《兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号８５２．５：１０４３４：Ｓ授予学位单位代码研究生学号：２０１４１１０４６５山东农业大学硕士学位论文兔出血症病毒ＲＰＡ检测方法的建立及间接ＥＬＩＳＡ检测抗体的研究ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＲｅｃｏｍｂｉｎａｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｓｓａａｎｄａｎＩｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡＡｎｔｉｂｏｄｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｙｆｏｒＲａｂｂｉｔＨａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ研究生：张连芝学科专业：预防兽医学研究方向：动物检疫与食品检验学院：动物科技学院指导教师：崔言顺教授２０１７年６月４日 ２０１７．论文提交日期．０４２８：论文答辩日期：２０１７．０６．０３学位授予日期：２０１７．０６？学科门类？农学答辩委员会主席：沈志强 关于学位论文原创性和使用授权声明本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下，独立进行科学研宄所取得的成果。对在论文研宄期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人和集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分论文编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：曰期：“ 山东农业大学硕士学位论文符号说明缩写词英文名称中文名称Ampampicilin氨苄青霉素bpBasepair碱基对CLPCore-likeparticles核心样颗粒DICDisseminatedintravascularcoagulation弥散性血管内凝血DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyrinediaminetriphoshate脱氧核糖核苷三磷酸EBEthidiumbrothide溴化乙锭EBHSEuropeanbrownharesyndrome欧洲棕色野兔综合症EBHSVEuropeanbrownharesyndromevirus欧洲棕色野兔综合症病毒E.coliEscherichiacoli大肠杆菌EDTAEthylenedianinetetra-acetic乙二胺四乙酸ELISAEnzyme-linkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附测定FQ-PCRReal-timefluorescentquantitativePCR实时荧光定量PCRGenBankGenebank核苷酸序列基因库gRNAgenomicRNA基因组RNAHAhemagglutination血凝HBGAHistobloodgroupantigens组织血型抗原HIhemagglutinationinhibition血凝抑制HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IDimmuneagardiffusiontest免疫琼脂扩散试验IHAIndirecthemagglutinationinhibitiontest间接血凝抑制试验IPTGIsopropyl-β-D-thiogalactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷KuKilodalton千道尔顿LBLuria-bertanimediumLB培养基NCNitrocellulosefilter硝酸纤维素膜 山东农业大学硕士学位论文ODOpiticaldenety光密度OIEOfficeInternationalDesEpizooties世界动物卫生组ORFOpenreadingframe开放阅读框架PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphatebufferdsaline磷酸盐缓冲液PBSTPhosphateBufferSodiumTween磷酸盐－吐温缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RdRpRNA-dependentRNApolymeraseRNA依赖性RNA聚合酶RHDrabbithaemorrhagicdisease兔出血症RHDVrabbithaemorrhagicdiseasevirus兔出血症病毒RNARibonucleicacid核糖核酸RPARecombinasePolymeraseAmplification重组酶聚合酶扩增r/minRevolutionsperminute转速/分钟RRIRibonucleaseinhibitorRNA酶抑制剂Reversetranscriptase-polymerasechainRT-PCR反转录聚合酶链式反应reactionSDStandarddeviation标准差SDSSodiumlaurylsulfate十二烷基硫酸钠SPFspecificpathogenfree无特定病原体TMB3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine3，3，5，5-四甲基联苯胺TrisTri(hydroxymethy)aminomet-hane三（羟甲基）氨基盐酸盐UTRUntranslatedregion非翻译区VLPvirus-likeparticles病毒样粒子VPgvirusgenome-linkedprotein病毒基因组结合蛋白 山东农业大学硕士学位论文目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1前言........................................................................................................................................11.1兔病毒性出血症的概述......................................................................................................11.2RHDV基因组结构及功能..................................................................................................31.3RHDV病原学特点..............................................................................................................41.3.1RHDV形态学...................................................................................................................41.3.2RHDV对理化因素的抵抗力...........................................................................................41.3.3RHDV的血凝特性...........................................................................................................51.4RHD的流行病学研究.........................................................................................................51.4.1流行特点...........................................................................................................................51.4.2传染源与传播途径...........................................................................................................51.4.3易感动物...........................................................................................................................61.5RHD诊断方法的研究进展.................................................................................................61.5.1根据临床症状进行初步诊断...........................................................................................61.5.2病理剖检及病理组织学诊断...........................................................................................61.5.3实验室检测.......................................................................................................................81.6本研究的目的及意义........................................................................................................122材料与方法..........................................................................................................................142.1材料....................................................................................................................................142.1.1主要试剂和材料.............................................................................................................142.1.2主要试剂的配制.............................................................................................................142.1.2.1琼脂糖凝胶电泳试剂..................................................................................................142.1.2.2诱导表达试剂..............................................................................................................152.1.2.3SDS-PAGE试剂的配制...............................................................................................152.1.2.4Westernblot试剂的配制.............................................................................................162.1.2.5ELISA试剂的配制......................................................................................................162.1.3主要仪器.........................................................................................................................172.2方法....................................................................................................................................17 山东农业大学硕士学位论文2.2.1RHDV的分离与分子遗传变异特性分析.....................................................................172.2.1.1兔出血症病毒VP60基因的克隆..............................................................................172.2.1.2VP60基因的核酸序列分析........................................................................................222.2.2兔出血症病毒RPA检测方法的建立...........................................................................242.2.2.1兔出血症病毒VP60基因引物的设计......................................................................242.2.2.2兔出血症病毒RNA的提取.......................................................................................242.2.2.3兔出血症病毒RPA检测方法的建立.........................................................................242.2.2.4特异性试验..................................................................................................................252.2.2.5敏感性试验..................................................................................................................252.2.2.6人工感染的样本检测..................................................................................................262.2.2.7临床应用......................................................................................................................262.2.3间接ELISA检测抗体的研究.......................................................................................262.2.3.1VP60基因序列比对....................................................................................................262.2.3.2VP60基因的分段扩增及原核表达载体构建............................................................262.2.3.3VP60-1、VP60-2、VP60-3基因的原核表达及纯化................................................282.2.3.4Westernblot分析.........................................................................................................302.2.3.5间接ELISA方法的建立............................................................................................302.2.3.6RHD免疫抗体检测.....................................................................................................323结果与分析...........................................................................................................................333.1RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析................................................................333.1.1VP60基因的克隆...........................................................................................................333.1.2VP60基因的核酸序列系统进化树分析.......................................................................333.2兔出血症病毒RPA检测方法的建立..............................................................................363.2.1重组酶聚合酶等温扩增反应.........................................................................................363.2.2RPA反应条件的优化.....................................................................................................363.2.3特异性试验.....................................................................................................................373.2.4敏感性试验.....................................................................................................................373.2.5人工感染的样本检测.....................................................................................................383.2.6临床应用..........................................................................................................................383.3间接ELISA检测抗体的研究...........................................................................................39 山东农业大学硕士学位论文3.3.1VP60基因序列比对.......................................................................................................393.3.2VP60基因的分段扩增及原核表达载体构建...............................................................433.3.3VP60-1、VP60-2、VP60-3基因的原核表达及纯化...................................................443.3.4Westernblot分析............................................................................................................463.3.5间接ELISA方法的建立...............................................................................................463.3.5.1抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度的确定..........................................................463.3.5.2抗原最佳包被时间的确定...........................................................................................473.3.5.3最佳封闭液的确定.......................................................................................................483.3.5.4最佳封闭时间的确定..................................................................................................483.3.5.5二抗工作浓度的确定..................................................................................................483.3.5.6ELISA阴阳性临界值的确定......................................................................................493.3.6RHD免疫抗体检测........................................................................................................494讨论......................................................................................................................................514.1RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析................................................................514.2兔病毒性出血症RPA检测方法的建立..........................................................................514.3间接ELISA检测抗体的研究...........................................................................................525结论......................................................................................................................................54参考文献..................................................................................................................................55致谢........................................................................................................................................65攻读学位期间发表论文情况..................................................................................................67个人简介..................................................................................................................................66 山东农业大学硕士学位论文中文摘要兔病毒性出血症（viralhaemorrhagicdiseaseofrabbits）是由兔出血症病毒（rabbithaemorrhagicdiseasevirus，RHDV）感染所引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、高致死性的传染性疾病，以全身实质器官出现水肿、淤血和出血为主要特征。RHDV被分为G1～G5以及G6（RHDVa，又名RHDV抗原变异株）6种基因型。2010年首次报道了变异型RHDV，它在遗传特性上与RHDV的6个基因型有很大的差异，命名为RHDV2也称为RHDVb。在欧洲野兔体内，发现一个能引起野兔发病的新型毒株与RHDV的基因组结构类似，被称为欧洲褐色兔综合症病毒（EBHSV）。本试验利用RHDV病原建立了RHDV重组酶聚合酶等温扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）检测方法，通过生物信息学分析，将RHDV的VP60基因进行分段表达确定其抗原性，以此建立了间接ELISA方法。本研究主要包括以下四部分内容：1RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析在山东不同地区分离了3株RHDV毒株，分别命名为BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株，克隆RHDV病毒的VP60蛋白基因，通过VP60核酸序列进化树分析显示，3个毒株均属G6（RHDVa）变异群，序列同源性比对分析显示，BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中其它经典型RHDV毒株核苷酸序列同源性分别在90.2%～98.6%、90.5%～99.9%、89.4%～99.5%，BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中RHDV2毒株核苷酸序列同源性分别在82.6%～82.9%、82.5%～82.8%、81.5%～81.9%。2014年河北分离到HB毒株与1984年江苏首次分离的WX84毒株遗传距离很近，推测其很可能来自毒株WX84株，近几年，中国从西北、华东、东北和西南四大地区分离到的具有代表性的RHDV毒株与WX84株差异较大，说明RHDV发生了变异，但是四大地区之间的RHDV毒株差异不大，且同世界其他国家和地区RHDV分离株基因序列几乎没有差异，同源性达到90%以上，因此，病毒基因型和流行的地域性没有必然联系。2RPA检测方法的建立根据BZ/2015株的VP60基因的核酸序列，设计1对特异性引物，优化反应条件，建立了RHDV重组酶聚合酶等温扩增检测方法。通过敏感性、特异性、人工感染和临床应用等表明，该方法能特异扩增出特异片段，检测灵敏度达到0.1LD50，与常规一步法RT-PCR敏感性相同。该方法具有较好的稳定性、敏感性和特异性。重组酶聚合酶等I 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究温扩增反应过程总耗时30min左右，RPA检测方法和一步法RT-PCR的检出符合率为100%。3VP60基因分段表达及抗原性分析VP60基因分为3个区域VP60-1（2aa-208aa）、VP60-2（174aa-425aa）和VP60-3（342aa-579aa）。VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60分别克隆到原核表达载体pET32a（+）和pColdⅢ中，4个重组质粒分别命名为pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60。对VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60基因进行IPTG诱导表达，重组蛋白进行SDS-PAGE和Westernblot分析。SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60条带大小，与预期大小一致。将表达的重组蛋白纯化后的蛋白进行Westernblot检测结果表明，表达的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60均能和RHDV阳性血清发生特异性反应。4ELISA方法建立利用纯化的VP60分段蛋白作为包被抗原，以兔出血症病毒阳性血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗建立间接ELISA检测方法。分别用ELISA方法和HI试验对7只6周龄SPF兔免疫RHD灭活疫苗后7d、14d、21d、28d、35d、42d的抗体水平进行检测，间接ELISA结果显示，重组蛋白VP60-1和VP60作为包被抗原检测兔免疫后血清中的抗体消长规律一致。HI试验和以VP60-1作为包被抗原的间接ELISA试验检测结果一致，本试验根据两种方法所测得的各组兔群的抗体效价建立了相应的回归方程r2=0.9547，表明ELISA方法与HI试验检测的抗体效价结果呈显著相关性。关键词：兔出血症病毒；VP60基因；遗传变异；RPA；间接ELISAII 山东农业大学硕士学位论文DevelopmentofaRecombinasePolymeraseAmplificationAssayandanIndirectELISAAntibodyDetectionTechniqueforRabbitHaemorrhagicDiseaseVirusAbstractRabbithemorrhagicdisease(RHD)causedbyRabbithemorrhagicdiseasevirus(RHDV)ischaracterizedbyanacutecourse,hemorrhagicsepticemaandahighmortalityinadultrabbits.RHDVisolatedbelongedtooneofthesixidentifiedgenotypes(GI～GVI),amongwhichtheGVIisanantigenicsubtype(RHDVa).In2010,anadditionalRHDVwasidentified,phylogeneticallyandantigenicallydistinctfromRHDVandprovisionallycalledRHDV2orRHDVb.Asimilardisease,termedEuropeanbrownharesyndrome(EBHS),hadbeendescribedinthehare(Lepuseuropaeus).Inthestudy,recombinasepolymeraseamplification(RPA)detectionmethodwasestablishedbyRHDVpathogen.BybioinformaticsanalysisthreeencodingregionsofRHDVweresub-clonedintopET32aforexpressioninE.colirespectively.Thisstudywasdividedintothefollowingfourparts:1TheisolationandgeneticvariationanalysisofRHDVThreeRHDVstrainswerenamedBZ/2015,LW/2015andMY/2015.TheywereisolatedbyanimalchallengetestindifferentregionsofShandongProvince.TheVP60proteingenesofthesestrainswereclonedandthenthegenephylogeneticanalysiswasperformed.TheresultsshowedthatthethreestrainswereallsubdividedintotheRHDVavariantgroupaccordingtothephylogenetictreebasedonnucleotidesequences.ThenucleotidesequencehomologyofBZ/2015,LW/2015,andMY/2015withthereportedVP60geneofRHDVwere90.2%～98.6%,90.5%～99.9%and89.4%～99.5%，ThenucleotidesequencehomologyofVP60geneofthreeRHDVstrainswiththoseofRHDV2were82.6%～82.9%,82.5%～82.8%and81.5%～81.9%.HBStrainwastheisolationofHebeiProvincein2014belongedtothesecondgenegroup.Inthisgroup.ThenucleotidesequencehomologyofHBStrainandWX84Strainwasveryclose,itprobablycomefromthesamestrainWX84.ExceptionWX84StrainandHBStrain,allotherChineseRHDVisolatesbelongedtofifthandsixthgenegroup.III 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究ThehereditarydistancebetweenthestrainsisolatedinrecentyearsandWX84Strainwasvariant.TheresultindicatedthattheVP60genesequenceswereveryconservative,andthehomologyofthenucleotideamongdifferentisolatesexceeded90%,thusthegenegroupandregionhadnegativeconnection.2Theestablishmentofrecombinasepolymeraseamplification(RPA)detectionforRHDVAccordingtothesequencesofVP60geneofBZ/2015strain,thespecificprimersweredesignedtoestablishrecombinasepolymeraseamplificationdetectionmethod.ThroughtheSpecificitydetection,sensitivityofartificialinfectionexperimentandclinicalapplication,themethodcoulddetectedRHDV.Theviruscouldbedetectedaminimumof0.1LD50ofviralcDNAbyRPAandonestepofRT-PCR.RPAdetectingmethodwithhighsensitivityandspecificity,theamplificationcouldbefinishedwithnomorethan30min,AnimalchallengetestshowedthatalltheRHDVpositivesamplesthatdetectedwiththeRPAandonestepofRT-PCRcouldleadto100%morbidityandmortality.3ProkaryoticexpressionandantigenicityanalysisofthreeencodingregionsofVP60geneToestablishaserologicaldetectionmethodforrabbithaemorrhagicdiseasevirus(RHDV),threeencodingregionsofRHDVVP60-1(2～208aa),VP60-2(174～425aa)andVP60-3(342～579aa)wereanalyzedthroughbioinformaticsandsub-clonedintopET32a(+)forexpressioninE.colirespectively.VP60weresub-clonedintopColdⅢforexpressioninE.colirespectively.TheyarenamedpET-VP60-1,pET-VP60-2,pET-VP60-3andpCold-VP60.TheVP60-1gene,VP60-2gene,VP60-3geneandVP60genewereexpressedsteadilyandhiglyinE.colibyIPTG.SDS-PAGEshowthatthreetruncatedrecombinantproteinsof42ku,47.5kuand45.6kuweregainedandcouldberecognizedbyanti-serumofRHDV.WesternblotshowthatrecombinantproteinsVP60-1,VP60-2,VP60-3canandRHDVpositiveserumspecificityreaction。4TheestablishmentoftheindirectELISAmethodfordetectingantibodytoRHDVBaseontheexpressedproteinanindirectELISAwasestablishedtodetectRHDVantibodyinrabbitserum.Afterimmunized7d,14d,21d,28d,35dand42d,bloodwascollectedfromeachrabbitinsevengroupstotestthespecificantibodylevelbyindirectELISAandHIassay.ThesedatasuggestedthatthetwomethodsshowedsignificantIV 山东农业大学硕士学位论文correlation（r2=0.9547）.TheseresultssimplythatVP60-1andVP60detectionantibodylevelschangerules，andtheindirectELISAmethodwithrecombinantproteinVP60-1couldbesuitableforimmunologicalevaluationofRHDVvaccine.Keywords:RHDV;VP60Gene;geneticvatiation;recombinasepolymeraseamplification;IndirectELISAV 山东农业大学硕士学位论文1前言兔病毒性出血症（viralhaemorrhagicdiseaseofrabbits）是由兔出血症病毒（rabbithaemorrhagicdiseasevirus,RHDV）感染所引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、高致死性的传染性疾病，又称兔出血性肺炎和兔出血症病毒，俗称兔瘟，全身实质器官出现水肿、淤血和出血为主要特征的传染病（李富金等,2015）。兔病毒性出血症呈世界流行性分布，发病率和病死率很高，是兔常见多发病之一（Bouslamaetal,1996）。该病1984年首次暴发于我国（刘胜江等,1984），随着自然流行或国际贸易的发展迅速流行，陆续在亚洲、欧洲、美洲地区多个国家发现了相关病例报告，新西兰、澳大利亚等少数国家引进病毒保护原始生态环境平衡外，该病困扰着其他各国养兔业的健康发展（Bouslama,1996;PattersonandHowie,1995）。近年来，随着畜牧养殖业的发展，养兔业也得到了快速发展，由以前的个体散养户到现在的规模养殖，随着饲养数量增多、规模变大，疾病的发生较以前有了很大的变化。2010年，法国最先发现变异型RHDV，被命名为RHDV2，该变异毒株与经典毒株的6个基因型发生了很大变异。随后，欧洲、澳大利亚地区报道了RHDV2的流行（Abrantesetal,2013;Bailyetal,2014;LeGall-Reculéetal,2013）。1.1兔病毒性出血症的概述1984年春天，在我国江苏省无锡市和江阴市首次从德国引进的安哥拉种兔发现兔出血症病毒，当年年底遍及整个华东地区，由于该病主要在成年兔中传播，传播速度快、传染性极强、潜伏期较短、发病率和致死率都很高，当地称之为“兔瘟”。1986年，意大利报道该病毒的流行，1987年韩国（Parketal,1991）、1988年墨西哥暴发兔出血症（Greggetal,1991），这均与从我国引进家兔和毛皮相关，导致大量家兔的死亡。墨西哥政府采取了扑灭措施，由于RHDV是输入性病原，所以墨西哥至今没有再暴发RHD。RHDV于1990年在欧洲地区出现大面积的暴发（CancellottiandRenzi,1991;Capuccietal,1991;Morisseetal,1991）。那维亚半岛和英国在1992年均有该该病暴发的报道。欧洲野兔起源于伊比利亚半岛，组成一个重要的生态系统，1988年，野兔出血症最早在西班牙暴发，1989年相继在葡萄牙发生传播，导致野兔数量急剧降低。澳大利亚为了控制野兔的数量，引进RHDV，结果导致RHDV在澳大利亚快速流行传播并引起兔子大量死亡。新西兰农民在1997年非法从澳大利亚引入该病毒，导致RHDV在新西兰暴发。2000年，北美地区出现该病相关报道，之后也发生几次暴发流行。如今，在中国、韩国、新西兰、1 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究摩洛哥、古巴、澳大利亚和欧洲仍呈地方性流行。国际病毒分类委员会（ICTV）把兔出血症病毒划分到杯状病毒科（Caliciviridae）、兔病毒属（Lagovirus）中，该科还包括其它3个病毒属，分别为水疱疹病毒属（Vesivirus）、诺如病毒属（Norovirus）与札幌病毒属（Sapovirus）。近几年又有人提出三个属的新分类：Nabovirus（或Becovirus），Recovirus和Valovirus，但这种分类尚未得到ICTV认可（Honmaetal,2000;Pringle,1998）。现有数据表明，RHDV可分为2个血清型：经典RHDV和变异毒株RHDV2（Halletal,2015）。世界范围内的所有经典RHDV分为6个基因型（G1～G6），从遗传特性和抗原性分析比较稳定（Hukowska-Szematowiczetal,2013），均为同一血清型（Leutholdetal,2015）。分离来自中国、埃及、法国、澳大利亚、德国、西班牙等国家多株病毒，对比其基因组5’末端的460个核苷酸序列发现，差异仅只有1.3%～3.4%，在氨基酸层次上也仅仅只有0.3%～2%的变异，说明经典RHD病毒几乎未发生较大的变异。有报道发现（Mulleretal,2009;Nowotnyetal,1997;RosBascuñanaCetal,1997）对分离1982～1995年期间的，来自17个不同国家的毒株进行了分子流行病学的研究，发现各个毒株之间核酸序列的同源性高达89.4%～100%。Beminger和House等（BerningerandHouse,1995）采用给健康兔免疫后进行攻毒试验以及分别与单克隆抗体反应的研究发现，来自意大利、西班牙、墨西哥以及韩国的病毒株的血清学差异非常小。LeGall等（LeGalletal,1998）研究发现了1988～1995年期间56株法国的RHDV，并对不同区域的RHDV基因片段进行的序列测定分析，结果表明经典RHDV的核酸序列极其保守。2010年8月，G.Le-Recule等（LeGall-Reculéetal,2011）在法国一养兔场检测到一株非典型的兔瘟，为了与经典RHDV辨别，命名为RHDV2。随后该病在欧洲地区内大范围流行。2012年，西班牙报道发现一种新型RHDV毒株，能使青年兔致病甚至死亡，这种新型毒株波及到苏格兰、德国、意大利等欧洲国家（Lopesetal,2014;Puggionietal,2013;Westcottetal,2014），这种病毒被命名为为RHDVb或RHDV2。RHDV2相对于经典毒株RHDVG1～G6基因型（图1），其感染性强，呈世界性流行，给世界上多个国家的养兔业造成了严重的威胁。在欧洲很多地区，现在出现一种RHDV2取代经典RHDV的趋势，然而国内还未报道该毒株的存在。2 山东农业大学硕士学位论文图1RHDV毒株亚型划分（引自Abrantesetal.VeterinaryResearch2012,43:12）Fig.1PhylogeneticrelationshipsbetweentheRHDVgenogroupsG1～G61.2RHDV基因组结构及功能RHDV和RHDV2的基因组都为单股正链RNA分子，无囊膜，呈正二十面体对称构型，RHDV和RHDV2全长约为7.4kb（Gouldetal,1997）。RHDV和RHDV2基因组都包含2个开放阅读框架（Open-readingframe,ORF）（Abrantesetal,2012）：其中ORF1，包括10~7,044核苷酸，ORF2，包括7,025~7,378核苷酸。ORF1起始于5’端，编码一个大的多聚蛋白，占全长的94%，分子量大小约为257kDa，被病毒基因组编码的胰蛋白样半胱氨酸水解酶水解，裂解成8个重要蛋白成熟的非结构性蛋白和一个主要的结构蛋白（Dunhametal,1998;Neill,1992）：该蛋白可被进一步胰蛋白样半胱氨酸水解酶水解为,裂解蛋白排列顺序为：NH2–p16–p23–2-ClikeNTPase–p29–p14（VPg）–3C-Like–RdRP–VP60–COOH（Wirblichetal,1996）。ORF2编码次要结构蛋白VP10（图2），VP10包括gRNA和sgRNA，最近证实VP10可以提升病毒复制、促进凋亡，此外证明，它还能够下调VP60蛋白表达，表明其可以调节病毒复制和病毒粒子释放（Leutholdetal,2015;Meyersetal,2000）。3 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究图2RHDV基因组结构模式图Fig.2GenomicorganizationofRHDV由ORF1的3’端编码的RHDVVP60蛋白，既是兔出血症病毒的衣壳蛋白，也是兔出血症病毒的唯一结构蛋白（Estevesetal,2008;Fouchetetal,2009;Meyers,2000），不仅是病毒免疫保护性抗原蛋白，也是决定着病毒遗传变异、红细胞凝集等重要特性，因此是用于构建基因工程疫苗、研制诊断试剂、开展病毒特性等研究的重要蛋白（刘光清等,2006;严维巍等,2004）。在GenBank已注册的序列中，VP60基因各分离株的核苷酸序列及氨基酸序列同源率均高达90％,一直以来具有高度的保守性，为进一步研制敏感性高、特异性好的临床诊断试剂盒和新型疫苗的研制奠定了基础（张秀娥等,2007）。1.3RHDV病原学特点1.3.1RHDV形态学RHDV在形态结构上，与杯状病毒科中其他的成员类似，病毒粒子无囊膜，也是呈球形，直径约为30nm，核衣壳呈二十面体对称构型，病毒直径仅为25～29nm，其中肝组织的病毒粒子直径大小为27～32nm（Alexandrovetal,1993）。病毒衣壳分为实心、空心两种形式，呈“格子”样，具有32个表面壳粒，在核衣壳上整齐地排列着中空的杯状结构（Valíceketal,1990）。病毒分子量大小为2.3×106Da～2.5×106Da，在氯化铯溶液中的浮密度大小为1.36～1.38g/cm3。目前研究发现，RHDV不适宜在鸡胚、鸭胚中增殖，也未找到其它适宜地体外培养的原代或传代细胞。1.3.2RHDV对理化因素的抵抗力病毒对酸（pH3.0）、加热（60℃，30min）、有机溶剂（20%乙醚）和化学试剂（1M氯化镁）均有较强的抵抗力。在10%漂白粉溶液作用2～3h、20%甲醛溶液作用2.5h、1%氢氧化钠溶液作用3.5h方可完全杀死病毒。生石灰效果较差，过氧乙酸则效果极差（孙松柏等,1991;郑红等,1992）。病毒在干燥条件下存活时间长，对紫外线抵抗力强：在4℃时，病毒可在悬浮液中存活约105d；室温下，在干燥衣服上病毒能够存活长达4 山东农业大学硕士学位论文225d；病毒在60℃时，可在悬浮液中存活约2d；含毒的肝脏病料在-80～-20℃冰箱中保存，可存活长达18个月（Henningetal,2005;Merchánetal,2011）。1.3.3RHDV的血凝特性目前已发现不能产生血凝现象的一些病毒分离株（Chaseyetal,1995），但大部分病毒毒株具有血凝性，能够与人的红细胞凝集，其中“O”型红细胞与病毒凝集作用最为稳定，血凝素在一定范围内对氯仿、乙醚、过典酸钾等有机溶剂和无机离子的影响不敏感，受体破坏酶（RDE）不受温度的影响，在pH值约为4.5～7.8时稳定，最适pH值约为6.0～7.2，如果pH值低于4.4，将会出现溶血现象，如果pH值高于8.5，则不能出现有效凝集。因此，在现代临床诊断上，人们常用人的“O”型红细胞进行HA、HI试验，将其作为临床诊断和疫苗校检的重要方法（Buetal,2008）。除人的“O”型红细胞外，病毒还可以与猴、绵羊、鸡、鹅等动物的红细胞发生凝集，但是凝集力较弱，而不能与马、牛、猪、犬、兔、鸭、仓鼠、豚鼠和大鼠的红细胞发生凝集。人工免疫或患病康复兔的特异性血清抗体能有效抑制病毒血凝特性。在患病兔体内，以肝组织病毒血凝效价最高，其它依次排列为脾脏、肾脏、肺脏、淋巴结、心脏、支气管、胸腺、脑、肌肉等，血液中也能检测出病毒，并与组织病理学变化趋势相一致（Neill,1992）。1.4RHD的流行病学研究1.4.1流行特点RHDV传播速度快，传染性强，本病不仅发生于全品系的家兔，而且发生于全部品种的野兔，长毛兔发病率高于肉兔，在家兔的品种中，纯种兔和杂交兔易感性均高于本土的家兔。成年兔发病率和死亡率居高于2月龄以内的幼兔，高达40～90%，未断奶的仔兔基本不发病。RHDV人工感染乳鼠后，可以引起规律性的发病和死亡，家兔回归实验可致发病甚至死亡。该病一年四季均可发生，流行无明显的季节性特点，在我国南方地区，大多数流行于春、秋两个季节，在北方地区，以冬季、春季多发。该病病程短，在新发疫区多发，呈大面积暴发性流行，在发病康复或免疫后的兔群中，由于兔群体内抗体水平非常高，则该病的发病率和死亡率偏低，零星发病，呈散发流行，其发病率和死亡率大多低于50%。1.4.2传染源与传播途径传染源为病兔和带毒兔，在自然界中排毒的野兔是病毒的隐形携带者和潜在的传染源。该病毒分布广泛，存在于病兔所有的实质性器官，粪便等排泄物和鼻液唾液等分泌5 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究物等。病毒主要排毒方式：粪尿等排泄物，鼻腔、眼睛、皮肤和生殖道分泌物等。该病的传播主要通过病兔的消化道、呼吸道、生殖道以及受伤的皮肤等途径，也可以通过病毒污染的饲料、饮水、空气中的灰尘等传播，同时饲养厂的管理人员、兽医服务人员、贩卖兔的商人和车辆等均是该病的传染源和传播媒介，均可导致该病的流行及传播。该病毒不经过胎盘垂直传播，在污染环境中饲养的种兔后代出生后迁移到未养过兔的地方，新生兔不发病。经相关试验证实，患病兔在康复后的3～4周仍能够向外排毒。RHDV可在冷冻肉和组织器官等兔产品内长期存活，因此在国际贸易中可导致远距离的兔出血症病毒的传播。1.4.3易感动物不同品种的青年以及成年家兔、野兔均为易感动物，该病对2月龄至3月龄以上的青年兔和成年兔易感，而新生乳兔和2月龄以内的仔兔对该病不易感。人工感染3月龄以上的易感兔，发病率高达90%～100%。用病兔肝组织人工接种牛、羊、犬、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、金黄地鼠、鸡、鸭、鸽、鱼等动物均不发病。1.5RHD诊断方法的研究进展对RHDV的诊断主要根据病原学诊断、流行病学调查、典型临床症状、病理剖检、病理组织学检测、血清学诊断和分子生物学诊断等（王焕章等,2005）。1.5.1根据临床症状进行初步诊断经典毒株RHDV和变异毒株RHDV2对家兔的致病性以及症状相似，在临床症状上较难区分RHDV所引起的症状。该病病程很短，自然感染病例潜伏期约为2～3天，人工感染兔潜伏期为1～3天。按照病程的长短，能够把该病分为三种类型：最急性型，急性型和慢性型。最急性型：多在夜间发生，常在非疫区或者流行初期发生，表现为短暂兴奋，死亡迅速，呈现抽搐、倒地，发出数声尖叫而死。急性型：病兔精神萎靡，厌食，体温升高达41℃以上，被毛粗乱，结膜潮红，病兔在临死前瘫痪，强烈撞击兔笼，不断地挣扎，大声尖叫、抽搐倒地，鼻孔流出泡沫性液体，死后呈角弓反张。慢性型：该病的发生多在老疫区或流行后期。潜伏期和病程相对较长，精神沉郁，采食量突然下降，体重急剧降低，有些病兔虽然能够耐过，但耐过之后出现生长缓慢和发育迟缓的现象。1.5.2病理剖检及病理组织学诊断呼吸系统：在病兔呼吸系统中，出现大面积充血、出血。鼻腔、口腔等呼吸道黏膜出现充血以及针尖状或者点状出血。气管和支气管眼观为红气管现象，黏膜呈点状或弥6 山东农业大学硕士学位论文漫性充血，内伴有泡沫状血液。肺水肿，大面积淤血甚至出血，在肺部的单侧或者两侧有大小不一的粟粒到绿豆大小的非对称性斑点出血。肺泡内和血管周围出血，有轻微的卡他性支气管炎，淋巴细胞增加。肺切开后，大量的暗红色的泡沫状液体流出，有散在的出血斑，眼观为花斑肺。肝脏：肝脏出现充血、肿大、质地脆弱易碎，颜色为暗红色，表面出现大量浅黄色或者白灰色的条纹，切开肝脏，有大量暗红色血液流出，眼观为槟榔肝。小叶增生明显，多呈黄灰色，局部粒细胞浸润，进行性细胞凋亡（空泡、线粒体结构发生严重改变，核固缩溶解）巨噬细胞显著增多，白细胞显著减少胆囊：肿大，充满稀薄胆汁。肾脏：出现“大红肾”；肾的单侧或者两侧出现不同程度的肿大，弥散性出血，呈鲜红色或深红色斑点状，在肾皮质有散在的针尖状出血点。病理切片呈现红细胞黏滞成团、毛细血管丛出现变性扩张充血甚至形成血栓等显著性变化；可观察到间质内血管呈现出扩张淤血；肾小球和肾髓质充血、出血，透明血栓，在肾小球上皮细胞呈现出颗粒变性；肾小管出现变性扩张现象，淋巴细胞浸润；红细胞黏滞成团。脾脏：肿大并增大2～3倍，被膜紧张，淤血呈暗紫色，切面结构不明显，实质易于刮脱。病理切片显示白髓显著萎缩，偶然有病例出现核碎裂，含铁血红素沉着，白细胞减少。无淋巴小结，看不清红髓结构，血窦呈现高度扩张充血，出现明显的红细胞崩解，无髓索淋巴细胞，充分裸露网状组织。心脏：心脏缺血，心脏肌肉有瘀点，眼观病灶性心肌变性、坏死，质地变软，暗红色，心腔心室壁变薄，高度扩张、大量血凝块充积，含铁血红素沉着。心内、外膜有大量针尖状出血点；病理学切片观察显示心肌纤维颗粒变性；能够看到间质血管出现充血扩张，红细胞粘滞在小静脉管内，并有血栓；心肌纤维间，呈现暗红色的出血灶。脑和脊髓：症状不是太明显。主要的眼观病变是进行横切面可见血管和小血管扩张。病理学切片观察是毛细血管高度扩张充血，出现黏滞红细胞，并形成透明血栓。皮质血管充血，脑膜皮质血管扩张，小脑皮质出血、充血，偶然有病例出现非化脓性渗出，并伴有淋巴细胞浸润的脑脊髓炎。淋巴器官：受损部位的淋巴结肿大、充血，甚至出血。淋巴组织残存的淋巴细胞核碎裂，淋巴组织萎缩；胸腺肿大、有散在出血点；肾上腺肿大，并有散在性针尖状至粟粒状大小的出血点。消化道：胃内容物饱满，积留大量食物，胃黏膜出现大小不等脱落，小肠黏膜充血7 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究甚至出血，偶然有病例出现肠炎，浆膜下出血概括来说，感染兔出血症病毒后全身的微循环系统出现障碍，红细胞黏滞成团，在肺脏、肾脏、心脏和脑等组织的微血管表现明显突出广泛淤血，形成血栓，导致出血和间质水肿；胸腔和腹腔内有少量浆液，偶然有病例出现渗出物，伴有浆膜下出血。血流不畅导致实质器官广泛变性或坏死。1.5.3实验室检测实验室常用的实验室诊断技术有凝集试验、病毒分离与鉴定、电镜技术、琼脂扩散试验、间接血凝试验、对流免疫电泳、胶体金技术、反转录—聚合酶链反应（RT-PCR）技术、核酸探针技术、酶联免疫吸附试验和实时荧光定量RT-PCR技术等。目前实验室对RHDV确诊常用方法如下：（1）凝集试验目前进行的红细胞凝集试验（HA）检测，大多与人“O”型红细胞凝集，是检测RHDV最早的实验室应用的最常规的检测方法（林治涌等,1995）。HI常用于检测病毒抗原、抗体，该检测方法简单方便、速度快、且不需要任何特殊的仪器设备，较为常用。HA和HI试验方法已在实验室诊断RHDV以及广泛应用于免疫抗体检测中，并且在凝集试验中抗RHDV特异性抗血清能抑制凝集，然而目前许多国家和地区已经发现一些不能够产生血凝现象的病毒分离株（Chaseyetal,1995）。并且意大利（Capuccietal,1991）和德国（Ohlingeretal,1993）的研究人员通过HA试验与ELISA试验对比后发现，HA试验比ELISA试验高出8％的假阳性或假阴性，Biermann认为（Biermannetal,1992）导致假阳性出现的原因可能是由于毒株中存在非特异性血凝因子，出现假阴性现象可能是由于病毒粒子中衣壳蛋白VP60降解或者抑制性抗体出现所致。因此，在采用HA试验方法检测临床样品出现阴性结果时，必须结合病兔临床表现和病理解剖，必要时需要与其他实验室诊断方法结合，做出综合分析诊断，加以确定（张秀娥等,2007）。（2）间接血凝试验（IHA）间接血凝试验即用抗原包被红细胞，形成可溶性的载体，来检测抗体，出现可凝集现象。杨汉春等（杨汉春等,1989）将戊二醛醛化绵羊红细胞作为载体，利用纯化后的病毒，建立了间接血凝试验，用以检测其抗体效价。IHA试验的敏感性均比HI试验高约32倍。此试验方法较HA试验和HI试验更易达到标准化的要求，操作简便，易于推广，本方法能够快速检测出RHDV，具有较好的敏感性和特异性。因此，间接血凝试验的较血凝试验稳定性更高，重复性更好，能够避免血凝试验中由于红细胞来源不同进而8 山东农业大学硕士学位论文影响试验结果的问题。但是间接血凝试验中红细胞戊二醛的醛化技术要求很严格且试验方法操作条件要求很高，否则将会严重地影响该试验检测结果的准确性。（3）病毒分离与鉴定目前研究发现，也未找到合适的原代细胞或传代细胞进行体外培养，至今没有找到能够使其长期稳定传代的体外培养的细胞系。故现有RHDV诊断试剂的抗原主要从病死兔的肝脏组织采集制备，活体进行病原分离、制备诊断用病毒抗原和生长组织灭活苗仍具有十分重要的意义。因为RHDV不能在鸡胚或者鸭胚中增殖，又没有其它合适体外培养的原代或者传代细胞，只能在肝脏组织制备抗原，纯化病毒过程复杂、难度较大，并且存在散毒的危险，因此人工感染试验在临床诊断中不实用。（4）电镜技术采集RHDV病死兔的肝脏组织进行研磨，经粗提纯化后能用作诊断RHDV的原始材料，经负染之后，在电镜下能观测到大量的杯状病毒粒子。病毒粒子无囊膜，核衣壳呈二十面体对称构型，病毒直径仅为25～29nm，其中有电子密集排列的核蕊其直径大约为25～27nm，周围有十个规律排列的突出物呈辐射状。病毒衣壳分为实心、空心两种形式，呈“格子”样，具有32个表面壳粒，在核衣壳上整齐地排列着中空的杯状结构（赵英哲等,1987）。抗RHDV的单克隆抗体或者特异性抗体通过免疫标记来诱导病毒粒子经电镜技术对形成的凝集块直接观察而进一步确诊（Smídetal,1989）。进出口的兔肉经研磨后，反复冻融后并用PEG2000浓缩到50至100倍之间，10,000r/min4℃离心10min，取上清液，并用电镜技术检测兔肉是否带有该病毒。（5）琼脂扩散试验（AGP）琼脂扩散试验是通过不同距离和浓度的抗原与高免血清抗体发生沉淀试验来检测病毒抗原的滴度（戴康等,1987）。矫正德等（矫正德等,1994）用应用琼脂扩散试验鉴定RHDV，通过制备的不同浓度的抗原，病死兔的肝脏经过乳化剂乳化，制备成冻融抗原，检测感染该种病毒的病死兔的血清，有一条沉淀线产生，证明检测出了沉淀抗体。琼脂扩散试验操作简单、方便，但其特异性和敏感性相对较低，且对抗原和抗体的浓度和纯度要求严格，否则将会有非特异性沉淀条带产生，将会严重地影响试验检测结果，因而在临床样品检测中难以推广及应用。（6）对流免疫电泳使用人工感染的兔出血症的病料，经过反复几次冻融，氟碳乳化以及盐析等方法处理后，纯化后的病毒作为对流免疫电泳的特定抗原，抗原与兔血清在巴比妥缓冲液中泳9 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究动约30min～60min，研究结果显示全部高免兔阳性血清均能出现一条白色沉淀线，而SPF兔阴性血清则没有出现沉淀线，研究证明该试验方法具有较高的特异性（张洪英等,2000）。（7）反转录―聚合酶链反应（RT-PCR）技术目前，实验室虽然已经建立了多种RHDV的检测方法，但很多方法存在检测条件要求高，检测需要时间长，检测敏感性弱，不易于检测方法的标准化，在实际临床样品检测应用中受到了限制。随着分子生物学技术的飞快发展以及广泛推广应用，PCR方法成为检测兔出血症病毒的主要分子生物学诊断方法。在PCR技术中，由于以RNA为模板，在DNA聚合酶作用下不能合成DNA，RNA病毒核酸不能直接进行PCR扩增。因此对于RNA病毒要先从病料中提取RNA，再加入反转录酶，合成cDNA，之后进行PCR扩增，此过程被称为RT-PCR。然而，RT-PCR实验方法处理样品不仅耗时长，而且不能同时处理多个样品，对于检测生产中大量临床样品的处理不易于推广。近几年，随着分子生物学技术的发展以及广泛应用聚合酶链式反应，提供了敏感性高的核酸检测方法，世界各国研究学者先后建立了流行病学调查（Capuccietal,1996;Frölichetal,2003;HCandEskens,1991;Laurentetal,1997;Wirblichetal,1994）和检测RHDV的RT-PCR方法（LeGall-Reculéetal,2001）。巩薇等（巩薇等,2006）研究发现RT-PCR方法从病死兔肝脏组织中，可以检测到107病毒滴度。张英等（张英等,1999）研究发现用该方法从病料中扩增和检测出RHDV。Psikal等（Psikaletal,1997）在Guitrre等（Guittréetal,1995）人的基础上发展了RT-PCR，他们在RT-PCR的过程中用地高辛非放射性标记PCR产物，变性后在液相中与生物素标记的探针进行杂交，将杂交后的DNA片段，通过生物素与链霉素亲和素（SA）的相互作用到SA包被的微孔板上，加入过氧化酶标记的抗地高辛抗体，通过底物ABTS显色，在450nm波长下，测定是否有RT-PCR扩增产物，该实验方法可使扩增产物检出的敏感性提高。PCR技术具有操作简易、反应快速、特异性强、敏感性高等诸多优点（Meyeretal,1994;Yangetal,2008）。（8）免疫组化技术免疫组化法就是通过对病死兔实质性器官组织中的病毒抗原进行定位，所检出的兔出血症病毒抗原大量存在于细胞浆中，此结果与杯状病毒所描述的形态发生学特性吻合一致（ParkandItakura,1992）。在常规诊断中一般不常用。（9）胶体金法10 山东农业大学硕士学位论文在各种人类疾病的诊断中，胶体金方法得到了广泛的推广及应用，目前也将此方法做为诊断动物疾病的新的诊断方法，与ELISA试验相比，它能有效避免酶底物致癌性所能带来的严重危害。肖跃强等（肖跃强,2014）利用截短VP60蛋白表达产物建立了ELISA抗体检测方法，选用可溶性表达的完整VP60蛋白作为胶体金抗体检测方法的包被抗原，建立了RHDV抗体胶体金快速检测方法。本研究建立的胶体金检测方法检测的阳性血清敏感性较间接血凝试验提高了4倍，对临床样本的检测阳性率由68.3%提高至90.0%，大大增加了临床检出阳性率。但是，该方法不易获取较高纯度的抗原，并且成本很高，使胶体金技术检测方法不易于推广。（10）酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是目前最为常用的检测兔肉和诊断方法之一，酶联免疫吸附试验在一定程度上正在取代以上其它检测方法（Capuccietal,1995;MothaandKittelberger,1998）。目前开发的用于该病诊断的包括：PAP-ELISA、夹心ELISA、间接ELISA、Dot-ELISA等方法。ELISA试验首先需要制备RHDV的阳性血清多克隆抗体，或者根据衣壳蛋白上不同抗原表位制备单克隆抗体进行包被，活的病毒与抗体结合，再跟抗兔酶标二抗结合并催化底物显色，此方法还可用于病毒抗原特性的研究。王永山等（王永山等,2004）用重组基因抗原用于RHDV抗体的检测,建立了ELISA方法并将其标准化。刘怀然等（刘怀然等,2006），陈兴祥等（陈兴祥等,2003）建立了间接ELISA检测方法并将其制备成检测RHDV抗体的试剂盒。杨汉春等（杨汉春等,1990）建立Dot-ELISA试验方法检测RHDV抗体。CollinsB.J.等（Collinsetal,1995）应用竞争ELISA检测RHDV抗体，抗RHDV的血清能够有效地阻断单克隆抗体，与抗原反应结合，此方法比HI试验更敏感（Capucci,1995;Capucci,1996;Tianetal,2007）。ELISA的敏感性明显高于血凝试验的敏感性，具有较高的特异性、稳定性和敏感性，能够简便、快速、准确诊断兔出血症（潘荣生等,1989;秦海斌等，2008;肖正国,1993）。（11）核酸探针技术核酸探针技术是用生物素或放射性同位素标记的病毒特异性片段作为探针，而建立的一种分子杂交诊断方法。GeimettiD等（Gelmettietal,1998）用地高辛配基标记的RNA特异性片段作为探针，用原位杂交技术来检测RHDV；余锐萍等（佘锐萍等,1998）研究证明用乙型肝炎病毒表面抗原地衣红染色法能检测出RHDV；宋英今等（宋英今等,2001）研究证明用金银染色三抗体夹心法能检测出RHDV。11 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究（12）实时荧光定量RT-PCR技术实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸检测技术，它具有特异性强，敏感性高，定量准确，高通量的特点。在临床诊断中可以检测多种传染病，广泛应用到实际生产中。参照RHDV的衣壳蛋白VP60基因，设计了1对引物和1段TaqmanMGB探针用来检测出病死兔病料中的RHD病毒含量为5pg（张秀娥等,2007）。研究表明，该方法能够快速准确检测出临床样品中的RHDV，可广泛应用于病死兔各种实质性器官组织中RHDV的检测。1.6本研究的目的及意义近年来,随着畜牧养殖业的发展，养兔业也得到了快速发展，由以前的个体散养户到现在的规模养殖，随着饲养数量增多、规模变大，RHDV的发生较以前有了很大的变化，并在国内许多地区广泛流行。根据各地送检的病死兔及病料的检测中，不难发现RHDV流行的原因主要是免疫接种做的不到位。传统兔出血症病毒毒株的主动免疫或者被动免疫失败的现象频繁发生，对兔出血症病毒的防控提出了新的挑战。迄今为止，国内流行的兔病毒性出血症病毒仅有经典RHDV一个血清型，生产中常用的灭活疫苗能起到很好的保护作用。我国近年兔群的RHDV感染日趋复杂化，有些地方出现无血凝性毒株，由于无凝集“O”红细胞特性毒株的出现，可能导致漏检、错检。2010年，在法国一养兔场检测到一株非典型的兔瘟，为了与经典RHDV区分，命名为RHDV2。随后西班牙、苏格兰、德国、意大利等国家纷纷报道了RHDV2的暴发，国内暂时未有该疫情的相关报道，但也不能排除是否真的没有发生过该疫情，因此，利用MEGA4.0软件的对上述各个毒株的结构蛋白VP60的基因序列进行比较并绘制遗传进化发生树，并用MegAlign软件分析结构基因VP60的核酸序列的同源性和差异性，以期待能为我国日后RHDV疾病的防控提供一些参考意见。重组酶聚合酶扩增RPA（RecombinasePolymeraseAmplification），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（吴耀东等,2016）。RPA反应的最适温度在37℃～42℃之间，不需要需变性，仅需普通恒温设备即可，该方法耗时短，操作方便、简单，敏感性强，易于在普通实验室推广及应用。RT-PCR实验方法处理样品不仅耗时长，而且不能同时处理多个样品，对于检测生产中大量临床样品的处理不易于推广。重组酶聚合酶等温扩增方法能够大大加快RT-PCR检测临床样品的速度。此外，由于仅需要普通恒温控制，重组酶聚合酶等温扩增方法可以真正实现便携式的快速核酸检测。12 山东农业大学硕士学位论文在RHDV病毒中，主要结构蛋白VP60基因编码主要的抗原位点，其决定病毒抗原性的主要构成部分，是迄今为止学术研究RHDV中最热点的基因之一。由于原核表达系统具有表达量大、周期性短以及成本低都有点，故本试验采用了原核表达载体。但RHDV结构蛋白VP60基因片段较大，而其截短蛋白的片段相对较小，易于折叠，能减少杂蛋白量，提高目的蛋白的表达量，有利于后续纯化（王净等,2012）。因此，本试验拟将VP60基因的3个截短蛋白分别克隆到pET-32a载体中进行分段表达，验证表达重组蛋白的抗原性，并将其作为包被抗原建立间接ELISA方法，检测RHDV免疫后阳性血清抗体的消长规律。13 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究2材料与方法2.1材料2.1.1主要试剂和材料病毒毒株：本实验室采集自滨州、临沂蒙阴山区、莱芜三个不同地区的病料，提取RNA，经英潍捷基（上海）贸易有限公司测序验证。载体：pET-32a（+）原核表达载体、pColdⅢ原核表达载体均由山东省农科院家禽研究提供；阳性血清：临床兔血清从济南、临沂、莱芜等地养兔场采集，RHD灭活苗、经免疫的兔RHDV免疫后血清由山东省滨州畜牧兽医研究院提供、SPF兔RHDV阴性血清山东省农科院家禽研究所保存。实验动物：无RHDV抗体兔由山东省农业科学院畜牧兽医研究所提供。SPF兔由江苏省农业科学院兽医研究所提供。试剂盒：TwistAmpDNAAmplificationKits（TwistAmpBasicRTKit）购自TwistDx公司；HiscripIIOneStepRT-PCRKit购自Vazyme公司；AxyPrepplasmidMiniprepkit、AxyPrepDNAGelExtractkit购自AXYGEN公司；核酸提取试剂盒（磁珠法）购自西安天隆科技有限公司。试剂：DH5α及BL21（DE3）感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司；TrizolReagent试剂、限制性内切酶EcoRⅠ、XholⅠ、NdeⅠ和HindⅢ、pMD18-T-Vector、RNA酶抑制剂、M-MLV反转录酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNAMarkerDL2,000及DL15,000购自大连宝生物工程有限公司；1.5mol/LTris·HCl缓冲液（pH8.8）、1mol/LTris·HCl缓冲液（pH6.8）等均购自Solarbio公司；蛋白质非预染蛋白Marker、IPTG均购自上海生物生工公司。硝酸纤维素膜（NC膜）购自Biosharp公司；HRP标记的山羊抗兔IgG购自美国KPL公司；ELISA酶标板购自美国Corning公司；甘油、浓盐酸、NaOH、溴酚蓝、DTT、咪唑、异丙醇、Na2HSO4、NaH2SO4、无水乙醇等其他常规试剂均为国产分析纯。2.1.2主要试剂的配制2.1.2.1琼脂糖凝胶电泳试剂（1）50×TAE（Tris-乙酸）：Tris242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）100mL加灭菌去离子水混合，定容至1L，用3层滤纸过滤，室温贮存备用。工作液浓14 山东农业大学硕士学位论文度为1×TAE。（2）琼脂糖凝胶（1.5%）：将1.5g琼脂糖加入至100mL1×TAE中，微波炉加热熔化后，冷却至室温，加入10μLEB混合均匀，倒入插好梳子的制胶槽，室温放置30min～1h，直至完全凝固。（3）EB贮存液：以10mg/mL浓度将1×TAE溶于去离子水中，剧烈搅拌至完全溶解后，室温下闭光保存。2.1.2.2诱导表达试剂（1）0.5mol/LIPTG储存液：称取IPTG1.19g溶于10mL超纯水中，用0.22μm小滤器过滤除菌，每500μL分装1管，分装后-20℃冻存。（2）细胞裂解缓冲液：50mMTrisCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0），100mMNaCl，最后调pH为8.0。（3）50mg/mL氨苄青霉素（Ampicillin）贮存液：称取0.5g氨苄青霉素溶于10mL超纯水中，用0.22μm滤器过滤除菌，每500μL分装1管，分装-20℃冻存。（4）LB液体培养基：称取胰蛋白胨：2g，酵母粉：1g，NaCl：2g，溶解于200mL去离子水中。溶解后，调pH值至7.0，分装到试管中（每管4mL），121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃放置备用。（5）LB固体培养基（含氨苄抗生素）：按LB液体培养基配方另加2g/100mL的琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌，待温度降至50℃左右时，加入氨苄青霉素贮存液，使其终浓度为100μg/mL，混匀，超净台中，无菌倒平板，待培养基完全凝固后，4℃存放。（6）PBS缓冲液（pH7.4）：称取NaCl：8g，KCl：0.2g，Na2HPO4：1.15g，KH2PO4：0.2g，加灭菌去离子水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌40min。（7）10%SDS（W/V）：10gSDS加入90mL灭菌去离子水中，加热至68℃助溶，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加浓盐酸调整溶液pH为7.2。2.1.2.3SDS-PAGE试剂的配制（1）5×SDS-PAGE：溴酚蓝：25mL，1MTris·HCl（pH6.8）：1.25mL，甘油：2.5mL，SDS：0.5g，加去离子水，溶解后定容至5mL；分装后置于室温保存，使用前加入5%的2-ME，4℃存放，备用。（2）5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris碱：15.1g，甘氨酸：94g，SDS：5.0g，加入约800mL灭菌去离子水中溶解，定容至1L烧杯中，室温保存。15 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究（3）10%过硫酸铵（W/V）：称取0.1g过硫酸铵溶于1mL灭菌去离子水中，现用现配。（4）考马斯亮蓝染色液：在45mL甲醇和10mL冰醋酸混合液中，溶解0.25g～0.5g考马斯亮蓝R-250，用3层定性滤纸过滤，除去颗粒状物质，室温保存。（5）脱色液：10%冰乙酸（50mL冰乙酸加入450mL去离子水中）。（6）30%丙烯酰胺溶液：称取C3H5NO：29g，N,N-亚甲叉双丙烯酰胺：1g，溶于100mL的灭菌去离子水中，充分溶解，0.22μm滤器过滤，4℃避光保存。（7）12%分离胶的配制（15mL）：灭菌去离子水：4.9mL，30%丙烯酰胺溶液：6.0mL，1.5mol/LTris·Cl缓冲液（pH8.8）：3.8mL，10%SDS：150μL，10%过硫酸铵：150μL，轻旋混匀，最后加入TEMED：4μL。（8）5%浓缩胶的配制（5mL）：灭菌去离子水：3.4mL，30%丙烯酰胺溶液：0.8mL，1.0mol/LTris·Cl缓冲液（pH6.8）：0.38mL，10%SDS：150μL,10%过硫酸铵：50μL，TEMED：5μL。（9）KCL（0.25mol/L）：称取KCL：9.3125g溶于500mL灭菌去离子水中，4℃贮存。2.1.2.4Westernblot试剂的配制（1）转膜液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris碱，0.037%SDS，20%甲醇。配制1L电转液，需称取甘氨酸：2.9g，Tris碱：5.8g，SDS：0.37g，并加入200mL甲醇，加去离子水定容至1L。（2）1%BSA封闭液（W/V）：称取1g的BSA，于100mLpH7.4PBST溶液中，盖好盖后，轻轻摇动，完全溶解后，贮存于4℃。（3）TBSbuffer：Tris碱:0.242g，NaCl:2.9422g，加灭菌去离子水定容至100mL，调pH值至7.4。（4）TBST（V/V）：0.5%Tween-20的TBS溶液。（5）DAB显色液：DAB：75mg，1%双氧水：0.5mL，TBSbuffer：100mL，现配现用。2.1.2.5ELISA试剂的配制（1）洗涤缓冲液（PBST）：pH7.4PBS，0.05％Tween-20，混匀后即可使用。（2）1%porcineskinGelatin：称取1gporcineskinGelatin，于100mLpH7.4PBST溶液中，盖好盖后，轻轻摇动，完全溶解后，于4℃贮存备用。16 山东农业大学硕士学位论文（3）1%coldwaterfishskin：称取1gcoldwaterfishskin，于100mLpH7.4PBST溶液中，盖好盖后，轻轻摇动，完全溶解后，4℃贮存备用。（4）5%脱脂奶粉：称取1gcoldwaterfishskin，于100mLpH7.4PBST溶液中，盖好盖后，轻轻摇动，完全溶解后，4℃贮存备用。（5）底物缓冲液：称取柠檬酸：2.1g，无水磷酸氢二钠：2.82g，1%过氧化氢：5mL，用灭菌去离子水定容至100mL，调pH值4.5～5.0。（6）底物溶液（显色液）：把200mg四甲基联苯胺（TMB），用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000mL；称取柠檬酸（C6H8O7·H2O）：21g，无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）：28.2g，0.75%过氧化氢尿素：6.4mL，双蒸水定容至1,000mL，调pH值4.5～5.0之间；二者的体积比为1:1。（7）终止液：0.25%的氢氟酸（取氢氟酸：0.25mL，用超纯水定容至100mL）。2.1.3主要仪器微量移液器购自Eppendorf公司；凝胶成像仪购自美国proteinsimple公司；电泳仪和电泳槽均购自Bio-RAD公司；高速离心机购自Beckman公司；ThermoScientificWellwashVersa洗板机、离心机、PCR仪、紫外分光度计购自ThermoFisher公司；高压蒸汽灭菌锅购自日本三洋公司；超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；恒温箱购自山东潍坊精鹰医疗器械有限公司；脱色摇床购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；摇床购自天津市欧诺仪器仪表有限公司；电热恒温水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司；连接仪购自杭州市朗基科学有限公司；ELIX-100超纯水器购自美国LABCONCO公司；核酸提取仪购自西安天隆科技有限公司。2.2方法2.2.1RHDV的分离与分子遗传变异特性分析2.2.1.1兔出血症病毒VP60基因的克隆2.2.1.1.1兔出血症病毒VP60基因引物的设计参照GenBank已登录的RHDVVP60基因核苷酸序列，设计1对特异性引物Vp60–F:GCTGAATTCGAGGGCAAAGCCCGCA;Vp60–R:CCAGCTCGAGACATAAGAAAAGCCA，引物均由上海博尚生物工程有限公司合成。2.2.1.1.2RNA的提取（1）分别从山东莱芜、蒙阴、滨州采集3个地区采集病死兔肝脏。加入10倍的17 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究PBS，进行研磨。冻融3次，冻融后10,000r/min离心10min。（2）无菌操作，分别取肝脏研磨液的上清液300μL于2mL离心管中，加入900μLTRIZOL试剂，剧烈颠倒60～100次，静置10min。（3）加入200μL氯仿，上下颠倒60～100次，静置5min，4℃、10,000r/min，离心10min。（4）取上清液700μL移入1.5mL离心管中，加同体积的异丙醇，上下颠倒20～30次，-20℃静置30min。（5）4℃、10,000r/min，离心10min，弃去上清。（6）加入1mL75%的乙醇（DEPC水配制），4℃、10,000r/min，离心5min，弃去上清，自然晾干。再离心5min，用微量移液器吸去管底部的液体，在超净工作台中干燥5min。（7）用适量0.1%DEPC水溶解RNA，-20℃冻存。2.2.1.1.3兔出血症病毒RNA的RT-PCR扩增（1）10μL反转录反应体系：表1VP60基因RT反应Table1RTreactionofVP60geneReagentVolume（μL）5×ReverseTranscriptaseM-MLV2.0M-MLV0.7dNTP（10mM）0.8ClonedRibonucleaseInhibitor（RRI）0.5VP60-R1.0RNA模板（RHDV）5.0TotalVolume10.0表1是RHDVVP60基因反转录反应。加入模板RNA、RT引物、dNTP（10mM）后，放入PCR仪70℃5min后；再加入RRI、M-MLV、M-MLVBuffer，42℃反应30min，然后95℃反应2min。（2）50μLPCR反应体系：18 山东农业大学硕士学位论文表2VP60基因PCR反应Table2PCRreactionofVP60geneReagentVolume（μL）10×ExTaqBuffer4.5VP60-F1.0VP60RT产物5.0ExTaq0.5H2O39.0TotalVolume50.0表2是VP60基因PCR反应。反应体系如下：95℃3min94℃20sec52℃20sec35cycles72℃30sec72℃10minPCR反应结束后，1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，120V，30min电泳，在凝胶成像仪中查看PCR产物扩增结果。2.2.1.1.4RT-PCR产物胶回收电泳检测正确后，将剩余的VP60PCR产物，用AxyPrepDNAGelExtractkit琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒对目的条带进行回收。回收步骤如下：（1）在紫外灯下，快速切下含有目的条带的琼脂糖凝胶，此过程要迅速，防止紫外灯灼伤。（2）将凝胶切碎，加入3倍凝胶体积的BufferDE-A溶液，轻摇混匀后，放入水浴锅75℃加热大约10min，每2～3min混合一次，直至胶块完全融化。（3）加入1/2BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀。（4）将DNA制备管置于2mL离心管中，把混合液移到制备管中，12,000×g离心1min，弃去滤液。（5）将制备管置于2mL离心管，加500μLBufferW1，12,000×g离心30s，弃去滤液。（6）将制备管置于2mL离心管，加700μLBufferW2（使用前，在BufferW2concentrate中加入56mL无水乙醇），12,000×g离心30s，弃滤液。再用同样体积的BufferW2以同样的方法洗涤一次，12,000×g离心1min。弃去滤液。（7）将制备管回置到2mL离心管中，12,000×g离心2min。（8）将制备管置于新的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25μLEluent（将Eluent19 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究提前加热至65℃将提高洗脱效率），室温静置5min。12,000×g离心1min洗脱DNA。2.2.1.1.5RHDVVP60基因胶回收产物与T载体的连接与转化按照Takara公司T载体连接试剂盒说明书进行，将VP60基因分别与pMD18-T-Vector连接，连接产物分别标记为pMD-VP60，连接体系如下：表3VP60胶回收产物与T载体的连接体系Table3LigationsystemaboutgelextractionproductofVP60withTvectorReagentVolume（μL）GelextractionproductofVP604.5pMD18-TSamplevector0.5SolutionI5.0Totalvolume10.0反应体系在连接仪中16℃连接过夜。第二天，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中。转化操作如下：（1）取连接产物10μL加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻摇混匀，冰浴30min。（2）水浴锅42℃热激90s后。（3）立即转移到冰盒中冰浴2min（此过程要迅速）。（4）向离心管中加入800μLLB培养基，混合后置于摇床中37℃、110r/min～120r/min培养45min～60min。（5）7000r/min，离心1min，弃去一部分上清液，重悬剩余菌液，将菌液均匀涂布到LB琼脂培养基（含氨苄）上，在37℃恒温培养箱培养16～24h，直到单菌落出现为止。（6）次日，挑取单菌落。2.2.1.1.6pMD-VP60菌落PCR鉴定PCR鉴定。反应体系如下：表4pMD-VP60菌落PCR鉴定Table4PCRidentificationofpMD-VP60bacterialcoloniesReagentVolume（μL）10×ExTaqBuffer2.5dNTP（2.5mmol/L）1.0VP60-F0.5VP60-R0.5Bacterialcolony1.0ExTaq0.5ddH2O19.0Totalvolume25.020 山东农业大学硕士学位论文反应程序如下：95℃3min94℃20sec52℃20sec30cycles72℃30sec72℃10min表4是pMD-VP60转化产物的PCR鉴定。PCR反应结束后，1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，120V，30min电泳，在凝胶成像仪中查看PCR产物扩增结果对鉴定正确的单菌落，将剩余菌落稀释液全部加入4mL（含终浓度0.1mg/mL的氨苄抗生素）LB培养基中，置于摇床中37℃、180r/min过夜培养。2.2.1.1.7pMD-VP60阳性菌质粒的提取及PCR鉴定过夜培养的新鲜阳性菌液使用AXYGEN公司的AxyPrepplasmidMiniprepkit提取质粒，操作步骤如下：（1）取1～4mL新鲜菌液（如果使用含菌量丰富的培养基，新鲜菌液体积应当减半或者更少），12,000×g离心10min，弃尽上清。（2）加入250μLBufferS1（确认BufferS1中是否加入RNaseA）将细菌沉淀悬浮，涡旋振荡至彻底悬浮，直至形成透亮的溶液，不能留有小的菌块。此步骤不宜超过5min。（3）加入250μLBufferS2溶液，温和地上下翻转4～6次，充分混匀，使菌体充分裂解，直至形成透明的溶液。此过程不要剧烈摇晃，否则会导致你基因组DNA剪切断裂，此步骤不宜超过5min，以免质粒受到破坏。（4）加入350μLBufferS3溶液，温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此过程不要剧烈摇晃，否则将会使基因组DNA污染。12,000×g离心10min，加入BufferS3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。（5）吸取上述步骤中的离心上清并转移到制备管（置于试剂盒内提供的2mL离心管中），12,000×g离心1min。弃滤液。（6）将制备管置于2mL离心管，加入500μLBufferW1溶液，12,000×g离心30s，弃滤液。（7）将制备管放置回2mL离心管中，再加入700μLBufferW2溶液（用前，在BufferW2concentrate中加入56mL无水乙醇），12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μLBufferW2洗涤一次，12,000×g离心1min。弃滤液。（8）将制备管放置回2mL离心管中，12,000×g离心1min。21 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究（9）将制备管置于新的1.5mL离心管中，在制备膜中央加60～80μLEluent（将Eluent提前加热至65℃将提高洗脱效率），室温静置5min。12,000×g离心1min洗脱DNA。（10）将提取的质粒保存于-20℃或者-80℃备用。取5µL提取的pMD-VP60阳性质粒在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测并进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性质粒送到英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。对分离到的3株兔出血症病毒，分别名为BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株。2.2.1.2VP60基因的核酸序列分析兔出血症病毒属成员的基因分型都是基于其结构蛋白VP60的差异，变异位点主要是位于结构蛋白高变异区的C端。RHDV根据经典RHDV毒株VP60的基因结构的不同将其分为6种基因型：G1～G6（即G1～G5和抗原变异株RHDVa）。将自己分离的3株RHDV与从GenBank上下载已公布的31株兔出血症病毒（包括RHDV的6个不同基因型和RHDV2）的VP60蛋白核苷酸序列分析（见表5～6），利用MEGA4.0软件的ClastalW方法对上述各个毒株的结构蛋白VP60的基因序列进行比较并绘制遗传进化发生树。通过进化树分析，新型兔出血症病原之间的关系以及RHDV2和经典毒株的差异。将近几年分离出的中国华东、东北、西南、西北地区地区的代表毒株的核酸序列进行比较，以分析国内不同地区毒株之间的差异性。22 山东农业大学硕士学位论文表5参考RHDV毒株序列资料Table5InformationofpublishedRHDVsequences分离物（Isolates）GenBank来源（Origin）年（Year）whn/China/01DQ069280China西南2005TPAF453761China东北2001JX/CHA/97DQ205345China华东1997YLDQ530363China西北200503-24AJ969628France2003FRGNC-001543America2000Iowa2000AF258618America2000NewZealandAF231353-1NewZealand2000WriezenY15427Germany1997FrankfurtY15424Germany1997Crech351U54983Australia199695-10AJ535094France1995AST/89Z24757Spain1993SDZ29514France1993Mexico89AF295785Mexico1989WX84AF402614China1984WFFJ794180.1China2007Or08KC595270.1Italy2008CBPico13-32KJ579160.1Portugal2013RHDV/MYKY406737China2015RHDV/BZKY398842China2015RHDV/LWKY398843China2015HagenowY15441Germany1997EisenhuettenstadtY15440Germany1997Haute～SaoneU49726America1996HB/2014KU207100.1China2014Italy90EU003579.1Italy199000-13AJ495856France2002表6RHDV2毒株序列资料Table6InformationofpublishedRHDV2sequences分离物（Isolates）GenBank来源（Origin）年（Year）10-01HE800529.1France2010Ss11KC345611.1Italy2011Vs11JX106023.1Italy2011Tn12-1KC907712.1Italy2012Ud11JQ929052.1Italy201110-05FR819781.3France201023 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究2.2.2兔出血症病毒RPA检测方法的建立2.2.2.1兔出血症病毒VP60基因引物的设计参照GenBank上公布的RHDV衣壳蛋白基因保守序列VP60设计1对引物:F:5'-CAGCCGTACTGAGCCAGATGTA-3';R:5'-AAGGACTAGTGTGGGAACAAGG-3'。经英潍捷基（上海）贸易有限公司测序验证。2.2.2.2兔出血症病毒RNA的提取将兔出血症肝脏病料剪碎，用PBS10倍稀释，研磨成悬液，10,000r/min4℃离心10min，装入1.5mLEP管中，于-80℃冰箱中反复冻融3次，冻融后以9,000r/min，离心10min，进行倍比稀释至10-8，用核酸提取仪提取RNA。2.2.2.3兔出血症病毒RPA检测方法的建立2.2.2.3.1重组酶聚合酶等温扩增反应（1）按照TwistAmpDNAAmplificationKits试剂盒操作说明进行，反应体系：表7VP60基因反应体系Table7RTreactionofVP60geneReagentVolume（μL）PrimerF1.2PrimerR1.2RehydrationBuffer29.5RNATemplate10.0ddH2O5.6TotalVolume47.5漩涡混匀，离心。加入2.5μL280mMMgAc，混匀。放入PCR仪，40℃、10min后取出，冷却至室温，混匀后，离心，再放入PCR仪，40℃，30min。反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，观察结果。将目的片段切下后，采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，PCR产物测序。2.2.2.3.2反应条件的优化（1）最佳引物浓度的确定设计两个反应体系，RehydrationBuffer和RNATemplate不变，分别加入引物（浓度为20μΜ/mL）1.2μL和2.4μL，漩涡混匀，离心。加入2.5μL280mMMgAc,混匀。放入PCR仪，40℃、10min后取出，冷却至室温，混匀后，离心，再放入PCR仪，在40℃恒温反应30min。反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果，确定最佳引物浓度。24 山东农业大学硕士学位论文（2）最佳温度的确定设计3个反应体系，反应体系不变（同表7），放入PCR仪，分别在37℃、39℃、40℃3个温度下反应30min。反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果，确定最佳反应温度。2.2.2.3.3RHDVRT-PCR一步法扩增反应按照HiscripIIOneStepRT-PCRKit操作说明进行,反应体系：表8VP60基因反应体系Table8RTreactionofVP60geneReagentVolume（μL）PrimerF1.0PrimerR1.02×OneStepMix25.0OneStepEnzymeMix2.5RNATemplate10.0RNasefreeddH2O10.5TotalVolume50.0表3是VP60基因PCR反应。反应体系如下：50℃30min95℃3min94℃30sec52℃30sec30cycles72℃40sec72℃10min反应结束后于2%琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，观察结果。2.2.2.4特异性试验提取大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、波氏杆菌和SPF肝脏的RNA或DNA，按2.2.2.3所述的条件进行RT-PCR扩增，检测其特异性。分别用HiscripIIOneStepRT-PCRKit和TwistAmpDNAAmplificationKits进行RT-PCR，设RHDV阳性对照，SPF兔肝脏为阴性对照。2.2.2.5敏感性试验6LD-2-8将RHDV阳性肝脏悬液（1050）依次稀释至10～10，用0.5mL稀释液腹腔注射SPF兔各1只，攻毒2d后分别采集肝脏，将肝脏用PBS10倍稀释，研磨成悬液，装入高压灭菌处理过的1.5mLEP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9,000r/min，离心10min，用核酸提取仪提取RNA。将提取的RNA，分别用TwistAmpDNA25 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究AmplificationKits和HiscripIIOneStepRT-PCRKit进行RT-PCR，检测其敏感性。2.2.2.6人工感染的样本检测人工感染5只兔，攻毒后每隔12h取鼻拭子以及发病死亡家兔的肝脏组织提取RNA，分别用TwistAmpDNAAmplificationKits和HiscripIIOneStepRT-PCRKit两种方法进行检测，以验证RPA检测方法的准确性。2.2.2.7临床应用采集山东莱芜、临沂、济南3个市地区共计122份临床采集的正常兔和有鼻炎症状兔的鼻拭子。提取样品病毒RNA，采用本试验建立的重组酶聚合酶等温扩增方法方法检测，同时进行所有样品HiscripIIOneStepRT-PCRKit检测，比较二者的检出率差异。应用建立的RPA检测方法对122份采自不同地区正常兔和有鼻炎症状疑似兔出血症鼻拭子进行检测，2.2.3间接ELISA检测抗体的研究2.2.3.1VP60基因序列比对ViaplanaE等发现VP60蛋白的1～175位氨基酸具有抗原性，Martínez-Torrecuadrada等研究认为VP60蛋白具有两个主要抗原优势区域，分别位于VP60蛋白N端的31aa～250aa之间和C端477aa～579aa之间，且VP60蛋白N端（31aa～250aa）的抗原性显著强于C端（477aa～579aa）。本试验结合生物信息学软件对结构蛋白VP60的抗原表位进行了分析，将VP60分为3个区域VP60-1（2aa～208aa）、VP60-2（174aa～425aa）和VP60-3（342aa～579aa）。用MegAlign软件分别对VP60-1、VP60-2、VP60-3与Genbank中下载的34株VP60比较氨基酸序列的同源性分别达95.7%～99.1%、91.7%～99.2%、92.1%～100%。2.2.3.2VP60基因的分段扩增及原核表达载体构建2.2.3.2.1引物设计及基因扩增根据RHDV-VP60序列（GenBankKY398842）设计引物（见表1），与GenBank已有VP60序列氨基酸相似性分别达97.0%。扩增VP60全长基因序列（1,740bp），VP60-1（第4～624位）、VP60-2（第517～1,275位）和VP60-3（第1,024～1,737位）片段，经英潍捷基（上海）贸易有限公司测序验证。26 山东农业大学硕士学位论文表9引物序列Table9PrimerssequencesPrimernameSequences（5→3'）Size/bpRestrictionsiteVP60-FGTGCATATGGAGGGCAAAGCCCGCANdeⅠ1,740VP60-RGACAAGCTTTCAGACATAAGAAAAGCHindⅢVP60-1-FGCTGAATTCGAGGGCAAAGCCCGCAEcoRⅠ600VP60-1-RTACCTCGAGTGCGTTGGTGGATCCAXhoⅠVP60-2-FTGCCAGAATTCCGTCCCAACATGTAEcoRⅠ750VP60-2-RGGTCTCGAGAACACCCGAGGCCATCXhoⅠVP60-3-FGACATGGAATTCGTGCCCTTTAACAEcoRⅠ700VP60-3-RCCAGCTCGAGACATAAGAAAAGCCAXhoⅠPCR扩增反应体系和条件如表9。将PCR反应混合液轻轻混匀，低速离心，按以下反应条件分别进行扩增：95℃预变性3min；95℃10s、52℃15s、72℃20s，30个循环；72℃延伸10min。取5µLPCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳鉴定，通过凝胶成像仪在紫外光下观察PCR产物。PCR产物胶回收（方法同2.2.1.1.4）表10PCR扩增VP60-1、VP60-2和VP60-3Table10PCRforamplifyingtheVP60-1、VP60-2和VP60-3ReagentVolume（µL）5×SFBuffer10.0dNTPMix（10mM）1.0VP60-F/VP60-1-F/VP60-2-F/VP60-3-F1.0VP60-R/VP60-1-R/VP60-2-R/VP60-3-R1.0PMD-VP60（自2.2.1.1.5）1.0GXLDNAPolymerase1.0ddH2O35.0TotalVolume50.02.2.3.2.2重组质粒pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60的构建用NdeⅠ和HindⅢ双酶切回收产物VP60和原核表达载体pColdⅢ，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切回收产物VP60-1、VP60-2、VP60-3和原核表达载体pET-32a（+），酶切体系同表11。27 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究表11pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3andpCold-VP60双酶切鉴定Table11DoubleenzymedigestionofpET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3andpCold-VP60ReagentVolume（μL）10×HBuffer（10×HBuffer）2.0PlasmidofVP60-1/VP60-2/VP60-3（VP60）5.0EcoRⅠ（NdeⅠ）3.0XhoⅠ（HindⅢ）3.0ddH2O7.0Totalvolume20.0回收酶切后的pET-32a（+）载体、pColdⅢ载体和VP60-1、VP60-2、VP60-3、VP60基因片段，用T4DNAligase16℃连接过夜，连接体系如下表：表12载体和VP60-1、VP60-2、VP60-3、VP60基因的连接体系Table12LigationsystemofvectorandVP60-1/VP60-2/VP60-3/VP60geneReagentVolume（μL）10×T4LigaseBuffer2.0pET-32a（+）（pColdⅢ）2.0（3.0）GeneofVP60-1/VP60-2/VP60-3（VP60）4.0（5.0）T4DNAligase2.0（-）Totalvolume10.0步骤同2.2.1.1.5。次日，无菌条件下挑取单个菌落，溶解在50μL无菌生理盐水中，PCR扩增鉴定，1.2%琼脂糖凝胶鉴定PCR扩增产物，鉴定为阳性的菌落，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，重组质粒命名为pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60。2.2.3.3VP60-1、VP60-2、VP60-3基因的原核表达及纯化2.2.3.3.1VP60-1、VP60-2、VP60-3基因的原核表达（1）挑取正确的单个菌落，接种于4mL液体LB培养基的试管中，以50µg/mL的浓度加入氨苄青霉素，37℃振摇培养过夜。（2）次日，按1:100比例稀释过夜的新鲜菌液，取40µL加入4mL加有Amp的LB液体培养基中，继续在37℃振摇培养，培养至OD600大约达到0.4～0.6之间时（以菌液出现云雾状，视线不可透过菌液为准），加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，继续培养，37℃诱导表达8h，保持摇床转速在170r/min。期间第2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h收集1mL样品。设立诱导的pET-32a（+）/pColdⅢ空载体宿主菌作为对照。（3）将诱导表达的菌液10,000r/min4℃离心10min，弃上清，用等量PBS缓冲液冲洗沉淀（洗2次），4℃10,000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀，用细胞裂解液28 山东农业大学硕士学位论文（菌液体积的1/10，即400µL）悬浮菌体，在-20℃冰箱反复冻融两次后，在冰盒中固定好，超声波破碎（额定功率的15%，每次破碎3s，停3s，破碎3min）。（4）破碎结束后，4℃10,000r/min离心10min，收集上清液，沉淀用相同体积的PBS缓冲液重悬。（5）分别取上清和沉淀各100µL，各加入5×SDS凝胶上样缓冲液25µL，吹打混匀，封口膜封口，在电磁炉上煮沸5min，冷却至室温，4℃10,000r/min离心3min，取上清进行SDS-PAGE电泳，剩余样品-20℃保存备用。2.2.3.3.2SDS-PAGE分析聚丙烯酰胺凝胶配制步骤如下：（1）胶的配制：按照Bio-RAD电泳装置的使用说明书，用清洁剂清洗干净玻璃板，自然晾干，配制12%的分离胶5mL，最后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀，迅速用移液器将混合液加入胶板中。在分离胶上覆盖1mL的超纯水封闭。待分离胶和超纯水间出现一个明显的界限，说明分离胶已凝固，吸出超纯水，之后配制5%浓缩胶2mL，最后加入过硫酸铵和TEMED，轻轻吹打混匀，在浓缩胶上插入梳子。（2）加样：浓缩胶凝固后拔掉梳子，将电泳槽放在冰水浴中，在样品槽中加入电泳缓冲液，按照顺序加入蛋白Marker和蛋白诱导表达后的样品，并在记录本上记录加样顺序。（3）跑胶：先使用70V电压电泳1h，观测溴酚蓝带已经到达分离胶，电压调至130V，电泳2h，溴酚蓝带电泳至胶的底部，电泳结束。（4）染色和脱色：取出凝胶，将凝胶放入盛有考马斯亮蓝G-250染色液的平皿中，室温下水平摇床染色2h，用去离子水反复冲洗几遍，把胶放入脱色液平皿中，脱色至条带清晰，此过程大约8h左右，此期间注意更换脱色液。将凝胶放入凝胶成像仪中白光拍照并记录试验结果，并分析各个蛋白的浓度，之后浸泡在含20%甘油的水或者去离子水中保存。2.2.3.3.3VP60、VP60-1、VP60-2和VP60-3的大量表达及纯化按2.2.3.3.1的诱导表达方法，诱导100mL重组蛋白VP60、VP60-1、VP60-2和VP60-3的蛋白菌液，用切胶纯化的方法进行纯化，具体操作方法如下：首先将250mmol/L的KCL放入4℃冰箱预冷2h，按常规方法（同2.2.3.3.2）进行SDS-PAGE电泳。电泳完成后，取出凝胶，用超纯水反复冲洗几次，之后放入KCL溶液显色大约5min，直至银白色条带出现为止，将银白色条带切下，再用灭菌的PBS缓冲液（pH7.4）反复洗涤几29 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究次，把目的蛋白捣碎放入透析袋内加入新配置的电泳液，150V进行电洗脱2h，使目的蛋白游离出来（此过程一定要在冰浴中进行，防止蛋白降解）。电洗脱结束后，把透析袋中溶液吸出，剩余碎胶弃去，然后用灭菌的PBS缓冲液（pH7.4）透析（于在江等,2007），用SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯化情况。2.2.3.4Westernblot分析（1）SDS-PAGE电泳完毕后，切胶。（2）转膜：裁剪24张滤纸（大小：与凝胶长和宽大约相等或略小于凝胶）和3张硝酸纤维素膜（NC膜）；将NC膜、滤纸和海绵浸泡在电转液中。（3）组装好电转移装置，平放底部电极‒阳极板，放一层海绵，海面上放三层滤纸，用镊子将NC膜放在滤纸上，将凝胶精准对齐放在NC膜之上，用玻璃棒除去气泡，轻轻地将三层滤纸放在凝胶上，中间不要有气泡，轻轻铺上海绵，将阴极板放下，夹紧固定夹，放于电转槽装置中，加入电转缓冲液（电转缓冲液要没过NC膜）。（4）接通电源，200mA电转65min。（5）电转完成后，将凝胶染色和脱色（步骤同2.2.3.3.2（4）），检查蛋白质条带转移是否完全。（6）将4张NC膜放入去离子水中冲洗一次，分别放入封口袋中，加入1%BSA封闭液进行封闭（每平厘米滤膜加入0.1mL的封闭液），除去气泡，封好袋口，平放在水平缓慢摇动的摇床上37℃封闭2h（或4℃封闭过夜）。（7）将封闭液倒掉，用TBST漂洗NC膜5次，5min/次。4张NC膜分别加入20mL一抗RHDV阳性血清（用PBST1:200稀释），平放在水平缓慢摇动的摇床上37℃封闭1h。（8）将一抗阳性血清回收，将NC膜用TBST漂洗5次，5min/次。分别加入20mLHRP标记的羊抗兔二抗（用PBST1:2,000稀释）中，平放在水平缓慢摇动的摇床上37℃封闭45min。（9）将二抗倒掉，将NC膜用TBST漂洗5次，5min/次。将NC膜置于底物DAB溶液中显色5min，显色过程需避光操作。观察4组重组蛋白对兔出血症病毒阳性血清的反应原性，拍照，干燥后放入封口袋中4℃长期保存。2.2.3.5间接ELISA方法的建立2.2.3.5.1抗原最适包被浓度和血清最佳稀释度的确定用紫外分光光度计测得纯化后重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3的浓度，用纯化30 山东农业大学硕士学位论文后的蛋白做包被抗原。采用方阵试验确定抗原的最适包被浓度和抗体的最佳稀释度。方阵试验具体操作步骤为：用50mMNa2CO3（pH9.6）的包被缓冲液将纯化后的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3的分别按1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL3个质量浓度稀释，3种蛋白分别包被ELISA反应板，100μL/well，37℃包被1h后4℃过夜；次日，用1%BSA37℃封闭2h，300μL/well；RHDV阳性血清和阴性血清分别作1:50、1:100、1:200和1:400等系列稀释，100μL/well，37℃作用1.5h；1:500稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/well，37℃作用1h；四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenaidine,TMB）底物显色，100μL/well；0.25%氢氟酸终止液终止反应，100μL/well；测定OD650nm值，阳性血清OD650nm值接近1.0，且阳性血清OD650nm/阴性血清OD650nm即P/N值大于2.1时，抗原浓度和血清稀释度为最佳工作浓度。2.2.3.5.2抗原最佳包被条件的确定将纯化蛋白以5μg/mL包被ELISA反应板，分别在先在恒温箱37℃包被2h后4℃冰箱过夜、在恒温箱37℃包被1h后4℃冰箱过夜、4℃冰箱过夜3种条件下，根据阳性OD650nm值接近1.0且P/N值最大，以确定最佳包被条件。2.2.3.5.3最佳封闭液的确定以最佳包被浓度包被ELISA反应板和最佳血清稀释度孵育，PBST洗涤后，分别用5%脱脂奶粉、1%BSA、1%coldwaterfishskin、1%porcineskinGelatin作为封闭液，300µL/well。测定OD650nm值和P/N值，选择P/N值最大者作为最佳封闭液。2.2.3.5.4最佳封闭时间的确定以最佳抗原包被浓度和最优的包被条件包被ELISA反应板，用最佳封闭液封闭，分成3组。第1组在恒温箱中37℃封闭1h；第2组在恒温箱中37℃封闭1.5h；第3组在恒温箱中37℃封闭2h；以P/N值最高的为最佳封闭时间。2.2.3.5.5最佳二抗工作浓度的确定以最佳抗原包被浓度和最优的包被条件包ELISA反应板，用最佳封闭液及最佳封闭时间封闭，分别按1:1,000、1:2,000和1:5,000稀释HRP标记的羊抗兔IgG二抗，根据阳性OD650nm值接近1.0和P/N值大小判断最佳封闭时间，以P/N值最大的为最佳封闭时间。2.2.3.5.6ELISA阴阳性临界值的确定将收集10份SPF兔血清，在最佳工作条件下进行间接ELISA测定，以确定兔血清在无RHDV感染时其吸收值范围（x±3s，s：标准差，x：算数平均值），以此确定31 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究P/N值大于或等于2.1，且待检样本OD650nm值大于阴阳性临界值的判为阳性。2.2.3.6RHD免疫抗体检测用ELISA试验对7只6周龄SPF兔免疫RHD灭活疫苗后7d、14d、21d、28d、35d、42d的抗体水平进行监测，测定OD650nm值（OD650nm=样品OD650nm–阴性对照OD650nm）。分别用VP60-1（5μg/mL）、VP60-2（5μg/mL）、VP60-3（5μg/mL）和pCold-VP60（15μg/mL）作为包被抗原，37℃包被2h,4℃过夜。1%BSA37℃封闭1h。RHDV阳性血清（1:200）37℃孵育1h，山羊抗兔IgG‒HRP抗体（1:2,000）37℃孵育30min，经TMB显色15min，测定其OD650nm值。4LD用HI试验对7只6周龄SPF兔免疫RHD灭活疫苗（1050抗原量）后7d、14d、21d、28d、35d、42d的抗体水平进行监测，方法如下：25μL生理盐水加入96孔板中，每行第1孔加入25μl免疫后阳性血清，加入25μl已稀释至4单位的RHDV抗原，室温静止30min，最后每孔加入25μl1%人“O”型红细胞，统计HI试验结果。根据ELISA试验和HI试验所测得的各组兔群的抗体效价，建立相应的回归方程。32 山东农业大学硕士学位论文3结果与分析3.1RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析3.1.1VP60基因的克隆对分离到的3株（BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株）兔出血症病毒，分别提取RNA，以病毒RNA为模板，以VP60-F/VP60-R为引物，进行RT-PCR，在与VP60蛋白基因预期大小一致的位置有1,740bp的特异性扩增条带（图3），与预期目的片段大小一致，连接T载体，PCR鉴定正确，送往英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序正确。图3VP60基因的RT-PCR扩增Fig.3RT-PCRamplificationofVP60M,DL-2,000Marker;lane1-3,AmplificationofstrainBZ/2015、LW/2015、MY/2015VP60gene（1,740bp）.3.1.2VP60基因的核酸序列系统进化树分析在山东不同地区分离了3株RHDV毒株，分别命名为BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株，应用MEGA4软件，从系统进化树中可以看到（图4），34株RHDV可以分为2个血清型：经典RHDV和RHDV2，经典RHDV可以分为6个基因群，G1～G4在差异不大，G5和G6差异性不大，3个毒株均属G6（RHDVa）变异群。用MegAlign软件对序列同源性和差异性分析显示（图5），BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中其它经典型RHDV毒株核苷酸序列同源性分别在90.2%～98.6%、90.5%～99.9%、89.4%～99.5%，BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中RHDV2毒株核苷酸序列同源性分别在82.6%～82.9%、82.5%～82.8%、81.5%～81.9%。运用生物信息学软件分析，构建系统进化树和氨基酸序列同源性表，结果表明从山东不同地区分离的3株RHDVVP60基因均属于第6基因群，其遗传距离很近，3个地区间RHDV几乎没有差异；中国四大地区中的JX/CHA/97（华东）、TP（东北）、whn/China/01（西南）毒株均属于第5基因群，其遗传距离较近，地区间差异不大，RHDV发病应该与国内各养兔区之间病毒性兔出血症的疫情传播有关，无血凝特性whn-1株与33 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究其他毒株差异不大；YL毒株（西北）属于第6基因群，与中国江苏WF毒株差异性不大；中国1984年首次发现的WX84株与2014年河北分离的HB株同属于第2基因群。根据34株RHDVVP60氨基酸序列，应用MegAlign软件分析的两个血清型核酸序列差异表显示各毒株间氨基酸序列同源性在81.3%～99.7%之间，这其中Wriezen毒株和Ss11毒株序列差异最大，YL株、whn/China/01/2005株、SD株、TP株4个毒株的核酸序列同源性在89.5%～99.7%。2014年河北分离到HB毒株与WX84毒株遗传距离很近，推测其很可能来自毒株WX84株，近几年，中国从西北、华东、东北和西南四大地区分离到的具有代表性的RHDV毒株与WX84株差异较大，RHDV发生了变异。四大地区之间的RHDV毒株差异不大，且同世界其他国家和地区RHDV分离株基因序列几乎没有差异，同源性达到90%以上，因此，病毒基因型和流行的地域性没有必然联系。图434株RHDV的VP60基因构建的系统进化树Fig.4Phylogenictreeofthe34RHDVstrainsbasedonVP60genesequence34 山东农业大学硕士学位论文图534株RHDV的核酸序列同源性（上）与变异性（下）Fig.5Thenucleicacidsequencehomologyanddivergenceof34RHDV35 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究3.2兔出血症病毒RPA检测方法的建立3.2.1重组酶聚合酶等温扩增反应取RHDV阳性病料提取RNA,分别用TwistAmpDNAAmplificationKits和HiscripIIOneStepRT-PCRKit两种方法建立的RT-PCR方法，扩增条带大小一致（图6和图7）。3.2.2RPA反应条件的优化图6RHDV扩增反应（TwistAmpDNAAmplificationKits）图7RHDV扩增反应（HiscripIIOneStepRT-PCRKit）Fig.6AmplificationofRHDVFig.7AmplificationofRHDVM,DL-2,000Marker;lane1,RabbithemorrhagicdiseaseM,DL-2,000Marker;lane1,Rabbithemorrhagicdiseasevirusvirus两个反应体系，分别加入引物（浓度为20μΜ/mL）1.2μL和2.4μL，反应结束后，琼脂糖凝胶电泳观察结果，差异不大（图8）。图8最佳引物浓度的确定Fig.8TheoptimizationofconcentrationofprimersM,DL-2,000Marker;lane1,1.2μL;lane2,2.4μL.3个反应体系分别在37℃、39℃、40℃3个温度下反应30min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳观察结果，确定最佳反应温度40℃（图9）。图9最佳温度的确定Fig.9TheoptimizationoftemperatureofprimersM,DL-2,000Marker;lane1,37℃;lane2,39℃;lane3,40℃36 山东农业大学硕士学位论文3.2.3特异性试验取RHDV阳性病料、SPF兔肝脏，提取RNA，分别用TwistAmpDNAAmplificationKits和HiscripIIOneStepRT-PCRKit两种方法建立的RT-PCR方法只能特异地检出RHDV，而对大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、波氏杆菌和SPF肝脏的RNA或DNA的检测，均未能扩增出任何条带（图10和图11）。图10特异性试验（HiscripIIOneStepRT-PCRKit）Fig.10SpecificitydetectionofHiscripIIOneStepRT-PCRKitM,DL-2,000Marker;lane1,Rabbithemorrhagicdiseasevirus;lane2,Negativecontrol（SPFrabbitliver）;lane3,EscherichiaColi;lane4,Pasteurella;lane5,salmonella;lane6,BordetellaCaniculum图11特异性试验（TwistAmpDNAAmplificationKits）Fig.11SpecificitydetectionofTwistAmpDNAAmplificationKitsM,DL-2,000Marker;lane1,Rabbithemorrhagicdiseasevirus;lane2,Negativecontrol（SPFrabbitliver）;lane3,EscherichiaColi;lane4,Pasteurella;lane5,salmonella;lane6,BordetellaCaniculum3.2.4敏感性试验将RHDV病毒分别稀释至10-2～10-8，提取RNA，并分别用TwistAmpDNAAmplificationKits和HiscripIIOneStepRT-PCRKit进行RT-PCR。HiscripIIOneStepRT-PCRKit方法和TwistAmpDNAAmplificationKits方法，结果一致，两种方法均可以检测到RHDV的0.1LD50（图12和图13）。37 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究图12敏感性试验(HiscripIIOneStepRT-PCRKit)Fig.12TheresultsofsensitivityassayofHiscripIIOneStepRT-PCRKit～2～8M,DL-2,000Marker;lane1-7,differentdilution(10～10)ofRHDpositiveliver;lane8,Negativecontrol(SPFrabbitliver)图13敏感性试验（TwistAmpDNAAmplificationKits）Fig.13TheresultsofsensitivityassayofTwistAmpDNAAmplificationKits～2～8M,DL-2,000Marker;lane1-7,differentdilution（10～10）ofRHDpositiveliver;lane8,Negativecontrol（SPFrabbitliver）3.2.5人工感染的样本检测人工感染5只SPF兔均发病，检测结果如表13所示。对5只兔子12h、24h和36h收集的鼻拭子和病死兔的肝组织样品，用RPA方法检测结果均为阳性（表13）。表13人工感染试验Table13Artificialinfectedtestgroups12h24h36h48h1排毒排毒排毒死亡（+）2排毒排毒死亡（+）3排毒排毒死亡（+）4排毒排毒排毒死亡（+）5排毒排毒死亡（+）3.2.6临床应用利用建立的RHDV重组酶聚合酶等温扩增方法检测122份临床样品，同时与HiscripIIOneStepRT-PCRKit检测方法结果进行比对。兔出血症病毒RPA检测方法和38 山东农业大学硕士学位论文HiscripIIOneStepRT-PCRKit检测方法均检测出24份RHDV阳性样品（表14）。以上结果表明，所建立的重组酶聚合酶等温扩增检测方法与HiscripIIOneStepRT-PCRKit检测方法，阳性检出率相同，具有较强的临床适用性。表14鼻拭子样品详表与检测结果Table14Detailsanddetectingresultsofthenoseswabsamples样品来源地域样品采集数量HiscripIIOneStepRT-PCRKitRPA检测方法符合率阳性数阳性率阳性数阳性率山东济南402460%2460%100%山东莱芜370000100%山东蒙阴450000100%合计1222419.7%2419.7%3.3间接ELISA检测抗体的研究3.3.1VP60基因序列比对本试验结合MegAlign软件对BZ/2015毒株VP60-1、VP60-2、VP60-3氨基酸序列进行了分析，结果显示，VP60-1和经典RHD病毒同源性为：95.7%～99.1%，VP60-1和RHDV2同源性为：93.7%～94.2%;VP60-2和经典RHD病毒同源性为：91.7%～99.2%，VP60-2和RHDV2同源性为：84.2%～85%；VP60-3和经典RHD病毒同源性为：92.1%～100%，VP60-2和RHDV2同源性为：84.5%～86.2%。（图14-16）39 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究图1434株RHDVVP60-1的氨基酸序列同源性（上）与变异性（下）Fig.14Theaminoacidsequencehomologyanddivergenceof34RHDVVP60-140 山东农业大学硕士学位论文图1534株RHDVVP60-2的氨基酸序列同源性（上）与变异性（下）Fig.15Theaminoacidsequencehomologyanddivergenceof34RHDVVP60-241 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究图1634株RHDVVP60-3的氨基酸序列同源性（上）与变异性（下）Fig.16Theaminoacidsequencehomologyanddivergenceof34RHDVVP60-342 山东农业大学硕士学位论文3.3.2VP60基因的分段扩增及原核表达载体构建以提取到的PMD-VP60质粒为模板，分别以VP60-1-F/VP60-1-R、VP60-2-F/VP60-2-R、VP60-3-F/VP60-3-R和VP60-F/VP60-R为引物，进行PCR，PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到4条大小分别为600bp、750bp、700bp和1,740bp碱基的片段（图17），与预期目的片段大小一致。图17VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60基因的RT-PCR扩增Fig.17RT-PCRamplificationofVP60-1、VP60-2、VP60-3andVP60M,DL-2,000Marker;lane1,AmplificationofVP60gene（1,740bp）;lane2,AmplificationofVP60-3gene（700bp）;lane3,AmplificationofVP60-2gene（750bp）;lane4,AmplificationofVP60-1gene（600bp）用NdeⅠ和HindⅢ双酶切回收产物VP60和原核表达载体pColdⅢ，用T4DNA连接酶连接。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切回收产物VP60-1,、VP60-2、VP60-3和原核表达载体pET-32a（+），用T4DNA连接酶连接。将重组质粒转化至BL21感受态细胞,通过PCR、酶切鉴定，筛选阳性重组质粒，命名为pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60。分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3，用NdeⅠ和HindⅢ双酶切pCold-VP60，经琼脂糖凝胶电泳分别检测出两条条带（图18），与预期大小相符。图18重组质粒pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60的酶切鉴定Fig.18DigestionofplasmidpET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3andpCold-VP60M1,DL-15,000Marker;M2,DL-2,000Marker;lane1,RecombinantplasmidofpCold-VP60;lane2,RecombinantplasmidofpET-VP60-3;lane3,RecombinantplasmidofpET-VP60-1;lane4,RecombinantplasmidofpET-VP60-2.43 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究3.3.3VP60-1、VP60-2、VP60-3基因的原核表达及纯化将阳性重组质粒pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60在37℃、170r/min振荡培养过夜，取新鲜菌液按1:100加入LB培养基中，37℃、170r/min摇至OD600值达到0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃、170r/min进行诱导表达。设置pET-32a（+）和pColdⅢ空载体作对照。收取重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3诱导后的2、3、4、5、6、7、8h的样品（收取重组蛋白VP60诱导后24、48h样品），超声波破碎，4℃10,000r/min离心10min，分别取诱导上清液和沉淀用于SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白VP60（63.8ku，表达量：2.82mg/mL）、VP60-1（42ku,表达量：4.86mg/mL）、VP60-2（47.5ku,表达量：3.83mg/mL）和VP60-3（45.6ku,表达量：3.53mg/mL），均以包涵体形式存在，与预期大小一致（图19）；以诱导后5h表达量最大，重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中（图20-26）；切胶纯化后，重组蛋白VP60和VP60-1、VP60-2、VP60-3得到条带分别与SDS-PAGE出现的重组表达产物条带的质量大小一致，表明KCL银色染色法结合电洗脱的方法均可获得较纯的目的蛋白（图27）。图19诱导表达蛋白的SDS-PAGE分析Fig.19SDS-PAGEanalysisofinducedexpressionproteinM,ProteinMarker;lane1,blankvector（supernatant）;lane2,blankvector（precipitate）;lane3,VP60-1（supernatant）;lane4,VP60-1（precipitate）;lane5,VP60-3（supernatant）;lane6,VP60-3（precipitate）;lane7,VP60-2（supernatant）;lane8,VP60-2（precipitate）;lane9,blankvector（supernatant）;lane10,blankvector（precipitate）;lane11,VP60（supernatant）;lane12,VP60（precipitate）44 山东农业大学硕士学位论文图20不同诱导时间下蛋白表达量分析图21不同诱导时间下蛋白表达量分析Fig.20ProteinexpressionanalysisunderdifferentFig.21ProteinexpressionanalysisunderdifferentinducingtimesinducingtimesM,ProteinMarker;lane1-7,supernatantofVP60-1M,ProteinMarker;lane1-7,precipitateofVP60-1（Afterinduced2,3,4,5,6,7hrespectively）（Afterinduced2,3,4,5,6,7hrespectively）图23不同诱导时间下蛋白表达量分析图22不同诱导时间下蛋白表达量分析Fig.23ProteinexpressionanalysisunderdifferentFig.22ProteinexpressionanalysisunderdifferentinducingtimesinducingtimesM,ProteinMarker;lane1-7,precipitateofVP60-2M,ProteinMarker;lane1-7,supernatantofVP60-2（After（Afterinduced2,3,4,5,6,7hrespectively）induced2,3,4,5,6,7hrespectively）图24不同诱导时间下蛋白表达量分析图25不同诱导时间下蛋白表达量分析Fig.24ProteinexpressionanalysisunderdifferentinducingFig.25ProteinexpressionanalysisunderdifferenttimesinducingtimesM,ProteinMarker;lane1-7,supernatantofVP60-3（AfterM,ProteinMarker;lane1-7,supernatantofVP60-3induced2,3,4,5,6,7hrespectively）（Afterinduced2,3,4,5,6,7hrespectively）45 兔出血症病毒ＲＰＡ检测方法的建立及间接ＥＬＩＳＡ检测抗体的研究ＫｔＪＭ１２３４，＂ＫｕＭ１２３４＾＞１７０、麵表，〈ｆ－＇辦＃聲”１００■３３０—：１００ｍｍｍ－７〇——５５—７０＿？一—臀與．—ｍｍ５５４０参＿？—＾３５獅ｍＭＭ，、１塗＾４０繼＿ｎｍｍｍｍ２２＇２５一—：：：１５－禮疆图２６不同诱导时间下蛋白表达量分析图２７重组蛋白的纯化ｉｉｏｎａｎａＦｉ＊２６ＰｒｏｔｅｎｅｘｒｅｓｓｌｓｉｓｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｕｃｉｎｔｉｍｅｓｇｐｙｇＦｉ２７Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｏｔｅｉｎｇ．ｐＭＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ－－，；ＭＰｒｏｔｅｍｒｋｅｒｌａｎｅｌＶ６０ｌｌａｎｅ２Ｖ６０２Ｍａ；，，ｐ；，ｐ；ｌａｎｅ１ｕｅｒｎａｔａｎｔｏｆ－ｓＶＰ６０（Ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄ２４ｈｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ）Ｖ３ＶＰ６０，ｐｐｙｌａｎｅ３６０ｌａｎｅ４，ｐ；，ａｎｅ２ｒｅｃｉｉｔａｔｅｏｆＶ６０（ｅｒｉｎｄｕｃｅｄ２ｅｌＰＡｆｔ４ｈｒｓｅｃｔｉｖｅｌ），ｐｐｐｙｌａｎｅ３，ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆＶＰ６０（Ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄ４８ｈｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｌａｎｅ４，ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｏｆＶＰ６０（Ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄ４８ｈｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）３．３．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＶＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现，该重组蛋Ｐ６０－１、白－－Ｖ有Ｐ６０２、ＶＰ６０３和ＶＰ６０与ＲＨＤＶ阳性血清均能发生反应（图２８），表明重组蛋白具良好的免疫反应性。ＫｕＭ１２３４５６Ｍ—１７０■■—１３０■—１〇〇７０——５５■—？４０響？鑄．—２５ＨＷ图２８ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析Ｆｉ２８ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｏｔｅｉｎｇｙｐＭ－－－ＶＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ；ｌａｎｅ１ｂｌａｎｋｖｅｃｔｏｒｌａｎｅ２ＶＰ６０１Ｉａｎｅ３ＶＰ６０２ｌａｎｅ４，ＶＰ６０３；ｌａｎｅ５Ｐ６０ｌａｎｅ６ｂｌａｎｋｖｅｃｔｏｒ．，，；，；，；，；，３．３．５间接ＥＬＩＳＡ方法的建立３．３．５．１抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度的确定测定重组蛋白纯化后的浓度为０．４ｍｇ／ｍＬ。根据间接ＥＬＩＳＡ方阵试验结果，确定抗－－－原最佳浓度为５／ｍＬ和血清稀释倍数为１：２００。当重组蛋白ＶＰ６０１、ＶＰ６０２和ＶＰ６０３ｐｇ包被量为５ｐｇ／ｍＬ、血清稀释倍数为１：２００时，阳性血清ＯＤ＾ｎｍ值接近１．０左右，阳性样品与阴性对照的比值（Ｐ／Ｎ）最髙（表１５）。４６ 山东农业大学硕士学位论文表15抗原和血清最佳工作浓度的确定（OD650值）Table15ELISAfordetectingtheoptimumworkconcentrationofantigenandserum（OD650nm）VP60-1抗原包被量VP60-2抗原包被量VP60-3抗原包被量稀释度血清（μg/mL）（μg/mL）（μg/mL）151015101510+1.2291.5432.1370.9511.1901.5510.9771.2361.6771:50-0.2720.390.5880.4060.4550.6530.3460.4260.54P/N4.5173.9563.6372.32.62.42.82.93.1+1.0741.3151.9370.9231.0391.2060.9631.1231.311:100-0.2550.3190.5470.3840.4310.590.3690.4110.522P/N4.2184.1293.542.42.42.02.62.72.5+0.8641.0431.7830.7071.0050.9470.8070.9911.1571:200-0.2220.2630.4560.3530.3790.3850.3360.3630.462P/N3.94.03.92.02.72.52.42.72.5+0.6640.8960.9620.7190.770.7850.6610.7640.7961:400-0.1870.2440.2890.2880.3110.3280.2360.2750.305P/N3.63.73.32.52.52.42.82.82.6注：“+”为阳性；“-”为阳性3.3.5.2抗原最佳包被时间的确定将纯化重组蛋白以5μg/mL包被ELISA反应板。分别在4℃过夜、37℃包被1h后4℃过夜、37℃包被2h后4℃过夜3种条件下，测定阳性血清OD650nm值接近1.0和P/N值最大，确定最佳包被条件。由表16结果显示，重组蛋白VP60-1、VP60-2和VP60-3，37℃包被1h后4℃过夜时，P/N值最大，表明该ELISA方法中将3个纯化重组蛋白37℃包被1h后4℃过夜均为最佳包被条件。表16抗原最佳包被条件的确定Table16TheoptimizationofcoatingconditionofantigenTheaverageOD650ofTheaverageOD650ofP/NRatiopositiveserumnegativeserumconditionsVP60-1VP60-2VP60-3VP60-1VP60-2VP60-3VP60-1VP60-2VP60-3Coatingovernightunder4℃0.9470.9020.9170.2670.380.3753.552.372.45Coatingovernightunder4℃after0.9440.9160.9230.2610.3810.3813.622.402.42coating1hunder37℃Coatingovernightunder4℃after0.9680.9380.940.2980.4110.3993.252.282.36coating2hunder37℃47 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究3.3.5.3最佳封闭液的确定将纯化蛋白以5μg/mL包被ELISA反应板，37℃包被1h后4℃过夜。次日，用PBST洗涤5次后，分别用5%脱脂奶粉、1%BSA、1%coldwaterfishskin、1%porcineskinGelatin4种封闭液，300µL/well，测定阳性、阴性OD650值和P/N值，确定最佳封闭液。由表17结果显示用1%BSA封闭时，P/N值最高，表明本ELISA方法中1%BSA为最佳封闭液。表17最佳封闭液的确定Table17DeterminationoftheblockingbufferTheaverageOD650ofpositiveTheaverageOD650ofnegativeP/NRatioBlockingbufferserumserumVP60-1VP60-2VP60-3VP60-1VP60-2VP60-3VP60-1VP60-2VP60-31%coldwaterfishskin0.980.9550.9830.2740.4030.3973.62.42.51%porcineskin0.9750.9470.990.2740.4040.383.62.32.6Gelatin1%BSA0.9921.0540.9920.2660.3840.3643.72.72.75%脱脂奶粉0.970.9820.9130.2720.3910.3743.62.52.43.3.5.4最佳封闭时间的确定按上述优化的条件包被ELISA反应板，分成5组。第1组37℃封闭1h，第2组37℃封闭1.5h；第3组37℃封闭2h，测定每个重组蛋白的阴阳性，测定OD650值和P/N值。表18表明1h为最佳封闭时间。表18最佳封闭时间的确定Table18DeterminationofthebestblockingtimeTheaverageOD650TheaverageOD650ofnegativeP/NRatioofpositiveserumserumconditionsVP60-1VP60-2VP60-3VP60-1VP60-2VP60-3VP60-1VP60-2VP60-3Block1.0hunder37℃0.9490.9110.9270.2710.3790.3733.502.402.49Block1.5hunder37℃0.9570.9250.9330.2750.3860.3773.482.392.47Block2.0hunder37℃0.9710.9330.9510.3020.4210.3953.212.222.413.3.5.5二抗工作浓度的确定按上述优化的条件包被ELISA反应板，分成3组，将HRP标记的羊抗兔二抗分别进行1:1,000、1:2,000、1:5,000稀释，测定阳性血清及阴性血清OD650nm值和P/N值，确定合适的二抗工作浓度。由表19可见羊抗兔二抗按1:2,000稀释时，P/N值最高，表明ELISA方法中酶标二抗的最佳稀释度为1:2,000。48 山东农业大学硕士学位论文表19二抗最佳工作浓度的确定Table19DeterminationforoptimaldensityofsecondaryantibodyTheaverageOD650TheaverageOD650ofP/NRatioDilutionofofpositiveserumnegativeserumsecondaryantibodyVP60-1VP60-2VP60-3VP60-1VP60-2VP60-3VP60-1VP60-2VP60-31:1,0000.9670.9270.9320.2750.3970.3883.522.342.401:2,0001.0590.980.9970.2680.3790.3693.952.582.71:5,0000.9490.9250.9170.2740.4030.3973.462.302.313.3.5.6ELISA阴阳性临界值的确定将收集的10份无RHDV抗体的阴性兔血清，在最佳工作条件下进行间接ELISA测定。VP60-1、VP60-2和VP60-3检测样品平均数为0.28、0.39、0.37和标准差（s）分别为0.019、0.016、0.016，阴阳性临界值（x±3s）分别为0.34、0.44、0.42，因此我们把0.34、0.44、0.42分别作为VP60-1、VP60-2和VP60-3检测RHDV阴性血清的上限，得到间接ELISA判定标准，即待检样本阳性OD650值与阴性OD650值的比值（P/N）大于或等于2.1且OD650值大于阴阳性临界值者判为阳性，否则判为阴性（图29）。图29RHDV阴性血清OD650值分布图Fig.29ELISAfordetecting10negativeseraagainstRHDV.3.3.6RHD免疫抗体检测选择ELISA试验抗原最佳包被浓度：VP60-1（5μg/mL）、VP60-2（5μg/mL）、VP60-3（5μg/mL），以相同的质量浓度VP60（15μg/mL），对RHDV灭活疫苗免疫后的抗体水平进行检测，测得其OD650nm值（即OD650nm=免疫后血清样品OD650nm–阴性对照OD650nm）。免疫14d后可检测到较高抗体水平，21d达到高峰，42d后开始下降（图30a）。且VP60-1和VP60作为包被抗原监测免疫后抗体消长规律一致,而基于VP60-2和VP60-3包被抗原的ELISA抗体值差异不明显，无法准确显现不同免疫时期的抗体水平。HI检测结果显示，抗体在21d达到高峰，42d后开始下降（图30b），与ELISA结果一致。49 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究本试验根据所测得的各组兔群的ELISA与HI抗体效价建立了相应的回归方程：ELISA=0.1988HI+0.1849（r2=0.9547），经显著性检验，表明ELISA方法与HI试验检测的抗体效价结果呈显著相关性（见图31）。b图30免疫抗体的消长规律Fig.30ChangesofantibodytitersatthedifferentstagesinrabbitwithRHDVvaccinea,ELISAtest;b,HItest图31回归直线方程的建立Fig.31Establishmentoftheregressionequation.50 山东农业大学硕士学位论文4讨论4.1RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析本试验根据分离了3株RHDVVP60基因和GenBank中已公布的VP60基因的核酸序列，运用MEGA4.0软件，构建了VP60基因进化树，运用MegAlign软件对VP60核酸序列的同源性和差异性进行分析，从山东不同地区分离的3株RHDVVP60基因均属于第6基因群，其遗传距离很近，3个地区间RHDV几乎没有差异；对世界上的RHDV毒株进行了分型；并重点对中国四个不同大地区（西北、华东、东北、西南）的代表性RHDV毒株进行分析，结果表明，基因型和地域性没有必然联系。传统的兔病毒性出血症不断地发生变异，对兔病毒性出血症的防控提出了新的挑战。通过遗传进化树分析，发现经典RHDV和RHDV2核酸序列同源性仅81.4%～82.9%。目前，中国虽尚未报道该变异毒株RHDV2的存在（谭永贵等,2016），但由于国内养兔业与欧洲养兔业有密切的贸易往来，因此国内随时会有RHDV2的侵入风险。经典RHDV疫苗对RHDV2感染的家兔不能提供有效的交叉保护，可用于分析监测国内RHDV2的流行情况，对保障国内家兔养殖业的健康发展具有重要意义。目前关于RHDV2的生物学特征，流行病学规律了解很少，迫切需要我们研制RHDV2毒株的病原学和分子生物学诊断方法。4.2兔病毒性出血症RPA检测方法的建立重组酶聚合酶扩增RPA（RecombinasePolymeraseAmplification），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（吴耀东等,2016）。目前RPA检测方法在医学上广泛用于多种病原微生物的检测（王建昌等,2016；AbdElWahedA.etal,2013）。本实验室用TwistAmpDNAAmplificationKits和HiscripIIOneStepRT-PCRKit进行RT-PCR进行平行试验，两种方法都能使RHDV阳性病料扩增出明显的特异性条带，阴性对照SPF兔肝脏及其他传染病未能扩增出条带。目前，对肝脏进行检测是当前检测RHDV的主要途径，在实际工作中对鼻拭子进行检测对于规模化兔场活体兔的病原学检测还有待遇研究。李超美等（李超美等，2007）报道用RT-PCR方法能够特异性地检测出RHDV，其最小检出RHDV的RNA浓度为1.66ng/μL。张秀娥等（张秀娥等，2007）报道用实时荧光定量RT-PCR技术设计了1对引物和1段TaqmanMGB探针用来检测出病死兔病料中的RHD病毒含量为5pg。现有的方法在实际检测工作中，需要特殊设备，并且不能在很短时间内检测。而本试验建立的RPA检测方法，大大提高了检测量，能够快速检51 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究测，并降低了污染的风险。重组聚合酶等温扩增方法具有稳定性好、敏感性高和特异性强的特点，易于在普通实验室推广。本试验中，所用试剂均为商品化产品，有利于该方法的标准化与试剂盒化。重组酶聚合酶等温扩增方法总反应过程耗时30min左右，该技术对硬件设备的要求很低，且不需要温控设备，RPA检测方法可以真正实现便携式的快速核酸检测。该方法适合临床进行大规模病原学检测和兔群携带病毒的调查，将会成为RHDV流行病学调查等的首选方法，具有良好的应用前景。在检测中能快速、灵敏、特异地从兔肝脏组织中检测到RHDV。为防控该病奠定了基础，在今后检测具有很好的应用前景。4.3间接ELISA检测抗体的研究目前国内主要通过HI试验对RHDV抗体进行检测，RHDV只和人红血球发生凝集反应，与兔或其他哺乳动物红血球均无凝集反应（Ruvoën-Clouetetal,2000;马力等,2013），但是该方法中人O型血的获取存在困难，且公共卫生条件达不到。肖跃强等（肖跃强等,2012）发现无凝集“O”型红细胞特性毒株的出现，可能导致漏检、错检。故酶联免疫吸附试验（ELISA）在某种程度上，比血凝抑制敏感性更高、更易于标准化（付瑞等,2016）。鉴于当前RHDV对养兔业造成的危害极大，且不能在鸡胚、鸭胚中增殖，也未找到其它合适体外培养的原代或传代细胞。目前RHDV诊断试剂的抗原主要来源于感染病死兔的肝脏组织，由于组织毒抗原制备过程繁琐、纯化难度大，同时存在散毒的危险（Forresteretal,2006）。因此，本研究以表达纯化的蛋白建立了用于RHDV检测的ELISA方法，有利于兔病毒性出血症的诊断。LaurentS等（Laurentetal,1994）已证实经原核表达载体表达的RHDVVP60蛋白具有抗原性，E.Viaplana等（Viaplanaetal,1997）发现VP60蛋白的1～175位氨基酸具有抗原性，Martínez-orrecuadrada等（Martínez-orrecuadradaetal,1998）研究认为VP60有两个主要抗原优势区域，分别位于VP60蛋白N端的31aa～250aa间和C端的477aa～579aa间，且N端的抗原性明显优于C端。由于VP60基因片段大，而截短蛋白其片段较小，容易折叠，有利于提高其表达量，减少杂蛋白，利于后续纯化（王净等,2012）。因此，我们选用了VP60基因分段进行原核表达。本试验结合生物信息学软件对VP60蛋白的抗原表位进行了分析，将结构蛋白VP60分为3个区域VP60和经典RHD病毒同源性为：95.7%～99.1%、91.7%～99.2%、92.1%～100%，VP60-1与经典RHDV毒株的VP60的氨基酸序列同源性最高。因此本对VP60分段为VP60-1（2aa～208aa）、VP60-2（174aa～425aa）和52 山东农业大学硕士学位论文VP60-3（342aa～579aa）进行IPTG诱导表达，并对重组蛋白进行SDS-PAGE分析。且Westernblot分析表明，VP60-1（2aa～208aa）、VP60-2（174aa～425aa）和VP60-3（342aa～579aa）基因表达蛋白均都具有抗原性，但是VP60-1抗原性最强（p<0.05）。抗原的纯度和包被浓度直接影响试验的敏感性和特异性。以纯化蛋白VP60-1、VP60-2和VP60-3包被ELISA反应板，确定抗原的最佳包被浓度为5μg/mL，血清的最佳工作浓度稀释为1:200时，ELISA方法的特异性较高。以确定的最佳抗原浓度和血清最佳稀释度进行其他反应条件的摸索，结果发现抗原的最佳包被条件为37℃包被1h后4℃过夜，最佳封闭液为1%BSA，最佳封闭时间为1h，羊抗兔二抗最佳稀释度为1:2,000。将VP60-1、VP60-2、VP60-3分别作为包被抗原建立ELISA，对RHDV灭活疫苗免疫后的抗体水平进行检测，VP60-1和VP60作为包被抗原监测免疫后抗体消长规律一致，而基于VP60-2和VP60-3包被抗原的ELISA抗体值差异不明显，无法准确显现不同免疫时期的抗体水平。并且以VP60-1作为包被抗原的ELISA方法对RHDV免疫抗体的检测结果与HI试验结果一致，本试验根据所测得的各组兔群的ELISA与HI抗体效价建立了相应的回归方程：ELISA=0.1988HI+0.1849（r2=0.9547），经显著性检验，表明ELISA方法与HI试验检测的抗体效价结果呈显著相关性。说明基于VP60-1重组蛋白的ELISA可用于RHDV抗体检测和免疫后抗体消长规律的检测。53 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究5结论（1）从山东滨州、莱芜和蒙阴三个不同地区分离的3个毒株与WF株距离很近；近几年，中国分离到的具有代表性的RHDV毒株差异不大，且同世界其他国家和地区RHDV分离株基因序列同源性达到90%以上，病毒基因型和流行的地域性没有必然联系。（2）建立了基于VP60基因的RHDV重组酶聚合酶等温扩增检测方法，该方法能扩增出特异片段，检测灵敏度达到0.1LD50，与RT-PCR一步法敏感性相同。（3）HI试验和以VP60-1作为包被抗原的间接ELISA试验检测结果一致，本试验根据两种方法所测得的各组兔群的抗体效价建立了相应的回归方程r2=0.9547，表明ELISA方法与HI试验检测的抗体效价结果呈显著相关性。说明基于VP60-1重组蛋白的间接ELISA可用于RHDV抗体检测和免疫后抗体消长规律的检测。54 山东农业大学硕士学位论文参考文献陈兴祥,薛家宾,徐为中,周永银,诸玉梅.测定RHDV抗体的间接ELISA方法的建立.,JiangsuJournalofAgriculturalSciences,2003,19(04):233-236.戴康,徐为燕,杜念兴.应用免疫扩散试验检测兔病毒性出血症抗体,畜牧与兽医,1987,(02):70-71.付瑞,王洪,王淑菁,李晓波,王吉,卫礼,岳秉飞.兔出血症病毒抗体的实验室检测能力验证结果评价.中国实验动物学报,2016,24(2):188-190.巩薇,付瑞,贺争鸣,邢瑞昌.兔出血症病毒RT-PCR方法的研究,ChineseJournalofComparativeMedicine,2006,24(08):466-468.矫正德,王英厚,王翠兰,王西川.免疫扩散法诊断家兔溶血性链球菌病的研究,中国畜禽传染病,1994,(01):37-39.李富金,宋晓飞,周荣荣,田真.兔病毒性出血症灭活疫苗免疫程序研究,中国养兔杂志,2015,(03):14-15.林治涌.兔瘟血凝及血凝抑制试验操作方法,畜牧兽医杂志,1995,(02):53-55.刘光清,云涛,倪征,张玉颖.兔病毒性出血症病毒基因组结构与功能研究进展,VirologicaSinica,2006,21(02):194-199.刘怀然,关云涛,李昌文,张龄,姜骞,陈洪岩,曲连东.兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用,ActaLaboratoriumAnimalisScientiaSinica,2006,14(01):20-25.刘胜江,薛华平,浦伯清,钱年华,徐为燕,杜念兴.兔的一种新病毒病——兔病毒性出血症,畜牧与兽医,1984,(06):253-255.马力,杨丽梅,王艳,郭时金,沈志强,张颖.兔瘟病毒VP60蛋白原核表达及其应用,家畜生态学报,2013,34(05):67-70-64.潘荣生,杜念兴,杨先进,孙晓斌.应用ELISA检测出口冻兔肉产品中兔出血症病毒的研究,畜牧与兽医,1989,(05):225-226.秦海斌,刘怀然,曲连东,刘家森,韩凌霞,姜骞,李亚明,杨增岐.兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立,中国兽医学报,2008,28(01):28-31.佘锐萍,杨汉春,马毅新,高齐瑜.用乙型肝炎表面抗原地衣红染色法检测兔出血症病毒,畜牧兽医学报,1998,29(01):80-84.55 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山东农业大学硕士学位论文致谢硕士研究生已接近尾声。回首硕士生活三年的学习、思想、工作和生活，充满酸甜苦辣，心中难免思绪万千，更多地是收获和成长。本论文是在我的恩师崔言顺教授的耐心指导和淳淳教诲下完成的，衷心感谢我的恩师对我的殷切关怀和悉心指导。三年研究生学习期间，他如慈父又如良友，不仅在学业上给予我循循善诱的指导，还在日常生活和思想状况上给予我鼓舞和支持。恩师学识渊博、学术态度严谨，在工作上精益求精，深深地感动了我。我在实验和生活中取得的所有成绩都凝聚着崔老师的辛勤的汗水和毕生心血。在此向我的恩师表示诚挚的感谢和崇高的敬意。教诲如春风，师恩似海深，在此衷心祝福恩师桃李满天下，春晖四方。该课题在选题和研究过程中得到山东省农科院家禽研究所黄兵研究员的悉心指导，从论文的选题到完成，黄兵老师给予我很大的关心和帮助，黄老师学识渊博、开阔的视野、态度严谨以及精益求精的工作作风对我实验能力和素养的提升大有裨益。感谢山东省农科院家禽所禽病室的宋敏训老师、李玉峰老师、马秀丽老师、于可响老师、刘存霞老师、胡峰老师、吴静老师、刘玉山老师、郎冬梅老师等以及家禽所内的其他领导和职工们，对我在做课题的两年中生活和实验的指导和帮助，感谢禽病室这个精英团队，让我感受到家庭的温暖，让我全身心的投入到课题中去。在此衷心的祝福他们最一切顺利，幸福美满。感谢山东省滨州畜牧兽医研究所肖跃强博士在实验上给予我很大的关心和帮助。感谢山东农业大学动物科技学院预防兽医系崔治中老师、赵孝民老师、商营利老师、柴同杰老师、朱瑞良老师、刁有祥老师、常维山老师、姜世金老师、孙淑红老师、柴家前老师、谢之景老师、赵鹏老师以及其他老师对我的教导和其他各方面的支持和帮助。感谢李建亮老师和杨萍萍老师，在学习和生活上给予的鼓励和无私的帮助，感谢实验室的王樱历、孔正杰等同学，2015级师妹路化梅、魏冉、程汝佳、师弟王瑞明，感谢他们在我生活和学习中无微不至地帮助。滴水之恩，当涌泉相报。“羊有跪乳之恩，鸦有反哺之义”，感谢父母的养育之恩以及家人对我的坚定支持和无私奉献，让我能有一个舒适的学习环境。他们的鼓舞是我前进的步伐。在即将完成学业之际，感谢曾经教育和帮助过我的所有老师、同学、朋友，衷心的感谢评阅本论文的专家教授，感谢他们付出宝贵的时间和辛勤的劳动。65 兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究攻读学位期间发表论文情况张连芝，王樱历，路化梅，李建亮，胡峰，李富金，肖跃强，黄兵，崔言顺*.兔病毒性出血症免疫评估方法的研究.中国预防兽医学报（第一作者，已录用）王樱历，张连芝，路化梅，孙俊颖，崔言顺*，李建亮，黄兵，马秀丽，宋敏训*.1型鸭甲肝病毒和坦布苏病毒液相芯片抗体检测方法的建立。中国兽医学报（已录用）66 山东农业大学硕士学位论文个人简介张连芝，女，1989年出生，河北邢台人。2009年考入山东畜牧兽医职业学院，就读畜牧兽医专业；2012年考入临沂大学，就读于生命科学学院-动物医学专业；2014-2017年于山东农业大学动物科技院预防兽医专业就读硕士研究生。师从崔言顺教授，从事动物检疫与食品检验的研究。67
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