儿童呼吸道合胞病毒分子流行病学及其致炎症反应机制研究

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分类号Ｒ７２密级公开ＵＤＣ６１０学校代码１０５５５為＃义拿＊＠ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＯＵＴＨＣＨＩＮＡ硕±学位论文（专业学位）儿童呼吸道合胞病毒分子流行病学义其致炎＃反应机制研究研究生姓名；范如艳指导教师、职称：范楚平主任医师合作导师、职称：藝小巧研究员专业学位类别（领域）：临床医学（儿科学）研究方向：儿童呼吸一所在学院：附属栅州市第人民医院二〇一六年五月 戀義考Ａ拿ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＯＵＴＨＣＨＩＮＡ论文题目：儿童呼吸道合胞病毒分子流行病学及其致炎症反应机制研究论文作者签名：斯和考＾指导教师签名：令论文评阅人２：邹敏书，硕导，副主任医师，广州军区武汉总區院评阅人２；吴学东，硕导，副主化民师，南方医科大学南方睽院答辩委员会主席：薄涛，教授，硕导，中南大学湘雅二医院委员１：何小解，副研究最，硕导，中南大学湘雅二民院委员２：彭华保，主任医师，硕导，南华大学附属栅帅医院委员３：李海鹏，主任医师，硕导，南华大学附属栅州医院委员４欧义肿，主巧医师，硕导，南华大学附属術州民院＾答辩日期：２０１６年５月１４日、 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人工在导师指导下进行的究作及研取得的１研。尽我，：＾究成果所知除了论文中特别加标注和致谢的地方外，论中文不包含其已经他人发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学。工所位或证书而用过的材料与我共同作的同志对本研作的均已使究贡献在论文。。中作了明确的说明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担：（名：ｉ作者签知Ｊ月１知钟南华大学论版学位文权使用授权书（ｉ本学位论文是本人在南华学攻读博学期在师大位间导指导下完成。的学位论义本论文的研究成归南华大学所有，本论文的研内得果究容不Ｗ其它。、的名义发表人同意学有留用论文的规定，：单位本南华大关保使学位即学校有权保留学位论文，允许学位论文查阅和借阅；学校可公布学位论文全被的部、或分内容，可用印印或它手学部Ｗ采复缩其段保留位论文；学校可根据圈家或湖有关部定送交。入南省口规学位论文同意学校将论文加《中圍优秀博硕±学位库－论文全数》，并按《中上文据国优秀博硕学位论文全文数据库出版章程》规定。享受相关权益同意授权中国科学信息技术究所将本学位论文收《研录到中國学位，。抢文全文数据》通过网络向社会公提供息涉密库并众信服务对于的学位论。文，解密后适用该授权：如１作者签名年月咖导师签年月Ｊ 儿童呼吸道合胞病毒分子流行病学及其致炎症反应机制研究中文摘要第一部分呼吸道合胞病毒分子流行病学研究背景呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)是引起5岁以下儿童呼吸道感染的主要原因。方法(1)收集了2014年1月至12月郴州市第一人民医院儿童呼吸科所有因呼吸道感染的住院患儿的7种呼吸道病毒(呼吸道合胞病毒，腺病毒，A型流感病毒，B型流感病毒，副流感病毒1-3型)抗原检测资料，分析RSV的流行特点。(2)为了进一步了解RSV感染的分子流行病特点，采集了2014年RSV流行季节的RSV感染患儿的鼻咽拭子(nasalswabs,NSs)样本，采用逆转录PCR(Polymerasechainreaction,PCR)方法对RSVG蛋白基因组进行扩增,并进行测序分析，了解RSV的分子流行病学特点。(3)收集RSV感染患儿的临床资料，分析其临床特征。结果(1)RSV是引起儿童呼吸道感染最常见的病毒，主要流行季节为每年的1-5月及10-12月。(2)本研究一共鉴定了64例RSV阳性的患儿，ON1(n=13,I 20.3%)，NA1(n=11,17.2%)，BA9(n=39,60.9%)，GB2(n=1,1.6%)，其中ON1，NA1及BA9是引起儿童呼吸道感染的主要RSV亚型。(3)NA1亚型及BA9亚型主要感染6个月以下婴幼儿，而ON1亚型感染的各年龄段分布比较平均。(4)氨基酸分析显示所有ON1及大部分NA1亚型分别由于T251K及N249Y的氨基酸置换，失去该糖基化位点。(5)RSV主要引起下呼吸道感染（98.4%），伴有咳嗽（100%）、咳痰、发热及喘息。结论(1)RSV是引起儿童下呼吸道感染的主要病原，其中NA1、ON1及BA9亚型是主要流行亚型。(2)ON1亚型逐渐成为RSV-A的主要流行亚型。关键词呼吸道合胞病毒；下呼吸道感染；ON1亚型；NA1亚型；BA9亚型；G蛋白II 第二部分呼吸道合胞病毒感染致炎症反应机制研究背景抑制性细胞因子具有广泛的免疫抑制功能，并参与调解宿主免疫反应对抗病毒感染。然而，抑制性细胞因子在呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)感染中的功能仍不清楚。方法为了进一步探讨抑制性细胞因子在RSV感染中的作用，一共99例因RSV感染住院的患儿被纳入研究，并分为三组：组Ⅰ(年龄≤6月)，组Ⅱ(年龄6-12月)，组Ⅲ(年龄>12月)。同时纳入20例年龄匹配的健康对照患儿。采用Bio-Plex悬液芯片技术或酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测血浆中细胞因子表达水平，主要有1型辅助性T细胞(THelperType1,Th1)类细胞因子，包括干扰素(Interferon,IFN)-γ，白介素(Interleukin,IL)-2，肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)-α；2型辅助性T细胞(THelperType2,Th2)类细胞因子包括IL-4，IL-13；17型辅助性T细胞(THelperType17,Th17)类细胞因子IL-17；及抑制性细胞因子，包括IL-10，IL-27，IL35及转化生长因子(Transforminggrowthfactor,TGF)-β。结果(1)RSV感染患儿的年龄分布显示，43例(43.4%)患儿年龄≤6月，33例(33.3%)患儿年龄为6-12个月，23例(23.2%)患儿年龄>12月。(2)不同年龄组之间的病程比较显示，年龄>12月患儿的病程明显比年龄≤6月及6-12月的患儿短(P值分别为0.004，0.019)。III (3)与对照组比较，RSV感染患儿的抑制性细胞因子IL-10及IL-35表达水平明显增加(P值分别为0.006，<0.001)；而TGF-β及IL-27在两组之间无明显差异；(4)RSV感染组与健康对照组之间Th1、Th2及Th17类细胞因子表达水平无明显差别。(5)RSV诱导的IL-10，IL-27及IL-35表达水平增加呈现出年龄相关方式，并且与病程表现出的年龄相关方式相反。(6)IL-10表达水平与RSV疾病病程呈负相关。结论(1)抑制性细胞因子IL-10、IL-35及IL-27在RSV感染疾病中促进疾病恢复，缩短疾病病程，调节机体免疫平衡，在RSV所致炎症反应机制中扮演着非常重要角色。(2)IL-10表达水平增加是影响RSV住院患儿疾病病程的重要因素。关键词呼吸道合胞病毒；Th1类细胞因子；Th2类细胞因子；Th17类细胞因子抑制性细胞因子；IL-10IV THEMOLECULAREPIDEMIOLOGICAL,INFLAMMATIONRESPONSEANDPATHOGENESISOFRESPIRATORYSYNCYTIALVIRUSINFECTIONINCHILDRENRuyanFan(Pediatric)DirectedbyChupingFanAbstractPart1ThemolecularepidemiologicalofrespiratorysyncytialvirusBackground:Respiratorysyncytialvirus(RSV)infectionistheleadingcauseofacuterespiratorytractdiseaseinchildrenlessthan5yearsold.Methods(1)ToanalyzetheepidemiologicalofRSV,wecollectedthesevenkindsofrespiratoryviralantigendetectiondataofhospitalizedchildrenwithrespiratorytractinfectionsindepartmentofrespirationattheFirstPeople’sHospitalofChenzhoufromJanuarytoDecember2014.(2)Tofurtherunderstandthemolecularproperties,nasalswabs(NSs)werecollectedtoinvestigatethemolecularepidemiologicalofRSVintheepidemicseasonsofRSVin2014fromhospitalizedchildrenwithRSVinfections.AndRSVGgeneswereamplifiedbyreversetranscriptionV polymerasechainreaction(RT-PCR)andsequenced.(3)TounderstandtheclinicalcharacterizationofRSVinfections,patientdemographicsandclinicalcharacteristicswerecollectedandanalyzed.Results(1)RSVisthemostcommonvirusinchildrenwithrespiratorytractinfection,andoutbreaksoftenlastfromOctobertoMay.(2)Weidentified64patientswithRSVinfections.ArecentlyidentifiedRSVsubtype,ON1(n=13,20%),NA1(n=11,17%)，BA9(n=39,61%)andGB2(n=1,1.6%).ON1,NA1andBA9aredominantstrainsinchildrenwithrespiratorytractinfections(RTIs).(3)RSVsubtypesNA1andBA9infectionsmostlyinfectinfants(<6monthsold),howeversubtypeON1infectionsshowequalagedistributiontrends.(4)PhylogeneticanalysisindicatedthatallON1andmostNA1isolateslostonepotentialN-glycosylationsiteataminoacid251and249duetoT251KandN249Ysubstitution,respectively.(5)RSVmostlycauseslowerrespiratorytractinfections(LRTIs)(98.4%)withcoughing(100%),sputumproduction,fever,andwheezing.Conclusions(1)RSVistheleadingcauseofinducinglowerrespiratorytractinfectionsinchildren，andNA1,ON1andBA9werethedominantsVI subtypes.(2)SubtypeON1becomesthepredominantsubtype.KeywordsRespiratorysyncytialvirus(RSV);Lowerrespiratorytractinfections(LRTIs);SubtypeON1;SubtypeNA1;SubtypeBA9;Attachmentglycoprotein(G)gene.VII Part2RespiratorySyncytialVirusInfectionInducedInflammationResponseandPathogenesisAbstractBackgroundTheinhibitorycytokineswithbroadimmunosuppressivefunctionsinvolvedinregulationofhostimmuneresponseagainstvirusinfection.However,theireffectsinchildrenwithrespiratorysyncytialvirus(RSV)infectionhavenotbeenilluminatedyet.MethodsToexploretheroleofinhibitorycytokinesinRSVinfection,total99RSVinfectedhospitalizedchildrenwhichweredistributedintothreeagegroups:groupⅠ(age≤6months),groupⅡ(612months),and20age-matchedhealthycontrolswereenrolled.MultiplecytokinesincludingTHelperType1(Th1)cytokines,includinginterferon(IFN)-γ,interleukin(IL)-2,tumornecrosisfactor(TNF)–α;THelperType2(Th2)cytokines,includingIL-4,IL-13;THelperType17(Th17)cytokines(IL-17)andinhibitorycytokinesincludingIL-10,IL-27,IL-35andtransforminggrowthfactor(TGF)-βweremeasuredinRSVinfectedpatientsandhealthycontrolsplasmabyBio-Pleximmunoassayorenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).Results(1)TheagedistributionofRSVpatientsshowedthat43(43.4%)ofVIII thepatientswereage≤6months,33(33.3%)were612months.(2)Wealsocomparedthecourseofdiseasebetweenthreeagegroups,andthecourseofdiseaseweresignificantlydescendinginpatientsage>12monthsold,comparingwithpatients≤6monthsoldand624月2(15.4)1(9.1)2(5.0)男性,n(%)12(92.3)8(72.7)28(70)症状发热，n(%)8(61.5)4(36.4)18(45)最高体温，n(%)37.3-38.0℃01(25)3(16.7)38.1-39.0℃4(50)3(75)9(50)>39.0℃4(50)06(33.3)咳嗽，n(%)13(100)11(100)40(100)喘息，n(%)12(92.3)8(72.7)29(72.5)咳痰，n(%)12(92.3)11(100)38(95)气短，n(%)3(23.1)2(18.2)8(20)过敏史，n(%)3(23.1)3(27.3)19(47.5)临床诊断，n(%)上呼吸道感染01(9.1)0下呼吸道感染13(100)10(90.9)40(100)病程(天)，均数±标准差14±611±216±1216 4.中国内陆地区儿童RSV感染的流行趋势为了了解中国地区儿童RSV感染的流行趋势，该研究分析了近8年来，中国四个城市RSV流行的主要型别，分别是北京(中国东北部)、上海(中国东部)、重庆(中国西南部)、兰州(中国西北部)，数据表明近8年来，4个地区具有相似[9,19,47-50]的RSV流行型别(ABBAABA)(表1.11)。但是，上海、兰州的资料缺乏完整性。此外NA1亚型与GA2亚型在过去是RSV-A的主要流行亚型，BA9亚型是RSV-B的主要流行亚型。表1.11近八年中国四个城市儿童RSV感染的主要型别分布年份北京重庆上海兰州郴州2007/2008RSV-A/NA1RSV-A/GA2NDRSV-A/GA2ND2008/2009RSV-B/BA9RSV-B/BANDRSV-B/BAND2009/2010RSV-B/BA9RSV-B/BARSV-B/BANDND2010/2011RSV-A/NA1RSV-A/GA2RSV-A/NA1NDND2011/2012RSV-A/NA1RSV-A/NA1RSV-A/NA1NDND2012/2013RSV-B/BA9RSV-B/BARSV-B/BANDND2013/2014RSV-A/ON1NDNDNDRSV-B/BA917 第四章讨论[10]RSV是导致婴幼儿及幼儿LRTIs最常见的病原，但是在中国，关于RSV分子流行病学的研究相当少，尤其是中国南部。本研究主要分析了郴州市儿童医院呼吸科住院患儿RSV的分子流行病学特征。64例RSV阳性样本中，24例为RSV-A，40例为RSV-B，表明RSV-A与RSV-B为共感染，以RSV-B为主，这与北京、重庆的相关研究并不一致，可能与气候的原因有关。系统进化树分析表明，RSV-B主要以BA9亚型为主，而RSV-A以ON1亚型及NA1亚型为主。[11,50-52]与中国及其他地区的研究一致，BA9是最主要的流行株，表明该亚型已在全球快速适应及广泛传播。ON1作为新的亚型，在2010年首先被加拿大安大略湖的研究人员检测出来，[10]其在G蛋白基因组的羧基端具有72个氨基酸序列的重复。而类似这种氨基酸序列的重复现象曾经在1999年发现的RSV-B的BA亚型中发现。经过15年，[11,13,14,50-52]BA亚型已经成为RSV-B中最主要的流行亚型。如今，ON1亚型逐渐[10][17][16][9,48,49][53]在全世界各地流行，如加拿大、意大利、德国、中国、日本、马[54][55][56][15][57][58]来西亚、印度、韩国、台湾、肯尼亚及南非等。这些研究表明ON1亚型在全世界各地迅速蔓延，逐渐成为RSV-A中最主要的流行亚型。此外，很[16,17,56,57]多研究已经报道，ON1亚型已经成为当地主要的流行亚型。因此，ON1亚型是否会跟随BA亚型的流行趋势，逐渐成为RSV-A最主要的流行亚型将是一个非常有趣的问题。[47]在我国，于2012年北京首次报道了ON1亚型(BJ/35320)。随后，ON1[9][48]逐渐在重庆、上海检测出来。根据RSV在重庆的流行趋势，在过去的8年，NA1亚型是RSV-A的主要流行亚型，而在2014-2015年ON1逐渐成为主要的流[9]行亚型。表明ON1亚型的快速传播。与这种流行趋势相似，本研究中发现ON1亚型可能是RSV-A的主要流行亚型。因此，关于ON1亚型是否会成为中国大陆地区主要的流行亚型仍需要更多的研究去证明。进化树及氨基酸序列分析表明RSV-A不同亚型仍在不断的变化。与中国其他地区的研究一致，ON1亚型主要表现为E232G，T253K及P292L氨基酸置换[9]。此外在该研究中所有ON1亚型S222P氨基酸置换。更有趣的是所有ON1亚18 型及NA1亚型分别由于T251K和N249Y氨基酸置换而丢失了第二个糖基化位[15]点。这些变化可能与逃避宿主的免疫反应有关，但是目前仍不清楚。通过年龄分组发现RSV感染主要发生在年龄小于1岁的患儿，以年龄小于6月龄的患儿感染率最高，表明年龄小于6月龄的婴幼儿更易感染RSV，随着年[2,24]龄增加，感染RSV的风险逐渐降低。这些可能是由于在婴幼儿时期不同阶段对于RSV的免疫存在几个重要的转变：免疫系统的不断成熟、母体免疫不断减[24]弱、及初次感染等，使婴幼儿及幼儿时期的免疫力具有相当大的异质性。RSV传播迅速，有研究证明在1岁以内的婴幼儿50%曾感染过RSV，而2岁以内的[59]婴幼儿几乎全部感染过RSV。大部分RSV感染患儿被诊断为毛细支气管炎或[60]肺炎，伴咳嗽、持续性喘息、发热、咳痰，但是不同基因型别引发的临床症状无明显差异。更有趣的是，该研究发现ON1亚型呈现出相似的年龄分布趋势，而NA1亚型及NA9亚型主要感染6月以下婴幼儿。因此，我们推断，ON1亚型作为新的RSV亚型，可能很多患儿为第一次感染，机体尚未产生特异的免疫应答。相反，对于NA1亚型及BA9亚型，机体可能存在保护性免疫，尽管非常弱。此外，大[61]多数RSV再感染往往与既往感染的亚型不一致，这同样也证明了这一点。总之，根据RSV的分子流行病学分析表明，BA9亚型、NA1亚型及ON1亚型在处于共流行状态，其中以BA9亚型为主。与其他地区研究，我们推测ON1将逐渐成为RSV-A的主要流行亚型。本研究的发现有助于我们进一步了解中国南方地区RSV的分子流行病特点。但是，更好的了解RSV感染的抗原机制需要我们更进一步监测RSV流行的基因型别、遗传多样性及临床特征。19 第五章小结1.RSV感染是5岁以下儿童下呼吸道感染的主要病原，并存在RSV-A与RSV-B共感染状态，其中NA1亚型，BA9亚型及ON1亚型是主要流行的主要亚型。2.ON1亚型逐渐成为RSV-A的主要流行亚型。3.所有的ON1亚型及大多数NA1亚型分别由于氨基酸置换：T251K和N249Y而失去了第二个糖基化位点。20 21 第六章参考文献[1]NairH,NokesDJ,GessnerBD,etal.Globalburdenofacutelowerrespiratoryinfectionsduetorespiratorysyncytialvirusinyoungchildren:asystematicreviewandmeta-analysis[J].Lancet,2010,375(9725):1545-1555.[2]AndersonLJ.Respiratorysyncytialvirusvaccinedevelopment[J].SeminImmunol,2013,25(2):160-171.[3]MufsonMA,OrvellC,RafnarB,etal.Twodistinctsubtypesofhumanrespiratorysyncytialvirus[J].TheJournalofgeneralvirology,1985,66(Pt10):2111-2124.[4]PeretTC,HallCB,HammondGW,etal.CirculationpatternsofgroupAandBhumanrespiratorysyncytialvirusgenotypesin5communitiesinNorthAmerica[J].JInfectDis,2000,181(6):1891-1896.[5]PeretTC,HallCB,SchnabelKC,etal.CirculationpatternsofgeneticallydistinctgroupAandBstrainsofhumanrespiratorysyncytialvirusinacommunity[J].JGenVirol,1998,79(Pt9):2221-2229.[6]PretoriusMA,vanNiekerkS,TempiaS,etal.ReplacementandpositiveevolutionofsubtypeAandBrespiratorysyncytialvirusG-proteingenotypesfrom1997-2012inSouthAfrica[J].JInfectDis,2013,208Suppl3:S227-237.[7]VenterM,MadhiSA,TiemessenCT,etal.GeneticdiversityandmolecularepidemiologyofrespiratorysyncytialvirusoverfourconsecutiveseasonsinSouthAfrica:identificationofnewsubgroupAandBgenotypes[J].JGenVirol,2001,82(Pt9):2117-2124.[8]ShobugawaY,SaitoR,SanoY,etal.EmerginggenotypesofhumanrespiratorysyncytialvirussubgroupAamongpatientsinJapan[J].JClinMicrobiol,2009,47(8):2475-2482.[9]RenL,XiaQ,XiaoQ,etal.ThegeneticvariabilityofglycoproteinsamongrespiratorysyncytialvirussubtypeAinChinabetween2009and2013[J].InfectGenetEvol,2014,27:339-347.[10]EshaghiA,DuvvuriVR,LaiR,etal.Geneticvariabilityofhumanrespiratory22 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第二部分呼吸道合胞病毒感染致炎症反应机制研究第二章资料和方法1.研究对象1.1选取2014年RSV流行季节，因呼吸道感染入住郴州市第一人民医院儿童医院呼吸一区，年龄小于5岁，鼻咽拭子呼吸道病毒抗原检测为RSV阳性的患儿做为RSV感染组。收集临床资料，根据患儿的年龄，将其分为3组：组Ⅰ(年龄≤6月),组Ⅱ(6＜年龄≤12月)及组Ⅲ(年龄＞12月)。1.2纳入标准：年龄＜5岁；入院时鼻咽拭子RSV抗原检测阳性；排除合并其他细菌或病毒感染。1.3排除标准：早产儿、合并基础疾病(慢性肺部疾病、先心病、免疫缺陷等)、近1个月有细菌、病毒感染史。1.4健康对照组：健康对照由20例年龄匹配的外科手术患儿，无感染病灶；近1个月无细菌、病毒感染史。所有对照样本均在非RSV流行季节采集。1.5病程定义：从出现临床症状开始至临床症状缓解，达到临床治愈。1.6样本收集与处理：在入院12小时内采集外周静脉血2ml置于EDTA管中，置于4℃冰箱，500×g，离心10min，收集血浆，做好标记，冻于-80℃备用。1.7该研究获得患儿家属的知情同意，并通过郴州市第一人民医院伦理委员会批准。2.材料及仪器2.1试剂TM（1）细胞因子检测：Bio-PlexProAssays(10014905)，购于美国BIORAD公司；Humaninterleukin35(IL-35)ELISAkit(CSB-E13126h)，购于CUSABIO30 公司；HumanIL-27ELISAReady-SET-Go(88-7278)、HumanTGF-beta1nd(2Generation)ELISAReady-SET-Go(88-8350)购于eBioscience公司。（2）去离子水、1×PBS、0.05%Tween-20、浓硫酸、浓盐酸。2.2仪器（1）多功能酶标仪：购于Thermo公司；（2）Luminex：购于MILLIPORE公司；（3）恒温孵育箱；购于上海博讯实业有限公司医疗设备厂；（4）生物安全柜；购于Thermo公司；（5）旋涡震荡器；HYQ-3110购自SilentShake公司；（6）移液器：P-10、P-20、P-20、P-100、P-200、P-1000购于Eppendorf公司。（7）台式离心机：购于Thermo及Eppendorf公司；（8）冰箱：4℃、-20℃、-80℃冰箱购于海尔公司；3.实验方法3.1细胞因子检测Th1类因子：IFN-γ，IL-2，TNF-α；Th2类细胞因子IL-4，IL-13；Th17类TM细胞因子：IL-17；抑制性细胞因子：IL-10，均使用Bio-PlexProAssays试剂盒采用悬液芯片技术进行检测。抑制性细胞因子：IL-35、IL-27及TGF-β1分别使用Humaninterleukin35(IL-35)ELISAkit、HumanIL-27ELISAndReady-SET-Go、HumanTGF-beta1(2Generation)ELISAReady-SET-Go试剂盒进行检测。所有试验准备及操作及按试剂说明书进行。3.1.1悬液芯片技术（1）预热Luminex仪器30分钟；（2）4倍稀释标准品；（3）一次性96孔板中，血浆样本：样本稀释液=1:4稀释；（4）100μlassaybuffer处理96孔板；（5）加入震荡混匀的1×beads50μl/孔，洗液100μl/孔洗板2次；（6）标准孔、空白孔、样本孔各加入相应的液体50μl/孔，850+50转的摇床避光孵育30分钟；（7）洗液100μl/孔洗板3次；31 （8）加入提前10min准备好的抗体(检测抗体：检测抗体稀释液=1:9)25ul/孔，850+50转的摇床避光孵育30分钟；（9）洗液100μl/孔洗板3次；（10）加入提前10分钟准备好的SA-PE(60ulSA-PE+5940ulassaybuffer混匀即SA-PE：assaybuffer=1:99)50μl/孔，850+50转的摇床避光孵育10分钟；（11）洗液100μl/孔洗板3次；（12）加入assaybuffer125μl/孔，850+50rpm的摇床避光孵育30秒，放入Luminex仪器中读数。3.1.2IL-35：ELISA法（1）将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30分钟，并按试剂说明配置试剂，备用。（2）加样：分别设标准品孔，待测样品孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时。（3）弃去液体，甩干，不用洗板。（4）每孔加生物素标记抗体工作液100μl，覆上新的板贴，37℃温育1小时。（5）弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2分钟，200μl/孔，甩干。（6）每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，覆上新的板贴，37℃温育1小时。（7）弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，200μl/孔，甩干。（8）依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色15-30分钟。（9）依序每孔加终止溶液50μl，终止反应。（10）在反应终止后5分钟内使用多功能酶标仪在450/570nm波长依序测量各孔的光密度值(OD值)。（11）使用CurveExpert1.3软件进行数据处理，得出样本的实际浓度。3.1.3IL-27：ELISA法（1）按照试剂说明书，准备相关试剂；（2）包被captureantibody(用1×coatingbuffer稀释)，包被96孔板，每孔加100μl，覆上贴板膜，4℃过夜。（3）弃去液体，洗液洗板3次，浸泡1分钟，300μl/孔，甩干。32 （4）用1×ELISA/ELISPOT封闭，200μl/孔，覆上贴板膜，室温下孵育1小时。（5）按说明稀释标准品(用1×ELISA/ELISPOT稀释)，2倍稀释，连续稀释8孔，每孔加入100μl稀释的标准品和待测样本，覆上贴板膜，在室温下孵育2小时。（6）弃去液体，洗液洗板5次，浸泡1分钟，300μl/孔，甩干。（7）每孔加入100μldetectionantibody(用1×ELISA/ELISPOT稀释)，覆上贴板膜，室温下孵育1小时。（8）弃去液体，洗液洗板5次，浸泡1分钟，300μl/孔，甩干。（9）每孔加入100μlAvidin-HRP(用1×ELISA/ELISPOT稀释)，覆上贴板膜，室温下孵育30分钟。（10）弃去液体，洗液洗板7次，浸泡2分钟，300μl/孔，甩干。（11）每孔加入100μl1×TMB，室温下孵育15分钟。（12）每孔加入50μl终止液终止反应。（13）在反应终止后5分钟内使用多功能酶标仪在450/570nm波长依序测量各孔的光密度值(OD值)。（14）使用CurveExpert1.3软件进行数据处理，得出样本的实际浓度。3.1.4TGF-β1：ELISA法（1）按照试剂说明书，准备相关试剂；（2）包被captureantibody(用1×coatingbuffer稀释)，包被96孔板，每孔加100μl，覆上贴板膜，4℃过夜。（3）弃去液体，洗液洗板5次，浸泡1分钟，300μl/孔，甩干。（4）用1×AssayDiluent封闭，200μl/孔，覆上贴板膜，室温下孵育1小时。（5）弃去液体，洗液洗板5次，浸泡1分钟，300μl/孔，甩干。（6）在新的96孔板中酸活化样本：将样本使用1×PBS稀释5倍，然后每孔加入100μl，然后加入20ul1NHCl，室温下孵育10分钟，再加入20μl1NNaOH中和。（7）按说明稀释标准品(用1×AssayDiluent稀释)，2倍稀释，连续稀释8孔，每孔加入100μl稀释的标准品和酸活化的样本，覆上贴板膜，在室温下孵育2小时。33 （8）弃去液体，洗液洗板5次，浸泡1分钟，300μl/孔，甩干。（9）每孔加入100μldetectionantibody(用1×AssayDiluent稀释)，覆上贴板膜，室温下孵育1小时。（10）弃去液体，洗液洗板5次，浸泡1分钟，300μl/孔，甩干。（11）每孔加入100μlAvidin-HRP(1×AssayDiluent稀释)，覆上贴板膜，室温下孵育30分钟。（12）弃去液体，洗液洗板7次，浸泡2min，300μl/孔，甩干。4每孔加入100μlSubstratesolution，室温下孵育15分钟。5每孔加入50μl终止液终止反应。6在反应终止后5分钟内使用多功能酶标仪在450/570nm波长依序测量各孔的光密度值(OD值)。7使用CurveExpert1.3软件进行数据处理，得出样本的实际浓度。4.统计分析对于描述性统计，患儿的人口统计及临床特征使用频率及百分数描述，连续变量使用中位数及四分位数描述。分类变量使用卡方检验或Fisher’s精确检验。非正态分布的连续变量使用Mann-WhitneyU检验及Spearman’s相关。P＜0.05认为有统计学意义。所有统计通过SPSS19.0软件进行，作图使用GraphPad6.0软件。34 35 第三章结果1.临床特点一共99例RSV阳性患儿被纳入研究，其临床特征及人口统计学特征见（表2.1），年龄中位数及四分位数为8(4-12)月，其中75例(75.76%)为男性，97例(98%)患儿被诊断为下呼吸道感染(LRTI)，咳嗽、咳痰、喘息及发热是最常见的症状。年龄分布显示，43例(43.4%)患儿年龄≤6月，33例(33.3%)患儿年龄为6-12个月，23例(23.2%)患儿年龄>12月，见(图2.1A)。结果显示，年龄≤6月婴幼儿更易感染RSV，并且需要住院治疗，其次依次是6-12月，>12月患儿。同时通过比较不同年龄组之间的病程差异(图2.1B)，发现年龄>12月患儿的病程明显比年龄≤6月(P=0.004)及6-12月(P=0.019)的患儿短。表2.1临床特征及人口统计学特征分析变量统计学数据年龄(月)，中位数(IQR)8(4-12)男性,No.(%)75(75.76%)临床特征发热,No.(%)53(53.54%)咳嗽,No.(%)99(100%)喘息,No.(%)72(72.73%)咳痰,No.(%)41(97.94%)呼吸困难,No.(%)20(20.20%)临床诊断上呼吸道感染(URTI),No.(%)2(2%)下呼吸道感染(LRTI),No.(%)97(98%)36 图2.1RSV感染患儿不同年龄组病程的比较2.RSV感染患儿的抑制性细胞因子表达水平研究中比较了RSV感染组与健康对照组的抑制性细胞因子IL-10，TGF-β，IL-27及IL-35的表达水平(图2.2)。结果显示，与健康对照组相比，RSV感染组的IL-10(P=0.006)及IL-35(P<0.001)的表达水平明显升高(图2.2A，2.2B)。IL-27与TGF-β在两组之间的表达无差异(图2.2C，2.2D)。图2.2血浆中抑制性细胞因子的表达水平3.RSV感染组患儿Th1，Th2，Th17类细胞因子表达水平研究结果表明Th1(IFN-γ，IL-2，TNF-α)，Th2(IL-4，IL-13)，Th17类细胞因子(IL-17)在RSV感染组与健康对照组两组之间的表达水平无明显差异(图37 2.3)。图2.3血浆中Th1、Th2、Th17类细胞因子的表达水平4.RSV诱导特异的抑制性细胞因子表达增加呈现出年龄相关方式年龄是RSV重症感染的一个风险因子，为了进一步探讨抑制性细胞因子在不同年龄组儿童之间的表达水平及作用，该研究比较了三组之间抑制性细胞因子IL-10，TGF-β，IL-27及IL-35的表达水平的差异。研究结果表明，年龄>12月的患儿的IL-10表达水平明显高于≤6月患儿(P=0.029)。(图2.4A)其次，IL-27的表达水平在年龄>12月的患儿中明显高于年龄≤6月患儿(P<0.001)及6-12月的患儿(P=0.002)。(图2.4B)而TGF-β的表达水平在三组之间无明显差异。图2.4抑制性细胞因子表达水平在不同年龄组的比较分析38 为了探讨抑制性细胞因子的表达水平上升是否年龄相关，进一步分析了RSV感染组中抑制性细胞因子与年龄的相关性(表2.2)。研究发现IL-10，TGF-β及IL-35的表达水平与年龄无相关性，IL-27与年龄呈正相关。但是在健康对照组中并没有发现IL-27表达水平与年龄呈相关性(表2.3)。这些结果表明，在RSV感染患儿中IL-10的表达水平增加是RSV特异的并呈现出年龄相关的方式，而IL-27的表达水平增高可能同时与RSV及年龄相关。表2.2RSV感染组抑制性细胞因子表达水平与年龄的相关性分析细胞因子相关系数P*IL-100.2550.062IL-270.615<0.001IL-350.0330.808TGF-β0.0060.961表2.3健康对照组抑制性细胞因子表达水平与年龄的相关性分析细胞因子相关系数P*IL-100.1890.143IL-270.2350.102IL-350.0110.726TGF-β0.0790.3215.RSV诱导特异性IL-10的表达与疾病病程相关为了进一步探讨抑制型细胞因子在RSV感染疾病中的作用，进一步分析了IL-10，IL-27，IL-35及TGF-β与疾病病程的相关性。研究表明IL-10的表达水平与疾病病程呈负相关(r=-0.311，P=0.019)，但是IL-27，IL-35的表达水平与疾病病程无相关性。(表2.4)39 表2.4抑制性细胞因子表达水平与疾病病程的相关性分析细胞因子相关系数P*IL-10-0.3110.019IL-27-0.0340.793IL-350.0460.723TGF-β0.1920.13740 41 第四章讨论该研究中表明RSV感染诱导抑制性细胞因子IL-10及IL-35的表达。IL-10及IL-35作为抑制性细胞因子，不仅可以抑制急性炎症，同时也可以调节Th1/Th2[1-5]反应平衡。研究结果表明，IL-10与IL-35参与了RSV感染诱导的免疫反应，同时在RSV感染患儿中高表达，这可能是维持Th1/Th2免疫反应平衡，降低免疫病理损伤的关键机制。研究表明，IL-27与TGF-β作为抗炎性细胞因子，在细[6-9]菌及病毒感染过程中，具有抑制Th1及Th2免疫反应的功能。但是本研究中并未发现IL-27及TGF-β的表达在RSV感染组及健康对照组之间有差异。研究表明年龄是RSV感染的重要风险因子，RSV感染的住院率及严重程度[10,11]与年龄呈负相关。病程被认为是评估RSV感染严重程度的重要指标。与其他研究一致，本研究数据显示，年龄越小，尤其是年龄≤6月的患儿，其病程更[12,13]长，表明年龄越小的患儿更容易感染RSV，且病情更严重。非常有趣的是，我们发现在RSV感染患儿中，IL-10与IL-35的表达增加显示出年龄相关方式，年龄越大的患儿IL-10与IL-35的表达水平越高，而其病程相对缩短。因此，我们推断抑制性细胞因子表达的增加可能降低了RSV感染的严重程度。早期有研究表明，年龄小的患儿RSV感染的早期，与低水平的RSV特异性[14]IFN-γ反应及高水平的RSV特异性IL-9，IL-13，TNF-α及IL-17有关。此外，研究表明，婴幼儿重症感染与Th2反应增强，即IL-4，IL-5及IL-13在血清中表[15,16]达增加有关。所有这些结果均表明，与Th1免疫反应比较，Th2免疫反应在婴幼儿的重症RSV感染所致的免疫病理过程中贡献更大。因此，Th1/Th2免疫反应的平衡及过度转变对于疾病的严重程度至关重要。但是，RSV感染组与健康对照组两组之间Th1、Th2及Th17细胞因子水平无明显差异，这可能归因于RSV感染诱导的高水平IL-10及IL-35减弱了Th1、Th2及Th17细胞因子的表达。此外，该研究发现IL-10的表水平与病程呈负相关，表明IL-10可能促进RSV感染疾病的恢复，延缓疾病进展。有研究表明，效应性T细胞及单核细胞来源的IL-10在控制疾病严重程度起着关键作用，主要通过抑制Th1类细胞因子(IFN-γ，[2,17]IL-12)及促炎性细胞因子(IL-6，TNF-α，IL-1β)的释放。此外，在RSV感染疾+病中，IL-10可以对抗CD4T细胞分泌Th2类细胞因子，进而抑制气道高反应及42 [3]组织重塑。尽管IL-35及IL-27与病程无相关性，但是在RSV感染患儿中增强，不能排除其通过诱导IL-10的表达，间接控制疾病的严重程度，促进疾病的恢复。目前仍需要进一步的实验来探讨抑制性细胞因子在RSV感染中的表达及来源，进而了解RSV感染诱导的免疫炎症机制。总之，该研究结果表明RSV特异的IL-10及IL-35表达在控制RSV疾病进展起着重要作用，为RSV感染诱导的免疫炎症反应研究提供了新的视角。43 第五章小结1.年龄越小，尤其是年龄≤6月的患儿，越易感RSV，且病程较年长儿更长，病情更严重。2.抑制性细胞因子IL-10、IL-35及IL-27在RSV感染疾病中促进疾病恢复，缩短疾病病程，调节机体免疫平衡，在RSV所致炎症反应机制中扮演着非常重要角色。3.IL-10表达水平增加是影响RSV住院患儿疾病病程的重要因素。44 45 第六章参考文献[1]LoebbermannJ,SchnoellerC,ThorntonH,etal.IL-10regulatesvirallungimmunopathologyduringacuterespiratorysyncytialvirusinfectioninmice[J].PloSone,2012,7(2):e32371.[2]SunJ,CardaniA,SharmaAK,etal.AutocrineregulationofpulmonaryinflammationbyeffectorT-cellderivedIL-10duringinfectionwithrespiratorysyncytialvirus[J].PLoSpathogens,2011,7(8):e1002173.[3]SunL,CornellTT,LeVineA,etal.Dualroleofinterleukin-10intheregulationofrespiratorysyncitialvirus(RSV)-inducedlunginflammation[J].Clinicalandexperimentalimmunology,2013,172(2):263-279.[4]TsaiTT,ChuangYJ,LinYS,etal.Anemergingrolefortheanti-inflammatorycytokineinterleukin-10indenguevirusinfection[J].Journalofbiomedicalscience,2013,20:40.[5]ChoiJ,LeungPS,BowlusC,etal.IL-35andAutoimmunity:aComprehensivePerspective[J].Clinicalreviewsinallergy&immunology,2015,49(3):327-332.[6]ZengR,ZhangH,HaiY,etal.Interleukin-27inhibitsvaccine-enhancedpulmonarydiseasefollowingrespiratorysyncytialvirusinfectionbyregulatingcellularmemoryresponses[J].Journalofvirology,2012,86(8):4505-4517.[7]Aparicio-SiegmundS,GarbersC.Thebiologyofinterleukin-27revealsuniquepro-andanti-inflammatoryfunctionsinimmunity[J].Cytokine&growthfactorreviews,2015,26(5):579-586.[8]RobinsonKM,LeeB,SchellerEV,etal.TheroleofIL-27insusceptibilitytopost-influenzaStaphylococcusaureuspneumonia[J].Respiratoryresearch,2015,16:10.[9]ThornburgNJ,ShepherdB,CroweJE,Jr.Transforminggrowthfactorbetaisamajorregulatorofhumanneonatalimmuneresponsesfollowingrespiratorysyncytialvirusinfection[J].Journalofvirology,2010,84(24):12895-12902.[10]WintersteinAG,KnoxCA,KubilisP,etal.Appropriatenessofagethresholdsforrespiratorysyncytialvirusimmunoprophylaxisinmoderate-preterminfants:a46 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文献综述呼吸道合胞病毒概要范如艳(综述)范楚平(审校)急性呼吸道感染(acutelowerrespiratoryinfections，ALRIs)是导致全球儿童死亡率的主要原因[1,2]。呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)被认为是导致幼儿ALRIs最主要的病毒，是导致儿童呼吸道疾病高发病率及死亡率的重要原因[3,4]。RSV可引起一系列呼吸道疾病，包括上呼吸道感染、普通肺炎、毛细支气管炎、甚至重症肺炎，是引起儿童呼吸道感染住院最常见的病毒[5]。尽管目前有关于RSV流行病学、临床发病机理、诊断技术、动物实验及感染诱导的免疫反应的大量研究，但是经过60年的努力，目前国际上仍没有有效疫苗及特异性治疗药物。关于病毒1956年RSV首先从大猩猩中分离出来[6]，随后在严重下呼吸道感染的婴幼儿中发现。RSV为单股、负链RNA病毒，正粘液病毒科，人偏肺病毒属。根据G蛋白的抗原特异性，将RSV分为两个基因型：A型和B型。其基因组超过15000氨基酸，由10个基因编码11个蛋白，2个非结构蛋白(NS1及NS2)及9个结构蛋白，包括粘附蛋白(G)，融合蛋白(F)，小疏水蛋白(SH)，磷蛋白(P)，非结构蛋白(NS1和NS2)，核蛋白(L)，M2-1及M2-2蛋白[7]。G蛋白和F蛋白为表面蛋白，是诱导机体保护性免疫最重要的抗原。G蛋白是RSV中最易突变的蛋白，F蛋白比较保守，其诱导的中和抗体可以同时中和RSV-A和RSV-B[8,9]。核衣壳蛋白(N)结合病毒RNA、基因组及反链基因组，从而形成病毒粒子。磷蛋白(P)是核壳体的关键组成部分。基质蛋白(M)在病毒粒子形成中占主要作用，同时参与病毒的复制[10]。其中基质蛋白(M2-1)与P蛋白、M蛋白及RNA相连接，是RNA转录的关键因子，基质蛋白(M2-2)在感染细胞中表达水平较低，可以诱导转录并增加RNA复制[8]。病毒核蛋白(L蛋白)转录mRNA并复制基因组、抗基因组RNA[8]。小疏水蛋白(SH)是病毒的主要离子通道。结构蛋白(NS1和NS2)主要抑制细胞干扰素反应[11]。48 基于G蛋白的遗传学特性及单克隆抗体反应，将RSV分为两种基因型：RSV-A和RSV-B。到目前为止，一共有14RSV-A亚型[12-18]，包括GA1-7，SAA1-2，NA1-4及ON1和22种RSV-B亚型[12,13,19-23]，包括GB1-5,SAB1-4,URU1-2,BA1-10,andTHB。其中RSV-A中，NA1是当前全球最主要的流行亚型，ON1为新发现的亚型，逐渐成为主要流行亚型；RSV-B中，BA亚型为最主要的流行亚型。流行病学RSV是引起幼儿及婴幼儿ALRIs的最重要的病原，据统计，每年全球约有340万年龄＜5岁的儿童因感染RSV住院治疗，其中约6.6万至20万患儿死亡[24]。在温带地区，RSV感染呈季节性流行，主要是每年的晚秋、冬天到第二年早春。在我国主要是每年的10月至次年的5月[25]。临床表现及诊断研究表明，在儿童中，RSV导致的住院率在年龄＜6月的患儿中最高，其高峰期主要在2-3月龄的婴幼儿；其次依次是6-12月龄患儿，1岁-5岁患儿[26]。年龄＜1岁的婴儿约50-70%曾经感染过RSV，而2岁以下儿童，几乎100%感染过RSV[27]。由于RSV感染后保护性免疫不完全，且持续时间短，因此RSV感染在一生中可反复发生。此外，有研究表明，婴幼儿时期感染RSV，后期可能发展为持续的气道高反应，甚至增加了青少年时期哮喘的风险[28]。RSV初次感染几乎都是有症状的，重复感染症状往往较第一次感染轻。RSV可引起不同程度的呼吸道感染，从轻度的上呼吸道感染到中、重度下呼吸道感染，甚至威胁生命安全。约15-50%的RSV感染患儿需要住院治疗，其中5-10%的住院患儿需要入PICU治疗。RSV引起婴幼儿最常见的下呼吸道感染疾病为毛细支气管炎、肺炎等，常引起咳嗽、发热、喘息等症状[27]。随着分子生物学诊断技术及直接免疫荧光技术在临床的推广，并结合临床表现及影像学检查，可明确诊断为RSV感染。重症RSV疾病的高危因素[29,30]包括：早产儿，低出生体重儿，唐氏综合症，年龄＜6月婴幼儿，合并肺部基础疾病，合并先天性心脏病，营养不良，免疫功能不全，合并代谢性疾病等。针对RSV感染，目前确定的有2个保护性因素，母乳喂养及高水平的母体免疫。RSV发病机理49 大量的人和动物实验表明，RSV复制导致的病理学反应不足以解释RSV疾病，而RSV诱导的炎症反应及免疫反应似乎在RSV疾病进展中占据更重要的作用。1.病毒入侵与免疫逃逸RSV进入机体后，首先通过G蛋白粘附至宿主细胞，然后通过F蛋白逐渐融合，并进入宿主细胞，整合、复制、形成新的病毒粒子并释放。RSV反复感染在人的一生中反复发生，表明RSV诱导的保护性免疫非常有限，并且与其他病毒一样，RSV在宿主中产生了免疫逃避并破坏宿主免疫反应[31]。RSV中只有G蛋白和F蛋白可诱导产生中和抗体，其糖基化可干扰特异性抗体对其识别[32]。此外可能还存在另一种免疫逃避机制，G蛋白不仅具有融合功能还具有分泌功能，其分泌的蛋白可能成为中和抗体的目标，从而使G蛋白避免被中和。此外NS1及NS2蛋白可以干扰I型干扰素的产生，从而干扰病毒的清除[33]。2.细胞免疫++研究表明CD4及CD8T细胞在RSV感染后病毒清除及肺部免疫病理中有一定的作用。T淋巴细胞在RSV感染疾病中具有双重作用。在严重RSV感染疾病中，T淋巴细胞参与细支气管上皮的损伤，而T淋巴细胞反应不足时可导致致命的重症RSV系呼吸道感染。NK细胞在RSV感染2天后可在肺部及肺泡灌洗液中检测道，并在第4天出现高峰后迅速下降，其主要在RSV感染早期病毒清除中扮演重要角色。在RSV感染中，主要通过骨髓pDCs诱导IFNα的产生，敲出pDCs可降低病毒的清除，增强肺部及气道的炎症反应，增加气道分泌物，延长RSV诱导的气道高反应性。调节性T细胞(Tregs)可以抑制趋化因子及促炎性+性细胞因子的产生，控制RSV特异的CD8T趋化至肺部。RSV感染可诱导一系列细胞因子反应，包括促炎性细胞因子，Th1类细胞因子、Th2类细胞因子、Th2类细胞因子、Th17类细胞因子、调节性细胞因子IL-10及趋化因子IL-8。促炎性细胞因子包括IL-1、IL-6、TNF-α，主要是诱导和上调粘附分子的表达，促进RSV感染诱导的炎症反应。研究表明，与健康对照组比较，RSV感染组炎症部位及血浆中的IL-6及TNF-α表达上调。Th1类细胞因子主要包括IFN-γ、IL-12及IL-18，可以减少病毒病毒复制，促进病毒清除[34,35]。Th2类细胞因子主要包括IL-4、IL-5及IL-13。在RSV疾病的免疫病理中，Th150 及Th2均起着重要作用。福尔马林灭活疫苗接种可加强RSV疾病，其IL-4、IL-5及IL-13表达水平明显增高[36,37]，而Th1类细胞因子可抑制放大的Th2免疫反应。研究表明，重症RSV疾病患儿的IL-4、IL-5及IL-13表达水平明显增高[37]。IL-17在调节适应性免疫反应中起着关键作用，但是同时也可诱导促炎性细胞因子的产生。小鼠实验显示，RSV感染后可上调IL-17A的水平。IL-10作为调节性细胞因子，对于调节Th1类细胞因子、Th2类细胞因子、Th2类细胞因子及Th17类细胞因子反应非常重要[38-40]。3.体液免疫F和G蛋白RSV的主要抗原，包含其抗原表位可以诱导RSV中和抗体。在小鼠实验中，RSV感染可以产生RSV特异的IgM、IgG，主要以IgG2a为主[41,42]。此外，在RSV感染的小鼠的肺泡灌洗液中还包含有RSV特异的IgA。研究表明，在体液免疫缺乏时，RSV的清除不受影响，但是肺部的炎症更严重[43]。年龄＜6月的小婴儿自身免疫系统尚未发育完全，尽管母体的免疫力表现较高水平，RSV初次感染仍多见于2-6个月小婴儿，这表明RSV感染在母体免疫存在下仍可发生，母体免疫在RSV感染中是保护作用还是增强疾病仍不清楚。但很多研究表明，来自母体免疫的中和抗体水平滴度与RSV感染呈负相关。RSV感染后，血浆及鼻咽拭子中RSVG或F蛋白特异的IgG与IgA水平明显增加，但部分患儿仍没有明显变化[44,45]。这些结果表明由于RSV感染后诱导的中和抗体水平不高，因此在幼儿及儿童时期出现反复RSV感染。治疗RSV感染引起的急性毛细支气管炎往往需要住院治疗，目前主要治疗方案包括(1)支持治疗，包括氧气吸入、雾化、吸痰等；(2)抗感染治疗，利巴韦林是国际上批准的用于治疗重症毛细支气管炎的广谱抗病毒药物，研究表明，利巴韦林对于缩短气管插管及住院时间有效。尽管临床上无合并细菌感染的绝对证据，但是通常会联合使用抗生素治疗。帕利珠单抗是一种单克隆抗体[46]，主要对抗RSV的F蛋白，目前在国际上已被认可，用于高危患儿的的预防，但是价格昂贵，目前在我国临床应用不多。总结RSV是儿童呼吸道感染最重要的病原，需要更多的实验研究去证明RSV诱51 导的免疫炎症反应与毛细支气管炎等一系列呼吸道感染性疾病之间的相关性。获得有效的RSV疫苗仍面临着巨大的挑战。52 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中、英文词对照表缩写全称中文RSVRespiratorysyncytialvirus呼吸道合胞病毒LRTIsLowerrespiratorytractinfections下呼吸道感染URTIsUpperrespiratorytractinfections上呼吸道感染GGproteinG蛋白NSNasalswab鼻咽拭子PCRPolymerasechainreaction聚合酶联反应RT-PCRReversetranscription-polymerasechainreaction逆转录聚合酶链式反应IPTGIsopropyl-β-d-thiogalactoside异丙基-β-d-硫代半乳糖苷X-Gal半乳糖苷TBTerrificbroth极品肉汤培养基ADVAdenoviridae腺病毒Th1Thelpertype11型辅助性T细胞Th2Thelpertype22型辅助性T细胞Th17Thelpertype1717型辅助性T细胞ILInterleukin白介素IFNInterferon干扰素TNFTumornecrosisfactor肿瘤坏死因子TGFTransformingGrowthFactor转化生长因子ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentAssay酶联免疫吸附试验EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸ODopticaldensity光密度PBSPhosphatebufferdsaline磷酸盐缓冲液58 59 本课题资助1、2014年院内重点课题：呼吸道合胞病毒人源化中和抗体筛选(N2013-005)。2、2015年郴州市科技局课题：儿童呼吸道合胞病毒感染诱导的炎症反应及其致病机制研究(CZ2015-005)。60 61 作者攻读学位期间的科研成果1.范如艳,范楚平,潘俊秀.病毒感染与儿童哮喘急性发作相关性分析[J].医学理论与实践.2015:701-03.2.陈礼娟,范如艳,范楚平.儿童哮喘支气管肺泡灌洗液成分分析[J].医学理论与实践.2015:1554-56.3.潘俊秀,范如艳,陈礼娟,.支气管肺泡灌洗并镜下布地奈德灌注对儿童哮喘肺功能改善的分析[J].医学理论与实践.2015.4.曾平,范楚平,范如艳.纤维支气管镜术在儿童反复咳喘疾病诊治中的应用分析[J].医学理论与实践.2013:2254-56.5.潘俊秀,范楚平,范如艳.儿童哮喘急性发作支气管肺泡灌洗液病毒病原学分析[J].医学理论与实践.2015:706-08.6.第一作者：RespiratorysyncytialvirussubtypeON1/NA1/BA9predominatesinhospitalizedchildrenwithlowerrespiratorytractinfections.已投稿。7.第一作者：Respiratorysyncytialvirusinfectioninduceinhibitorycytokineexpressioninrelationtodiseaseprogressioninhospitalizationchildren.已投稿。62 63 致谢三年的研究生学习时光即将结束，虽然短暂但却珍贵和难忘。值此论文完成之际，谨向三年来关心和支持我的各位老师、同事、家人和朋友表示诚挚的感谢和祝福!衷心感谢我的导师范楚平教授。作为我的导师，范老师执着追求、勇于创新的工作精神时时激励着我，范老师工作勤奋、敬业；治学严谨、求实；待人谦和、为人善良、生活低调、育人无私，给予我们充分信任，开放式的辅导，使我们更好地锻炼了自己各方面的能力。在此谨向范老师表示崇高的敬意和诚挚的感谢！在今后的岁月里，我必将以范老师为榜样，刻苦钻研勇攀科研高峰，以报答这份师恩。诚挚感谢我的实验室指导老师瞿小旺研究员。本课题是在他的直接指导下完成的，瞿老师在实验设计、实施及论文撰写中都给予我很多指导和帮助，生活中的他和蔼可亲、平易近人，对我学习做人和做学问都产生了积极影响。感谢文波博士、刘文培博士在实验设计和技术方面给予我的指导和支持，感谢张健老师在统计方面给予我的指导和支持。衷心感谢这个温暖的大家庭。衷心感谢郴州市第一人民医院对我的培养，感谢转化研究所提供了这个平台，感染黄仁彬院长对我们研究生的支持与帮助。感谢我的父母多年来对我的学习、生活的支持和鼓励。在我困难的时候，是他们给予了我战胜困难的信心和力量，本文凝结了他们的心血、教诲和温暖。64