌分型结合Eric-PCR电泳图谱，将电泳图与16株不同型别肺炎克雷伯菌的电泳图谱进行比对，图谱一致的两株菌为相同分型。3.2.5肺炎克雷伯菌MLST分型在地区间分布表2-5CRKP菌株在各地区分布情况ST分型113753071575323227053429070910871031219南昌10629331112211景德镇7234110110100新余621211011010116 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析4讨论4.1药物敏感性研究结果分析目前，临床上治疗CRKP感染最常用的抗菌药物是碳青霉烯类抗生素。对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌一般为多重耐药，本次收集的CRKP菌株只有8株非多重耐药。药敏试验显示受试菌对替加环素、多粘菌素B和阿米卡星的抗菌活性最高，对头孢西丁耐药率最高。本研究发现厄他培南、亚胺培南两种抗生素的耐药率远远高于美罗培南[28-31]（72.6%、77.5%VS29.8%），可能原因是前者研发早，在临床应用时间较早，而美罗培南应用于临床不久。本研究中有10株CRKP菌株对亚胺培南耐药，而[29]对美罗培南敏感，究其原因可能是两者耐药机制有差异，美罗培南的抗菌靶[31]位是PBP2和PBP3，而亚胺培南仅对PBP2有高亲和力。VillegasMV等对分离的77株CRKP菌株进行药敏试验，发现CRKP菌株对多黏菌素B和替加环素的耐药率均仅为3.9％。有文献显示治疗CRKP菌株引起的感染疾病时，可选用多[32]黏菌素B联合氨基糖苷类抗菌/替加环素进行联合治疗。本研究中，80株CRKP[33]菌株对其耐药率分别为7.1%及23.5%，耐药率明显高于文献数据。造成的原因可能是标本的来源和抗生素的使用有区别。药敏结果显示，多粘菌素B联合替加环素在临床上治疗CRKP菌株感染效[34]果较好。CalfeeD等学者提出无症状的定植患者可能为重要的传染源储菌库。所以医生在日常工作中应高度重视其隔离措施的执行，合理选择抗菌药物的使用。总之，减少侵袭性操作，加强环境消毒，阻断传播途径，防止菌株在院内的储存和患者间传播，同时合理使用抗生素是降低CRKP感染风险的关键措施。4.2感染CRKP基因型分析本研究中80株肺炎克雷伯菌中主要以ST11型为主，占所有菌株中的28.75%[35]（23/80），其次较多的型别为ST375和ST15。研究表明，ST11是中国肺炎克[36-42]雷伯菌的主要流行株。在日本和新加坡，也存在ST11肺炎球菌肺炎流行。本研究发现，三个地区的主要基因型均为ST11型，呈现出克隆和传播的趋势。南昌大学第一附属医院是江西省规模最大的综合性医院，患者主要来自江西不同县区。因此，ST11型可以代表江西省的主要流行类型，也与新余和景德镇的[45]主要基因型结果一致。浙江省首次报告肺炎克雷伯菌（ST11），可能是由于浙17 第二部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的体外药物敏感性研究及同源性分析江地处沿海，交通便利，人口流动性大，成为耐药菌株传播的起点。本研究结果表明，该地区与沿海城市肺炎克雷伯菌的主要基因型是相同的，这表明菌株已经由沿海地区向内陆地区蔓延。本研究显示23株ST11型有20株产KPC酶(86.95％,20/23)，与杭州、宁波、绍[45]兴等地区曾报道的结果一致，同时发现所有的ST11型CRKP均来自同一菌群(ERIC分型中主要克隆群A)：虽然江西地区耐药菌基本来源于同一克隆群(ST11型)，但仍需警惕其他克隆群菌株的流行。本研究还发现7种散发ST型：ST2270、ST534、ST290、ST709、ST1087、ST1031和ST219，也要引起医院感染管理的重视。为了减少院内感染发生，我们在加强宣传医院感染的相关知识，做到早期监测、早控制和早隔离，及时交换各个科室之间感染信息，降低科室间的交叉感染。严格要求各个科室做好诊疗环境及医用物品消毒的规范。18 第三部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶研究第三部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶研究1材料与方法1.1实验材料(一)抗生素：头孢他啶标准品购自美国辉瑞制药公司。(二)主要试剂和培养基：参照第二部分。(三)主要仪器：参照第二部分。1.2实验方法1．PCR法检测碳青霉烯类耐药基因1)PCR模板：参照第二部分。2)PCR扩增碳青霉烯酶基因的环境：基因序列在文献查找，使用premier5.0软件制作各基因扩增引物，并送往北京生物技术有限公司完成，引物序列见表3-1扩增体系：引物1（20uM）1ul引物2（20uM）1ulTaqDNA聚合酶（5U/ul）0.25ul210×PCRBuffer（Mg＋Free）5uldNTPMixture（各2.5mM）4ulMgCl2（25mM）3ul灭菌蒸馏水加至50ul19 第三部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶研究反应环境：温度（℃）945min9460s2660s循环四次7260s9430s4030s循环四十次72560s7210min表3-1.PCR引物序列、长度和参考文献GeneSequenceProduct（bp）ReferenceF5’-GCTACACCTAGCTCCACCTTC-3’blaKPC-1709[44]R5’-GCATGGATTACCAACCACTGT-3’F5'-CTACCGCAGCAGAGTCTTTG-3'blaIMP587[45]R5'-AACCAGTTTTGCCTTACCAT-3'F5'-CTCGCACCGAATGTCTGGC-3'blaNDM-1386[46]R5'-CATTGGCGGCGAAAGTCA-3'F5'-ATGGTGTTTGGTCGCATATC-3'blaVIM510[47]R5'-TGGGCCATTCAGCCAGATC-3'F5'-TTATGGAGCAGCAACCGATGT-3'blaVIM-1920[48]R5'-CAAAAGTCCCGCTCCAACGA-3'F5'-AAAGTTATGCCGCACTCACC-3'blaVIM-2865[48]R5'-TGCAACTTCATGTTATGCCG-3'F5'-GTCACTTAATGTAAAGCA-3’blaNMC-A869[48]R5’-GGTTATCAATTGCAATTC-3F5’-CTAATAATTGATCTACTCAAG-3’blaOXA-69975[49]R5'-CCAGTGGATGGATGGATAGATTATC-3'F5'-AAAGGAGTTGTCTCATGCTGTCTCG-3’blaOXA-60848[50]R5’-AACCTACAGGCGCGCGTCTCACGGTG-3F5'-CATCTACCTTTAAAATTCCC-3'blaOXA-55870[51]R5'-AGCTGTTCCTGCTTGAGCAC-3'F5’-AATCCGGCGCTCATCCATC-3’blaOXA-50869[49]R5'-GGTCGGCGACTGAGGCGG-3'F5'-TTGGTGGCATCGATTATCGG-3’blaOXA-48743[48]R5’-GAGCACTTCTTTTGTGATGGC-320 第三部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶研究（二）检测其他β-内酰胺酶1.多重PCR检测OXA型碳青霉烯酶基因查阅文献获取PCR扩增引物序列，委托北京生物技术有限公司合成，查阅引物序列见表3-2。表3-2.多重PCR检测OXA型碳青霉烯酶基因的引物序列及产物长度引物片段参考基因型引物名序列（5’3’）长度（bp）文献blaOXA-23FGATCGGATTGGAGAACCAGA501[52]RATTTCTGACCGCATTTCCATblaOXA-24FGGTTAGTTGGCCCCCTTAAA246[52]RAGTTGAGCGAAAAGGGGATTblaOXA-51FTAATGCTTTGATCGGCCTTG353[52]RTGGATTGCACTTCATCTTGGblaOXA-58FAAGTATTGGGGCTTGTGCTG599[52]RCCCCTCTGCGCTCTACATAC2.PCR检测blaTEM、blaSHV、blaCTX-M等各型别耐药基因：反应体系及条件同上述。引物序列参见表3-3。表3-3.ESBLs基因引物序列、长度和参考文献引物产物引物名称参考文献序列（5’3’）长度（bp）TEMFATGAGTATTCAACATTTCCG859[53]TEMRCCAATGCTTAATCAGTGAGGSHVFAGGATTGACTGCCTTTTTG392[54]SHVRATTTGCTGATTTCGCTCGCTX-M-1群FGGTTTAAAAAATCACTGCGTC833[55]CTX-M-1群RTTGGTGACGATTTTAGCCGCCTX-M-2群FATGATGACTCAGAGCATTCG865[56]CTX-M-2群RTGGGTTACGATTTTCGCCGCCTX-M-8群FATGATAGAGACATCGCGTTAAG864[57]CTX-M-8群RCGGTGACGATTTTCGCGGCAGCTX-M-9群FATGGTGACAAAGAGAGTGCA863[56]CTX-M-9群RCCCTTCGGCGATGATTCTCCTX-M-25群FCACACGAATTGAATGTTCAG924[58]CTX-M-25群RTCACTCCACATGGTGAGT4.扩增产物电泳：将产物置于1.2%琼脂糖，电压设置为180V，时间是指21 第三部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶研究为30分钟，最后通过紫外成像仪上拍照读取结果。2实验结果2.1碳青霉烯酶的检测1.PCR检测碳青霉烯酶基因经PCR检测和测序确认，CRKP临床分离检出单产blaKPC型基因18株（22.50%,18/80），检出31株IMP型耐药基因（38.75%,31/80）,分别为19株IMP-4型耐药基因，12株IMP-8型耐药基因。2株菌株同时携带blaIMP-4和blaNDM-1，2株菌株同时携带blaIMP-8和blaKPC-2。4株CRKP菌株仅携带blaNDM-1（5.00%,4/80）。而其余类别耐药基因均未扩增出阳性结果。80株CRKP菌株携带碳青霉烯酶基因的情况见表3-4。部分KPC耐药基因检测结果见图3-1。表3-4.80株CRKP菌株碳青霉烯酶基因阳性率基因阳性例数（株）阳性率（%）单产blaIMP3138.75单产blaNDM-145.00单产blaKPC1822.50blaIMP-4+blaNDM-122.35blaIMP-8+blaKPC-222.352.2其他β-内酰胺酶基因1.其他β-内酰胺酶基因检测经PCR检测和测序确认，80株CRKP均检出45株携带blaTEM；38株携带blaSHV，其中亚型最多的为blaSHV-12（18株）；blaCTX-M-918株阳性，分别为12株blaCTX-M-14，6株blaCTX-M-65；blaCTX-M-113株阳性，分别为5株blaCTX-M-115，4株blaCTX-M-79和4株blaCTX-M-3；未发现阳性标本的亚型包括blaCTX-M-2、blaCTX-M-8、blaCTX-M-22和blaCTX-M-25。80株CRKP菌株中的其他β-内酰胺酶基因分型见表3-5。部分β-内酰胺酶耐药基因检测结果见图3-2。22 第三部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶研究表3-5.80株CRKP菌株中其他β-内酰胺酶基因检测情况基因类型阳性例数（株）阳性率（%）blaTEM型4556.25blaSHV型3847.50blaCTX-M-91822.50blaCTX-M-11316.25图3-1.部分KPC耐药基因检测结果1为阳性对照，2为阴性对照，3、4为KPC基因阳性条带。图3-2.部分β-内酰胺酶耐药基因结果1：CTX-M-1；2：CTX-M-9;3：TEM；4：SHV；23 第三部分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶研究3讨论目前用于治疗由CRKP菌株引起的感染性疾病的抗生素主要为美罗培南、[59]亚胺培南和厄他培南，但近些年在国内外研究发现对其耐药现象越来越多。CRKP菌株的耐药机制主要是产碳青霉烯酶，其主要包括三类：(1)染色体介导[60][61][62]的A类酶，如blaIMI和blaNMC-A；(2)质粒介导的A类酶，如blaGES和[63][64][65]blaKPC；(3)金属酶(B,MBL类)，主要包括blaVIM、blaIMP。[67]随着美国加州分离世界上第一株产KPC的肺炎克雷伯菌，碳青霉烯类抗生素耐药性问题逐步引起重视。起初其主要耐药机制是产生AmpC酶合并膜孔[51]蛋白的的丢失，当前研究最多的机制是由于产生碳青酶烯酶。现已发现14种变异酶，在肺炎克雷伯菌中发现11种均具有碳青霉烯酶活性，它们相互之间有1～3个氨基酸的差异。2007年中国首次报道肺炎克雷伯菌中分离到KPC酶[69](KPC-2型)。本研究中，携带blaKPC的阳性菌株20株（25%，20/80），与江[70]苏和浙江等地区报道的研究结果相符。美国肺炎克雷伯菌产ESBLs酶的检出主要包括blaTEM和blaSHV，同时[71][72]blaCTX-M也在呈上升趋势；在欧洲地区,流行的主要类型是blaTEM和blaCTX-M;[73-74]blaCTX-M是近些年南美地区的主要类型;在亚洲，blaCTX-M正在迅速传播和变[72]异。根据卓超研究表明，中国kp菌产ESBLs酶的检出主要包括blaCTX-M-14和blaCTX-M-3。本研究结果显示，江西部分医院产ESBLs肺炎克雷伯菌临床分离株主要耐药基因为blaTEM（45/80，56.25%），其次为blaSHV（38/80，47.50%）和blaCTX-M（31/80，38.75%），与前者结果有差异的可能原因是不同地区抗生素管理和抗感染治疗方法存在差异，导致不同地区产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因存在差异。应加强医院感染预防和控制措施，防止其蔓延。目前，产NDM-1酶细菌已在全球多个国家相继检出和报道，包括印度、中[71][72]国大陆及香港、台湾地区，其多在肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌检出。本研究中检出的金属酶为NDM-1（4/80，5.00%），与学者的研究一致。日本最早临床分离出IMP型金属酶。当前，全球范围不断有CRKP菌株产[71]IMP金属酶的报道。至目前，我国产IMP金属酶肠杆菌科细菌的报道很少，[71]广州最先于2001年中检测到IMP-4金属酶杨氏枸橼酸杆菌。本研究检出的IMP型耐药基因，19株IMP-4型耐药基因，12株IMP-8型耐药基因。24 第四部分结论第四部分结论1、入住ICU、进行手术、泌尿道插管是江西部分医院感染CRKP的独立危险因素。2、江西部分医院临床分离出的肺炎克雷伯菌耐药比较严重，主要包括碳青霉烯酶和产超广谱β-内酰胺酶。3、江西部分医院临床中分离的CRKP以ST11型为主，主要分布在重症医学病区、烧伤整形科。25 致谢致谢研究生的学习和工作即将结束，回首三年的生活。首先感谢我的导师曹先伟教授在学习生活的悉心帮助，对导师付出的辛勤劳动致以最衷心的感谢和最诚挚的敬意。感谢南昌大学第一附属医院刘洋老师对本课题给予的大量指导和鼓励。同时，我得到南昌大学第一附属医院检验科各位老师的帮助，在此一并表示感谢。特别感谢邓琼师兄、魏丹丹师姐、王连慧师姐、刘盼盼同学、曾玲师妹和女友王小红，希望以后还有机会继续合作，共同进步。感谢我的父母，有了你们的支持和鼓励，我才能更坦然地面对生活中的各种挑战！刘鹏2018年4月20日26 参考文献参考文献[1].LoganLK.Carbapenem-resistantenterobacteriaceae:anemergingprobleminchildren[J].ClinInfectDis.2012,55(6):852-9.[2].MarsikFJ,NambiarS.ReviewofcarbapenemasesandAmpC-betalactamases[J].PediatrInfectDisJ.2011,30(12):1094-5.[3].NordmannP,CuzonG,NaasT.TherealthreatofKlebsiellapneumoniaecarbapenemase-producingbacteria.[J].TheLancetinfectiousdiseases,2009,(4):228-236.[4].GeraciDM,BonuraC,GiuffreM,SaporitoL,GrazianoG,AleoA,etal.IsthemonoclonalspreadoftheST258,KPC-3-producingclonebeingreplacedinsouthernItalybythedisseminationofmultipleclonesofcarbapenem-nonsusceptible,KPC-3-producingKlebs-iellapneumoniae?[J].ClinMicrobiolInfect.2015,21(3):e15-7.[5].DelfinoE,GiacobbeDR,DelBonoV,CoppoE,MarcheseA,MannoG,etal.FirstreportofchronicpulmonaryinfectionbyKPC-3-producingandcolistin-resistantKlebsiellapneumo-niaesequencetype258(ST258)inanadultpatientwithcysticfibrosis[J].JClinMicrobiol.2015,53(4):1442-4.[6].Sorlozano-PuertoA,Esteva-FernandezD,Oteo-IglesiasJ,Navarro-MariJM,Gutierrez-FernandezJ.AnewcasereportofurinarytractinfectionduetoKPC-3-producingklebsiellapneumoniae(ST258)inSpain[J].ArchEspUrol.2016,69(7):437-40.[7].LamoureauxTL,FraseH,AntunesNT,VakulenkoSB.AntibioticresistanceandsubstrateprofilesoftheclassAcarbapenemaseKPC-6[J].AntimicrobAgentsChemother.2012,56(11):6006-8.[8].DornelesEM,SantanaJA,AndradeGI,etal.Molecularcharacterizationof,CorynebacteriumpseudotuberculosisisolatedfromgoatsusingERIC-PCR[J].Genetics&MolecularResearchGmr,2012,11(3):2051[9]卓超,苏丹虹,倪语星,等.2009年中国CHINET大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2010,10(6):430-435.[10]朱德妹，汪复，胡付品，等。2010年中国CHINET细菌耐药性检测[J].中国感染与化疗杂志.2011，11（5）：321-329.[11]胡付品，朱德妹，汪复，等.2011年中国CHINET细菌耐药性检测[J].中国感染与化疗杂志.2012，12（5）：321-329.[12]汪复,朱德妹,胡付品,等.2012年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2013,11(5):1-9.[13]胡付品，朱德妹，汪复，等.2013年中国CHINET细菌耐药性检测[J].中国感染与化疗杂志.2014，14（5）：365-374.[14]GastmeierP,VonbergRP.Klebsiella,spp.inendoscopy-associatedinfections:wemayonlybeseeingthetipoftheiceberg[J].Infection,2014,42(1):15-21.[15]SchwaberMJ,CarmeliY.AnOngoingNationalInterventiontoContaintheSpreadof27 参考文献Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae[J].ClinicalInfectiousDiseasesAnOfficialPublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica,2014,58(5):697.[16]NaasT,CuzonG,TruongHV,etal.RoleofISKpn7andDeletionsinblaKPCGeneExpression[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy,2012,56(9):4753-9.[17]Hidalgo-GrassC,WarburgG,TemperV,etal.KPC-9,anovelcarbapenemasefromclinicalspecimensinIsrael[J].AntimicrobAgentsChemother,2012,56(11):6057-6059.[18]YalcinAN.Socioeconomicburdenofnosocomialinfections[J].IndianJMedSci,2011,57(10):450-456.[19]BanachDB,FrancoisJ,BlashS,etal.Activesurveillanceforcarbapenem-resistantEnterobacteriaceaeusingstoolspecimenssubmittedfortestingforClostridiumdifficile.[J].InfectionControl&HospitalEpidemiology,2014,35(1):82-84.[20]MarioTumbarello,TeresaSpanu,etal.BloodstreamInfectionsCausedbyExtended-Spectrum-β-Lactamase-ProducingKlebsiellapneumoniae:RiskFactors,MolecularEpidemiology,andClinicalOutcome[J].ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,2006,50(2):498-504.[21]Chang-HuaChen,Chieh-ChenHuang.Riskfactoranalysisforextended-spectrumβ-lactamase-producingEnterobactercloacaebloodstreaminfectionsincentralTaiwan[J].InfectiousDiseases,2013,13(6):417.[22]LuciCorrea,MarinesDallaValleMartino,ItacySiqueiraetal.Ahospital-basedmatchedcase–controlstudytoidentifyclinicaloutcomeandriskfactorsassociatedwithcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeinfection[J].InfectiousDiseases,2013,13(6):80[23]邓琼.医院感染血液中肺炎克雷伯菌的分子流行病学及其耐碳青霉烯类抗菌药物危险因素调查[D].南昌大学,2014.[24]BaraniakA,GrabowskaA,IzdebskiR,etal.MolecularcharacteristicsofKPC-producingEnterobacteriaceaeattheearlystageoftheirdisseminationinPoland,2008-2009[J].AntimicrobAgentsChemother,2011,55(6):5493-5499.[25]CLSI(2014)Performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting;twenty-fourthinformationalsupplement.M100-S22[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2014.ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.[26]QueenanAM,BushK.Carbapenemases:theversatilebeta-lactamases[J].ClinMicrobiolRev,2007,20(3):440-458.[27]DavidvanDuin,KeithS.Kaye,ElizabethA.Neuner,等.Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae:areviewoftreatmentandoutcomes,[J].DiagnosticMicrobiology&InfectiousDisease,2013,75(2):115-120.[28]DeshpandeLM,SaderHS,FritscheTR,etal.ContemporaryprevalenceofBRObeta-lactamasesinMoraxellacatarrhalis:reportfromtheSENTRYantimicrobialsurveil-lanceprogram(NorthAmerica,1997to2004)[J].JournalofClinicalMicrobiology,2006,44(10):3775-3777.28 参考文献[29]CastanheiraM,FarrellSE,DeshpandeLM,etal.Prevalenceofβ-Lactamase-EncodingGenesamongEnterobacteriaceaeBacteremiaIsolatesCollectedin26U.S.Hospitals:ReportfromtheSENTRYAntimicrobialSurveillanceProgram(2010)[J].AntimicrobAgentsChemother,2013,57(7):3012-3020.[30]NaasT,NordmannP,VedelG,etal.Plasmid-MediatedCarbapenem-Hydrolyzingβ-LactamaseKPCinaKlebsiellapneumoniaeIsolatefromFrance[J].AntimicrobAgentsChemother,2005,49(10):4423-4424.[31]VillegasMV,LolansK,CorreaA,etal.Firstdetectionoftheplasmid-mediatedclassAcarbapenemaseKPC-2inclinicalisolatesofKlebsiellapneumoniaefromSouthAmerica[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy,2006,50(8):2880.[32]FalagasME,KarageorgopoulosDE.Pandrugresistance(PDR),extensivedrugresistance(XDR),andmultidrugresistance(MDR)amongGram-negativebacilli:needforinternationalharmonizationinterminology.[J].ClinicalInfectiousDiseases,2008,46(7):1121-1122.[33]马季娜等，亚胺培南-西司他丁的抗生素后效应及影响因素的研究[J]，中国抗生素杂志，1998,23（6）：443-446[34]CalfeeD,JenkinsSG.Useofactivesurveillanceculturestodetectasymptomaticcolonizationwithcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeinintensivecareunitpatients[J].InfectControlHospEpidemiol,2008,29(10):966-968.[35]李娟，王晓辉，吕晓菊.成人肺炎克雷伯菌败血症53例临床分析[J],2008,33(8):491-494.[36]孙璐.某院2003-2008年败血症患者血液中病原菌分布、耐药性及感染危险因素调查[D].广东:南方医科大学公共卫生学院:2009.[37]孙璐，聂军，芮勇宇等.败血症患者血液中病原菌分布、耐药性及感染危险因素调查[J],2009,29(5):990-992.[38]QiY,WeiZ,JiS,etal.ST11,thedominantcloneofKPC-producingKlebsiellapneumoniaeinChina.JAntimicrobChemother.2011,66(4):307-312.[39]LeeCM,LiaoCH,LeeWS,LiuYC,MuJJ,LeeMC,etal.OutbreakofKlebsiellapneumoniaecarbapenemase-2-producingK.pneumoniaesequencetype11inTaiwanin2011.AntimicrobAgentsChemother.2012,56(3):5016-5022.[40]BalmMN,NganG,JureenR,LinRT,TeoJ.MolecularcharacterizationofnewlyemergedblaKPC-2-producingKlebsiellapneumoniaeinSingapore.JClinMicrobiol,12;50(6):475-476.[41]RheeJY,ParkYK,ShinJY,etal.KPC-producingextremedrug-resistantKlebsiellapneum-oniaeisolatefromapatientwithdiabetesmellitusandchronicrenalfailureonhemodialysisinSouthKorea[J].AntimicrobAgentsChemother.2010,54(4):2278-2279.[42]GiakkoupiP,PapagiannitsisCC,MiriagouV,etal.AnupdateoftheevolvingepidemicofblaKPC-2-carryingKlebsiellapneumoniaeinGreece(2009-10).JAntimicrobChemother,2011,66(5):1510-1513.[43]PereiraPS,deAraujoCF,SekiLM,ZahnerV,Carvalho-AssefAP,AsensiMD.UpdateofthemolecularepidemiologyofKPC-2-producingKlebsiellapneumoniaeinBrazil:spreadof29 参考文献clonalcomplex11(ST11,ST437andST340)[J].JAntimicrobChemother,2012,66(8):1510-1513.[44]WolterDJ,KurpielPM,WoodfordN,etal.PhenotypicandEnzymaticComparativeAnalysisoftheNovelKPCVariantKPC-5andItsEvolutionaryVariants,KPC-2andKPC-4[J].AntimicrobAgentsChemother,2009,53(2):557-562.[45]冯雅君，沈萍，杜小幸，等.产碳青霉烯酶KPC-2肺炎克雷伯菌局部流行[J].浙江医学.2008，30（9）：923-930[46]WoodfordN,TiernoPM,YoungK,etal.OutbreakofKlebsiellapneumoniaeProducingaNewCarbapenem-HydrolyzingClassAβ-Lactamase,KPC-3,inaNewYorkMedicalCenter[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy,2004,48(12):4793-9.[47]ShahcheraghiF,NobariS,RahmatiGF,etal.FirstreportofNewDelhimetallo-beta-lactamase-1-producingKlebsiellapneumoniaeinIran.[J].MicrobialDrugResistance,2013,19(1):30-36.[48]XiongJ,HynesMF,YeH,etal.bla(IMP-9)anditsassociationwithlargeplasmidscarriedbyPseudomonasaeruginosaisolatesfromthePeople'sRepublicofChina[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy,2006,50(1):355-8.[49]FrancoMR,CaiaffafilhoHH,BurattiniMN,etal.Metallo‐beta‐lactamasesamongimipenem‐resistantPseudomonasaeruginosainabrazilianuniversityhospital[J].Clinics,2010,65(9):825-829.[50]ChangYL,ChouMH,LinMF,etal.Determinationandpharmacokineticstudyofmeropeneminratbileusingon-linemicrodialysisandliquidchromatography.[J].JournalofChromatographyA,2002,961(1):119-124.[49]KangYK,etal.Synthesisandantibacterialactivityofnewcarbapenenmscontainingisoxazolemoiety[M].BioorgandMedChemLett.2000.10(2):95-99.[50]HirschEB,TamVH.DetectionandtreatmentoptionsforKlebsiellapneumoniaecarbapenemases(KPCs):anemergingcauseofmultidrug-resistantinfection.[J].JAntimicrobChemother,2010,65(6):1119-1125.[51]ChangYL,ChouMH,LinMF,etal.Determinationandpharmacokineticstudyofmeropeneminratbileusingon-linemicrodialysisandliquidchromatography.[J].JournalofChromatographyA,2002,961(1):119-124.[52]LeeYT,FungCP,WangFD,etal.Outbreakofimipenem-resistantAcinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumanniicomplexharboringdifferentcarbapenemasegene-associatedgeneticstructuresinanintensivecareunit[J].JMicrobiolImmunolInfect,2012,45(1):43-51.[53]TonkicM,MoharB,SiskokraljevićK,etal.Highprevalenceandmolecularcharacterizationofextended-spectrumβ-lactamase-producingProteusmirabilisstrainsinsouthernCroatia.[J].JournalofMedicalMicrobiology,2010,59(10):1185-90.[54]AmitabhaBhattacharjee,MalayRanjanSen,PradyotPrakash,etal.Roleofβ-lactamaseinhibitorsinenterobacterialisolatesproducingextended-spectrumβ-lactamases[J].Journal30 参考文献ofAntimicrobialChemotherapy,2008,61(2):309-314.[55]YeonJoonPark,SeungokLee,YangReeKim,etal.Occurrenceofextended-spectrumβ-lactamasesandplasmid-mediatedAmpCβ-lactamasesamongKoreanisolatesofProteusmirabilis[J].JournalofAntimicrobialChemotherapy,2006,57(1):156-8.[56]GarrecH,DrieuxrouzetL,GolmardJL,etal.ComparisonofNinePhenotypicMethodsforDetectionofExtended-Spectrumβ-LactamaseProductionbyEnterobacteriaceae[J].JournalofClinicalMicrobiology,2011,49(3):1048-57.[57]Navon-VeneziaS,ChmelnitskyI,LeavittA,etal.DisseminationoftheCTX-M-25familybeta-lactamasesamongKlebsiellapneumoniae,EscherichiacoliandEnterobactercloacaeandidentificationofthenovelenzymeCTX-M-41inProteusmirabilisinIsrael[J].JournalofAntimicrobialChemotherapy,2008,62(2):289.[58]GorenMG,NavonveneziaS,ChmelnitskyI,etal.Carbapenem-resistantKPC-2-producingEscherichiacoliinaTelAvivMedicalCenter,2005to2008.[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy,2010,54(6):2687.[59]BenensonS,TemperV,CohenMJ,etal.ImipenemDiscforDetectionofKPCCarbapenemase-ProducingEnterobacteriaceaeinClinicalPractice[J].JournalofClinicalMicrobiology,2011,49(4):1617-20.[60]Tribuddharat,C,SrifuengfungS,ChiangjongW.Preliminarystudyofrandomly-amplifiedpolymorphicDNAanalysisfortypingextended-spectrumbeta-lactamase(ESBL)-producingKlebsiellapneumoniae[J].JMedAssocThai,2008,91(4):527-532.[61]石晓路,刘小立,黄薇,等.脉冲场凝胶电泳在沙门菌食物中毒溯源中的应用研究.疾病控制杂志[J],2007,11(5):502-504.[62]朱佩琼,郑慧娟,俞云松,等.产ESBLs的肺炎克雷伯菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究[J].疾病监测,2008,23(3):140-143.[63]胡冬梅,陈世平.肺炎克雷伯菌的耐药性及PFGE电泳核型.中华微生物学和免疫学杂志[J],2000,20(4):319-322.[64]刘红露,张京云,冯泽惠,等.脉冲场凝胶电泳分型技术在追溯O139霍乱传染来源中的应用[J].中华流行病学杂志,2006,27(2):102-106.[65]Khot,PD,FredricksDN.PCR-baseddiagnosisofhumanfungalinfections.ExpertRevAntiInfectTher[J],2009,7(10):1201-1221.[66]叶智颖,吕火祥,胡庆丰,等.耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌KPC酶检测分析[J].中国卫生检验杂志,2011(2):454-455.[67]VirgincarN,IyerS,StaceyA,MaharjanS,PikeR,PerryC,etal.KlebsiellapneumoniaeproducingKPCcarbapenemaseinadistrictgeneralhospitalintheUK.JHospInfect,2011,78(7):293-296.[68]冯雅君，沈萍，杜小幸，等.产碳青霉烯酶KPC-2肺炎克雷伯菌局部流行[J].浙江医学.2008，30（9）：923-930[69]WeiZQ,DuXX,YuYS,etal.Plasmid-mediatedKPC-2inaKlebsiellapneumoniaeisolatefromChina.[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy,2007,51(2):763-765.31 参考文献[70]BushK.Extended-spectrumB-lactamasesinNoahAmerica,1987-2006.ClinMicrobialInfect,2008,14(Suppl1):134—143．[71]CoqueTM,BaqueroF,CantonR.IncreasingprevalenceofESBLs-producingEntero-bacter-iaceaeinEurope.EuroSurveill,2008,13(47):pii:19044．[72]卓超，苏丹虹，李红玉，等．广州地区产CTX-M型超广谱B内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的研究．中华检验医学杂志，2009，32(10)：lll4—1119．32 附录附录感染CRKP菌株患者病例资料登记表姓名：住院号：性别：年龄：入院科室：病例来源：主要疾病诊断：123如已出院，疾病最终转归：1、治愈2、好转3、无变化4、恶化5、死亡是否发生医院感染：1、是2、否3、无感染1、医院感染名称：医院感染部位：2、社区感染名称：社区感染部位：存在危险因素打勾1、泌尿道插管2、使用呼吸机3、放疗、化疗4、手术5、抗菌药物6、动静脉置管7、使用免疫抑制剂8、入住ICU抗菌药物使用情况药物名称剂量使用时间联用情况1233 攻读学位期间的研究成果攻读学位期间的研究成果已发表的论文:[1]XieXX,LiuP,WanFY,etal.Bloodpressureloweringandstrokeeventsintype2diabetes:Anetworkmeta-analysisofrandomizedcontrolledtrials[J].InternationalJournalofCardiology,2016,208:141-146.共同第一作者，影响因子为：6.18934 综述综述碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌机制及分子流行病学研究摘要：本综述主要分析了耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的分子流行病学及耐药机制。自上个世纪80年代，多药耐药革兰阴性菌的最有效治疗是碳青霉烯类抗菌药物。获得性碳青霉烯酶是造成碳青霉烯类耐药的主要原因，另外还有外排泵的产生以及孔蛋白缺失或下调表达。笔者针对碳青霉烯类耐药机制的研究进展作一综述。关键词：肺炎克雷伯菌；分子流行；耐药机制；碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌是革兰氏阴性菌中的一个重要分类，该类细菌已经成临床感[1]染病例中最重要的致病菌之一。随着对β-内酰胺类药物耐药性的增加，越来越少的抗生素能有效治疗革兰阴性杆菌特别是多重耐药肠杆菌科细菌的感染。作为治疗肠杆菌科感染的最后一道防线，碳青霉烯类药物广泛使用于临床抗感染[2]中。但是，自从20世纪90年代的早期耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)首次[3-5]发现以来，其流行率不断上升，使该药物的临床应用也面临了严重的挑战。１碳青霉烯类抗菌药物碳青霉烯类抗菌药物是使用最多的针对革兰阴性菌的广谱β-内酰胺类抗菌药物，曾被认为是自20世纪80年代来对抗多药耐药革兰阴性菌的最后一道防[9-13][13-16]线。1976年从牲畜链霉菌中发现，结构与青霉素类和头孢类均有所不同。[17碳青霉烯类抗菌药物具有的共同特征：抗菌谱广抗菌作用强、对多数细菌产生的β-内酰胺酶高度稳定（包括ESBLs）等。通过与细菌青霉素结合蛋白（PBP）结合，抑制细菌细胞壁的合成，从而发挥抗菌作用；对革兰阳性菌、革兰阴性菌及厌氧菌均有强大的抗菌活性。但是随着该类药物的大量使用，细菌也逐渐获得了耐药性[18,19]2流行与传播在发达国家CRKP的传播大多发生在医疗保健所，主要传播途径是通过医35 综述护工作者的手在患者之间传播。在这个传播途径中，需要三个步骤：首先，医护工作者必须触摸过一个CRKP定植或感染患者，此时医护工作者就会成为CRKP的暂时定植者，之后再治疗一个不携带也未感染CRKP的患者（例如，不更换手套或者洗手）。因此，获得CRKP或者多药耐药菌的因素不仅仅取决于单[20,21]个患者，也取决于其他患者的状态。[22-25]3肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制[26]自1997年CRKP首次被发现以来，世界各国各地区陆续出现。细菌耐药主要有以下方面：耐药酶的产生、靶位的改变、主动外排泵和膜通透性的改变、[27]过量合成靶酶或竞争性靶酶底物等。[28-31]3.1耐药酶的产生碳青霉烯酶是一类能够明显水解至少亚胺培南或美罗培南的一类β－内酰胺酶，可分Ａ、Ｂ和Ｄ３类。其中Ａ和Ｄ类属于丝氨酸酶，Ａ类酶主要见于肠杆菌科细菌，以KPC酶为主，Ｄ类酶（OXA型酶）主见于不动杆菌，Ｂ类酶属[18,19]于金属酶。[32-35]3.1.1Ａ类碳青霉烯酶自从20多年前发现第1个Ａ类碳青霉烯酶以来，至今已发现的A类碳青霉烯酶至少可以分为８类：KPC（主要存在于肺炎克雷伯菌）、mca／IMI（主要存在于阴沟肠杆菌）、SME（主要存在于黏质沙雷菌）、GES、FPH、FTU、BIC和SFC。其中GES、KPC其他均由染色体介导。Ａ类碳青霉烯酶为丝氨酸碳青霉烯酶，在Bush分类中属于２f组，由265-269个氨基酸组成，分子量在25～32之间，等电点从5.8-9.7不等。所有A类酶均可以水解各种β－内酰胺类抗菌[32]药物，包括碳青霉烯类、青霉素类、氨曲南，主要通过水解丝氨酸活性位点[33]使药物失活，其水解活性在体外能被克拉维酸和他唑巴坦抑制，但不能被EDTA所抑制。（1）IMI、Nmc－Ａ、SME酶由染色体编码，IMI与Nmc－Ａ氨基酸序列有99％相同。IMI发现于美国环境中的大肠埃希菌以及中国的阴沟肠杆菌中，它是第1个由质粒编码且具有诱导性的碳青霉烯酶，与IMI和Nmc－Ａ的同源性分别为99％和97％。Nmc－Ａ于1990年从法国患者分离的一株阴沟肠杆菌中被发现。SME酶只在黏质沙雷菌中被发现，包括３种变体，且全部染色体编码。（2）KPC、GES酶是质粒介导的A类丝氨酸碳青霉烯酶。KPC酶是36 综述目前临床上分离的最常见的A类碳青霉烯酶。1996年，第１个KPC酶（KPC－2）在美国东部被鉴定出。短短的几年时间，包括波多黎各、希腊、以色列、[32]欧洲以及南美等国家均报道了KPC酶的出现。主要是KPC-2型，其特点是几乎可水解所有的β-内酰胺类抗菌药物，包括碳青霉烯类、头孢菌素类和单环β－内酰胺类抗菌药物，但对亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟和氨曲南的水解作用则不及对青霉素、一代头孢菌素的，同时对孢西丁和头孢他啶的水解作用也较弱。（3）GES基因主要位于质粒的整合子上。3.1.2Ｂ类碳青霉烯酶[36]Ｂ类酶属金属酶的氨基酸序列呈多样性，但具有３个共同功能特性：（1）能够水解青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类药物。（2）活性不被克拉维酸、舒巴坦以及他唑巴坦抑制。[22]3.1.3Ｄ类碳青霉烯酶Ｄ类碳青霉烯酶又称OXA酶，在bush分群中属于２d类，包括232种酶。D类碳青霉烯酶不能水解超广谱头孢菌素类药物，不能被克拉维酸和EDTA抑制，但是能被Nacl抑制。主要分布于临床分离的铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌以OXA223最为流行，其碳青霉烯酶活性显著。对亚胺培南的水解效率是不动杆菌属OXA酶的10倍。[37]3.2其他耐药机制3.2.1外排泵的产生细菌外排泵作用是细菌产生耐药性的重要途径。目前已发现5个外排泵类型：ATP结合盒超家族（ABC）、多重耐药家族（SMR）、多药及毒性化合物[36]外排家族（MATE）和耐药节结化细胞分化家族。3.2.2孔蛋白缺失或下调表达的耐药机制细菌产生外膜屏障，使通透性下降，阻止或减少抗菌药物进入菌体。这种降低外膜通透性的耐药机制主要通过改变跨膜通道孔蛋白的结构使其与药物的结合降低，以减少跨膜孔蛋白的数量，甚至使其消失来实现。产碳青霉烯酶的[38-40]细菌通常伴有外膜孔蛋白的丢失。如肺炎克雷伯菌中的OmpK35肺炎克雷伯菌是细菌感染性疾病最重要的致病菌，可引起呼吸道、泌尿道等多种部位感染。随着临床应用的不断增加，CRKP感染持续增多。目前常见的碳青霉烯酶主要有KPC，IMP，VIM，NDM等，国内以KPC和IMP为主。产37 综述碳青霉烯酶细菌已经成为临床治疗上的难题。使用单一抗菌药物进行治疗的成功率非常低，只有多种抗菌药物联合使用才能提高成功率。为了阻止耐药细菌的蔓延和暴发，临床医师需要准确掌握细菌耐药现状，根据药敏结果合理使用抗菌药物，减少耐药菌的产生，并且做好手卫生等消毒措施从而减少耐药菌的传播因此，耐药菌感染的预防控制应从整体、全局出发，综合考虑抗菌药物合理使用、病原菌检测、耐药菌监测、患者管理、医院感染管理等各方面因素。参考文献：[1].LoganLK.Carbapenem-resistantenterobacteriaceae:anemergingprobleminchildren[J].ClinInfectDis.2012,55(6):852-9.[2].MarsikFJ,NambiarS.ReviewofcarbapenemasesandAmpC-betalactamases[J].PediatrInfectDisJ.2011,30(12):1094-5.[3].LiuY,WanLG,DengQ,CaoXW,YuY,XuQF.FirstdescriptionofNDM-1-,KPC-2-,VIM-2-andIMP-4-producingKlebsiellapneumoniaestrainsinasingleChineseteachinghospital[J].EpidemiolInfect.2015,143(2):376-84.[4].GeraciDM,BonuraC,GiuffreM,SaporitoL,GrazianoG,AleoA,etal.IsthemonoclonalspreadoftheST258,KPC-3-producingclonebeingreplacedinsouthernItalybythedisseminationofmultipleclonesofcarbapenem-nonsusceptible,KPC-3-producingKlebsiellapneumoniae?[J].ClinMicrobiolInfect.2015,21(3):e15-7.[5].DelfinoE,GiacobbeDR,DelBonoV,CoppoE,MarcheseA,MannoG,etal.FirstreportofchronicpulmonaryinfectionbyKPC-3-producingandcolistin-resistantKlebsiellapneumoniaesequencetype258(ST258)inanadultpatientwithcysticfibrosis[J].JClinMicrobiol.2015,53(4):1442-4.[6].Sorlozano-PuertoA,Esteva-FernandezD,Oteo-IglesiasJ,Navarro-MariJM,Gutierrez-FernandezJ.AnewcasereportofurinarytractinfectionduetoKPC-3-producingklebsiellapneumoniae(ST258)inSpain[J].ArchEspUrol.2016,69(7):437-40.[7.LoganLK.Carbapenem-resistantenterobacteriaceae:anemergingprobleminchildren[J].ClinInfectDis.2012,55(6):852-9.[8].LamoureauxTL,FraseH,AntunesNT,VakulenkoSB.AntibioticresistanceandsubstrateprofilesoftheclassAcarbapenemaseKPC-6[J].AntimicrobAgentsChemother.2012,56(11):6006-8.[9]胡冬梅,陈世平.肺炎克雷伯菌的耐药性及PFGE电泳核型.中华微生物学和免疫学杂志[J],2000,20(4):319-322.[10].NakaseK,HayashiN,AkiyamaY,AokiS,NoguchiN.AntimicrobialsusceptibilityandphylogeneticanalysisofPropionibacteriumacnesisolatedfromacnepatientsinJapanbetween2013and2015[J].JDermatol.2017.38 综述[11].AzaraE,PirasMG,ParisiA,TolaS.AntimicrobialsusceptibilityandgenotypingofStaphylococcusaureusisolatescollectedbetween1986and2015fromovinemastitis[J].VetMicrobiol.2017,205:53-6.[12]朱佩琼,郑慧娟,俞云松,等.产ESBLs的肺炎克雷伯菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究[J].疾病监测,2008,23(3):140-143.[13].DeguchiT,ItoS,HatazakiK,HorieK,YasudaM,NakaneK,etal.AntimicrobialsusceptibilityofHaemophilusinfluenzaestrainsisolatedfromtheurethraofmenwithacuteurethritisand/orepididymitis[J].JInfectChemother.2017.[14]高山,林碧英,许端祥等.苦瓜种质遗传多样性的RAPD和ISSR分析[J].植物遗传资源学报2010,11(1):78-83.[15].张培江,才宏伟,袁平荣,占新春，阮新民，孙传清等.RFLP标记水稻遗传距离及其在杂种优势中的关系[J].杂交水稻.2001(05)[16].林鸿宣，闵绍楷，熊振民，等.应用RFLP图谱定位分析籼稻粒形数量性状基因座位[J].中国农业科学.1995（04）[17].刘佳妍,金莉莉,王秋雨.细菌基因组重复序列PCR技术及其应用[J].微生物学杂志,2006,26(3):90-93.[18].KaushikAM,HsiehK,ChenL,ShinDJ,LiaoJC,WangTH.Acceleratingbacterialgrowthdetectionandantimicrobialsusceptibilityassessmentinintegratedpicoliterdropletplatform[J].BiosensBioelectron.2017,97:260-6.[19].GuB,XuT,KangH,XuY,LiuG,PanS,etal.A10-yearsurveillanceofantimicrobialsusceptibilitypatternsinShigellasonneiisolatescirculatinginJiangsuProvince,China[J].JGlobAntimicrobResist.2017,10:29-34.[20]TagliaferriE,MenichettiF.Treatmentofinvasivecandidiasis:betweenguidelinesanddailyclinicalpractice[J].Expertreviewofanti-infectivetherapy.2015,13(6):685-9.[21]PappasPG,KauffmanCA,AndesD,etal.Clinicalpracticeguidelinesforthemanagementofcandidiasis:2009updatebytheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica[J].ClinInfectDis,2009,48(5):503-535.[22]Maiden,MC,BygravesJA,FeilE,etal.Multilocussequencetyping:aportableapproachtotheidentificationofcloneswithinpopulationsofpathogenicmicroorganisms[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(6):3140-3145.[22]EnrightM,SprattB.Multilocussequencetyping.TrendsinMicrobiology[J],1999,7(12):482-487.[23]Diancourt.L,PassetV,VerhoefJ,etal.MultilocussequencetypingofKlebsiellapneumoniaenosocomialisolates[J].Journalofclinicalmicrobiology,2005,43(8):41-48.[24]Nemoy.L,KotetishviliM,TignoJ,etal.Multilocussequencetypingversuspulsed-fieldgelelectrophoresisforcharacterizationofextended-spectrumbeta-lactamase-producingEscherichiacoliisolates.Journalofclinicalmicrobiology[J],2005,43(4):1776.[25]Singh.A,GoeringR,SimjeeS,etal.Applicationofmoleculartechniquestothestudyofhospitalinfection[J].Clinicalmicrobiologyreviews,2006,19(3):512.39 综述[26]胡玉山.侯水平.庞杏林,等.多位点基因序列分型在沙门菌鉴定中的应用[J].实用预防医学.2012.19(12):1776-1779.[27]Vimont,S,MnifB,FevreC,etal.ComparisonofPFGEandmultilocussequencetypingforanalysisofKlebsiellapneumoniaeisolates[J].JMedMicrobiol,2008,57(10):1308-1310.[28]胡冬梅,陈世平.肺炎克雷伯菌的耐药性及PFGE电泳核型.中华微生物学和免疫学杂志[J],2000,20(4):319-322.[29]朱佩琼,郑慧娟,俞云松,等.产ESBLs的肺炎克雷伯菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究[J].疾病监测,2008,23(3):140-143.[30]刘红露,张京云,冯泽惠,等.脉冲场凝胶电泳分型技术在追溯O139霍乱传染来源中的应用[J].中华流行病学杂志,2006,27(2):102-106.[31]石晓路,刘小立,黄薇,等.脉冲场凝胶电泳在沙门菌食物中毒溯源中的应用研究.疾病控制杂志[J],2007,11(5):502-504.[32]Khot,PD,FredricksDN.PCR-baseddiagnosisofhumanfungalinfections.ExpertRevAntiInfectTher[J],2009,7(10):1201-1221.[33]Wong,NA,LintonCJ,JalalH,etal.RandomlyamplifiedpolymorphicDNAtyping:ausefultoolforrapidepidemiologicaltypingofKlebsiellapneumoniae[J].EpidemiolInfect,1994,113(3):445-454.[34]Tribuddharat,C,SrifuengfungS,ChiangjongW.Preliminarystudyofrandomly-amplifiedpolymorphicDNAanalysisfortypingextended-spectrumbeta-lactamase(ESBL)-producingKlebsiellapneumoniae[J].JMedAssocThai,2008,91(4):527-532.[35]李孝权,刘衡川,柴巧学,等.副溶血性弧菌食源性疾病分离株的RAPD分子分型研究.现代预防医学[J]，2005,32(7)：726-728.[36]高山,林碧英,许端祥等.苦瓜种质遗传多样性的RAPD和ISSR分析[J].植物遗传资源学报2010,11(1):78-83.[37]Kumari,DN,KeerV,HawkeyPM,etal.ComparisonandapplicationofribosomespacerDNAampliconpolymorphismsandpulsed-fieldgelelectrophoresisfordifferentiationofmethicillin-resistantStaphylococcusaureusstrains[J].JClinMicrobiol,1997,35(4):881-885.[38]刘佳妍,金莉莉,王秋雨.细菌基因组重复序列PCR技术及其应用[J].微生物学杂志,2006,26(3):90-93.[39]Maiden,MC,BygravesJA,FeilE,etal.Multilocussequencetyping:aportableapproachtotheidentificationofcloneswithinpopulationsofpathogenicmicroorganisms[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(6):3140-3145.[40]EnrightM,SprattB.Multilocussequencetyping.TrendsinMicrobiology[J],1999,7(12):482-487.40