《西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：S763.14学校代码：10712UDC：579研究生学号：2010060050密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究学科专业：植物病理学研究方向：植物病毒学研究生李正男指导教师：吴云锋教授完成时间：2015年5月中国陕西杨凌 Classificationcode:S763.14Universitycode:10712UDC:579Postgraduatenumber:2010060050Confidentialitylevel:PublicDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015MOLECULARDIAGNOSISOFPHYTOPLASMADISEASESONCOMMONPLANTSINNORTHWESTCHINAANDDIVERSITYSTUDYOFTHEASSOCIATEDPHYTOPLASMASMajor:PlantPathologyResearchField:PlantVirologyNameofPostgraduate:LiZheng-NanAdvisorProfessor:WuYun-FengDateofSubmission:May2015YanglingShaanxiChina 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的博士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:时间：zcr年（（月/fr曰导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的博士研究生所呈交的博士学位（毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名：g4时间年‘月日 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人（包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。(保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：时间：上年^月斤曰导师签名：时间：年丨月$日 西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究摘要植原体（Phytoplasma）是一类没有细胞壁的原核生物，严格寄生于植物韧皮部筛管细胞内，能够引起多种植物病害并造成严重经济损失。自然条件下，植原体类病害主要由刺吸式口器昆虫传播。本研究采用分子生物学方法对西北地区常见植物植原体相关病害的种类进行了鉴定，并克隆了这些植原体株系的16SrRNA基因及部分株系的rp基因，从组和亚组水平明确了它们的分类地位。另外，对10种PCR鉴定为植原体感染的植物材料进行了透射电镜观察，从形态学上确定了植原体的侵染，并对寄主植物进行了细胞病理学观察。采用昆虫传毒和菟丝子传毒的方式在温室内长春花上保存四种植原体毒源。1、根据植原体病害的症状特点，从陕西省、甘肃省、宁夏回族自治区、青海省、新疆维吾尔族自治区、内蒙古鄂尔多斯市采集了218份疑似植原体侵染的植物样品。采用植原体16SrRNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R2对这些样品进行了植原体感染情况鉴定，共检测出泡桐丛枝、枣疯、酸枣丛枝、凌霄花丛枝、甜樱桃丛枝、仙人掌丛枝、国槐丛枝、刺槐丛枝、南瓜丛枝、苦楝丛枝、油菜绿变、狗尾草绿变、樱花黄化、桃树黄化、苦楝黄化、中华小苦荬扁茎、狗尾草红叶、马铃薯紫顶、狗牙根白叶、苜蓿丛枝、早园竹丛枝、菲白竹丛枝、五角枫丛枝、辣椒丛枝、凤仙花绿变、月季绿变、菊花绿变、樱花绿变、马塘黄化、葡萄黄化、樱桃李黄化、谷子黄化、苹果衰退、普纳菊苣扁茎、桔梗扁茎、国槐扁茎、紫薇扁茎、芝麻扁茎、谷子红叶等39种植原体病害，218份植物病害样品中201份PCR鉴定为阳性。明确了泡桐丛枝、枣疯和酸枣丛枝是西北地区分布最广泛的一类植原体病害；凌霄花丛枝、菲白竹丛枝、早园竹丛枝、中华小苦荬扁茎、普纳菊苣扁茎、桔梗扁茎、谷子黄化（红叶）、苹果衰退等9种病害为世界上首次报道的植原体病害；南瓜丛枝、狗尾草绿变（红叶）、油菜绿变、五角枫丛枝、凤仙花绿变、菊花绿变、马唐黄化、葡萄黄化等8类为中国首次发现的植原体病害。2、植原体16SrRNA基因的系统发育分析结果和RFLP分析结果表明：苹果衰退（AD）属于16SrV-B亚组、AWB属于16SrV-B亚组、油菜绿变（BrV）属于16SrVI-A亚组、仙人掌丛枝属于16SrII-A亚组、苦楝丛枝（CbWB）属于16SrI-B亚组、狗牙根白叶（CdWL）属于16SrXIV-A亚组、中华小苦荬扁茎（CiFS）属于16SrI-C亚组、樱桃李黄化（CpY）属于16SrI组一个新的亚组、凌霄花丛枝（CtcWB）属于16SrI-C亚组、菊花绿变（CV）属于16SrI-B亚组、苦楝黄化（CY）属于16SrI-B亚组、马唐黄 化（DY）属于属于16SrV-B亚组、狗尾草红叶（GbR）属于16SrI-B亚组、狗尾草绿变（GbV）属于16SrI-B亚组、五角枫丛枝（JmWB）属于16SrI-D亚组、枣疯病（JWB）属于16SrV-B亚组、紫薇扁茎（LiFS）属于16SrI组新亚组、谷子红叶（MR）属于16SrI-B亚组、谷子黄化（MY）属于16SrI-C亚组、泡桐丛枝（PauWB）属于16SrI-D亚组、普纳菊苣扁茎（PcWB）属于16SrV-B亚组、辣椒丛枝（PepWB）属于16SrI-B亚组、桔梗扁茎（PgFS）属于16SrI组新亚组、马铃薯紫顶（PpT）属于16SrVI-A亚组、早园竹丛枝（PpWB）属于16SrI组新亚组、桃黄化（PY）属于16SrV-B亚组、凤仙花绿变（RBP）属于16SrI-B亚组、月季绿变（RcV）属于16SrI-B亚组、刺槐丛枝（RpWB）属于16SrV-B亚组、甜樱桃丛枝（ScWB）属于16SrV-B亚组、芝麻扁茎（SFS）属于16SrI-B亚组、菲白竹丛枝（SfWB）属于16SrI-C亚组、国槐扁茎（SjFS）属于16SrI组新亚组、国槐丛枝（SiWB）属于16SrV-B亚组、樱花绿变（SV）属于16SrI一个新亚组、SWB1属于16SXrII-A亚组、SWB2属于16SrXII组新亚组、樱花黄化（SY）属于16SrV-B亚组、葡萄黄化（VvY）属于16SrI-B亚组、酸枣丛枝（WjWB）属于16SrV-B亚组。3、采用透射电子显微镜观察经PCR鉴定为植原体感染的5种症状类型的10种病害样品。10种病害样品分别为：丛枝症状的泡桐、苜蓿、五角枫、辣椒；白叶症状的狗牙根；黄化症状的苦楝、桃、樱桃李；扁茎症状的普纳菊苣；衰退症状的苹果。在该10种被检测样品中植原体颗粒均存在于植物的韧皮部，且筛管和伴胞中均有分布，植原体粒子大小各不相同，在200-850nm之间，粒子大小与寄主种类或症状并无明显关联。4、将枣疯植原体和芝麻扁茎植原体采用菟丝子传毒的方式传到了长春花上；利用条沙叶蝉将小麦蓝矮植原体、利用小绿叶蝉将泡桐丛枝植原体传播到长春花上。通过嫁接，对以上获取的四种毒源进行了温室内繁殖。比较发现，经昆虫传毒长春花可在传毒后1-2个星期内发病；经菟丝子传毒长春花可在传毒后2-3个月发病；通过嫁接扩繁毒源，长春花在嫁接后2-3个星期发病。关键词：植原体；系统发育；透射电镜；RFLP；iPhyclassifier MOLECULARDIAGNOSISOFPHYTOPLASMADISEASESONCOMMONPLANTSINNORTHWESTCHINAANDDIVERSITYSTUDYOFTHEASSOCIATEDPHYTOPLASMASABSTRACTPhytoplasmasarecell-wall-lessprokaryotes,andstrictlyinhabitinthephloemtissueofhostplants,causingthousandsofplantdiseasesandeconomicloss.Innaturephytoplasmasaremainlytransmittedbypiercing-suckingmouthpartinsects.Inthepresentstudy,wesurveyphytoplasmasassociatedplantdiseasesinShaanxi,Chinaanddetectedandidentifiedthetaxonomicpositionsofthesephytoplasmasusingmoleculartechnique.The16SrRNAgenesofallthestrainswereclonedaswellasrpandtufgenesofsomestrains.Basedonthesegenes,thephytoplasmaswerecorrectlyclassifiedintodifferent16Srgroupsandsubgroups.Moreover,severalstrainsweretestedandexaminedundertransmissionelectronmicroscope(TEM)forthemorphologicalproperties.Fourphytoplasmastrainsweretransmittedfromtheirnaturalhostplantstoperiwinkleplantsbydodderbridgeorinsectfeeding.1.Twohundredsandeighteensamplesofplanttissues,accordingtothephytoplasma-likesymptoms,werecollectedinShaanxi,Gansu,Ningxia,Qinghai,XinjiangandErdosofInnerMongolia.PCRtestswereconductedusingthephytoplasmauniversalprimerpairsP1/P7andR16F2n/R2fordetectingphytoplasmasinthesesamples.ThepositivePCRresults(201of218samplespositive)indicatedthatthereare39phytoplasma-associateddiseases,includingPaulowniawitches'broom(PauWB),Wildjujubewitches'broom(WjWB),Jujubewitches'broom(JWB),Cynodondactylonwhiteleaves(CdWL),Chinaberrywitches'broom(CbWB),Chinaberryyellows(CY),Appledecline(AD),Cherryplumyellows(CpY),Chinaixerisflatstem(CiFS),RoseBalsamphyllody(RBP),Pepperwitches'broom(PepWB),Cactuswitches'broom(CaWB),Punachicorywitches'broom(PcWB),Japanesemaplewitches'broom(JmWB),Alfalfawitches'broom(AWB),Peachyellows(PY),Chinesetrumpetcreeperwitches'broom(CtcWB),Sweetcherrywitches'broom(ScWB),Sophorajaponicawitches'broom(SjWB),Robiniapseudoacaciawitches'broom(RpWB),Squashwitches’broom(SWB),Phyllostachyspropinquawitches'broom(PpWB),Sasafortunewitches'broom(SfWB),Brassicarapavirescence(BrV),Greenbristlegrassvirescence(GbV),Rosachinensisvirescence(RcV),Chrysanthemumvirescence(CV),Sakura virescence(SV),Sakurayellows(SY),Digitariayellows(DY),Vitisviniferayellows(VvY),Milletyellows(MY),Platycodongrandiflorumflatstem(PgFS),Sophorajaponicaflatstem(SjFS),Lagerstroemiaindicaflatstem(LiFS),sesameflatstem(SFS),Milletreddening(MR),Greenbristlegrassreddening(GbR)andPotatopurpletop(PpT).TheresultssuggestedthatPaulowniawitches’broom,jujubewitches’broomandwildjujubewitches’broomarethemostcommonphytoplasmaassociateddiseasesinNorthwesternChina.Nineoutofthe39werethefirstreportsinworldthatCtcWB,SfWB,PpWB,CiFS,PcWB,PgFS,MY,MDandAD.AnothereightoneswerethefirstreportsinChina,includingSWB,GbR,GbV,BrV,JmWB,RBP,CV,DYandVvY.2.Phylogenyanalysisandrestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP)analysisof16SrRNAgenesequencesindicatedthatphytoplasmaassociatedwithADbelongstosubgroup16SrV-BaswellasAWBto16SrV-B,BrVto16SrVI-A,CaWBto16SrII-A,CbWBto16SrI-B,CdWLto16SrXIV-A,CiFSto16SrI-C,CpYtoanovelsubgroupingroup16SrI,CtcWBto16SrI-C,CVto16SrI-B,CYto16SrI-B,DYto16SrV-B,GbRto16SrI-B,GbVto16SrI-B,JmWBto16SrI-D,JWBto16SrV-B,LiFStoanovelsubgroupingroup16SrI,MRto16SrI-B,MYto16SrI-C,PauWBto16SrI-D,PcWBto16SrV-B,PepWBto16SrI-B,PgFStoanovelsubgroupingroup16SrI,PpTto16SrVI-A,PpWBtoanovelsubgroupingroup16SrI,PYto16SrV-B,RBPto16SrI-B,RcVto16SrI-B,RpWBto16SrV-B,ScWBto16SrV-B,SFSto16SrI-B,SfWBto16SrI-C,SjFStoanovelsubgroupingroup16SrI,SiWBto16SrV-B,SVtoanovelsubgroupingroup16SrI,SWB1to16SXrII-A,SWB2toanovelsubgroupingroup16SrXII,SYto16SrV-B,VvYto16SrI-BandWjWBto16SrV-B.3.Tensampleswereselectedanddestedbytransmissionelectronmicroscope.Thesamplesarewitches’-broom-symptomaticpaulownia,alfalfa,Japanesemapleandpepper;Cynodondactylonshowingwhiteleaves;yellows-symptomaticchinaberry,peachandcherryplum;flat-stem-symptomaticPunachicoryandappledecline.UnderTEM,thephytoplasmaparticleswereobservedinthephloemtissueofhostplants,insidebothsievetubeelementsandcompanioncells.Thediameteroftheparticlesrangedfrom200-850nm,anddisassociatedwiththespeciesofhostplantsaswellassymptoms.4.ThephytoplasmasassociatedwithJujubewitches’broomandSesameflatstemweretransmittedtohealthyperiwinkles,respectively,bydodderbridges.ThephytoplasmaassociatedwithwheatbluedwarfwastransmittedtoperiwinklebyPsammotettixstriatusasphytoplasmaassociatedwithpaulowniawitches’broombyEmpoascaflavescens.Theinfectedperiwinkleplantswerethenmaintainedandproliferatedbygraftonnewhealthyperiwinkleplants.Afterinsect-feedingtransmission,theperiwinkleplantsdevelopedsymptomsinoneweektotwo,whilethetimeswere2to3monthsand2-3weeksfordodder transmissionandgraft,respectively.KEYWORDS:phytoplasma,phylogeny,transmissionelectronmicroscope,RFLP,iPhyclassifier 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1植原体基本特性..........................................................................................................11.1.1什么是植原体？...................................................................................................11.1.2植原体粒子形态...................................................................................................11.1.3植原体名称的变迁...............................................................................................21.1.4植原体病害的症状特点.......................................................................................21.1.5植原体在介体昆虫内的传播特性.......................................................................31.1.6植原体可以通过菟丝子和嫁接传播...................................................................31.1.7植原体在植物内的传播.......................................................................................41.2植原体检测和鉴定技术研究进展..............................................................................51.2.1组织学观察研究技术...........................................................................................51.2.2血清学检测技术...................................................................................................81.2.3分子检测技术........................................................................................................81.3基于多个保守基因的植原体分类现状....................................................................121.3.1基于16SrRNA基因的植原体分类系统..........................................................121.3.2基于16S-23SrRNA基因间隔区（ISR）的植原体分类系统.........................171.3.3基于tuf基因的分类系统...................................................................................171.3.4基于核糖体蛋白基因的分类系统.....................................................................171.3.5基于secY基因的分类系统...............................................................................181.3.6基于SecA基因的分类系统...............................................................................181.3.7基于其他基因的分类研究.................................................................................181.3.8多基因分类系统的前景.....................................................................................181.3.9植原体系统分类中存在的问题.........................................................................191.4植原体功能基因组和致病机理研究........................................................................201.4.1已测序的植原体基因组......................................................................................201.4.2Sec系统的功能....................................................................................................211.4.3植原体分泌蛋白预测.........................................................................................221.4.4植原体其他蛋白分泌系统..................................................................................231.4.5植原体的主要膜蛋白..........................................................................................231.4.6IDPs变异和正向选择（positiveselection）.....................................................241.4.7Amp与昆虫微丝形成复合体..............................................................................25 1.4.8Amp-微丝复合体决定昆虫介体特异性.............................................................261.4.9植原体致病机理研究进展.................................................................................271.5本研究的目的和总体思路........................................................................................271.5.1研究目的和意义.................................................................................................271.5.2研究的总体思路.................................................................................................28第二章实验部分....................................................................................................................302.1西北地区植原体病害种类鉴定.................................................................................302.1.1材料与方法.........................................................................................................302.1.2疑似植原体病害植物材料分子鉴定..................................................................352.1.3结果.....................................................................................................................372.1.4小结.....................................................................................................................562.2西北地区植原体株系多样性研究.............................................................................562.2.1材料与方法.........................................................................................................572.2.2结果与分析.........................................................................................................642.2.3小结.....................................................................................................................742.3植原体的透射电镜检测及其形态学.........................................................................742.3.1材料与方法.........................................................................................................742.3.2结果与分析.........................................................................................................752.3.3总结....................................................................................................................762.4植原体资源保存........................................................................................................772.4.1材料与方法.........................................................................................................782.4.2结果.....................................................................................................................802.4.3小结.....................................................................................................................83第三章讨论..........................................................................................................................843.1西北地区植原体病害多样性....................................................................................843.2西北地区植原体株系多样性....................................................................................843.2.1泡桐丛枝植原体.................................................................................................853.2.2枣疯植原体、酸枣丛枝植原体..........................................................................853.2.3禾本科植物植原体多样性.................................................................................853.2.4桃黄化植原体.....................................................................................................863.2.5南瓜丛枝植原体的混合侵染.............................................................................863.2.6樱属植物植原体病害的发生.............................................................................863.2.716SrVI组植原体在中国的发生..........................................................................863.2.8观赏植物植原体病害.........................................................................................863.2.9扁茎类植原体病害.............................................................................................87 3.2.10苦楝黄化和苦楝丛枝.......................................................................................873.2.11国槐丛枝、刺槐丛枝........................................................................................873.2.12葡萄黄化...........................................................................................................873.2.13仙人掌丛枝.......................................................................................................873.2.14苹果衰退和苜蓿丛枝.......................................................................................873.2.15樱桃李黄化.......................................................................................................883.2.16辣椒丛枝和五角枫丛枝...................................................................................883.3透射电子显微镜........................................................................................................883.3.1透射电镜的作用.................................................................................................883.3.2透射电镜的局限性.............................................................................................883.4植原体资源保存........................................................................................................893.4.1菟丝子传毒.........................................................................................................893.4.2昆虫传毒.............................................................................................................903.4.3嫁接传毒.............................................................................................................903.5全文结论与创新点....................................................................................................90参考文献..................................................................................................................................92附录................................................................................................................................104附录1植物样品采集信息............................................................................................104附录2未提交的24个植原体株系16SrRNA基因序列............................................113附录3未提交的12个植原体株系rp基因序列.........................................................127附录4英文缩写全称对照............................................................................................133致谢................................................................................................................................136作者简介................................................................................................................................137 第一章文献综述1第一章文献综述1.1植原体基本特性1.1.1什么是植原体？在过去许多黄化型植物病害都被认为是植物病毒造成的，这是基于这些黄化型病害具有传染性、可以由昆虫传播等特征得出来的结论（Kunkel1926,1932,1955;McCoyetal.1989;Maramorosch2008）。1967年，日本学者土居养二在表现黄化矮缩症状的桑树韧皮部发现了一种多形态的无细胞壁原核生物，首次报道这类疾病的病原物很可能是该无细胞壁的原核生物而不是病毒，该结论开辟了植物病理学的一个全新的研究领域（Doietal.1967）。1.1.2植原体粒子形态植原体粒子大小一般在800-1000nm之间，因为缺少细胞壁所以容易受到植物体内液体环境渗透压的影响，因此在植原体在形态上呈现多形态性，如球形、哑铃型、棒状、梭形等不规则形态，还有些因为处于不同的生长周期，而呈现出分裂状态、丝状体等形态(图1-1)。在植原体粒子有一层单位膜，厚度在10nm左右。植原体主要存在于被感染植物韧皮部的筛管细胞、伴胞内，在介体昆虫体内，植原体主要存在于昆虫的唾液腺组织中。植原体不能培养，基因组大小在680-1600kb之间。植原体的基因组与它们的祖先有细胞壁的梭菌属的芽孢杆菌相比大大减少。植原体缺少合成生存必需化合物的生物合成途径,因此必须从植物和昆虫等寄主体内获得这些物质（Baietal.2006）。图1-1植原体在侵染植物韧皮部横切面电镜照片（Bertaccini2007）Fig1-1.Electronmicrographsatdifferentmagnificationsofsievetubescrosssectionsshowingthepolymorphrisminshapeandindimensionsofphytoplasmas(Bertaccini2007) 2西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究1.1.3植原体名称的变迁因为在形态学上，植原体与支原体的超微结构的相似性，所以最初植原体被命名为类菌原体(MLOs)。支原体和类菌原体都是原核生物属于柔膜细菌纲，无细胞壁。但是和造成动物和人类一系列疾病的支原体比，类菌原体不可以在培养基离体培养（LeeandDavis1986），随着分子技术的发展，原核生物中类支原体的神秘身份被揭开，导致新名字的产生-植原体，2004年国际原核系统分类委员会（IRPCM2004）将其定名为新的分类单元“植原体暂定种”。1.1.4植原体病害的症状特点被植原体侵染的植物表现出一系列的症状，表明植原体对植物生长调节的平衡上有着深远的干扰。症状包括丛枝、黄化、小叶、花变叶、花器绿变等（Bertaccini2007）(图1-2)。这些微生物被叶蝉、蝉、木虱、飞虱、蜡蝉等刺吸式口器昆虫以持久性传播（WeintraubandBeanland2006）。值得一提的是，在过去的研究中丛枝、黄化、小叶、花变叶、花器绿变等症状常常被作为植物是否受到植原体侵染的症状标准，但是近几年来越来越多的研究证明植物表现出扁茎也是与植原体相关的（Lietal.2012;Lietal.2013）。图1-2植原体侵染植物后引起的常见症状从左上至右下依次是：桔梗扁茎、泡桐丛枝、苦楝黄化、红薯小叶(PhytoplasmaResourceCenter2015)、长春花花变叶(PhytoplasmaResourceCenter2015)、长春花花器绿变(PhytoplasmaResourceCenter2015)Fig1-2CommonsymptomscausedbyphytoplasmasonhostplantsFromtop-lefttobottom-right:Platycodongrandiflorumphyllody,Paulowniawitches’broom,Chinaberryyellows,Sweetpotatolittleleaves,PeriwinklephyllodyandPeriwinklevirescenceofflowers 第一章文献综述31.1.5植原体在介体昆虫内的传播特性植原体主要是由叶蝉科(叶蝉)、蜡蝉科（蜡蝉）和木虱科等刺吸式口器昆虫传播，它们在植物的韧皮部取食，感染植原体，再传播下一个取食的植物上。出于这个原因植原体的寄主范围强烈依赖于昆虫介体。植原体编码一个主要抗原蛋白，细胞表面蛋白的绝大多数是由这些抗原蛋白组成的，这些蛋白已被证明与昆虫肠道肌肉的微丝复合体互作，同时被认为对于植原体传播和侵染是非常重要的（Suzukietal.2006;Hoshietal.2007）。植原体可以在昆虫介体中或多年生寄主植物中越冬，它们对昆虫寄主可以有很多不同的影响，比如可以减少或者增加介体的适应度（Christensenetal.2005）。植原体通过口针进入昆虫介体的身体，穿过肠，被吸入血淋巴。从这里它们开始定殖唾液腺，这一过程需要几个星期。从植原体被昆虫吸食到植原体在唾液腺达到一定侵染剂量的时间被称为“潜伏期”（图1-3）（Kunkel1932）。有报道称一些植原体可以经昆虫卵传播，如葡萄带叶蝉（传播翠菊黄化病）（Daniellietal.1996;Almaetal.1997）；拟菱纹叶蝉（传播桑矮缩病）（Kawakitaetal.2000）。图1-3被吸食后植原体在昆虫介体内的侵染扩散Fig.1-3thereproductionandmovementofphytoplasmasinsideaninsectvector(http://papilio.ab.a.u-tokyo.ac.jp/planpath/phyto-genome/index.html)1.1.6植原体可以通过菟丝子和嫁接传播植原体和一些植物病毒都可以通过菟丝子传播到健康的植物上。尤其是一些传播介体不明确的植原体病害，通过菟丝子将植原体由寄主转传到实验室寄主长春花上是最常见的植原体研究手段，同时将植原体由一种寄主植物传播到其他植物上进行寄主范围研究的时候也是常用手段之一（图1-4）。植原体也具有可以嫁接传播的特性，在木本植物植原体病害的研究中该技术应用较广的。 4西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图1-4菟丝子从红醋栗传播植原体到长春花(JaroslavaandJosef2013)Fig.1-4Dodder(Cuscutacampestris)transmissionofphytoplasmasfromaninfectedredcurrantplant(Ribessp.)toperiwinkleplants(Catharanthusroseus)(JaroslavaandJosef2013)1.1.7植原体在植物内的传播植原体在植物体内的含量呈现季节性波动，一般情况下，春夏季节植原体在植物的幼嫩组织含量较高，如新生的叶和茎秆，而冬季，植物表症部分的植原体含量会明显降低，植原体会向下移动至根部。日本学者通过二叉叶蝉将洋葱黄化植原体传播到了茼蒿上面，在接种后1天，植原体从侵染点转移到植物主茎，2天后到达根部和植株顶端，在从顶端向下移动至底部叶片，在接种14天后，植原体主要存在于根部和茎韧皮部组织中，接种21天后，可以侵染整株植株（图1-5）图1-5植原体侵染植物寄主不同阶段的分布示意图（Weietal.2004）Fig.1-5Thediagramofphytoplasmadistributioninsideaplanthostindifferentphases(Weietal.2004) 第一章文献综述51.2植原体检测和鉴定技术研究进展鉴于植原体不能纯培养，特别是在木本类寄主植物上含量低的特点，发展快速、高灵敏度的检测和鉴定方法对于防治植原体病害有重要的指导意义。同时，也可以加深对植原体类病害的流行病学研究。从1967年日本学者土居养二通过电镜发现植原体开启了植物病理学一个新的研究领域开始，人们随着科学技术的进步逐渐将新的科学研究手段应用到植原体研究中，使植原体的检测研究得到了长足发展。但是由于植原体不能纯培养的特性，人们很难将其从寄主植物中分离出来，从而使每一种检测方法都受到了一定的限制。上个世纪60年代开始，对于植原体检测和鉴定技术的研究先后经历了以下几个过程：早期人们对植原体的检测和鉴定主要采用组织学结合生物学的研究方法，其中组织学方法包括：应用电子显微镜观察感病组织的超薄切片、应用光学显微镜观察经过迪纳氏染色（Dienesstain）染色的感病组织徒手切片、应用荧光显微镜观察经过DAPI荧光染色的感病组织徒手切片。生物学方法主要是观察发病植物症状特征，调查寄主范围，昆虫介体并应用四环素或者土霉素进行抗生素实验。这些研究方法耗时费力，结果也容易出现错误。80年代后血清学方法和分子杂交方法的加入，极大地推进了植原体的检测和鉴定研究。90年代，PCR技术的应用除了增加了检测的灵敏度外，也简化了检测过程和时间。本世纪，实时定量PCR、基因芯片、DNA条形码等技术在植原体检测和鉴定中也被应用，既增加了植原体检测和鉴定的准确性，又实现了样品检测的批量化，即一次可以同时检测同一病害多个样品或不同病害多个样品。1.2.1组织学观察研究技术1.2.1.1光学显微技术初期人们对于植原体病害的研究常常会借助光学显微镜的帮助，在光学显微镜下看不到植原体粒子，但是可以观察到植原体引起寄主植物的细胞病理学变化，从而了解植原体与其寄主间的互作，现在的研究中，光学显微镜常常被用于前期结果的观察，更加细微的病理变化需要借助透射或扫描电镜等更先进仪器的帮助。1.2.1.2荧光显微技术植原体没有细胞核具有明显的核区，应用甲基绿（methylgreen）和迪纳氏（Dienes’stain）染色都可以显示出植原体的核酸。应用迪纳氏染色法对感病植物茎部徒手切片进行染色会发现健康和发病植株木质部组织均为亮蓝色，感病植株韧皮部为天蓝色，健康植株无颜色（图1-6），该方法适用于植原体含量高的感病植株，快速准确。 6西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图1-6光学显微镜下观察到的迪纳氏染色长春花徒手切片（MusettiandFavali2004）A：健康植株；B：感病植株Fig.1-6HandcutsectionSofCatharanthusroseusL.withDienes’stainingunderlightmicroscope(MusettiandFavali2004)A:healthy;B:phytoplasmainfected1.2.1.3DAPI荧光染色（DAPIStain）通过DAPI对感病植物徒手切片进行染色通过荧光显微镜进行观察是对植原体研究最常用的组织学手段之一，主要是由于植物组织（如木质部细胞壁）和植物体内化学成分（如酚类）具有导致植物自身荧光的特性。DAPI具有和双链DNA结合的特性，植物自发荧光不能用于植原体检测，但是对比这些自发荧光，经过DAPI染色后的感病组织中被染色的植原体会发出弥散的荧光，健康植株中看不到这些弥散荧光，从而发现植原体存在（图1-7）。图1-7光学显微镜下的DAPI染色长春花徒手切片（MusettiandFavali2004）A：健康植株；B：感病植株Fig.1-7HandcutsectionsofCatharanthusroseusL.withDAPIstainingunderlightmicroscope(MusettiandFavali2004)A:healthy;B:phytoplasmainfected 第一章文献综述71.2.1.4透射电镜显微技术由于植原体没有细胞壁，需要承受来源于植物的渗透压而导致出现不规则形态，并且植原体粒子大小差异巨大。因此，借助于电子显微镜的高倍放大特性是鉴定植原体的最好方式。目前，在植原体检测中应用较多的电镜技术有超薄切片技术（图1-8）、免疫吸附电子显微技术、超薄切片的免疫电子显微技术（图1-9）、冷冻超薄切片技术。图1-8超薄切片中观察到的植原体（MusettiandFavali2004）左：长春花样品；右：苹果叶片样品Fig.1-8Phytoplasmasinultrathinsections（MusettiandFavali2004）Left:CatharanthusroseusL.right:anappleleaf图1-9超薄切片中观察到的免疫金标记的植原体（MusettiandFavali2004）Fig.1-9Immunogold-labelledphytoplasmasonanultra-thinsectionofCatharanthusroseusL.(MusettiandFavali2004)1.2.1.5扫描电镜技术扫描电镜技术在植原体检测中没有透射电镜技术应用那么广泛，但是也常常被用于植原体检测，Lebsky等应用扫描电镜在木瓜植株韧皮部筛管细胞中观察到短小状、分枝状及丝状等形态的植原体（图1-10）。 8西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图1-10扫描电镜在木瓜组织中观察到的植原体（Lebskyetal.2010）PV-2和AC-31，田间样品；EMP-16和AC-23，索引植物箭头指示：ph-植原体；sp-筛孔；xyl-木质部Fig.1-10Scanningelectronmicrographsofphytoplasmasinphloemtissueofsomelocalpapayalines.（Lebskyetal.2010）PV-2andAC-31,fieldsamples;EMP-16andAC-23,indexedplants.Arrowsindicate:ph-phytoplasmacells;sp-sievepores;xyl-xylemtissue1.2.2血清学检测技术上个世纪80年以来，很多科学家尝试通过提取植原体粒子的方式来制备抗血清，目前为止已经制备了十余种单克隆抗体和多克隆抗体，并应用于植原体检测中，这些抗血清已被应用于直接ELISA、间接ELISA、DAS-ELISA、斑点杂交、组织免疫印迹杂交、免疫电镜等实验中，应用这些抗血清可以用来进行寄主植物是否感染植原体鉴定、植原体寄主范围、昆虫介体的研究。应用血清学方法检测植原体主要优点是可以进行样品大量检测，操作简单，成本相对低，缺点为抗体不容易制备，制备的多克隆抗体与寄主植物抗原存在交叉反应，并且多克隆抗体的灵敏度低。1.2.3分子检测技术PCR（PolymeraseChainReaction）技术的发明并引用到植原体检测中，极大的推动了这类微生物的研究。目前为止，世界范围内鉴定到的植原体病害1000多种，几乎均是借助于该技术，PCR检测技术具有以下优点：灵敏、快速、简便，该技术的灵敏度比ELISA高至少9个数量级，比核酸杂交要高出3个数量级。目前，在植原体的PCR鉴定中，不同组或者不同亚组的16SrRNA基因、tuf基因、rp基因、secY基因等保守基因的通用引物都已经被开发出来。因此，使得植原体的检测盒鉴定变得程序化。由于植原体在很多寄主植物中含量低，所以在PCR检测过程中常常用到半巢式PCR和巢式PCR，其中在16SrRNA基因和rp基因的扩增中最为常用，这样增加了PCR的灵敏度，缺点是也引入了污染的可能性。1.2.3.1保守基因的RFLP分析基于16SrRNA测序结果进行的系统发育分析，可以完成植原体组的分类。但是亚组的分类就需要引入更多的分子证据，如Tuf基因、rp基因、SecY基因等保守基因。 第一章文献综述9但是基于这些基因的系统发育分析也只是能够明确大体的分类地位，明确的分类地位确定就需要在参考植原体存在的情况下，应用限制性酶切片段多态性（RFLP）来区分，尤其对于新的分类单元和亚组更是需要进行RFLP分析来确认。虚拟RFLP的开发大大节省了操作时间和减低了成本，但是对于有差异的多肽位点实际的RFLP分析还是必不可少的。1.2.3.2T-RFLP技术植原体传统的诊断是基于16SrRNA的通用引物。然而对这一区域的扩增经常会扩增到近缘物种的片段，从而产生假阳性。末端限制性片段多态分析（T-RFLP）是1997年发明的一向技术，该技术是基于对DNA限制性酶切位点的位置来描述微生物菌群。它包括以下步骤：首先利用含有荧光标签引物来进行PCR扩增，随后一种或者多种限制性内切酶切割，然后利用高分辨率凝胶电泳分离片段，随后检测带荧光标签的片段产物。这种产物叫做末端限制性片段（TRFs）。在修改过后的T-RFLPs方法中，每个TRFs可以代表一个单一不同的16Sr组。这样检测结果可以跟标准的不同组的TRFs做比对，从而得出植原体所在的组。为了进一步排除假阳性，同样的方法可以用于23SrRNA基因（图1-11）。图1-11T-RFLP操作流程图（HodgettsandDickinson2013）Fig.1-11Schematicillustrationofthevariousstepsinconductingterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism(T-RFLP)onplantsamples(HodgettsandDickinson2013)1.2.3.3实时荧光定量PCR很多传统的PCR都涉及到巢氏PCR，通过巢氏PCR提高其检测的灵敏性。然而，这样的方法必然增加污染和错配的概率。实时荧光定量PCR已经被证明在灵敏性上等于甚至是优于巢氏PCR(Christensenetal.,2004)。同时，实时荧光定量PCR对污染有一定的忍受度。在过去，通用的检测植原体的实时荧光定量PCR很少被报道（Christensen 10西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究etal.2004;Hodgettsetal.2009），尽管有一些实时荧光定量PCR可以检测某些组的植原体。(1)荧光染料法实时荧光定量PCR是基于测量在扩增过程中的荧光强度。目前常用的有两种：荧光染料和荧光探针。SYBRGreen®是最常用的荧光染料，可以和DNA双链结合（图1-12），其缺点是不能特异的结合到扩增产物中，进而导致假阳性结果。图1-12荧光染料SYBRGreenI结合DNA双链示意图Fig.1-12AdiagramofcombinationofSYBRGreenIandDNAhelix(http://www.biov.cn;http://www.daangene.com)(2)荧光探针法荧光探针，例如TaqMan探针（图1-13）可以保证更高的特异性，它不仅可以与引物杂交，还可以与产物杂交。植原体在不同的组织和季节分布上有很大的差异，定量分析植原体也就很重要。此外，定量分析植原体也可以有效的寻找抗植原体的物质材料。从另一方面来说，定量分析植原体在研究植原体，鉴定和定量检测植原体都是很有意义的。在进行植原体的定量分析时，已知浓度的标准质粒是必须的。植原体的定量分析检测的程序基本上基于Christensen等（2004）确定的方法。该方法已经被用于定量检测一品红不同器官或组织的植原体，也被证明在检测其他植物是也是可行的。一些程序应用Hodgetts等（2009）设计的引物，但是这些引物不能扩增16SrRNA基因，建立的标准曲线不能通用，因此该方法还需要不断的提高。图1-13TaqMan探针结构（蔡红2007）Fig.1-13StructureofTaqManprobe(Cai2007)1.2.3.4基因芯片技术目前基于16SrRNA基因的植原体鉴定主要通过巢式PCR，大部分采用通用引物 第一章文献综述11P1/P7（DengandHiruki1991;Smartetal.1996）和R16F2n/R16R2（GundersenandLee1996），并结合限制性片段长度多态性（RFLP）和高分辨率凝胶电泳（Leeetal.1998）。这一方法较为繁琐，需要专业技术，并且需要许多参考株系。DNA微阵列技术是鉴定、区分包括植物病原物在内的微生物的有力工具，该方法可以同时鉴定多种生物。例如，微阵列技术可以鉴定线虫（Françoisetal.2006）、真菌（Nicolaisenetal.2005;Lievensetal.2006）、细菌（Pelludatetal.2009;Fessehaieetal.2003）、植原体（NicolaisenandBertaccini2007）和病毒（Boonhametal.2007）。建立微阵列检测体系的关键是探针设计.短的探针（15-25nt）检测灵敏度较低，但是对微小的序列差异有着更好的区分.较长的探针（>50nt）有更高的检测灵敏度但是难以区分有着微小差异的序列.理想上，阵列上的所有探针都有着相同的退火温度。目前针对植原体的DNA微阵列检测主要基于Nicolaisen和Bertaccini（2007）的方法，该方法能用短的DNA探针检测大部分植原体。但是该方法中探针数量较少，为了提高检测的可靠性，还可以根据不同组的植原体设计特异性的检测探针。1.2.3.5DNA条形码技术DNA条形码技术是一种用短的DNA序列进行物种鉴定的技术（Hebertetal.2004;Hebertetal.2003_ENREF_13）。简单的说，就是从待鉴定的生物中提取DNA，用一系列通用引物进行扩增、测序，最终将序列与标准数据库中的序列进行比较从而确定样品的分类地位。这一方法基于以下几个假设：（1）DNA条码在所有物种中均存在；（2）通过一套通用引物能在所有物种中扩增出DNA条码区域；（3）不同物种间的序列差异要远大于同一物种不同个体间的序列差异；Montanoetal.条码区域相对较短以利于快速测序。该方法的主要优势是不需要形态学特征来进行鉴定，DNA能从不同来源的样品中提取，包括环境样品和保藏样品，且方法是通用的。该方法的局限在于有可能因操作污染导致鉴定错误，另外对提取的样品DNA浓度也有要求。利用DNA条形码检测植原体需要注意的是：首先，植原体DNA在植物DNA背景中所占比例很小；其次，植原体常常与其它细菌共同存在，所以所用的引物必须不能扩增植物DNA和其它无关细菌的DNA。在许多被测试的区域中，基于tuf基因和16SrRNA基因的两个条形码最终被证明可以克服以上困难，被应用于植原体鉴定。目前应用DNA条形码鉴定植原体的流程为：从疑似感染植原体的植物中提取DNA，巢式PCR扩增DNA条形码，测序，序列分析和组装，网络在线鉴定。当样品中存在混合侵染时，必须通过分子克隆来分离扩增序列，再进行测序和分析，DNA条形码技术操作基本流程（图1-14）。 12西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图1-14植原体鉴定DNA条形码技术操作流程图（Makarovaetal.2013）Fig.1-14PhytoplasmaidentificationDNAbarcodingflowchart(Makarovaetal.2013)1.3基于多个保守基因的植原体分类现状自从40多年前植原体被发现，人们一直在尝试培养植原体，但目前尚未成功。所以传统的用于原核生物的研究方法对于植原体都不实用，也因此植原体的分类地位很难确定。现代的柔膜菌纲系统分类采用了多项分类系统，该系统是过去20年间建立起来的，其基于表型的、基因型的、系统发育学的标准对柔膜菌纲成员进行分类（Weisburgetal.1989;Murrayetal.1990;Vandammeetal.1996）。基于对16SrRNA和其他保守基因的系统发育学研究，将植原体归入到柔膜菌纲（LimandSears1989;Nambaetal.1993;Gundersenetal.1994;Seemülleretal.1998;Leeetal.2000;Leeetal.2006a;Zhaoetal.2005;Martinietal.2007;Hodgettsetal.2008）。由于缺乏表型标准，不可避免地，植原体的分类将在极大程度上依赖于分子特征和系统发育学。过去的20年的研究已经证明，在植原体的鉴定中，以分子为基础的分析比生物学标准更准确、可靠（Leeetal.2000）。PCR的发明应用使植原体的检测和鉴定更为灵敏（Leeetal.2000）。1.3.1基于16SrRNA基因的植原体分类系统高度保守的16SrRNA序列是植原体分类的主要分子依据。根据对16SrDNA序列的RFLP分析，已鉴定到19个16Sr组；根据虚拟的RFLP分析，鉴定出30个组（Leeetal.1998,2000;Weietal.2007;Mitrovićetal.2011）（表1-1）。根据这种方法，可以进一步划分出16Sr亚组。每个组至少代表一个植原体种（Gundersenetal.1994）。目前，植原体种的划分主要是基于植原体16SrDNA序列的差异，规定2.5%的差异作为新种出现的阀值（IRPCM2004）。由于16SrRNA基因的保守性，这个准则可能无法区分许多明 第一章文献综述13显的生态或生物株系，而其中一些株系是可以作为独立分类单元的。其他一些独特的生物学特征，比如昆虫介体、植物寄主，和分子标准也应当用于物种的划分。过去十年间，基于16SrRNA基因序列的流行病学研究表明在不同地理区域、某一作物的不同栽培种上，许多是关系很近的植原体引起了相似的病害。了解各种植原体的相互关系以及他们独特的生态分布，对于病害控制是很重要的。通常仅依据16SrRNA基因序列无法区分这些相近的植原体株系，因此需要应用其他的标记基因。过去十年间，已经有几个其他保守基因或特异的基因组DNA片段作为补充的分子标记区分很相近的植原体株系。表1-1基于16SrRNA基因的植原体组分类现状Table1-1Taxonomicgroupingsofphytoplasmasbasedon16SrRNAgenes16Sr组暂定种代表株系登录号地理分布16SrgroupsCandidatus(TypestrainGenBankGeographicCa.)speciesAccessiondistributionnumberofthegroupI-ACa.PhytoplasmaasterisAsteryellowsNC_007716NorthAmerica,witches’broomEuropeI-BCa.PhytoplasmaasterisOnionyellowsNC_005303WorldwideI-CCa.PhytoplasmaasterisCloverphyllodyAF222065NorthAmerica,EuropeI-DCa.PhytoplasmaasterisPaulowniawitches’AY265206AsiabroomI-ECa.PhytoplasmaasterisBlueberrystuntAY265213NorthAmericaI-FCa.PhytoplasmaasterisApricotchloroticAY265211SpainleafrollII-APeanutwitches’L33765AsiabroomII-BCa.PhytoplasmaLimewitches’U15442ArabianpeninsulaaurantifoliabroomII-CCactuswitches’AJ293216Asia,AfricabroomII-DCa.PhytoplasmaPapayayellowY10097Australiaaustralasiae*crinkleIII-ACa.PhytoplasmapruniWesternXdiseaseL04682NorthAmerica 14西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究*III-BCloveryellowedgeAF189288America,Asia,EuropeIV-ACa.PhytoplasmaCoconutlethalAF498307Florida,Caribbeanpalmae*yellowingIV-BCa.PhytoplasmaPhytoplasmasp.AF500334Mexicopalmae*LfY5(PE65)-OaxacaIV-DCa.PhytoplasmaCarludovicaAF237615Mexicopalmae*palmataleafyellowingV-ACa.PhytoplasmaulmiElmyellowsAY197655NorthAmerica,EuropeV-BCa.PhytoplasmaJujubewitches’AB052876AsiaziziphibroomV-CCa.Phytoplasmavitis*AlderyellowsAY197642EuropeV-GJujubewitches’AB052879AsiabroomrelatedVI-ACa.PhytoplasmatrifoliiCloverproliferationAY390261NorthAmerica,AsiaVII-ACa.PhytoplasmaAshyellowsAF092209NorthAmericafraxiniVIII-ACa.PhytoplasmaluffaeLoofahwitches’AF353090Taiwan*broomIX-APigeon-peawitches’AF248957AmericabroomIX-DCa.PhytoplasmaAlmondwitches’AF515636MiddleEastphoeniciumbroomX-ACa.PhytoplasmamaliAppleproliferationAJ542541EuropeX-CCa.PhytoplasmapyriPeardeclineAJ542543EuropeX-DCa.PhytoplasmaspartiiSpartiumX92869Europewitches’-broomX-FCa.PhytoplasmaEuropeanstonefruitAJ542544EuropeprunorumyellowsXI-ACa.PhytoplasmaRiceyellowdwarfAB052873Asia,Africa,Europe 第一章文献综述15oryzaeXII-ACa.PhytoplasmasolaniStolburAJ964960Europe*XII-BCa.PhytoplasmaAustralianL76865AustralasiaaustraliensegrapevineyellowsXII-CStrawberrylethalAJ243045AustraliayellowsXII-DCa.PhytoplasmaJapanesehydrangeaAB010425JapanjaponicumphyllodyXII-ECa.PhytoplasmaStrawberryyellowsDQ086423EuropefragariaeXIII-AMexicanperiwinkleAF248960Mexico,FloridavirescenceXIV-ACa.PhytoplasmaBermudagrassAJ550984Asia,AfricacynodontiswhiteleafXV-ACa.PhytoplasmaHibiscuswitches’AF147708BrazilbrasiliensebroomXVI-ACa.PhytoplasmaSugarcaneyellowAY725228CubagraminisleafXVII-ACa.PhytoplasmaPapayabunchytopAY725234CubacaricaeXVIII-ACa.PhytoplasmaPotatopurpletopDQ174122NorthAmericaamericanumwiltXIX-ACa.PhytoplasmaChestnutwitches’AB054986JapancastanaebroomXX-ACa.PhytoplasmaBuckthornwitches’X76431GermanyrhamnibroomXXI-ACa.PhytoplasmapiniPineshootAJ632155SpainproliferationXXII-ACa.PhytoplasmaCoconutlethalY14175WestAfrica,*cocosnigeriaedeclineMozambiqueXXIII-ABucklandvalleyAY083605Australiagrapevine 16西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究yellowsXXIV-ASorghumbunchyAF509322AustraliashootXXV-AWeepingteawitches’AF521672AustraliabroomXXVI-ASugarcaneAJ539179MauritiusphytoplasmaD3T1XXVII-ASugarcaneAJ539180MauritiusphytoplasmaD3T2XXVIII-ADerbidphytoplasmaAY744945CubaXXIX-A*Ca.PhytoplasmaAllocasuarinaAY135523AustraliaallocasuarinaemuellerianaphytoplasmaXXX-A*Ca.PhytoplasmaTanzanianlethalX80117Tanzaniacocostanzaniae*decline目前16SrRNA基因在植原体分类中应用最为广泛，适合应用于植原体的初步分类。根据植原体16SrRNA基因、16-23S基因间隔区和部分的23SrRNA基因序列，设计了通用引物对，该引物对可以从各种植物和昆虫寄主中，扩增到近全长的16SrRNA基因序列（Leeetal.1993;Nambaetal.1993;Schneideretal.1993;GundersenandLee1996;Smartetal.1996）。Schneideretal.（1993）和Leeetal.（1993）基于16SrRNA基因的RFLP分析对植原体进行分类，Leeetal.（1993,1998,2000）构建了植原体的17种限制性内切酶的图谱。根据RFLP图谱相似性系数划分了主要的植原体组（Leeetal.1998），两个不同组的相似性系数是90%或者更低。某一组内亚组的划分主要是基于1.2kb片段上的限制性位点，如果一个未知的植原体株系有一个或者更多的限制性位点不同于已知成员，那么该株系可被划分为新的亚组。限制性图谱会被定期更新（Leeetal.1998;Leeetal.2000;Leeetal.2006b;Montanoetal.2001;Arochaetal.2005;Al-Saadyetal.2008;Zhaoetal.2009）。目前包括19个植原体组和大约50个亚组。这些组的划分情况和系统发育树（根据16SrRNA基因序列构建）呈现出的结构近乎等同。每个组至少代表一个植原体种（Gundersenetal.1994）。最近，Weietal.（2007,2008）和Zhaoetal.（2009）基于电脑模拟的RFLP，对大量已报道发表的植原体16SrRNA基因序列进行了分析，根据所得的结构，对RFLP图谱进行了更新。目前，RFLP图谱中包含29个组和89个 第一章文献综述17亚组，每个组都有不同的RFLP图谱，这些图谱为植原体参照株系提供了最广泛地图谱参照。通过与这些图谱进行比较，可以根据对植原体16SrRNA基因的实际或虚拟RFLP图谱对未知的植原体进行鉴定。当然，虚拟RFLP必须要知道16SrRNA基因序列。在实践中，如果有大量的样品或者序列未知的情况下，可以根据实际的RFLP酶切图谱进行初步的分类。更新后的RFLP图谱是最广泛地植原体分类系统，其为植原体新株系的快速鉴定提供了可靠的分子标记。基于16SrRNA基因对植原体进行分类，其优点是16SrRNA基因非常保守，能够设计通用引物进行扩增，GenBank数据库中的大量序列，也为系统发育分析提供了可能。不过也因为16SrRNA基因太保守，以至其不能很好的区分非常相近但又有明显差异的植原体株系。很显然，一些植原体的亚组中包含着多于一种重要的植原体株系类型。1.3.2基于16S-23SrRNA基因间隔区（ISR）的植原体分类系统植原体16S-23SrRNA基因间隔区（大约232bp），包含编码一段序列，其负责编码高度保守的tRNAIle。不过，tDNAIle和16SrDNA、23SrDNA之间的序列变异都非常大。ISR是区分植原体组和亚组的重要标记。总之，在区分明显不同的植原体株系时，ISR堪比16SrRNA基因序列（Smartetal.1996）。一方面，由于ISR序列太短、信息有限，所以不能用于区分所有的16Sr亚组。另一方面，研究发现在一个给定的亚组中，将16SrRNA基因和ISR结合起来对植原体进行分类，是一个非常有用的工具（Marconeetal.2000;Padovanetal.2000;Andersenetal.2006;Griffithsetal.1999）。1.3.3基于tuf基因的分类系统Tuf基因是另一个植原体保守基因，其编码延伸因子EF-Tu，也被用于植原体区分和分类。1997年Schneideretal.设计了扩增大部分植原体组tuf基因的引物。发现，像16SrRNA基因一样，tuf基因也可以作为植原体组划分的分子标记。翠菊黄化、桃X病及僵顶组的植原体，其tuf基因相似性在87.8到97.0%之间。通过RFLP分析可以区分植原体的组和亚组。对于不同组植原体的区分能力，tuf基因要稍弱于16SrRNA基因（Schneideretal.1997;Marconeetal.2000）。但是在一些研究中发现，tuf基因可以用于区分不同的生态株系或者同一16Sr亚组的不同株系（LangerandMaixner2004）。例如，根据tuf基因鉴定出了一些16XII-A和16XII-B亚组的株系（StretenandGibb2005;Andersenetal.2006;Pacificoetal.2007;Rioloetal.2007;Iritietal.2008）。1.3.4基于核糖体蛋白基因的分类系统核糖体蛋白（rp）基因较16SrRNA基因的变异大，能够提供更多地系统发育信息，这一点无疑增强了对植原体分类的能力。在早期的研究16SrI和16SrV组植原体时，发现根据rp基因区分亚组时不仅能够获得和16SrRNA基因一致的结果，还能区分一些16SrRNA基因未能区分的株系（Martinietal.2002;Leeetal.2004b）。例如，玉米丛矮（MBS）植原体属于16SrI-B亚组，与16Sr组的其他亚组不同，16SrI-B亚组植物寄主 18西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究范围较窄、昆虫介体也不同，其形成一个明显的rp亚组。相似地，根据几个关键的限制性内切酶，16SrV-C组植原体可以被进一步划分到不同的rp亚组（Martinietal.2002;Leeetal.2004b）。最近，Martinietal.（2007）通过分析12个16Sr组46个植原体株系的rplV（rpl22）和rpsC（rps3）基因序列，构建了系统发育树。该进化树与16SrRNA基因序列进化树是一致的，但是显示出更多地亚枝。比如，根据rp基因能够很容易地区分3个暂定种“Ca.Phytoplasmamali”“Ca.Phytoplasmapyri”和“Ca.Phytoplasmaprunorum”，其16SrDNA序列的相似性在98.9–99.1%之间，rp基因相似性在94.3–94.6%之间。两个给定的16S植原体组，其16SrDNA序列的平均序列相似性为85.0到96.9%，而其rp基因序列的相似性仅50.4到83.5%。这种较大的变异使rp基因更适合于区分植原体株系。1.3.5基于secY基因的分类系统SecY基因编码蛋白移位酶亚基，是另外一个可以用于区分植原体株系的分子标记。SecY基因的可变性和rp基因很相似。任何两个给定16Sr植原体组的secY基因相似性在57.4到76.0%之间（Leeetal.unpublished）。在16SrI和16SrV组，根据secY基因得到的亚组和rp基因基本一致（Leeetal.2004b;Leeetal.2004a;Leeetal.2006a;Martinietal.2007）。不过由于secY基因能提供更多地信息，所以比rp基因稍微好一些。对大多数植原体组和代表株系的完整描述正在进行（Leeetal.unpublished）。secY基因也是一个很好地分子标记。1.3.6基于SecA基因的分类系统另一个蛋白转移酶亚基编码基因，secA基因也被用于植原体的分类（Hodgettsetal.2008）。通过PCR获取了12个16Sr组的约480bp部分secA基因片段，这些序列的两两之间的一致性在69.7到84.4%。SecA基因对植原体的辨识能力与secY基因和rp基因相似。1.3.7基于其他基因的分类研究nusA（Shaoetal.2006）、叶酸基因（folP和folk）（Davisetal.2003）、dnaB、groEL在鉴定16SrI和16SrXII组植原体时起到很好地作用。几个看家基因，如dnaA、polC、dnaE也是不错的候选基因。这些基因的变异性与secY基因和rp基因相似。1.3.8多基因分类系统的前景植原体是昆虫传播的植物病原物，其能够在植物和昆虫寄主中繁殖（Leeetal.2000）。因为寄主植物、昆虫介体的敏感性会随植原体株系（甚至同亚组的不同株系）的变化而变化，所以随着时间推移，有寄主植物和（或）昆虫介体造成的选择压力促进了某一植原体种群或有差异的株系的进化或分离。此外，由于寄主植物和昆虫介体地理分布不同，地理环境的差异或许也能加速该过程。植原体、植物寄主和昆虫介体之间的 第一章文献综述19互作造成了植原体生态系统的复杂性。这些因生态环境产生的植原体通常具有独特的生物学特点，比如寄主植物特异性、昆虫介体特异性及症状特异性。一方面，某一病害（如葡萄黄化）与多种相关的植原体种群相关并不常见（Angelinietal.2001;Leyva-Lópezetal.2002;Martinietal.2002;LangerandMaixner2004;Leeetal.2006a;BottiandBertaccini2007）某些种群可能在某一栽培种或某一地理区域占据主导地位。另一方面，相关的的株系（e.g.‘Ca.Phytoplasmaasteris’strains）能够引起不同的病害，造成不同的症状（Leeetal.2004a）。对于流行病学研究，弄清楚与不同病害相关的生态株系是很必要的。基于16SrRNA基因的分类系统不能很好的区分非常相近的株系，这一缺陷导致了在常规植原体分类中对其他分子标记的需求。这些分子标记也显示出他们在植原体分类中的价值。这种基于多基因的植原体分类系统为植原体种和株系的鉴定提供了很多好的标准。对于植原体种的区分，InternationalResearchProgramforComparativeMycoplasmology,Phytoplasma/SpiroplasmaWorkingTeam（IRPCM2004）规定以16SrRNA基因序列一致性为基准，其阀值为97.5%。对于一致性>97.5%的株系，没有具体的再分标准，但是<97.5%，是划分新种、新株系的必要条件。另外，提到的几个其他的分子标记，则可作为标准的系统发育参数，用于区分相近的但又明显有差异的株系。已经证明，将16SrRNA基因和其他一个或多个分子标记结合，能够很好地区分两个很相近的株系，如16SrRNA和secY、16SrRNA和rp或者16SrRNA和secA（Leeetal.2004b;Leeetal.2004a;Leeetal.2006a;Martinietal.2007;Hodgettsetal.2008）。16SrRNA结合ISR也能用于区分一些很相近的株系，而这些株系单独根据16SrRNA基因是无法区分的（LangerandMaixner2004）。由于这些标记基因的变异性，他们可以很好的区分很近的株系、或某一株系的变体。如同16SrRNA基因，也可以决定出这些分子标记的阀值。最近，secY、map和uvrB-degV基因被用于区分三个flavescencedorée植原体和感染葡萄藤、桤木的16SrV组植原体（Arnaudetal.2007）。1.3.9植原体系统分类中存在的问题分子工具，比如单克隆抗体、DNA探针、PCR检测，很大程度上取代了传统的基于生物学特征的植原体研究方式，并且极大地方便了植原体病害的诊断，促进了植原体的鉴定研究。在过去15年间，基于植原体的16SrRNA基因序列，已经鉴定出超过1500个植原体株系。基于GenBank中16SrRNA基因序列的系统发育学研究表明，植原体的具有共同的祖先，其与Acholeplasmaspp.关系密切，而且在自然界中具有极大的多样性（Weietal.2007;Weietal.2008;Zhaoetal.2009）。由于植原体无法培养，且没有可用的表型学标准，因此，植原体的分类学研究不得不依赖于其分子特征和系统发育学，目前主要是基于16SrRNA基因。目前采用Murray和Schleifer（1994）提出的用于不可培养微生物的分类学系统。目前为止，根据IRPCM（2004）的标准，已有28个暂定种被命名。不过，最用能够取代“Candidatus(Ca.)Phytoplasma”，对植原体进行正式的命名， 20西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究是国际植原体工作组的最终目标。系统发育学研究的进展以及大量基因组测序工作的完成，使人们对基因组结构、基因组多样性的决定因素、细菌的表型特征都有了更深入的了解。也因而使得原核生物的现代分类学前景发生了变化（Woeseetal.1980;Woese1987,2000;Murrayetal.1990;Vandammeetal.1996;Stackebrandtetal.2002;Stackebrandt2007;Brownetal.2007）。人们一致认为，应用保守的16SrRNA基因作为系统发育学研究的参数，对细菌进行分类，取代了传统的复杂困难的基于DNA-DNA同源性的方法（http://www.bergeys.org/;Brownetal.2007）。基于目前适用的16SrRNA基因序列，Stackebrandt和Goebel（1994）发现，当细菌的序列一致性<97%时，基因组DNA非重新组合的可能性>60%，并且与DNA-DNA杂交的方法无关。这一发现表明，一致性97%可以作为划分细菌新种的阀值，从而替代传统的通过DNA-DNA杂交评估细菌基因组同源性。随着DNA测序技术的发展，包括植原体在内的大量细菌基因组序列将被获得。通过比较基因组学的研究，与生化、表型、生物特征相关的不同水平的分子标记将被开发，用于属、种、株系的界定描述。预计在将来，分子方法将是细菌检测和鉴定的主要方法。因此，基于分子方法对细菌种类的界定和描述，将会形成一种进化上有效的、不模糊的标准，从而有别于传统的基于主观表型描述的标注。在命名前必须获取细菌绝对纯净的培养物，也变得没有意义，因为分子方法仅仅基于细菌的基因组序列，而不需要培养物。基于分子系统，最终建立正式的植原体系统分类或许是可行的，在细菌分类中使用的97%一致性阀值，也应当用于不可培养的植原体。许多植原体暂定种，尤其是那些基因组序列已经清楚的植原体，已经被命名为正式的种。已有证据表明以97%为阀值筛选新的种，或许会将许多不符合标准的株系排除在外，但同样也保证了被命名的种独特的生物学特性（Foxetal.1992）。在细菌分类时，依据多种系统发育学参数或许能够帮助克服只用16SrRNA基因参数的缺陷。选择的多个分子标记也将最终在株系、种或更高水平上区分界定植原体。就当前而言，对于细菌，正式的基于分子的分类学系统尚未确立，但对于不可培养的植原体，该系统却不可避免的成为焦点。1.4植原体功能基因组和致病机理研究1.4.1已测序的植原体基因组由于植原体不能体外培养，所以很难分析其侵染系统或致毒机制。不过近年来测序技术的发展，使我们能够获得不可培养微生物的全基因组序列。目前为止，已测定了五个植原体全基因组序列（Baietal.2006;Andersenetal.2013;Oshimaetal.2004;Kubeetal.2008;Tran-Nguyenetal.2008）（表1-2）。在植原体的基因组中大约有500-840个基因，其中约40-50%编码假蛋白。植物病原细菌通常拥有不同类型的致病基因（JonesandDangl2006;Abramovitchetal.2006）_ENREF_1，这些致病基因在染色体上形成“致病岛”。一种III型分泌系统对于许多病原细菌是必须的，该系统可以将效应蛋白转移到寄主细 第一章文献综述21胞内（Grantetal.2006）。然而，植原体的基因组中没有任何已知的致病基因的同源基因，表明通植原体与植物之间以不同的机制产生互作（Oshimaetal.2002;Oshimaetal.2004;Oshimaetal.2007）。植原体没有细胞壁且严格寄生于寄主细胞内，因此植原体的膜蛋白或分泌蛋白可能直接作用于植物或昆虫介体的细胞质（Hogenhoutetal.2008）。因此，了解植原体的膜蛋白或分泌蛋白对于理解植原体与寄主互作很关键。表1-2五个植原体全基因组的基本特性Table1-2Generalfeaturesofthefivecompletelysequencedphytoplasmagenomes暂定种asterisasterisaustralienseaustraliensemali‘Ca.Phytoplasma’speciesasterisasterisaustralienseaustraliensemali株系OY-MAY-WBPAaSLYATStrainOY-MAY-WBPAaSLYATChromosomesize(kb)860631706569879324959779601943ChromosomeorganisationCircularCircularCircularCircularLinearG+Ccontent(%)2827272721.4Protein-codingregions(%)7372747878.9Protein-codinggeneswithassigned446450502528338functionConservedhypotheticalgenes5114921424972Hypotheticalgenes2577212334987Totalno.ofgenes7546718391126497rRNAoperons22222tRNAgenes3231353532ExtrachromosomalDNAs24110GenBankaccessionno.AP006628CP000061AM42201CP002548CU4694684数据来源于Oshimaetal.(2004)、Baietal.(2006)、Kubeetal.(2008)、Tran-Nguyenetal.(2008)及Andersenetal.(2013).1.4.2Sec系统的功能细菌至少有5个独立的蛋白输出系统（Economou1999）。在E.coli中，这些系统分泌不同的蛋白，比如毒性蛋白、粘着蛋白、水解酶。在这些系统中，仅Sec系统对细胞是必须的。在Bacillussubtilis中，Sec途径是四个运输途径中最重要的（Tjalsmaetal.2000）。在E.coli中，其Sec蛋白易位系统了解最为清楚，由11个蛋白和一种RNA组成（Economou1999）。这些蛋白中，SecY、SecE、SecG和SecA组成易位复合体在质膜 22西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究上起输出作用。对于E.coli，SecA、SecY和SecE对蛋白转运和细胞生活力是必需的（Economou1999）Economou1999，在体外培养的条件下，可以通过该三种蛋白获得蛋白易位能力（Akimaruetal.1991），而SecG是不必要的。SecYEG异质复合体形成跨膜孔。分泌蛋白N端具有信号肽。当一个分泌蛋白表达时，信号识别小体SRP能够识别信号肽。在E.coli中，SRP由Ffh蛋白元件和4.5SRNA组成。SRP将特定蛋白锚定到细胞膜受体FtsY。SecB是Sec系统的伴侣蛋白，主要识别分泌蛋白上的一些模体，延缓其折叠。SecA能结合分子伴侣锚定的蛋白，将其转运到SecYEG复合孔。SecA通过ATP酶活性以渐进式促进蛋白分泌。在‘Candidatus(Ca.)Phytoplasmaasteris’OY株系中，SecA、SecY和SecE蛋白是Sec系统的必要元件（Economou1999），其编码基因已经确定（Kakizawaetal.2001;Kakizawaetal.2004），并且在植原体侵染的植物中证实了SecA蛋白的表达（Kakizawaetal.2001;Weietal.2004）。在AY-WB株系中，这三个基因也被确定（Baietal.2006），并且从几个植原体中克隆了SecY基因（Leeetal.2006a）。这些结果表明Sec系统在植原体中的存在。在植原体中发现的一种免疫显性膜蛋白Amp在其N端具有Sec系统的信号序列，该信号序列在OY株系中是切割的（Kakizawaetal.2004），表明Sec系统在植原体中起作用。1.4.3植原体分泌蛋白预测植原体的膜蛋白或者分泌蛋白可能直接作用于寄主植物或昆虫的细胞质。因此，推测植原体的粘着蛋白（adhesins）、蛋白酶和水解酶能够通过Sec途径从植原体的细胞质转运到植原体细胞膜或寄主的细胞质，而这些被转运的蛋白可能影响植原体的致病性。因此，鉴定植原体基因组编码的分泌蛋白对于了解植原体-寄主互作很有必要。一般有Sec系统分泌的蛋白在其N端会有信号肽。这些信号肽包含3个部分：拥有至少一个精或赖氨酸、带正电的N端结构域；一个疏水的核心结构域，形成a螺旋，穿过细胞内膜；一个A-X-A保守序列作为信号肽酶I（SPaseI）裂解位点，在该位点的两个丙氨酸残基可以被小的、不带电的残基取代，比如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等（Tjalsmaetal.2000）。所预测的OYAmp与一般的Sec系统信号肽非常相似，OYAmp似乎是由植原体和E.coli的Sec系统分泌并伴随信号序列加工。这一点表明，植原体和E.coli在信号序列识别机制中的共性（Kakizawaetal.2004）。进而表明，预测系统，如SignalP（Nielsenetal.1997）或PSORT（NakaiandKanehisa1991）可以识别植原体的信号肽，故而能够用于植原体分泌蛋白的鉴定。不论是细胞膜锚定蛋白还是分泌到寄主细胞质的蛋白，这两种植原体分泌蛋白都被认为能够直接和寄主产生互作，从而扮演重要角色。因此，鉴定植原体分泌蛋白、明确其功能对于阐述植原体-寄主互作很关键。目前已有 第一章文献综述23报道：‘Ca.Phytoplasmaasteris’AY-WB株系分泌一种蛋白以植物细胞核仁为靶标，因此该蛋白可能与植原体毒性有关（Baietal.2009）。1.4.4植原体其他蛋白分泌系统动植物上的许多革兰氏阴性病原物具有III型分泌系统（T3SS），能够将细菌的毒性“效应因子”蛋白注入寄主细胞（CornelisandVanGijsegem2000）。T3SS和鞭毛在进化上是相关的，他们具有非常相似的基础结构。然而，T3SS和鞭毛都仅存在于革兰氏阴性细菌。植原体属于革兰氏阳性细菌，因此并没有发现T3SS的存在。细菌IV型分泌系统（T4SS）是动植物病原菌的另一种重要分泌系统。T4SS构成了一个很大的易位系统家族，他们具有纤毛状结构，能够调节DNA和蛋白质从包膜转运到细菌或真核细胞中，一般而言，该过程需要细胞间的直接接触（Grohmannetal.2003）。革兰氏阳性和阴性细菌的耦合转运系统中，有几个序列和T4SS的蛋白非常相似；因此，该耦合转运系统和T4SS是同源的（Grohmannetal.2003）。因此，认为T4SS广泛分布于革兰氏阳性和阴性细菌中（ChristieandCascales2005）。然而，植原体没有T4SS和菌毛。在植原体基因组中没有T4SS和菌毛组成蛋白基因的同源序列，电镜观察也没有发现鞭毛类似结构。这一点与螺原体是不同的，螺原体有鞭毛类似结构（Ammaretal.2004）。YidC参与新合成的膜蛋白与膜的融合过程。在Sec系统组成物的纯化过程中发现了YidC（Scottietal.2000）；YidC可能与Sec易位酶关联，将依赖于Sec系统的底物蛋白的跨膜区转运到疏水的双分子层（Urbanusetal.2001）。然而，最近证明仅YidC也可以促进跨膜蛋白插入双分子层，表明YidC能够独立于Sec系统其作用。YidC仅能使膜蛋白插入膜脂层，不能完成输出蛋白的易位（DalbeyandKuhn2000;Samuelsonetal.2000）。YidC可能的功能是：识别膜蛋白疏水区，催化该区转入膜疏水双分子层（Sereketal.2004）。在植原体OY、AYWB基因组中，有一个基因编码YidC（Oshimaetal.2004;Baietal.2006）；因此，植原体可能有该YidC融合系统。因为E.coli中，YidC具有重要作用（Samuelsonetal.2000），所以很可能其在植原体中也有重要作用。1.4.5植原体的主要膜蛋白之前的研究表明，在大多数植原体中有一类膜蛋白占了总膜蛋白很大一部分比例，比如免疫膜蛋白（IDPs）（ShenandLin1993）。免疫胶体金标记电镜研究证明IDP位于细胞膜外层（Milneetal.1995）。柔膜菌纲的膜蛋白在细菌和寄主细胞膜的结合过程中可能具有重要作用，因此IDP可能与植原体-寄主互作有关。编码IDP的基因已经从几个植原体株系中分离得到（Bergetal.1999;Blomquistetal.2001;Barbaraetal.2002;Mortonetal.2003;Kakizawaetal.2004;Kakizawaetal.2006a）。这些蛋白具有很高的氨基酸和抗原变异。所有的蛋白具有一个中央的疏水区和一或两个跨膜域，其中疏水区可能位于植原体细胞的外部。因此免疫显著的膜蛋白可能在蛋白定位后由植原体细胞膜转 24西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究运至膜外。IDPs有明显不同的类型：免疫显著膜蛋白（Imp）；免疫显著的膜蛋白A（IdpA）；（iii）抗原膜蛋白。这些蛋白之间没有氨基酸序列相似性，且位于基因组不同位置。所有的IDPs具有一个疏水区，该区可能位于植原体细胞外部，但是疏水区跨膜的锚定结构是不同的（Kakizawaetal.2006b）。因此，这三种蛋白并非直系同源。第一种类型（IdpA）仅N端跨膜区锚定；第二种类型（IdpA）有N-和C-端跨膜区，旦都未裂解；第三种类型Baietal.也由两个跨膜区，但N端裂解，只有C端起锚定作用（Barbaraetal.2002）。有意思地是，除了最初的IDP基因，在西方X病植原体（LieftingandKirkpatrick2003）和OY植原体（Kakizawaetal.2009）基因组中发现了编码imp的基因。二者之间imp序列的同源性很低；然而imp周围的基因结构很保守。相反，基于同源性或者基因组结构查找，在其他植原体的全基因组序列中并没有发现IdpA（在WX中发现的IDP）的同源基因（Oshimaetal.2004;Tran-Nguyenetal.2008;Baietal.2006;Kubeetal.2008）。另外，在“Ca.Phytoplasmamali”的全基因组序列中并没有发现amp的同源物。这些结构暗示：植原体的祖先中可能有imp，而AY组和WX组在进化的过程中分别获得了Amp和IdpA。1.4.6IDPs变异和正向选择（positiveselection）据报道，从几个不同植原体株系克隆得到的IDPs具有很高的变异（Barbaraetal.2002;Mortonetal.2003;Kakizawaetal.2004）。通常，因为功能的限制，和非编码区相比，编码区的序列很少出现较低的一致性。然而，植原体IDP基因的相似性要比其上游、下游或非编码区低（Barbaraetal.2002;Kakizawaetal.2004），表明IDPs遭受了较强的歧化选择压力。而且，IDPs的细胞外疏水区域比跨膜区域偶然输出信号序列更加歧化，表明植原体-寄主互作促进了IDPs变异（Barbaraetal.2002;Kakizawaetal.2004）。此外，有报道称在几个植原体中，imp的序列一致性与16SrDNA并无关联，表明IDPs的变异反应一些除进化时间之外的因素（Mortonetal.2003）。最近，在Amp蛋白上观察到一种正向选择的机制（Kakizawaetal.2006a）。正向选择意味着某一基因的变异使微生物更好地适应。因此，如果在一个蛋白上观察到正向选择，那么可以推测该蛋白在微生物的进化中具有重要作用，并且直接影响微生物的适应性。之前已报道的，有许多正向选择的例子（HughesandNei1988;TanakaandNei1989;Bishopetal.2000;Jigginsetal.2002;Urwinetal.2002;AndrewsandGojobori2004）。这些蛋白中，大多数对微生物都起到重要的作用，并且直接影响微生物的适应性。分析正向选择产生的蛋白，对于我们了解微生物和蛋白的进化具有积极作用Ohta1992。大部分正向选择的氨基酸存在于Amp中央疏水区域（Kakizawaetal.2006a）。这一现象说明Amp中氨基酸的替换增加了植原体的适应性，同时也说明Amp在植原体和植 第一章文献综述25物互作中起到重要作用。Amp中的正向选择可能是由于植原体和细胞外环境（寄主细胞质）的互作。最近通过分子进化分析，在几个imps中发现了正向选择（Kakizawaetal.2009），表明imp在植原体和植物互作中有重要作用。然而，正向选择压力是否来自植物或昆虫寄主尚不清楚。对正向选择压力的详细分析以及阐明IDPs变异方式仍是要进一步解决的问题。1.4.7Amp与昆虫微丝形成复合体据报道，OY植原体的Amp与昆虫微丝之间的互作决定昆虫介体特异性（Suzukietal.2006）。OY植原体定殖于昆虫肠壁周围的内脏平滑肌微丝，在体外培养或体内，Amp均与三个昆虫蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白重链和轻链形成复合体。Amp微丝复合体Baietal.与叶蝉传播植原体的能力相互关联，表明Amp与昆虫微丝复合体在决定植原体传播能力方面具有重要作用。经常有关于微生物表面蛋白和寄主微丝相互作用的报道。例如，在哺乳动物病原细菌中，如Listeria,Salmonella和Shigella，表面蛋白和寄主微丝的互作已有报道（TilneyandPortnoy1989;Gouinetal.1999;HaywardandKoronakis1999;TranVanNhieuetal.1999;Zhouetal.1999;Jurisetal.2000;Pantalonietal.2001;DelahayandFrankel2002;Cossartetal.2003），且与寄主微丝形成复合体的能力似乎极大地影响对寄主细胞的选择。细菌在受侵染的上皮细胞胞质中的移动能力取决于肌动蛋白聚合机制，通过该机制细菌获得推进力从而在细胞质中传播，或传播到连接的上皮细胞Goldberg2001。在Shigella中，VirG是一种关键的毒性因子，VirG与N-WASP的互作使其能够基于肌动蛋白进行移动（Suzukietal.2002）。算植原体Amp、昆虫寄主微丝复合体在内，细菌膜蛋白和寄主细胞微丝的互作是一种常见的对细菌成功侵染起关键作用的系统。植原体或螺原体对寄主昆虫的侵染包含几个步骤（Hodgettsetal.2008）。第一步，通过口针，昆虫从植物韧皮部筛管获取细菌，细菌附着于寄主昆虫肠上皮细胞。第二步，细菌进入肠细胞，穿过肠壁进入血淋巴，在血淋巴繁殖循环至其他组织。第三步，细菌在唾液腺中繁殖，在寄主昆虫吸食时，通过口针进入到新寄主的韧皮部筛管细胞。之前的研究表明，穿透昆虫肠和唾液腺的能力，是植原体选择寄主昆虫的重要因素（Purcelletal.1981）。对于螺原体而言，要传播，唾液腺是个必须穿越的障碍（MarkhamandTownsend1979）。AM复合体的形成，对于通过寄主障碍是必须得。Spiroplasmacitri通过肠上皮细胞、Circulifertenellus通过受体介导的细胞内吞作用侵染寄主昆虫（Kwonetal.1999）。叶蝉肠上皮细胞的受体可能能够识别特定的植原体膜蛋白。几个S.citri附着蛋白基因已经被分离，包括免疫膜蛋白（spiralin）（Foissacetal.1997;Duretetal.2003）、P58（Yeetal.1997）、SARP1（Bergetal.2001）和pSci6质粒的P32（Berhoetal.2006）。有报道称，spiralin的缺陷变异对其传播能力影响较小（Fletcheretal.1996），对spiralin结合昆虫介体Circuliferhaematoceps糖蛋白的能力影响也较小 26西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究（Killinyetal.2005）。尽管没有发现Amp和spiralin之间的同源性，但是植原体和螺原体的免疫显著性膜蛋白，在昆虫介体传播过程中，将起重要作用。最近有报道称pSci6质粒使原先不可传播的S.citri能够由昆虫传播（Berhoetal.2006）。由pSci6编码的P32蛋白可能与昆虫传播有关。但是仅将P32转入不可传播的S.citri株系时，该株系仍无法获得传播性。因此，P32蛋白可能对于昆虫传播植原体是必要的，但是pSci6可能还有其他的作用，需要作进一步的分析。在植原体中AM复合体对于昆虫传毒很是必要，但是并不能解释整个过程。因此其他的一些因子也是必要的。先前，一个质粒编码基因ORF3被认为对昆虫传毒起到重要作用（Oshimaetal.2001a;Oshimaetal.2001b;Nishigawaetal.2002）。进一步分析ORF3对于澄清昆虫传毒很重要。1.4.8Amp-微丝复合体决定昆虫介体特异性昆虫传播的病原能够对人、动植物引起毁灭性的破坏，因为这些病原能够快速传播到很大的区域。在自然条件下，大多数病原物有特定的昆虫介体传播，即使一些很相近的其他昆虫也无法取代（Leeetal.2000;Alavietal.2003）。因此，很大程度上一个病原物的破坏范围取决于其昆虫媒介的种类（Leeetal.2000）Leeetal.2000。阐述昆虫介体特异性的决定机制有助于迅速区分介体与非介体，进而管理和预防病原物的传播和侵染规律。通常某一植原体种类会由特定的的介体昆虫传播，而植物寄主相对要广泛一些。例如，植原体侵染至少98个科的700种植物（Leeetal.2000;Hogenhoutetal.2008）Leeetal.2000;Hogenhoutetal.2008，AY大约侵染39个科的120个属中的161个种（McCoyetal.,1989）。大部分植原体能够侵染长春花（Leeetal.1998）。相比而言，介体昆虫的特异性要强的多。例如，Macrostelesstriifrons（Fallen）传播OY植原体，但是不能传播水稻黄矮植原体（“Ca.Phytoplasmaoryzae”，RYDstrain）。相反NephotettixcincticepsUhler传播RYD植原体，但是不能传播OY植原体。因此，在自然条件下昆虫介体是影响植物寄主范围的一个很重要的因素。有报道称，OY植原体Amp与昆虫微丝复合体与介体昆虫特异性相关（Suzukietal.2006）Suzukietal.2006。因此，AM复合体对于植原体自然寄主范围以及植原体对作物的破坏程度研究都很重要。AM复合体对于昆虫介体特异性很重要，但是任然有许多不清楚的地方。首先，AM复合体是否与提到的三个步骤有关仍然不清楚。而且，如上所述，在植原体在昆虫介体内需要克服两个障碍，但AM复合体与那个壁垒相关尚不清楚。第二，直接与Amp作用的蛋白是哪个？目前为止，鉴定出3种与Amp结合的蛋白：肌动蛋白、肌球蛋白轻链以及肌球蛋白重链（Suzukietal.2006）Suzukietal.2006。Amp是否与该3种蛋白中的一种结合或者是否还有其他的因子存在都还不清楚。第三，为什么Amp变异如此大？如上所述，在Amp中观察到正向选择，意味着Amp中的氨基酸替换物能增强植原体的适应性。虽然已经知道，Amp的功能之一是与 第一章文献综述27昆虫微丝形成复合体，但是这并不能解释如此高的可变性。先前，有几个研究报道称寄主和细菌的互作促进了细菌膜蛋白的变异（Deitschetal.1997）Deitschetal.1997。以Borreliaburgdorferi的膜蛋白OspC为例，OspC是一种附着蛋白，在侵染过程中具有重要作用，其必须与寄主发生协同进化，不断改变自己以适应不同的寄主。基于这些例子，可以推及植原体，让人联想到差异选择压力，比如避免昆虫介体的免疫系统或者附着于植物蛋白等适应性，这些对于几个病原物来说，是完成侵染非常重要的一步（AndrewsandGojobori2004）AndrewsandGojobori2004。为澄清Amp的产生正向变异的原因、明确其功能与变异的关系，还有许多工作需要做。1.4.9植原体致病机理研究进展植物被植原体感染后的一个常见症状就是花叶变，即花呈现出类似于叶片的结构。研究证明，翠菊黄化植原体AY-WB株系基因组编码的SAP54蛋白是与此相关的，在拟南芥中超表达该基因，可以引起拟南芥产生花变叶症状（Macleanetal.2011），此后科学家证明植原体的分泌蛋白SAP54是影响到了植物中的MADS家族基因而引起的花器绿变现象（Maejimaetal.2014）。植原体侵染植物后常常引起植物叶片黄化,该现象被认为是植原体抑制了光合体系II的发生，并降解了叶绿素和类胡萝卜素的同时抑制了它们的生物合成途径（BertaminiandNedunchezhian2001）。研究者证明，洋葱黄化植原体编码的被命名为“tengu”的基因，其编码一个大小为4.5KDa成熟蛋白，将该基因转入本氏烟草和拟南芥中可引起植株产生丛枝和矮缩症状，并且在转基因的拟南芥中超过900个基因的表达水平发生了变化，由此证明“tengu”的基因是与植物感染植原体后表现丛枝和矮缩相关的（Hoshietal.2009）。Hogenhout实验室于2006年完成了翠菊黄化植原体AY-WB株系的全基因组测序，全基因组注释表明假定的693个蛋白中56个是可以分泌到寄主细胞质中，这些分泌蛋白被命名为SAP（secretedAY-WBproteins,SAP），其中的第11号蛋白SAP11被证明定位于植物细胞核中，是植原体与寄主互作的效应蛋白，SAP11可以调控植物防御素合成并影响植物发育（Sugioetal.2011）。植原体侵染一品红植株后让植株产生腋芽增多，多花，个小等优秀园艺性状，同时绿色花朵在自然界也是非常少见的，因此植原体侵染植物后产生的优秀园艺性状越来越引起人们的重视，它存在着潜在的商业应用（Bertaccinietal.1996;Leeetal.1997;Maejimaetal.2014）。1.5本研究的目的和总体思路1.5.1研究目的和意义植原体（Phytoplasma），是一类由刺吸式口器昆虫传播（叶蝉、木虱等），严格寄生于植物韧皮部、无细胞壁的原核生物。虽然Contaldoetal.（2012）人报道了植原体的纯培养方法，但该方法目前在植原体研究中并未得到广泛应用。因此，目前对植原体分类 28西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究的研究工作，主要还是依据对保守基因的系统发育分析和限制性酶切多态性分析（RFLP）。陕西省、甘肃省、宁夏回族自治区、新疆维吾尔族自治区和内蒙古蒙古族自治区均为我国的农业大省。种植粮食作物和特色水果为主，其中陕北、宁夏、甘肃陇西、内蒙古鄂尔多斯等地为我国马铃薯产区、小杂粮主产区；陕西关中，甘肃天水、平凉为我国小麦的主产区；青海省是我国春麦和青稞的主产区；陕北、南疆地区是红枣主产区；同时南疆和陕西也是我国特色水果的主产区，如葡萄、杏、苹果、猕猴桃等。西北地区丰富的植被资源和独特的气候类型，特别适合叶蝉、木虱等昆虫的繁衍，因此，西北地区成为植原体病害的易发区和多发区。泡桐丛枝病在陕西、甘肃发生最为普遍；枣疯病在陕西、甘肃、新疆，宁夏枣树种植区呈零星或者大面积发生，从而也使相关病原物传播到其他寄主植物上成为可能。我国对植原体类病害的研究起步较晚。目前，在我国植原体的检测以及植原体组及组以下分类研究仍是我国植原体研究的热点。本研究以明确陕西省植原体种、株系多样性为目标，利用可用于植原体系统发育研究的标记基因，如16SrRNA基因，rp基因，secY基因，tuf基因等展开陕西省植原体多样性研究，对丰富陕西省植原体研究具有重要的现实意义，对相关病害防治具有指导意义。1.5.2研究的总体思路对西北地区植原体病害进行调查和样品采集；对采集的样品进行组织学实验，采用透射电子显微镜技术观察感病植株组织内植原体粒子分布和粒子形态。对采集的样品进行植物总DNA提取，利用植原体16SrRNA基因和核糖体蛋白质（RP）基因的通用引物进行目标基因的克隆，将扩增的目标基因纯化、克隆和测序;将测序结果与NCBI中已公布的其他植原体株系的16SrRNA基因和rp基因序列进行比对，并进行系统发育分析，初步确定其分类地位，然后根据测序结果对16SrRNA基因和rp基因进行虚拟的RFLP分析，确定其分类地位（所属的组和亚组）。采集发病区内的可疑昆虫，结合PCR检测和电子显微镜观察带毒传毒情况，确定植原体传播媒介；对木本和草本感病作物进行植原体病害传播实验，木本植物采用嫁接实验验证，草本植物采用菟丝子传毒实验验证；利用分子生物学技术，明确田间寄主范围，对初侵染源和传播途径进行分析研究，明确西北地区常见植物植原体病害寄主范围、传播途径及流行规律。研究所采取的技术路线如下： 第一章文献综述29 30西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究第二章实验部分2.1西北地区植原体病害种类鉴定1967年，日本学者土居养二首次在表现黄化萎缩病症状的桑树中发现植原体。迄今植原体在世界范围内已经造成数千种植物病害。感病植物主要表现为植株黄化、衰退、花器绿变、花变叶、丛枝、小叶等症状，所侵染植物包括：大田作物、蔬菜、观赏植物、田间杂草等。我国在这方面研究起步较晚，迄今为止，世界上报道的植原体病害已经超过了1000种，但我国只报道了100种左右（常文程等2012）还不到世界的十分之一，证明我国在植原体鉴定方面的研究滞后于世界其他国家。我国幅员辽阔，以农业为主并且植物资源丰富，气候类型多样为植原体病害的易发生区域。因此，开展植原体多样性研究有重要的植物病理学意义和生产指导意义。已发现的100多种植原体病害中，只对枣疯病、泡桐丛枝病、小麦蓝矮病、柑橘黄龙病、桑矮缩等病害开展了全面系统的研究工作，包括病害的分布，相关植原体的分类地位、不同地区间的多样性、传播介体、寄主范围等工作；并完成了小麦蓝矮植原体的基因组测序（Chenetal.2014）和泡桐丛枝植原体染色体全长定位（杨毅etal.2011）。目前，蔡红完成了云南省植原体多样性的系统研究（蔡红2007），车海彦完成了海南省植原体多样性的系统研究（车海彦2010）。这两个省份均为我国南方省份，发生植原体类型以花生丛枝组（16SrII组）为主，翠菊黄化组次之（16SrI组），榆树黄花组（16SrV组）和僵顶组（16SrXII组）偶有发生，与我国台湾省发生植原体病害情况类似。因此开展我国北方省份植原体多样性研究是非常必要的。西北地区地域广阔气候类型多样，西北5省均为农业省，小麦、杂粮、马铃薯、特色水果等产业已发展成为当地农民经济创收的主要来源，除了干旱等自然灾害外，植物病虫害成为影响作物产量的限制因素。之前的研究证明发生在小麦上的小麦蓝矮病在关中地区普遍发生，而且寄主范围多样（顾沛雯etal.2007），枣疯病在陕西、新疆地区发生的非常严重，并且可以传播到三叶草、杏树、李子树等植物上（Lietal.2009;Lietal.2010b;Lietal.2010a）给当地农业生产造成严重损失。本研究将对西北地区植原体多样性进行研究，明确病害相关植原体的分类地位、分布情况、主要流行株系、可能寄主范围和传播介体。2.1.1材料与方法2.1.1.1植原体病害样品采集植原体侵染植物后会表现出明显的病症，依据病症于2010年至2014年，对陕西省榆林市的横山县、米脂县、吴堡县、清涧县、子洲县，延安市的延安县、安塞县、志丹 第二章实验部分31县、吴旗县、富县、洛川县、宜川县、黄陵县、宜君县，铜川市的王益区、印台区、耀州区，渭南市的华县、潼关县、蒲城县、澄城县、白水县、大荔县、合阳县、富平县，咸阳市的武功县、兴平县、泾阳县、三原县、礼泉县、乾县、永寿县、彬县、旬邑县、淳化县，西安市的未央区、碑林区、莲湖区、灞桥区、雁塔区、阎良区、临潼区、长安区、蓝田县、周至县、户县，宝鸡市的金台区、渭滨区、陈仓区、岐山县、扶风县、眉县、陇县、千阳县、太白县、凤县，汉中市，商洛市，安康市等10个市的60个县市地区进行了植原体病害的全面调查采集工作；此外，对甘肃省的天水市、平凉市、定西市，宁夏回族自治区的银川市、固原市、盐池县，新疆维族自治区的阿克苏地区、塔里木市、和田市，青海的西宁市、海东市、玉树地区，内蒙古的鄂尔多斯市也进行了植原体的调查和样品采集（图2-1），共采集疑似植原体病害植物样品材料218份（附录1）。图2-1西北地区植原体病害调查和样品采集地区Fig.2-1AmapofplacesofsurveyandcollectingsamplesinNorthwestChina2.1.1.2试剂及仪器(1)生化试剂 32西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究试剂名称供应商β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)Sigma三羟甲基氨基甲烷(Tris)Amresco琼脂糖(Agarose)SangonPVPAmrescoNa2EDTAAmresco胰蛋白胨OXOID酵母提取物OXOID氨苄青霉素Amresco琼脂糖Biowest无水乙醇苏州晶协氯仿苏州晶协异丙醇苏州晶协冰醋酸苏州晶协NaOH苏州晶协十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）Amresco十二烷基硫酸钠(SDS)Amresco溴化乙锭(Ethidiumbromide)Amresco蛋白酶K宝生物工程（大连）有限公司锇酸、环氧丙烷、环氧树脂Epon812、柠檬酸铅等试剂由旱区作物逆境生物学国家重点实验室电镜中心提供；聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂由植物病理学平台提供(2)菌株、载体、分子生物学试剂试剂名称试剂来源JM109分子病毒实验室保存DH5α分子病毒实验室保存pMDl8-T载体宝生物工程（大连）有限公司TaqDNA聚合酶(含10倍缓冲液和MgCI2)宝生物工程（大连）有限公司dNTP宝生物工程（大连）有限公司AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0宝生物工程（大连）有限公司PlasmidMiniKit天根生物DL2000Marker宝生物工程（大连）有限公司DL15000宝生物工程（大连）有限公司PCR所用引物上海生工 第二章实验部分33φx174DNAMarker.HaelIIdigest宝生物工程（大连）有限公司AluI、BamHI、BfaI、BstUI、DraI、EcoRI、宝生物工程（大连）有限公司以及NEB公司HaeIII、HhaI、HinfI、HpaI、HpaII、KpaI、Sau3AI、MseI、RsaI、SspI17限制性内切酶(3)主要实验仪器名称型号供应商超净工作台SW-CJ-1FD苏净集团苏州空泰空气技术有限公司高低温恒温振荡培养箱HZQ-F160A上海-恒科技有限公司恒温水浴锅HH-1、HH-2常州国华电器有限公司金属浴GL-150海门市其林贝尔仪器制造有限公司Mini离心机LX-200海门市其林贝尔仪器制造有限公司普通台式离心机Centrifuge-5424、EppendorfCentrifuge-5418PCR仪MYCYCLER美国BIO-RAD电泳仪JY600C北京君意东方电泳设备有限公司凝胶成像系统JY04S-3E北京君意东方电泳设备有限公司紫外可见分光光度计U-2800日本日立雷磁PH计PHS-3E上海精密科学仪器有限公司电子天平YP-B2003上海光正医疗仪器有限公司旋涡混合器QL-902海门市其林贝尔仪器制造有限公司单磁力加热搅拌器78-1常州国华电器有限公司高压蒸汽灭菌锅MLS-3750日本三洋制冰机IF300-150韩国透射电子显微镜JEM-1200EXⅡ日本电子JEOL2.1.1.3基本实验操作(1)常用试剂配制A.1MTris-HCl（pH=8.0）:Tris121g、ddH2O800mL、浓HCl约42mL充分溶解，冷却至室温时补水至980mL，用浓HCl调pH至8.0，定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。B.0.5MEDTA（pH=8.0）:Na2EDTA·H2O93.1g、NaOH11g、ddH2O400mL，加热搅拌充分溶解，冷却至室温补水至490mL，用10MNaOH细调pH至8.0，定容至500mL，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。C.50×TAEBuffer:Tris242g、Na2EDTA·H2O18.6g、800mLddH2O，加入57.1mL 34西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究冰乙酸，定容至1L，室温保存。使用时稀释至1×TAEBuffer。D.10×TEBuffer:1MTris-HClBufferpH=8.050mL、0.5MEDTApH=8.010mL、400mLddH2O混合均匀，定容至500mL，高压蒸汽灭菌，室温保存备用。使用时稀释成1×TEBuffer。E.3MNaCH3COOH（pH=5.2）:称取无水乙酸钠24.6g，加水溶解定容至100mL，再用冰乙酸调pH值为5.2。F.苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）:将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊（24:1）混合均匀后移入棕色玻璃瓶中4℃保存。G.氨苄青霉素（100mg/mL）储备液:1mL无菌水中加入100mg氨苄青霉素，用滤膜过滤后，放置于－20℃冰箱中备用。H.10%SDS:100gSDS溶于900mL水中，加热至68℃溶解，加几滴浓盐酸调pH至7.2，定容至1000mL分装，保存。I.LB液体培养基:Bacto-蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaCl10g，加950mL水溶解，用5NNaOH调pH至7.0。定容至1000mL，高压灭菌后保存。J.LB（Luria-Bertani）固体培养基:按照LB液体培养基，高压灭菌前加入琼脂糖15-18g/L。(2)感受态细胞制备A.将接种环在酒精灯上烧红灭菌，放置于超净工作台内，待至室温，取出保存于-80℃冰箱的JM109原始甘油菌种，用接种环在无抗生素的LB固体培养基上划线，37℃过夜培养；B.将37℃过夜培养的LB平板上的单克隆菌株接种到3mL液体LB中，37℃，220rpm/min过夜培养；C.将过夜培养的3mLJM109单克隆菌液转至灭过菌的LB液体培养基中100mLLB+3mL活化菌液37℃摇菌3-4小时，至OD值0.5左右；D.将培养好的菌液分装至50mL离心管中，冰置10min，4℃3000rpm离心15min；E.弃上清，每管中加入10mL0.lmolCaCl2溶液，使菌体重悬，冰置10min，再于4℃3000rpm离心15min；F.再倒掉上清，加入适量（2-7mL，依菌量而定）0.lmol的甘油CaCl2溶液，重悬菌体后分装入1.5mL离心管中，于-80℃保存备用；G.取一个标定为1ng/μL的质粒进行感受态细胞活力检测。(3)植物总DNA的提取参照李正男（2010）的提取方法:A.取感病植株叶脉或用镊子拨开茎秆表皮后的韧皮部组织0.2g，放入预冷的研钵内，加入适量的液氮研磨呈粉，将研磨好的粉末转移到事先预冷的2.0mL离心管中并 第二章实验部分35加入预热的0.6mLCTABDNA提取缓冲液，用封口膜封好并混匀；B.在65℃水浴锅水浴30min，期间轻摇2-3次；C.水浴30min后加入等体积氯仿、异戊醇（24：1），摇匀至乳白色，4℃下12000rpm/min离心10min，取上清；D.加入与所取上清等体积氯仿、异戊醇（24：1）抽提，4℃下12000rpm/min离心10min，取上清；E.加入等体积氯仿、异戊醇（24：1）进行二次抽提，4℃下12000rpm/min离心10min，取上清；F.加入2倍体积无水乙醇-20℃沉淀2h；G.4℃下12000rpm/min离心10min，弃上清，并用75%无水乙醇洗2次，真空干燥；H.沉淀溶于50μL灭菌双蒸水中;I.吸取1μL的总DNA，将其加入9μL灭菌的双蒸水中，通过使用紫外分光光度计测量其浓度，在测得浓度的情况下将所有提取DNA统一稀释为20ng/μL用于后续PCR；取2μL提取总DNA与嗅酚蓝混匀后跑胶并观察结果，确定DNA的完整性。(4)1.0%琼脂糖凝胶制备A.0.45g琼脂糖转入250mL三角瓶中，加入45mL1×TAE缓冲液混匀后用保鲜膜封住瓶口，放入微波炉中微波30s，左右摇晃看是否有未溶解琼脂糖，再次放入微波炉中微波30s后取出；B.事先冲洗好胶槽和梳子在室温下晾干并组装，待凝胶冷却至50℃时倒入胶槽并赶走胶面气泡；C.室温30min后小心拔出梳子，将制好凝胶放入电泳槽中并检查点样孔完整性，加入1×TAE电泳缓冲液，高出凝胶表面即可。(5)凝胶电泳检测PCR结果a.按照所要点样PCR数量，在一次性灭菌手套上按相应数量一字排开1μLDNALoadingbuffer，吸取5μL的PCR产物与相应1×DNALoadingbuffer混匀；b.用10μL微量移液器将样品按照顺序加入凝胶点样孔内；在最边上点样孔中加入5μLMarker（DL2000或者DL15000）；c.盖好电泳槽，点样端对着负极，恒压80V电泳60-70min，此时溴酚蓝约移动至凝胶3/4距离，停止电泳，放入配好的EB中染色10min，在凝胶成像系统下照相并保存照片。2.1.2疑似植原体病害植物材料分子鉴定16SrRNA基因是植原体分类中应用最为广泛的分子标准，是植原体组分类的初步 36西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究依据，因此在植原体分类鉴定研究中都是首先克隆这个基因。目前为止应用最为广泛的是16SrRNA基因通用引物Pl/P7（DengandHiruki1991;Schneideretal.1995）和R16F2n／R16R2（GundersenandLee1996）（表2-1），其中Pl/P7扩增片段长度在1.8kb，包括完整的16SrRNA基因、部分23SrRNA基因及16S-23S间隔区（ISR）。由于植原体含量低并且为了增加扩增的特异性将直接PCR扩增产物使用双蒸水按1：30倍比例稀释后为模板用R16F2n／R16R2进行巢式PCR扩增，16SrRNA基因的R16F2n／R16R2区间被用于实际和虚拟RFLP分析及系统发育分析。为了鉴定在西北地区常见植物上采集的疑似植原体感染样品中是否有植原体存在，我们提取了采集的218份样品的总DNA，进行16SrRNA基因的直接PCR扩增和巢式PCR扩增。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，根据是否有植原体特异性条带（直接PCR扩增目标条带大小为1.8kb，巢式PCR扩增目标条带大小为1.2kb）来判定采集的病害样品是否含植原体，进而判定病害是否为植原体病害。2.1.2.1引物合成植原体16SrRNA基因通用引物对P1/P7和R16F2n/R16R2序列信息（表2-1）表2-1PCR扩增16SrRNA基因所用引物的核苷酸序列Table2-1ThesequencesofprimersusedforPCRamplifying16SrRNAgenefragmentsofphytoplasmas引物名称引物序列（5’-3’）Tm值（℃）参考文献P1AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT57.9DengandHiruki1991;Schneideretal.1995P7CGTCCTTCATCGGCTCTT54.9DengandHiruki1991;Schneideretal.1995R16F2nGAAACGACTGCTAAGACTGG55.4GundersenandLee1996R16R2TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG66.1GundersenandLee19962.1.2.2PCR扩增(1)直接PCR反应体系：体系组成体积量（μL）终浓度总DNA模板1.020ngPrimerP1(10μmol/L)1.00.4μmol/LPrimerP7(10μmol/L)1.00.4μmol/L10×PCRBuffer2.51×dNTPs(2.5mmol/L)1.00.1mmol/LTaqDNA聚合酶5U/μL0.52.5U加ddH2O至25(2)直接PCR反应条件：预变性温度94℃3min 第二章实验部分37变性温度94℃30s退火温度55℃30s延伸温度72℃2min步骤2-430个循环补平72℃10min(3)巢式PCR反应体系：体系组成体积量（μL）终浓度模板(P1/P7为引物直接1.0PCR产物1:30稀释)PrimerR16F2n(10μmol/L)1.00.4μmol/LPrimerR16R2n(10μmol/L)1.00.4μmol/L10×PCRBuffer2.51×dNTPs(2.5mmol/L)1.00.1mmol/LTaqDNA聚合酶5U/μL0.52.5U加ddH2O至25(4)巢式PCR反应条件：预变性温度94℃3min变性温度94℃30s退火温度56℃30s延伸温度72℃1min30s步骤2-430个循环补平72℃10min2.1.2.3PCR扩增产物电泳检测凝胶制备和电泳检测详见2.1.1.3基本实验操作（4）和（5）。应用引物P1/P7，直接PCR扩增目标条带大小应该为1.8kb；应用引物R16F2n/R2，巢式PCR扩增目标条带大小应该为1.2kb。2.1.3结果2.1.3.1DNA提取结果(1)电泳法检测CTAB法提取的植物基因组总DNA制备1.0%的琼脂糖凝胶，分别取2μL提取的植物基因组总DNA进行电泳检测。电泳条件为恒压80V，80min。EB染色10min后凝胶紫外成像系统下照相并保存实验 38西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究照片（图2-2）。如果在凝胶图上可以看见清晰可辨的RNA条带，需要在提取总的DNA中加入RNA酶处理并再次抽提。图2-2采集的39种植原体病害样品植物总DNA提取结果1-39依次为：泡桐丛枝、枣疯、酸枣丛枝、凌霄花丛枝、甜樱桃丛枝、仙人掌丛枝、国槐丛枝、刺槐丛枝、南瓜丛枝、苦楝丛枝、苜蓿丛枝、早园竹竹子丛枝、菲白竹丛枝、五角枫丛枝、辣椒丛枝、油菜绿变、狗尾草绿变、凤仙花绿变、月季绿变、菊花绿变、樱花绿变、樱花黄化、桃树黄化、苦楝黄化、马黄化、葡萄黄化、樱桃李黄化、谷子黄化、苹果衰退、中华小苦荬扁茎、普纳菊苣扁茎、桔梗扁茎、国槐扁茎、紫薇扁茎、芝麻扁茎、谷子红叶、狗尾草红叶、马铃薯紫顶、狗牙根白叶Fig.2-2GelimageoftheisolatedtotalDNAsofthe39plantsamplesFrom1to39:Paulowniawitches'broom,Wildjujubewitches'broom,Jujubewitches'broom,Cynodondactylonwhiteleaves,Chinaberrywitches'broom,Chinaberryyellows,Appledecline,Cherryplumyellows,Chinaixerisflatstem,RoseBalsamphyllody,Pepperwitches'broom,Cactuswitches'broom,Punachicorywitches'broom,Japanesemaplewitches'broom,Alfalfawitches'broom,Peachyellows,Chinesetrumpetcreeperwitches'broom,Sweetcherrywitches'broom,Sophorajaponicawitches'broom,Robiniapseudoacaciawitches'broom,Squashwitches’broom,Phyllostachyspropinquawitches'broom,Sasafortunewitches'broom,Brassicarapavirescence,Greenbristlegrassvirescence,Rosachinensisvirescence,Chrysanthemumvirescence,Sakuravirescence,Sakurayellows,Digitariayellows,Vitisviniferayellows,Milletyellows,Platycodongrandiflorumflatstem,Sophorajaponicaflatstem,Lagerstroemiaindicaflatstem,sesameflatstem,Milletreddening,GreenbristlegrassreddeningandPotatopurpletop(2)分光光度计法测浓度吸取2μL提取的植物基因组总DNA，在分光光度计（GeneCompanyLimited）下测定浓度并记录结果。选取OD260/280在1.8左右、OD260/230在2.5左右的DNA，将其稀释至20ng/μL用于后续分子实验。2.1.3.2直接和巢式PCR扩增结果采用植原体16SrRNA基因通用引物P1/P7对所采集到的疑似植原体病害样品总DNA进行直接PCR扩增，电泳检测PCR结果。从19种采集的植物病害材料中获得了 第二章实验部分391.8kb的目标片段。这19种植物分别是表现丛枝症状的泡桐、枣树、酸枣树、凌霄花、甜樱桃、仙人掌、国槐、刺槐、南瓜、苦楝；表现花器绿变症状的油菜、狗尾草；表现黄化症状的樱花、桃树、苦楝；扁茎症状的中华小苦荬；表现红叶和花器绿变症状的狗尾草；表现紫叶和叶腋增殖的马铃薯以及表现白叶症状的狗牙根（图2-3）。图2-3.应用植原体16SrRNA基因通用引物P1/P7进行的直接PCR电泳结果目标片段为1.8kb；阳性对照：小麦蓝矮；阴性对照：灭菌双蒸水Fig.2-3PCRamplified116SrRNAgenefragmentsusingP1/P7Theexpectedsizeis1.8kb;positivecontrol:wheatbluedwarf;negativecontrol:doubledistilledwater将直接PCR产物用灭菌双蒸水稀释30倍作为巢式PCR的模板、以R16F2n/R16R2为引物进行巢式PCR扩增。从表现丛枝症状的泡桐、枣树、酸枣树、凌霄花、甜樱桃、仙人掌、国槐、刺槐、南瓜、苦楝、苜蓿、早园竹、菲白竹、五角枫、辣椒；从表现花器绿变症状的凤仙花、油菜、狗尾草、月季、菊花、樱花；表现黄化症状的樱花、马唐、桃树、葡萄、苦楝、樱桃李、谷子；表现小叶症状的苹果；扁茎症状的普纳菊苣、中华小苦荬、桔梗、国槐、紫薇、芝麻；表现红叶症状的狗尾草、谷子；表现紫叶和叶腋处增殖的马铃薯；表现白叶症状的狗牙根等39种植物样品中，扩增出了1.2kb的植原体特异扩增条带（图2-4）。采集的218份样品中201份PCR鉴定为植原体感染，根据16SrRNA基因PCR结果初步明确了植原体病害的种类。 40西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图2-4植原体通用引物R16F2n/R2进行的巢式PCR扩增结果目标片段为1.2kb；阳性对照：小麦蓝矮；阴性对照：灭菌双蒸水Fig.2-4PCRamplified16SrRNAgenefragmentsusingR16F2n/R2Theexpectedsizeis1.8kb;positivecontrol:wheatbluedwarf;negativecontrol:doubledistilledwater2.1.3.3鉴定为植原体侵染的植物症状(1)泡桐丛枝病采自陕西省西安市、咸阳市、杨凌区、宝鸡市，甘肃省天水市、平凉市的泡桐丛枝样品主要表现为花器绿变、小叶、叶片畸形、黄化、丛枝、枝条节间缩短、在叶腋处萌发大量不定芽等症状，新生枝条不能安全越冬（图2-5）。 第二章实验部分41图2-5泡桐丛枝病症状a.丛枝症状；b.枯死的丛枝类似于鸟巢；c.小叶症状；d.花器绿变症状Fig.2-5Symptomsonphytoplasma-infectedpaulowniaa.Witches’broom;b.Birds’nest-likewitches’broom;c.Littleleaves;d.Flowervirescence(2)枣疯病和酸枣丛枝采自陕西省榆林市、延安市、西安市、咸阳市、杨凌区、宝鸡市，宁夏回族自治区银川市、盐池县，新疆维吾尔族自治区阿克苏地区、塔里木市、和田市，甘肃省天水市、平凉市的枣疯和酸枣丛枝样品主要表现为丛枝、黄化、叶片变小、枝条节间缩短，花期时出现花器绿变，不能结果，当年形成的新生丛枝状枝条不能越冬等症状（图2-6）。图2-6枣疯病和酸枣丛枝病症状a.枣疯病症状；b.丛枝状枝条放大；c.酸枣丛枝；d.野外酸枣丛枝早春症状Fig.2-6Symptomsonphytoplasmas-infectedjujubetreesandwildjujubetreesa.Witches’broomonajujubetree;b.Themagnificationofpartialbranchesinimagea.;c.Witches’broomonwildjujubetrees;d.Thewitches’broomonwildjujubetreesinearlyspring(3)凌霄花丛枝采自陕西省杨凌区西北农林科技大学校园和新天地设施园的凌霄花样品主要表现为丛枝、叶片变小、花藤变短、不能开花、叶片向内卷曲、顶端枝条枯死等症状（图2-7）。 42西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图2-7凌霄花丛枝病症状a.凌霄花表现为丛枝、小叶、顶梢枯死症状；b为a图的局部放大Fig.2-7Mainsymptomsofwitches’broomonChinesetrumpetcreepera.Symptomsofwitches’broom,littleleavesandtopnecrosisonChinesetrumpetcreeper;bisamagnificationofpartialimagea(4)樱桃丛枝在陕西省铜川市的王益区、耀州区；渭南市的白水县、大荔县、富平县；咸阳市的武功县、兴平县、礼泉县、乾县、永寿县、彬县；西安市的阎良区、蓝田县、周至县、户县；宝鸡市的扶风县、眉县、杨凌区、安康市、商洛市、汉中市的甜樱桃园内均采集到了表现为丛枝、黄化、叶片变小、叶腋增殖等症状的甜樱桃样品，所采集品种为“红灯”，发病植株丧失了经济价值，不能结樱桃（图2-8）。图2-8甜樱桃丛枝病症状a-b.甜樱桃表现为丛枝、小叶、增殖症状；c.冬季时候甜樱桃丛枝部位症状Fig2-8Mainsymptomofwitches’broomonsweetcherryaandb.Theinfectedsweetcherryexhibitssymptomsofwitches’broom,littleleavesandproliferation;c.Thewitches’broominwinter(5)仙人掌丛枝在陕西省杨凌区居民生活区及花卉市场内收集到了仙人掌丛枝样品，感病植株表现 第二章实验部分43为植株矮化、茎条畸形，在茎的顶端和侧面长出来大量的圆柱形小茎（图2-9）。图2-9仙人掌丛枝病症状Fig.2-9Thesymptomofcactusshowingwitches’broom(6)国槐、刺槐丛枝在陕西省渭南市的华县、蒲城县、合阳县；咸阳市的武功县、兴平县、三原县、乾县；西安市的未央区、碑林区、莲湖区；宝鸡市的金台区、渭滨区、陈仓区、杨凌区等市县区主干街道观察到作为行道树的国槐树上出现了丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退等症状并采集样品；在杨凌区和西安市采集到了同样表现为丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退等症状的刺槐样品（图2-10）。图2-10植原体在国槐和刺槐上引起的症状a.左为健康国槐，右为表现丛枝症状的国槐；b.表现丛枝症状的刺槐树Fig.2-10SymptomsinducedbyphytoplasmasonSophorajaponicaLandRobiniapseudoacaciaa-left.SymptomlessSophorajaponicaL;a-right.Witches’boomonSophorajaponicaL;b.Witches’broomonRobiniapseudoacacia(7)南瓜丛枝在陕西省渭南市的合阳县；咸阳市的武功县、兴平县、三原县、乾县；宝鸡市的扶风县、杨凌区等地的农户家中观察到南瓜植株表现出丛枝、小叶、茎秆节间缩短、花器 44西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究绿变、果实黄化等症状（图2-11）。图2-11南瓜丛枝症状由左至右：健康南瓜藤、南瓜藤丛枝症状、健康南瓜果实与感病南瓜果实Fig.2-11Symptomsofsquashwitches’broomFromlefttoright:ahealthysquashvine,asquashvineshowingsymptomofwitches’broom,ahealthsquashandaninfectedsquash(8)苦楝丛枝在陕西省咸阳市周至县的苗木基地和杨凌区主干街道及西北农林科技大学校园内采集到表现为丛枝症状的苦楝样品。感病苦楝树植株矮化、叶片变小、开花变少、新生枝条节间缩短（图2-12）。图2-12苦楝丛枝症状a.表现为丛枝症状的苦楝树；b.丛枝症状放大Fig.2-12Symptomofwitches’broomonchinaberrya.Aninfectedchinaberrytreeshowingsymptomofwitches’broom;b.Amagnificationofpartialimagea.(9)苜蓿丛枝在陕西省咸阳市杨凌区的牧草种植区的紫花苜蓿零星的表现为丛枝、叶片变小、黄 第二章实验部分45化等症状（图2-13）。图2-13植原体在苜蓿上引起的症状a.健康苜蓿植株；b-d.植原体感染的苜蓿表现小叶、丛枝症状；c.苜蓿表现黄化症状Fig2-13Symptomscausedbyphytoplasmasonalfalfaa.Ahealthyalfalfaplantb-d.Phytoplasma-infectedalfalfashowingwitches’broomandsamllleaves;c.Yellowsonanalfalfaplant(10)竹子丛枝在陕西省西安市的兴庆公园、咸阳市的咸阳湖公园、周至县的百竹园和西北农林科技大学校园内种植的早园竹表现出鸟巢样丛枝症状、叶片变小、叶腋处小枝丛生；同时在西北农林科技大学校园内种植的菲白竹也表现出叶腋处小枝丛生的丛枝症状（图2-15）。图2-14植原体引起的竹丛枝症状a.早园竹丛枝；b.菲白竹丛枝Fig.2-14Symptomofwitches’broomcausedbyphytoplasmasonPhyllostachyspropinquaandSasafortunea.Phyllostachyspropinquawitches’broom;b.Sasafortunewitches’broom 46西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究(11)五角枫丛枝在陕西省咸阳市杨凌区西北农林科技大学校园内的种植的五角枫表现为丛枝、黄化、顶梢枯死等症状（图2-15）。图2-15植原体在五角枫上引起的症状五角枫被植原体侵染后表现为丛枝症状（a-d），节间缩短（箭头1所示）和叶片畸形坏死（箭头2所示）。b图是a图中箭头3所示枝的放大。c图是d图的局部放大。e图是健康的五角枫植株Fig2-15Phytoplasma-infectedJapanesemapleexhibitingwitches-broomsymptoms(a-d),shorteningofinternodes(arrow1)andnecrosisofabnormalleaves(arrow2).(b)isahighermagnificationofthebranchletshowedin(a)(arrow3).(c)isanenlargementof(d).(e):anapparentlyhealthyJapannesemaplesample.(12)辣椒丛枝在陕西省咸阳市杨凌区的辣椒园和宝鸡市陇县的红辣椒种植区发现了红线辣椒植株表现出明显的丛枝、叶片变小、植株矮小、辣椒畸形等症状（2-16）。图2-16受植原体侵染的辣椒a.辣椒表现出丛枝（左）健康辣椒（右）；b.焦枯的辣椒果实Fig.2-16Phytoplasma-infectedpepperplants.a-left.Pepperwithsymptomofwitches’broom;a-right.Ahealthypapper;b.Witheredpepperfruit 第二章实验部分47(13)油菜绿变对陕西省榆林市的横山县、米脂县、吴堡县、清涧县、子洲县；延安市的延安县、安塞县、志丹县、吴旗县；汉中市等陕西省油菜种植主产区进行了油菜植原体病害发生情况调查，采集到表现为花不能正常发育，花瓣变为紫色叶片，花蕊异变为新的花序，生成的果荚内没有种子，而是新的幼嫩植株（图2-17）。图2-17植原体在油菜上引起的症状A.健康对照；B.和C.花变叶，花蕊变为幼嫩花序类似物；D.健康荚果；E.畸形的荚果内没有种子，由幼株代替Fig.2-17SymptomsonBrassicarapacausedbyphytoplasmasA.Ahealthyinflorescence;BandC.Theabnormalflowerwithoutyellowpetal,stamenandpistilinsteadofvioletleavesandyoungbranches;D.Ahealthypods;E.Abnormalpodwithoutseedsinside,insteadofanewseedling(14)凤仙花绿变在陕西省咸阳市杨凌区市民种植的花园及西北农林科技大学校园内均发现了表现为花变叶的凤仙花（图2-18）。图2-18感病凤仙花主要变现为叶片皱缩、植株矮小，a.凤仙花花器绿变植株，b.绿变花器局部放大Fig.2-18Distortionandcrinklingofyoungleaves,plantstunting(a)andpetalphyllody(b)onRoseBalsam 48西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究(15)月季绿变和菊花绿变在陕西省咸阳市的武功县、杨凌区的西北农林科技大学农科院家属区；西安市的未央区、碑林区、莲湖区、雁塔区；宝鸡市的金台区、渭滨区、陈仓区；汉中市等地的绿化种植带内的月季表现出了花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝等症状；在杨凌区杨凌职业技术学院园艺农场种植的菊花表现出了典型的花器绿变现象，本应该是黄色的花朵完全变为绿色（图2-19）。图2-19植原体在月季和菊花上引起的症状a.左为月季丛枝、小叶，右为健康植株；b.月季花绿变；c.菊花绿变Fig.2-19SymptomscausedbyphytoplasmasonRosachinensisandchrysanthemuma-left.Symptomofwitches’broomandlittleleavesonRosachinensis;a-right.Ahealthyone;b.virescenceonRosachinensis;c.virescenceonchrysanthemum(16)樱花植物上植原体病害在陕西省杨凌区的主干街道和校园内种植的樱花植物表现出多种植原体感染症状，在早春时间很多植株表现出典型的花器绿变症状，花瓣和花蕊都变成绿色的类似于叶片的结构；在春末至秋末个别植株表现为典型的黄化症状，叶片黄化焦枯，植株衰退；也有个别植株表现为植株衰退、小叶等症状；以上三种类型症状都是出现在不同植株上，没有在同一植株上出现（图2-20）。 第二章实验部分49图2-20植原体在樱花上引起的症状a-b.樱花花器绿变；c-d.樱花黄化；e-f.樱花小叶Fig.2-20Symptomscausedbyphytoplasmasonsakuraa-b.Flowervirescenceonsakura;c-d.Yellowsofleavesofsakura;e-f.Littleleavesonsakura(17)桃树黄化采自陕西省榆林市、渭南市、西安市、咸阳市、宝鸡市、汉中市附近的桃园，感病桃树表现为黄化、生长衰退、果实干瘪脱落等症状（图2-21）。图2-21桃树感染植原体后的症状，感病桃树表现为黄化、定稍枯死（A，B），小而干瘪的果实和叶片坏死（C，D）。Fig.2-21Symptomsinpeachtreesinfectedwithphytoplasmas.Thediseasedpeachtreesexhibitedyellowsanddieback(A,B),smallandwiltedfruit(C)andtatteredappearanceofleaves(D). 50西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究(18)葡萄黄化在陕西省杨凌周边地区荒废的葡萄园和宝鸡市周边荒废的葡萄园内，葡萄植株表现出零星的黄化、叶缘坏死、向内卷曲、枝条不能越冬枯死等症状（图2-22）。图2-22葡萄黄化症状a.叶片黄化、叶缘枯死；b.叶片内卷、枝条枯死Fig.2-22SymptomofyellowsonVitisviniferaa.Yellowsandnecrosisofleafedge;b.Leafrollandnecrosisonbranches(19)苦楝黄化在陕西省咸阳市周至县的苗木基地和杨凌区主干街道及西北农林科技大学校园内采集到表现为黄化症状的苦楝样品，感病苦楝树表现为叶片黄化、小叶、树势衰退（图2-23）。图2-23苦楝黄化症状a.左侧黄化植株，右侧健康植株；b.左侧黄化植株放大Fig.2-23Symptomofyellowsonchinaberrya-left.Thechinaberryshowsyellowssymptom;a-right.Ahealthyone;b.Amagnificationofpartiala-left(20)李树黄化 第二章实验部分51在陕西省杨凌地区的果园内发现了表现为叶片黄化、树势衰退、不能结果实的樱桃李树并采集样品（图2-24）。图2-24李树黄化症状A.表现黄花症状的李子树；B.黄花部位的局部放大Fig2-24Imagesofsymptomaticcherryplumtreesandthephytoplasma-likebodies.A.acherryplumtreewithyellowleafsymptoms;B.acloselookofthepaleyellowleavesinA.(21)苹果衰退在陕西省杨凌地区的一个苹果苗圃内采集到了生长树势衰退的苹果苗样品，表现为小叶、叶片内卷、生长衰退症状（图2-25）。图2-25植原体感染苹果树后苹果树表现为小叶、叶片内卷（a，b）和黄化（b）。Fig2-25Phytoplasma-infectedappletreeexhibitinglittleleavesandmargininvolute(a,b)andyellows(b).(22)普纳菊苣扁茎在陕西省杨凌区西北农林科技大学草业科学专业试验田内发现普纳菊苣表现为扁茎、叶片畸形等症状（图2-26）。 52西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图2-26a.植原体感染的普纳菊苣表现为叶片反常和畸形（箭头1所示），扁茎（箭头2所示）；b.健康植株。Fig2-26a.Phytoplasma-infectedPunachicoryshowingabnormalleavesandshootdistortion(markedwitharrow1),flatstem(markedwitharrow2);b.healthyplant.(23)中华小苦荬扁茎在陕西省的韩城市、合阳县、渭南市、武功县、周至县、杨凌区、宝鸡市等地区的麦田间的闲置空地上均采集到扁茎、花器聚合、叶片变小、茎秆变短等症状中华小苦荬（图2-27）。图2-27中华小苦荬感染植原体症状。A，茎秆弯曲；B，扁茎、茎变短；C，叶片变小；D，多个花序聚合；E-F，正常植株。Fig2-27Symptomsofphytoplasma-infectedChinaixeris.Thesymptomsarecurvingstem(A);flatstem,shortingstalk(C);narrowingleaves(B)andclusteringofmulti-inflorescence(D),comparedtoone(E).(24)桔梗扁茎在陕西省杨凌区西北农林科技大学的中草药基地的苗圃内，发现了被植原体感染的桔梗，主要表现为扁茎症状（图2-28）。 第二章实验部分53图2-28桔梗扁茎症状a.桔梗扁茎全株症状；b.左侧桔梗扁茎，右侧健康植株Fig.2-28SymptomofflatstemcausedbyphytoplasmasonPlatycodongrandifloruma.ThePlatycodongrandiflorumwithflatstemsymptom;b-left.Theflatstem;b-right.Ahealthyone(25)国槐扁茎在陕西省渭南市的华县、蒲城县、澄城县、白水县、大荔县、合阳县、富平县；咸阳市的武功县、兴平县、泾阳县、三原县、礼泉县、乾县、永寿县、彬县、旬邑县、淳化县；西安市的周至县、户县；宝鸡市的岐山县、扶风县及杨凌农业示范区所有的苗木基地都采集到了变现为扁茎、茎秆扭曲、丛枝症状的国槐幼苗（图2-29）。图2-29国槐扁茎症状左，扁茎症状槐树；右，健康植株Fig.2-29SymptomofflatstemonSophorajaponicaLeft.FlatstemonSophorajaponica;right.Ahealthyone(26)紫薇扁茎在陕西省西安市的西安交通大学校园、陕西师范大学校园、长安大学校园、咸阳市的咸阳师范学院校园、咸阳中医药大学校园、西北农林科技大学校园及杨凌高中校园、宝鸡市的宝鸡文理学院校园、宝鸡一中校园、汉中市主干街道等地种植的观赏紫薇上均有扁茎病害发生（图2-30）。 54西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图2-30紫薇扁茎症状左.扁茎症状紫薇；右.健康植株Fig2-30SymptomofflatstemonLagerstroemiaindicaleft.FlatstemonLagerstroemiaindica;right.Ahealthyone(27)芝麻扁茎在陕西省周至县、杨凌区、宝鸡市扶风县农民种植的芝麻田内采集到表现扁茎症状的植株，主要表现为叶片变小、茎秆扁平、花器绿变、无果实等症状（图2-31）。图2-31芝麻扁茎症状左.扁茎症状芝麻；右.田间发病情况Fig.2-31SymptomofflatstemonsesameLeft.Topofaninfectedone;right.Theinfectedsesameplantsinfield(28)草本植原体多样性在陕西省韩城市、合阳县采集的自生谷子表现为黄化症状（图2-32a），狗尾草表现为草穗绿变症状（图2-32c），自生小麦表现为矮缩、黄化、叶片卷曲症状（图2-32h）；在三原县、蓝田县、周至县、杨凌区、扶风县采集的狗尾草表现为红叶和草穗绿变症状（图2-32d），自生小麦也表现为矮缩、黄化、叶片卷曲症状（图2-32h）；在杨凌地区采集的自生谷子表现为红叶症状（图2-32b）；在渭南市、铜川市、西安市、咸阳市、 第二章实验部分55宝鸡市、汉中市、安康市、商洛市内采集的草坪草狗牙根表现为白叶、叶片套叠、黄化等症状（图2-32e、f）；在杨凌区、宝鸡市枣园内采集的马塘草表现为黄化症状（图2-32g）。图2-32植原体在草本植物上引起的症状Fig.2-32Symptomscausedbyphytoplasmasonherbaceousplants(29)马铃薯紫顶（potatopurpletop）植原体从陕西省榆林市的横山县、米脂县、吴堡县、清涧县、子洲县；延安市的延安县、安塞县、志丹县、吴旗县、富县、内蒙古鄂尔多斯市、宁夏固原市的马铃薯种植区域内我们发现了一种新的病害在马铃薯上发生，感病植株表现为顶部叶片变为紫色、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根部薯块也为绿色没有食用价值，根系坏死等症状（图2-33）图2-33植原体引起的马铃薯紫顶病A.植原体感染的马铃薯植株；B.感病后，薯块长出地面；C.感病植株上的巨芽Fig.2-33PhytoplasmaassociatedpotatopurpletopdiseaseA.adiseasedpotatoplant;B.thepotatogrowsoutofsoilfromunderneath;C.abigbudonthediseasedpotatoplant 56西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究2.1.4小结采用植原体16SrRNA基因通用引物P1/P7从19种表现为植原体侵染症状的植物材料中扩增到了1.8kb的目标片段，这19种植物病害分别为：泡桐丛枝、枣疯、酸枣丛枝、凌霄花丛枝、甜樱桃丛枝、仙人掌丛枝、国槐丛枝、刺槐丛枝、南瓜丛枝、苦楝丛枝、油菜绿变、狗尾草绿变、樱花黄化、桃树黄化、苦楝黄化、中华小苦荬扁茎、狗尾草红叶、马铃薯紫顶、狗牙根白叶。以P1/P7为引物的直接PCR产物用灭菌双蒸水稀释30倍后为模板，用R16F2n/R2引物对进行巢式PCR从39种表现为植原体侵染症状的植物材料中扩增到1.2kb的目标片段。这39中植物样品除了上面提到的19种植物病害外，还包括以下20种病害：苜蓿丛枝、早园竹丛枝、菲白竹丛枝、五角枫丛枝、辣椒丛枝、凤仙花绿变、月季绿变、菊花绿变、樱花绿变、马唐黄化、葡萄黄化、紫荆花黄化、谷子黄化、苹果衰退、普纳菊苣扁茎、桔梗扁茎、国槐扁茎、紫薇扁茎、芝麻扁茎、谷子红叶。从西北地区四省区及内蒙古鄂尔多斯市境内采集的218份植物病害样品中201份PCR鉴定为植原体感染，201份鉴定为植原体感染的植物材料属于39种植物，依据植物种类我们命名了39种植原体病害，初步明确了西北地区植原体病害的种类。从巢式PCR结果得知基于直接PCR结果进行的巢式PCR检测结果要比直接PCR灵敏，在植原体检测中更适合采用巢式PCR的方式，这可能与不同种植物材料中植原体浓度高低有关。直接PCR扩增结果获得阳性最多的是丛枝型植原体病害，花器绿变型、黄化型和扁茎型植原体病害次之，这可能是丛枝型植原体病害样品中植原体浓度相对较高；其中在禾本科植物上发生的植原体病害是西北地区发生最多的植原体病害。2.2西北地区植原体株系多样性研究至今为止，人们一直尝试形态学结合分子的方式对植原体进行分类，但是植原体不能纯培养严重制约了这一经典原核生物分类方法在植原体分类中的应用。虽然Contaldo等于2012年报道了植原体的纯培养方法，但是目前这个方法还没有广泛应用，他们的报道也只是在个别组植原体上成功应用。植原体没有细胞壁，在植物韧皮部寄生要承受来至于植物的渗透压力所以呈现多形态性，就目前的研究来看，通过透射电子显微镜在寄主植物上观察到的植原体从形态上差异不大，都是呈现多形态性，只是大小有差异，但是这些大小差异也并不规律。因此，单纯的电镜形态差异还不能作为分类依据，只能作为病害鉴定依据。目前分子主要依靠分子数据，目前应用最多的分子数据是16SrRNA基因、rp基因及tuf基因，16SrRNA基因在植原体组的分类上应用最为广泛，rp基因和tuf基因更在植原体亚组分类地位的划分中应用更为广泛。在本研究中，我们针对2.1中鉴定到的39种植原体病害，通过PCR扩增、连接、转化、提取质粒及测序等技术分别获得了上述39种植原体近全长16SrRNA基因序列，并获得了部分植原体的rp基因序列，基于这些分子数据进行了一致性分析、系统发育 第二章实验部分57分析、RFLP分析明确了上述株系的分类地位。2.2.1材料与方法2.2.1.1植物材料本研究中所用植物材料来至于2.1陕西省植原体病害种类鉴定中经分子鉴定为阳性的39种感病植物。2.2.1.2植原体16SrRNA基因感病材料总DNA提取过程详见2.1.1.3实验操作指南（3），提取结果详见2.1.3.1；16SrRNA基因直接和巢式PCR扩增详见2.1.2疑似植原体病害植物材料分子鉴定。2.2.1.3植原体rp基因克隆(1)16SrVI组植原体rp基因扩增参考Martini等(2007)报道16SrVI组植原体核糖体蛋白基因特异性引物rpF1C/rp(I)R1A（表2-2）进行核糖体蛋白基因的克隆。表2-2PCR扩增16SrVI组植原体rp因所用引物的核苷酸序列引物名称引物序列（5’-3’）Tm值（℃）参考文献rpF1CGTTCTTTTTGGCATTAACAT52Martinietal.2007rp(I)R1AATGGTGGGTCATAAATTAGG56Martinietal.2007a.PCR反应体系：体系组成体积量（μL）终浓度总DNA模板1.020ngPrimerrpF1C(10μmol/L)1.00.4μmol/LPrimerrp(I)R1A(10μmol/L)1.00.4μmol/L10×PCRBuffer2.51×dNTPs(2.5mmol/L)1.00.1mmol/LTaqDNA聚合酶5U/μl0.52.5U加ddH2O至25b.PCR反应条件：预变性温度94℃3min变性温度94℃30s退火温度50℃30s延伸温度72℃2min步骤2-430个循环补平72℃10min 58西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究(2)16SrI组植原体rp基因扩增参考Martini等(2007)报道16SrI组植原体核糖体蛋白基因特异性引物rpF1/rpR1进行直接PCR扩增，将直接PCR产物用灭菌双蒸水按照1:30倍稀释后进行巢式PCR扩增，所用引物为rp(I)F1A/rp(I)R1A(表2-3)表2-3PCR扩增16SrI组植原体rp因所用引物的核苷酸序列引物名称引物序列（5’-3’）Tm值（℃）参考文献rpF1GGACATAAGTTAGGTGAATTT56Martinietal.2007rpR1ACGATATTTAGTTCTTTTTGG54Martinietal.2007rp(I)F1ATTTTCCCCTACACGTACTTA58Martinietal.2007rp(I)R1AGTTCTTTTTGGCATTAACAT58Martinietal.2007A.直接PCR反应体系体系组成体积量（μL）终浓度总DNA模板1.020ngPrimerrpF1(10μmol/L)1.00.4μmol/LPrimerrpR1(10μmol/L)1.00.4μmol/L10×PCRBuffer2.51×dNTPs(2.5mmol/L)1.00.1mmol/LTaqDNA聚合酶5U/μl0.52.5U加ddH2O至25B.PCR反应条件：预变性温度94℃10min变性温度94℃1min退火温度50℃2min延伸温度72℃3min步骤2-435个循环补平72℃7minC.巢式PCR反应体系体系组成体积量（μL）终浓度模板(rpF1/rpR1为引物直接1.0PCR产物1:30稀释) 第二章实验部分59Primerrp(I)F1A(10μmol/L)1.00.4μmol/LPrimerrp(I)R1A(10μmol/L)1.00.4μmol/L10×PCRBuffer2.51×dNTP(2.5mmol/L)1.00.1mmol/LTaqDNA聚合酶5U/μl0.52.5U加ddH2O至25D.PCR反应条件：预变性温度94℃10min变性温度94℃1min退火温度50℃2min延伸温度72℃3min步骤2-435个循环补平72℃7min(3)16SrV组植原体rp基因扩增16SrV组植原体核糖体蛋白基因的克隆采用半巢式PCR，参考引物为rp(V)F1/rpR1，rp(V)F2/rpR1(表2-4)(Leeeta1.1998)。表2-4PCR扩增16SrV组植原体rp因所用引物的核苷酸序列引物名称引物序列（5’-3’）Tm值（℃）参考文献rp(V)F1TCGCGGTCATGCAAAAGGCG64Leeetal.1998rp(V)F2TTGCCTCGTTTATTTCCGAGAGCTA72Leeetal.1998rpR1ACGATATTTAGTTCTTTTTGG54Leeetal.1998A.直接PCR反应体系体系组成体积量（μL）终浓度总DNA模板1.020ngPrimerrp(V)F1(10μmol/L)1.00.4μmol/LPrimerrpR1(10μmol/L)1.00.4μmol/L10×PCRBuffer2.51×dNTP(2.5mmol/L)1.00.1mmol/LTaqDNA聚合酶5U/μL0.52.5U加ddH2O至25 60西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究B.PCR反应条件：预变性温度94℃5min变性温度94℃1min退火温度50℃2min延伸温度72℃3min步骤2-435个循环补平72℃7minC.巢式PCR反应体系：体系组成体积量（μL）终浓度模板(rp(V)F1/rpR1为引物直接1.0PCR产物1:30稀释)Primerrp(V)F2(10μmol/L)1.00.4μmol/LPrimerrpR1(10μmol/L)1.00.4μmol/L10×PCRBuffer2.51×dNTPs(2.5mmol/L)1.00.1mmol/LTaqDNA聚合酶5U/μl0.52.5U加ddH2O至25D.PCR反应条件：预变性温度94℃5min变性温度94℃1min退火温度50℃2min延伸温度72℃3min步骤2-435个循环补平72℃7min2.2.1.4克隆及测序凝胶制备和电泳检测详见2.1.1.3基本实验操作（4）和（5）(1)PCR阳性样品回收对电泳检测为阳性样品进行回收，1.0%琼脂糖凝胶，大孔梳子胶孔至少加载25μLPCR产物和5μL1×DNALoadingbuffer。每回收一个样品所用电泳缓冲液（1×TAE）和EB均为新鲜配制（避免交叉污染）。割胶所用刀片每次用水冲洗后用无水乙醇擦干净，割胶所用台面每次擦干净并将凝胶垫在一次性手套上后在割胶。PCR扩增产物用北京百泰克生物技术有限公司生产的快捷型琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收。具体方法参 第二章实验部分61照试剂盒说明：A.在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含目标片段的凝胶，得到凝胶体积越小越好；B.将切下含有目标条带凝胶放入1.5mL离心管，称重（先称一个空1.5mL离心管称重并去皮，然后放入凝胶块后再称量一次，所显示数字即为凝胶重量）；C.加入一到两倍体积凝胶结合液DB（如果凝胶重为0.19g，其体积可视为100μL，则加入100-200μL凝胶结合液；如果凝胶浓度大于2%，应加入2-4倍体积溶胶液结合液；凝胶块最大不能超过400mg。如果超过400mg，请用多个离心柱进行回收）；D.56℃水浴放置3-5min（或直至胶完全溶解），每1-2min涡旋震荡一次帮助加速溶解；E.将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液（如果总体积超过750μL，可分两次将溶液加入同一个吸附柱中）；F.加入700μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心1min，弃掉废液；G.将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应H.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2min，12000rpm离心lmin如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心lmin（洗脱液体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积）。(2)回收产物连接反应A.连接反应体系如下：目的DNA4.7μLpMDl8-Tvector0.3μLSolutionI5.0μL总体积10.0μLB.连接反应条件：16℃1h，4℃过夜。(3)转化A.从-80℃冰箱中取出制备的E.coliJM109感受态细胞（每管50μL），加入连接液5μL，用微量移液器轻轻混合两者，冰置30min；B.将冰置了30min的1.5mL的离心管放入事先设置好温度的42℃水浴锅中热激30s；C.取出后在冰上冰置5min； 62西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究D.加入300uLLB液体培养基，混匀后转入试管中，37℃复苏90min；E.打开超净台，紫外灭菌15min，在酒精灯焰下将涂菌铲用外焰灭菌并冷却至室温；F.取100μL复苏菌液加到Amp（100μg/mL）LB固体培养基上，平板上已经涂有X-gal和IPTG，用涂菌铲涂均匀；G.倒置平皿，于37℃培养过夜；H.用灭菌的牙签挑取白色单菌落，放入含抗生素的培养基中（3mLLB液+3μLAmp），37℃，220rpm/min过夜培养。(4)菌液PCR鉴定A.菌液PCR反应体系：体系组成体积量（μL）终浓度模板1.0（过夜培养菌液）保守基因上游引物1.00.4μmol/L(10μmol/L)保守基因下游引物1.00.4μmol/L(10μmol/L)10×PCRBuffer2.51×dNTP(2.5mmol/L)1.00.1mmol/LTaqDNA聚合酶5U/μl0.52.5U加ddH2O至251.0%琼脂糖凝胶检测PCR结果，对经PCR鉴定为阳性菌液进行质粒提取。(5)质粒提取采用北京博大泰克生物基因技术有限公司生产的B型小量质粒快速提取试剂盒抽提质粒，具体步骤如下：A.1.5mL离心管收集菌体，室温12000rpm离心1min，分两次收集过夜培养的3mL菌液；B.用100μL溶液1充分重悬细胞至管底没有沉淀并且无块状悬浮；C.加入150μL溶液2，立即温和上下颠倒离心管5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液，随后将离心管放置于冰上1-2min；D.加入150μL溶液3，立即温和颠倒离心管数次至蛋白絮状沉淀不再增加，室温放置5min12000rpm离心5-8min；E.向一个新的吸附柱中加入420μL结合缓冲液，然后将上清小心转移至离心吸附柱中，尽量避免取到蛋白沉淀，混匀； 第二章实验部分63F.室温12000rpm离心30s，倒掉废液收集管中的液体，将离心吸附柱装回废液收集管；G.向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心30s倒掉废液并将离心吸附柱装回废液收集管；H.重复步骤G；I.倒掉废液后将离心吸附柱装回废液收集管，空管12000rpm离心2min以完全去除漂洗液；J.将吸附柱移至一个干净的1.5mL离心管中，向吸附柱膜中央加入50μL洗脱缓冲液，室温放置1-2min，12000rpm离心2min；K.采用核酸微量分析仪测定质粒浓度。(6)重组质粒酶切鉴定由于外源片段插入到了pMDl8-Tvector多克隆位点的两个EcoRI酶之间，因此采用EcoRI对提取质粒进行酶切验证。A.酶切体系如下：10×限制性内切酶缓冲液2.0μLEcoRI1.0μL质粒DNA100ng灭菌水补充体系至20μLB.反应条件：37℃保温1.5h，1%琼脂糖凝胶检酶切结果。(7)测序重组质粒委托宝生物工程（大连）有限公司测序，一般一个样品测3个阳性克隆，便于测序结果互为参考，测序过程采用桑格双脱氧法，采用两端测序的方式：测序过程所用引物为：M13F:GGTAACGCCAGGGTTTTCC；M13R:CAGGAAACAGCTATGACC每个测序反应可以测定700-800bp，可以满足本研究中16SrRNA基因巢式PCR、rp基因、tuf基因克隆结果测序，对于以P1/P7为引物的直接PCR扩增结果克隆后测序还需要根据两端测序结果在设计一对内部的测序引物来完成整个片段测序，因为P1/P7扩增片段长度为1.8kb。2.1.1.5序列分析将测序返回结果通过LaserGeneprogram(version7.1.0,DNASTAR,Madison,USA)和VectorNTIAdvance11Program(Invitrogen)11.5进行校正和拼接。校正并拼接好后，将获得的序列输入GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLASTn比对，初步确定获得序列的基本信息。采用DNAMAN6.0软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中 64西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究收录的植原体相应基因进行核酸和氨基酸一致性分析。系统发育进化树构建使用MAGA5.0（Tamuraetal.2007），采用NJ法（Neighbour-Jioning），重复值为1000进行Bootstrap效验，选择AcholeplasmalaidlawiiJA1（M23932）为外参。2.2.2结果与分析2.2.2.116SrRNA序列基本特征从以上39种寄主植物种，分析得到40种16SrRNA基因序列。其中，在南瓜中，得到两个不同的16SrRNA基因序列。该40个16SrRNA基因序列基本特征如下（表2-5）。表2-540个植原体株系16SrDNA长度、GC含量和登录号Table2-5Thelength,GC%andGenBankaccessionno.of16SrRNAof40phytoplasmas16SrRAN基因GenBank植原体株系Size(bp)G+C（%）登录号泡桐丛枝（Paulowniawitches'-broom，PauWB）123747DQ851169酸枣丛枝（Wildjujubewitches'-broom，WjWB)123946DQ886426枣疯（Jujubewitches'-broom，JWB)123946DQ919060狗牙根白叶（Cynodondactylonwhiteleaves，CdWL)124746EU999999苦楝丛枝（Chinaberrywitches'-broom，CbWB)124647FJ537132苦楝黄化（Chinaberryyellows，CY)124647FJ537133苹果衰退（Appledecline，AD)124846GU586972樱桃李黄化（Cherryplumyellows，CpY)124647HM131809中华小苦荬扁茎（Chinaixerisflatstem，CiFS)124647HM990973凤仙花绿变（RoseBalsamphyllody，RBP)124647HQ646367辣椒丛枝（Pepperwitches'broom，PepWB)124547JF734910仙人掌丛枝（Cactuswitches'broom，CaWB)124747JN582265普纳菊苣扁茎（Punachicorywitches'broom，PcWB)124846JN582266五角枫丛枝（Japanesemaplewitches'broom，JmWB)124647JQ015183苜蓿丛枝（Alfalfawitches'broom，AWB)124846JQ343221桃黄化（Peachyellows，PY)124846KF523369凌霄花丛枝（Chinesetrumpetcreeperwitches'broom，CtcWB)124647未提交（见附录2）甜樱桃丛枝（Sweetcherrywitches'broom，ScWB)124846未提交（见附录2）国槐丛枝（Sophorajaponicawitches'broom，SjWB)124846未提交（见附录2）刺槐丛枝（Robiniapseudoacaciawitches'broom，RpWB）124846未提交（见附录2）南瓜丛枝1（Squashwitches’broom1，SWB1）124447未提交（见附录2）南瓜丛枝2（squashwitches’broom2，SWB2）124347未提交（见附录2） 第二章实验部分65早园竹丛枝（Phyllostachyspropinquawitches'broom，PpWB）124647未提交（见附录2）菲白竹丛枝(Sasafortunewitches'broom，SfWB）124647未提交（见附录2）油菜绿变(Brassicarapavirescence，BrV）125145未提交（见附录2）狗尾草绿变(Greenbristlegrassvirescence，GbV）124647未提交（见附录2）月季绿变(Rosachinensisvirescence，RcV)124647未提交（见附录2）菊花绿变(Chrysanthemumvirescence，CV)124647未提交（见附录2）樱花绿变(Sakuravirescence，SV)124547未提交（见附录2）樱花黄化(Sakurayellows，SY)124846未提交（见附录2）马唐黄化(Digitariayellows，DY)124846未提交（见附录2）葡萄黄化(Vitisviniferayellows，VvY)124647未提交（见附录2）谷子黄化(Milletyellows，MY)124647未提交（见附录2）桔梗扁茎(Platycodongrandiflorumflatstem，PgFS)124647未提交（见附录2）国槐扁茎(Sophorajaponicaflatstem，SjFS)124347未提交（见附录2）紫薇扁茎(Lagerstroemiaindicaflatstem，LiFS)124647未提交（见附录2）芝麻扁茎(sesameflatstem，SFS)124647未提交（见附录2）谷子红叶(Milletreddening，MR)124647未提交（见附录2）狗尾草红叶(Greenbristlegrassreddening，GbR)124647未提交（见附录2）马铃薯紫顶(Potatopurpletop，PpT)125645未提交（见附录2）2.2.2.2基于16SrRNA序列的系统发育分析将获得的40个植原体株系16SrRNA基因序列（表2-5）与IRPCM（国际比较菌原体学研究计划署）已经明确的8个植原体暂定种：Ca.P.asteris、Ca.P.solani、Ca.P.aurantifolia、Ca.P.cynodontis、Ca.P.trifolii、Ca.P.ziziphi以及作为外参的AcholeplasmalaidlawiiJA1（M23932）进行序列比对，并构建系统发育树（图2-34）。从图上可以看出植原体聚集形成一个大的分枝，明显区别于支原体Acholeplasmalaidlawii。从系统发育树上可以看出：（CY）（PgFS）（CV）（VvY）（GbR）（PauWB）（SjFS）（CbWB）（PepWB）（SV）（LiFS）（RBP）（CpY）（JmWB）（RcV）（MR）（PpWB）（SFS）与“Ca.P.asteris”聚集在一起形成一个独立的分枝，表明该18个植原体株系与“Ca.P.asteris”暂定种亲缘关系较近；另外，该分枝与（CiFS）（CtcWB）（MY）（SfWB）（GbV）形成的分枝关系最近。在16Sr分类系统中，“Ca.P.asteris”为16SrI组的代表株系，因而据此可以推断该23个株系属于16SrI组。南瓜丛枝植原体的2个株系（SWB1和SWB2）与“Ca.P.solani”聚成一个分枝，表明他们属于16SrXII组；仙人掌丛枝（CaWB）与“Ca.P.aurantifolia”聚集，表明属于16SrII组；狗牙根白叶（CdWL）与“Ca.P.cynodontis”聚集，属于16SrXIV组；油菜绿变（BrV）和马铃薯紫顶（PpT）与“Ca.P.trifolii”聚集，属于16SrVI组。甜 66西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究樱桃丛枝（ScWB）、马唐黄化（DY）、刺槐丛枝（RpWB）、酸枣丛枝（WjWB）、枣疯病（JWB）、桃黄化（PY）、国槐丛枝（SjWB）、苹果衰退（AD）苜蓿丛枝（AWB）、普纳菊苣扁茎（PcWB）、樱花黄化（SY）与Ca.P.ziziphi聚集成簇，形成一个大的分枝，表明他们属于16SrV组。以上结果表明该40个植原体株系与特定的暂定种关系较近，可能属于该暂定种；但是是否确实属于，还需要进一步对其昆虫介体、寄主范围等多种因素综合分析考虑。同时，明确了植原体的16Sr组所属情况。基于上面的分析结果我们确定了上述40个植原体株系分别属于16SrI组、16SrV组、16SrVI组、16SrXII组和16SrXIV组。将这40个植原体株系分别与所在植原体组中各亚组代表株系进行16SrDNA进行序列比对，并构建系统发育进化树（图2-34）。从系统发育树中，可以看出：辣椒丛枝（PepWB）、樱花绿变（SV）聚集，并与凤仙花绿变（RBP）、谷子红叶（MR）、五角枫丛枝（JmWB）、月季绿变（RcV）、樱桃李黄化（CpY）、紫薇扁茎（LiFS）进一步聚集成簇，早园竹丛枝（PpWB）与芝麻扁茎（SFS），泡桐丛枝（PauWB）与国槐扁茎分别聚集，以上3个分枝与狗尾草红叶（GbR）、菊花绿变（CV）、苦楝黄化（CY）、葡萄黄化（VvY）、桔梗扁茎（PgFS）、OY-M（NC_005303）、PaWB（AY265206）最终聚集形成一个大的分枝，其中OY-M（NC_005303）为16SrI-B亚组代表，PaWB（AY265206）为16SrI-D亚组代表。由于PaWB具有两个异质的16SrRNA基因，所以他们在分类上常常属于16SrI-B/D亚组，因此，由上述可知该18个植原体株系与16SrI-B/D亲缘关系密切，但分类地位暂时不明确，需要进一步RFLP分析确认。中华小苦荬扁茎（CiFS）、凌霄花丛枝（CtcWB）、狗尾草绿变（GbV）、菲白竹丛枝（SfWB）、谷子黄化（MY）与三叶草绿变植原体（CPh，AF222065）聚集在一个分枝，关系密切，因此，其与三叶草绿变植原体（CPh）分类地位一致，为16SrI-C亚组。南瓜丛枝植原体（SWB1和SWB2）与“Ca.P.solani”（AJ964960，16SrXII-A亚组）聚成一个分枝，说明这两个株系可能属于16SrXII-A亚组；仙人掌丛枝（CaWB）与云南仙人掌丛枝株系（CWB，AJ293216）聚集，属于16SrII-A亚组；狗牙根白叶（CdWL）与“Ca.P.cynodontis”（AJ964960，16SrXIV-A亚组）聚集，属16SrXIV-A亚组；油菜绿变（BrV）和马铃薯紫顶（PpT）与“Ca.P.trifolii”（AJ964960，16SrVI-A亚组）聚成，可能为16SrVI-A，确切分类地位需要RFLP分析进一步确定。马唐黄化（DY）与JWB-G1株系（AB052876）聚集，苹果衰退（AD）与苜蓿丛枝（AWB）聚集，并与甜樱桃丛枝（ScWB）、酸枣丛枝（WjWB）、国槐丛枝（SjWB）、枣疯（JWB）、桃黄化（PY）、刺槐丛枝（RpWB）、普纳菊苣扁茎（PcWB）、樱花黄化（SY）构成大的分枝，说明几个植原体株系可能属于16SrV-B亚组，确切分类地位需要RFLP分析进一步确定。 第二章实验部分67图2-34根据40个植原体16SrRNA基因序列和各亚组代表株系构建的系统发育树箭头指示代表株系Fig.2-34Thephylogenetictreeinferredfromthe16SrRNAgenesequencesofthe40phytoplasmastrainsandtherepresentativestrainsof16Srgroups(narrowsindicatedtherepresentativestrains)2.2.2.3rp基因扩增结果和序列分析采用16SrVI组植原体rp基因特异引物rpF1C/rp(I)R1A从表现花器绿变症状的油菜和表现紫叶和叶腋增殖的马铃薯植株中获得了1.2kb的目标片段（图2-35）。 68西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究采用16SrI组植原体rp基因特异rpF1/rpR1和rp(I)F1A/rp(I)R1A进行巢式PCR从表现丛枝、黄化症状的苦楝；表现丛枝条症状凌霄花；表现花器绿变、红叶、黄化症状的狗尾草样品中均获得了1.2kb的目标片段(图2-35)。图2-3516SrI组植原体和16SrVI组植原体rp基因PCR结果电泳图目标片段均为1.2kb;1-5：采用16SrI组植原体rp基因特异rpF1/rpR1和rp(I)F1A/rp(I)R1A进行巢式PCR；6-7：采用16SrVI组植原体rp基因特异引物rpF1C/rp(I)R1A进行直接PCR；阴性对照：灭菌双蒸水Fig.2-35.Therpgenefragmentsofphytoplasmasofgroups16SrIand-VgeneratedbyPCRThesizeoftargetbandsis1.2kb;1-5:PCRproductsampliedusingprimerpairsrpF1/rpR1andrp(I)F1A/rp(I)R1A;6and7:PCRproductsampliedusingprimerpairsrpF1C/rp(I)R1A;negativecontrol:doubledistilledwater采用植原体16SrV组植原体rp基因特异rp(V)F1/rpR1和rp(V)F2/pR1进行半巢式PCR从表现丛枝症状的甜樱桃、枣疯、酸枣丛枝、国槐、刺槐样品中均获得了0.9kb的目标片段(图2-36)。 第二章实验部分692-3616SrV组植原体rp基因PCR结果电泳图目标片段均为0.9kb；阴性对照：灭菌双蒸水；阳性对照：樱桃致死性黄化Fig.2-36ThePCRproductsofrpgenesofphytoplasmasof16SrVgroupThesizeoftargetfragmentis0.9kb;negativecontrol:doubledistilledwater;positivecontrol:cherrylethalyellows2.2.2.4rp基因序列基本特征rp基因测序返回结果处理方式同16SrRNA基因，基本信息（表2-6）。表2-612个植原体株系rp基因特性Table2-6Thefeatureoftherpgenefragmentsofthe12phytoplasmastrainsrp基因长GenBank植原体株系度(bp)登录号酸枣丛枝（Wildjujubewitches'-broom，WjWB)926未提交（见附录3）枣疯（Jujubewitches'-broom，JWB)926未提交（见附录3）苦楝黄化（Chinaberryyellows，CY)1242未提交（见附录3）凌霄花丛枝（Chinesetrumpetcreeperwitches'broom，CtcWB)1212未提交（见附录3）甜樱桃丛枝（Sweetcherrywitches'broom，ScWB)926未提交（见附录3）国槐丛枝（Sophorajaponicawitches'broom，SjWB)1191未提交（见附录3）刺槐丛枝（Robiniapseudoacaciawitches'broom，RpWB）1191未提交（见附录3）油菜绿变(Brassicarapavirescence，BrV）1269未提交（见附录3）狗尾草绿变(Greenbristlegrassvirescence，GbV）1222未提交（见附录3）狗尾草红叶(Greenbristlegrassreddening，GbR)1242未提交（见附录3）马铃薯紫顶(Potatopurpletop，PpT)1269未提交（见附录3）苦楝丛枝（Chinaberrywitches'-broom，CbWB）1242未提交（见附录3）2.2.2.5基于rp基因序列的系统发育分析基于获得的12个rp基因序列我们选用AV2192(AY264858)、HYDP（AY264868）、MBS（AY264858）、PWB(EF183487)、CP(EF183486)、CLY5(AY197679)、PYIn(AY197680)为参考序列，构建了他们的系统发育进化树（图2-37）。其中AV2192属于rpI-B亚组、 70西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究MBS属于rpI-L亚组、HYDP属于rpI-B亚组、PWB属于rpVI-A亚组、CP属于rpVI-A亚组、CLY5和PYIn属于rpV-B亚组。从树上可以看出WjWB、ScWB、JWB、RpWB、SjWB与CLY5、PYIn聚集在一起，说明这5个植原体株系属于rpV-B亚组。BrV与PpT形成单独分枝，并与PWB、CP形成单独一枝，表明BrV、PpT与rpVI-A亚组关系很近。CtcWB、GbV、GbR、CY、CbWB与AV2192、HYDP及MBS聚合在一起，形成一个大的分枝，表明这5个植原体株系属于rpI组，但亚组无法确定，需要进一步的证据。图2-37基于12个植原体株系rp基因和已知rp序列构建的系统发育进化树Fig.2-37thephylogenictreeinferredfromrpgenesequencesofthe12phytoplasmasandrepresentativestrains2.2.2.6RFLP分析确定亚组分类地位应用基于植原体16SrRNA基因R16F2n/R2区间、可以和GenBank数据库中其他植原体16SrRNA基因序列相关联的植原体在线分类工具iPhyclassifier（Zhaoetal.2009）对获得的植原体进行分类，确定组和亚组分类地位（图2-38）。 第二章实验部分71 72西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图2-38在线分类工具iPhyclassifier构建的40个植原体株系虚拟RFLP分析图依次为AD、AWB、BrV、CaWB、CbWB、CdWL、CiFS、CpY、CtcWB、CV、CY、DY、GbR、GbV、JmWB、JWB、LiFS、MR、MY、PauWB、PcWB、PepWB、PgFS、PpT、PpWB、PY、RBP、RcV、RpWB、ScWB、SFS、SfWB、SjFS、SiWB、SV、SWB1、SWB2、SY、VvY、WjWBFig.2-38ThevituralRFLPpatternsofthe40phytoplasmastrainsgeneratedbyiPyclassifierThephytoplasmastrainsare:AD,AWB,BrV,CaWB,CbWB,CdWL,CiFS,CpY,CtcWB,CV,CY,DY,GbR,GbV,JmWB,JWB,LiFS,MR,MY,PauWB,PcWB,PepWB,PgFS,PpT,PpWB,PY,RBP,RcV,RpWB,ScWB,SFS,SfWB,SjFS,SiWB,SV,SWB1,SWB2,SY,VvYandWjWB 第二章实验部分73iPhyclassifier软件是基于16SrRNA基因R16F2n/R2区间序列，用软件中存储的17种限制性内切酶进行虚拟酶切，然后和DB2数据库中所有植原体组和亚组代表株系相同区间的虚拟酶切结果进行比较从而得出相似性系数，其中植原体组的划分标准是0.85，即相似性系数小于等于该数值时可以划分出新的组，亚组的划分标准是0.97，当相似性系数小于等于该数值是可以划分为新的亚组。根据iPhyclassifier软件的输出结果我们明确了39个植原体株系的分类地位:苹果衰退（AD）属于16SrV-B亚组，AWB属于16SrV-B亚组，油菜绿变（BrV）属于16SrVI-A亚组，仙人掌丛枝属于16SrII-A亚组，苦楝丛枝（CbWB）属于16SrI-B亚组，狗牙根白叶（CdWL）属于16SrXIV-A亚组，中华小苦荬扁茎（CiFS）属于16SrI-C亚组、樱桃李黄化（CpY）属于16SrI组一个新的亚组、凌霄花丛枝（CtcWB）属于16SrI-C亚组、菊花绿变（CV）属于16SrI-B亚组、苦楝黄化（CY）属于16SrI-B亚组、马唐黄化（DY）属于属于16SrV-B亚组、狗尾草红叶（GbR）属于16SrI-B亚组、狗尾草绿变（GbV）属于16SrI-B亚组、五角枫丛枝（JmWB）属于16SrI-D亚组、枣疯病（JWB）属于16SrV-B亚组、紫薇扁茎（LiFS）属于16SrI组新亚组、谷子红叶（MR）属于16SrI-B亚组、谷子黄化（MY）属于16SrI-C亚组、泡桐丛枝（PauWB）属于16SrI-D亚组、普纳菊苣扁茎（PcWB）属于16SrV-B亚组、辣椒丛枝（PepWB）属于16SrI-B亚组、桔梗扁茎（PgFS）属于16SrI组新亚组、马铃薯紫顶（PpT）属于16SrVI-A亚组、早园竹丛枝（PpWB）属于16SrI组新亚组、桃黄化（PY）属于16SrV-B亚组、凤仙花绿变（RBP）属于16SrI-B亚组、月季绿变（RcV）属于16SrI-B亚组、刺槐丛枝（RpWB）属于16SrV-B亚组、甜樱桃丛枝（ScWB）属于16SrV-B亚组、芝麻扁茎（SFS）属于16SrI-B亚组、菲白竹丛枝（SfWB）属于16SrI-C亚组、国槐扁茎（SjFS）属于16SrI组新亚组、国槐丛枝（SiWB）属于16SrV-B亚组、樱花绿变（SV）属于16SrI一个新亚组、SWB1属于16SrII-A亚组、SWB2属于16SrII组新亚组、樱花黄化（SY）属于16SrV-B亚组、葡萄黄化（VvY）属于16SrI-B亚组、酸枣丛枝（WjWB）属于16SrV-B亚组。 74西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究2.2.3小结1、从39个样品中获得了40个16SrRNA基因序列，这些序列长度在1242-1251bp之间，G+C含量在45.0-47.6％之间，这符合植原体16SrRNA基因低G+C含量的特征。2、基于16SrRNA基因序列构建的进化树分析证明，在陕西省存在的植原体与Ca.P.solani、Ca.P.trifolii、Ca.P.cynodontis、Ca.P.aurantifolia、Ca.P.ziziphi和Ca.P.asteris等6个暂定种关系密切。其中Ca.P.asteris和Ca.P.ziziphi种是发生最普遍，寄主最广泛，株系最多的。其中Ca.P.solani存在2个株系，Ca.P.trifolii存在2个株系，Ca.P.cynodontis存在1个株系、Ca.P.aurantifolia存在一个株系、Ca.P.ziziphi存在12个株系、Ca.P.asteris存在23个株系，在分类上分别属于16SrI-B亚组、16SrI-D亚组16SrI-C亚组和16SrI组新亚组；16SrII-A亚组；16SrV-B亚组；16SrVI-A亚组；16SrXII-A亚组和16SrXII组新亚组；16SrXIV-A组。3、基于rp基因的系统发育更加明确了WjWB、ScWB、JWB、RpWB、SjWB、CtcWB、GbV、GbR、CY、CbWB、BrV、PpT这12植原体株系的亚组分类。WjWB、ScWB、JWB、RpWB、SjWB这5个植原体株系属于rpV-B亚组，BrV、PpT与rpVI-A亚组关系很近，CtcWB、GbV、GbR、CY、CbWB这5个植原体株系属于rpI组。2.3植原体的透射电镜检测及其形态学自植原体被发现以来，一直无法实现对其离体培养。虽然，最近有报道称成功培养了植原体，但该方法尚不普遍或因种种因素，并未广泛应用。所以，目前为止，植原体的检测和鉴定，仍然主要依赖于分子生物学技术。传统的微生物学研究方法并不适用。通过对几个保守基因的研究，比如16SrRNA基因、tuf基因、rp基因、sec基因，达到诊断病害与植原体相关性的目的。因其简单易行、快速灵敏而被广泛适用，并被普遍认可。但同样由于这些参照基因的保守性，导致假阳性的可能。因此，在分子检测之后，通过组织学方法，如透射电子显微镜技术，对样品进行进一步检测，以植原体粒子的存在作为直接证据，具有十分重要的意义和必要性。本研究应用透射电子显微镜，检测了多个PCR阳性的样品的超薄切片。一方面，为病害与植原体的相关性，提供了直接的证据—植原体粒子的存在；另一方面，获得了相关植原体的形态学数据。2.3.1材料与方法2.3.1.1材料来源本研究使用的植物材料，主要取自PCR检测为植原体侵染呈阳性的新鲜植株。具体有：主要表现出丛枝症状的泡桐、苜蓿、五角枫、辣椒、狗牙根；表现黄化症状的苦楝、桃、樱桃李；有扁茎症状的普纳菊苣以及有衰退症状的苹果。 第二章实验部分752.3.1.2超薄切片制备参照Lietal等（2012）的方法进行样品制备，具体步骤如下：（1）从感病植株采摘新鲜叶片，用蒸馏水轻微冲洗叶表面，然后从叶中脉切出5mm×5mm的小块，立即放入2.5%的戊二醛固定液；抽真空，使样品完全浸没、沉入固定液；沉入固定液，4℃放置过夜。（2）倒掉旧的固定液，加入新的同一固定液，再固定3h;随后，移除固定液，用磷酸缓冲液（0.1M、pH7.0）漂洗1h，重复3或4次，每次使用新鲜磷酸缓冲液。（3）移除磷酸缓冲液，加入1%饿酸固定液（通风厨中进行），固定3h；再次漂洗，同（2）。（4）移除漂洗液，用乙醇梯度脱水：乙醇浓度依次为50%、70%（可过夜）、80%、90%、95%、100%，除100%乙醇脱水30min，其他浓度均脱水15min；最后加入环氧丙烷，30min，重复一次。（5）按说明配置Epon812包埋剂，按下列步骤注入瓶中：环氧丙烷:包埋剂=3:1，渗透1h；环氧丙烷:包埋剂=1:1，渗透1h；环氧丙烷:包埋剂=1:3，渗透2h；纯包埋剂渗透5h或过夜。（6）将样品按需求，放置于包埋板底部，注入包埋剂；随后在37℃聚合12h，45℃、12h，60℃、24h。（7）用单面刀片切割、修理包埋块前端，成梯形；随后，切片（ULTRACUT超薄切片机）；捞取超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色后，干燥处备用。2.3.1.3电镜检测将切片仔细检查、编号后，确认待检测的超薄切片位置正确，随后加载铜网；在透射电镜观测窗口，对切片进行检测，并照相记录。所使用的透射电镜型号为HT7700透射电子显微镜，检测电压为80kv。2.3.2结果与分析2.3.2.1植原体粒子检测结果通过对超薄切片的电镜观察，在被检测的10种植物材料中，均发现植原体粒子的存在。电镜检测与PCR检测结构一致（图2-40A-J）。2.3.2.2样品中植原体的形态学特征在该10个检测样品中，植原体颗粒均存在于植物的韧皮部，且筛管和伴胞中均有分布（图2-40D,E,H,I）。但由于超薄切片所能反映的信息量有限，并不能确定韧皮部薄壁细胞是否也有植原体存在。在细胞内，植原体的数量差别较大。有些样品的细胞内，植原体颗粒数量寥寥无几（图2-40B,C,J）；有些则塞满整个细胞，呈拥挤的状态（图2-40D,G,H）。另外，当植原体的颗粒数量较少时，倾向于沿着细胞壁分布（图2-40B,E,H,J）。 76西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究植原体粒子的形态比较多样，呈现多种形态，主要有圆球形、哑铃形和不规则的分枝形等形态，充分表现出植原体的多态性。观察的植原体粒子，其大小各不相同，200-850nm之间（表2-7）。同时，从表中可以看出，植原体粒子的大小，与寄主种类或症状并无明显关联。表2-7植原体粒子大小Table2-7Thesizeofparticlesofphytoplasmas病害症状草本寄主木本寄主粒子大小范植物种类植原体粒子植物种类植原体粒子围（nm）大小（nm）大小（nm）丛枝狗牙根250-300五角枫200-300250-840辣椒250-625泡桐400-550苜蓿300-400黄化苦楝450-850170-850桃250-450樱桃李170-550扁茎普那菊苣200-320—衰退苹果200-700—粒子大小200-625170-850范围（nm）从电镜图中可以看出，植原体粒子没有细胞壁，具有单层膜结构。在细胞的中心区域，有高浓度的纤维状结构，推测其为植原体的基因组DNA；沿细胞膜内侧，有一些高浓度的微小颗粒状物质，可能是植原体细胞内所含的核糖体。另外，还观察到一些细胞，其中部向内缢缩，可能是正处于二分裂增殖时期的菌体（图2-39），以及菌体细胞外膜向外凸起，形成芽状泡囊，可能是处于出芽增殖时期的细胞（图2-39G,I,J）。还可以看出，植原体能够穿过侧筛孔向相邻的细胞移动。其在穿越过程中，可能先附着于筛孔内的胞间连丝，然后再通过某种方式穿越细胞，而实现在细胞间的移动（图2-39D,E,H）。2.3.3总结1、本研究中，用透射电子显微镜，在待测的10个样品超薄切片中，检测到植原体粒子的存在。2、植原体粒子形态学特征明显：没有细胞壁，有单层膜包被的细胞；具有多种形态，且形态与寄主种类、病症并无明显关联。还观察到处于不同发育时期的植原体粒子。 第二章实验部分773、观察到附着于筛孔区的植原体粒子，其可能是植原体实现细胞间穿梭的重要方式。图2-39透射电镜观察到的植原体粒子样品依次为：表现丛枝症状的A，狗牙根；B，辣椒；C，苜蓿；D，泡桐；E，五角枫；表现黄化症状的：F，苦楝；G，桃；H，樱桃李；以及I，普那菊苣扁茎；J，苹果衰退（红色箭头指示每个植物细胞中的植原体粒子；CW，细胞壁）Fig2-39TheparticlesofphytoplasmasundertransmissionelectronmicroscopeA,Bermudagrasswitches’broom;B,pepperwitches’broom;C,alfalfawitches’broom;D,paulowniawitches’broom;E,Japanesemaplewitches’broom;F,Chianberryyellows;G,peachyellows,G,cherryplumyellows,I,Punachicoryflatstem;J,appledecline(Theredarrowsindicateaphytoplasmaparticleineachcell;CW,cellwall)2.4植原体资源保存自植原体被发现以来，至今无法培养。虽有文献称已经在该方面取得成果，但目前为止，仍未普遍推广。显然，想要在实验室保存植原体菌体资源，目前而言是无法实现的。另外，植原体在自然界中，有十分广泛的植物寄主。但是，其植物寄主也无法作为稳定的资源供体。首先，在室外，植物容易受到环境的影响，气候、动物取食、人为破坏等都能使植物寄主受到破坏，从而导致植原体资源的流失。另外，植物的生长习性，如一年生植物，常常随植物生长周期结束，其内寄生的植原体也会随之消失。这也是造成植原体资源流失的重要原因。再者，受到植原体侵染的植物，通常会随着年份的增加 78西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究而逐渐死亡。以上这些原因，决定了自然、野外的植物寄主不太可能成为保持植原体，以提供研究材料的介体。不过利用温室培养的长春花，相对成功地解决了这一难题。长春花属于夹竹桃科，是一种常见的多年生植物。选择长春花作为植原体的保存介体，主要是因为长春花非常容易受到植原体的侵染，并且能够表现出多种不同的症状。至于，为什么长春花对植原体敏感，目前并没有答案，但这并不影响人们选择应用长春花。在本研究中，我们采用嫁接、菟丝子传毒、昆虫饲喂传毒等不同的方法，成功地将几种植原体传播、保存到了长春花上。2.4.1材料与方法2.4.1.1材料(1)主要工具器材嫁接：单面刀片、封口膜菟丝子传毒：钩子、尼龙绳、起固定作用的材料昆虫传毒：捕虫网、纱网、有通气导管的玻璃试管、保持一定湿度的容器(2)植物材料温室内保存的健康长春花、传代繁殖的无毒菟丝子、用于保存菟丝子的无毒绣球(3)昆虫材料小麦蓝矮病发生区域用捕虫网捕捉的条沙叶蝉、泡桐丛枝树上用吸虫管捕捉的小绿叶蝉2.4.1.2生物材料准备(1)健康长春花的准备研究中使用的长春花必需严格保证无毒，其准备和繁殖要按照严格的流程进行。具体步骤如下：A.将新购置的腐殖土，装入干净的容器，放到灭菌锅中灭菌；取出，冷却后装入干净花盆。B.选择饱满的长春花种子，快速过水约2s，随后播种到灭菌好的土壤中，每盆中可播种3粒；最终保留一株使用。C.播种后，立即将花盆移入温室，温室温度约20°C；种子萌发直至应用，要确保温室内没有昆虫取食，没有机械性损伤。D.大约7天，种子萌芽；3个月左右，可长至约15cm，此时方可用于实验。(2)健康菟丝子的准备 第二章实验部分79A.用灭菌后的腐殖土，繁殖无毒的绣球作为菟丝子的繁殖寄主；B.取无毒的菟丝子种子，均匀播撒在种有绣球的花盆内,使其寄生并繁殖；C.经PCR为植原体阴性的菟丝子，可以用于传毒。(3)介体昆虫的准备A.在植原体发生地点、昆虫活动频繁的地方，设置捕虫板或者用网捕捉；B.从捕捉的昆虫，选择可能的介体昆虫，通常为刺吸式口器；C.将挑选的昆虫，妥善保存于湿润的带有气孔的试管内，保持其活性带回实验室备用。2.4.1.3传毒操作(1)菟丝子传毒A.选取大小适中的健康长春花，置于菟丝子周围，使菟丝子的藤状结构能够攀附其上；此处，可以人工调整菟丝子藤的延伸方向，以便于快速攀附。B.保持上述状态约1周，使菟丝子在长春花上充分生长、繁殖；C.当菟丝子在长春花上达到一定的生长量时，用灭菌的利器切断部分藤，使长春花能够独立移动；D.将已经缠有适量菟丝子的长春花，带至目的植株附近，根据目的植株的生长特点，决定长春花的放置方式。a.如果目的植株为高大木本植物，可选择将长春花悬挂到其上嫩枝附近，并固定；然后可调整菟丝子、帮助其与目的植株接触；b．如果目的植株为草本植物，则要注意避免损伤目的植株E.设置完成后，用纱网将长春花与目的植株罩上，放置昆虫取食；并设置醒目标志，提醒过往的行人以免碰撞；F.保持约两周，可撤离设置；期间注意浇水、检查；G.长春花取回后，立即转到温室，去掉菟丝子，纱网防虫；H.做PCR检测，确定是否传毒成功；I.观察记录长春花的生长状况。(2)昆虫传毒A.在使用的健康长春花枝条上，用纱网扎一个小口袋，或者用纱网罩住整个植株，使形成一个封闭的空间；B.取出一部分捕捉的昆虫，轻缓地放入纱网；同时，留一部分昆虫做PCR检测；C.保持约一周，用杀虫剂将残余昆虫杀灭，去除纱网；期间注意植物保湿；D.将长春花移入温室，注意避免其他昆虫取食；并注意观察记录长春花的生长状况；E.随后可进行PCR检测传毒是否成功。(3)嫁接传毒当毒源从室外引入到温室长春花后，可以通过嫁接的方式，不断在新的长春花上进 80西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究行繁殖，从而达到保存室内植原体资源的目的。关于嫁接，有不同的方法，如劈接、T接等。通常我们采用劈接的方法，其具体操作如下：A.用消毒的单面刀片，切取适当长度的带毒长春花的嫩芽为接穗，约5cm;接穗比砧木长春花的茎略细；B.用刀片切除接穗部分组织，使其形成楔形，两侧均有切口，以便与砧木配合；C.去除砧木长春花的茎部顶端，并从中间部位向下纵切；切口的长度与接穗的切口长度相当；注意接穗的切口与砧木的切口，要以叶的位置一致为适；D.将接穗的切口插入砧木切口，使其紧密贴合；E.用封口膜缠绕接口，使其固定，并避免污染；F.将新嫁接的长春花置于阴凉处，避免高温，约2周，确保接穗成活；G.观察并记录植株的生长状况；PCR检测，以确保传毒成功。2.4.2结果2.4.2.1菟丝子传毒结果应用菟丝子，对田间发现的枣疯和芝麻扁茎进行了传毒。将寄生有菟丝子的健康长春花（图2-40）分别带至野外发现的感病枣疯和芝麻扁茎（图2-41），进行传毒。枣疯植原体在传毒1.5个月后，在长春花上引起症状，症状包括小叶、增殖、丛枝等症状（图2-42A）；芝麻扁茎植原体在2个月后，在长春花上表症，症状包括生长衰退、丛枝等（图2-42B）。PCR检测结果也为阳性，获得了1.2kb片段。图2-40寄生有无毒菟丝子的健康长春花Fig.2-40Ahealthyperiwinkleparasitedbyhealthydodders 第二章实验部分81图2-41用菟丝子将植原体传到长春花A．菟丝子传枣疯植原体；B.菟丝子传芝麻扁茎植原体Fig.2-41TranmissionofphytoplasmastohealthyperiwinkleplantsA.transmissionofjujubewitches’broomphytoplasmas;B.transmissionofsesameflatstemphytoplasmas图2-42菟丝子传毒后长春花上表现的症状A．枣疯植原体；B.芝麻扁茎植原体Fig.2-42Symptomsonperiwinklesafterdodder-bridgedtransmissionA.jujubewitches’broomphytoplasmas;B.sesameflatstemphytoplasmas2.4.2.2昆虫传毒结果用条沙叶蝉传毒保存了小麦蓝矮植原体（图2-43）、用小绿叶蝉保存了泡桐丛枝植原体（图2-44）。在条沙叶蝉和小绿叶蝉传毒一周后，长春花表现症状（图2-45）。症状包括生长衰退、花器绿变、花变叶等。PCR检测结果也为阳性，获得了1.2kb片段。 82西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究图2-43条沙叶蝉传小麦蓝矮植原体Fig.2-43TransmissionofwheatbluedwarfphytoplasmasbyPsammotettixstriatus图2-44小绿叶蝉传泡桐丛枝植原体Fig.2-44Transmissionofpaulowniawitches’broomphytoplasmasbyEmpoascaflavescens图2-45昆虫传毒后长春花上表现的症状A．蓝矮植原体；B.泡桐丛枝植原体Fig.2-45SymptomsonperiwinkleplantsaftertransmissionofphytoplasmasbyinstectsA.wheatbluedwarfphytoplasmas;B.paulowniawitches’broomphytoplamas 第二章实验部分832.4.2.3嫁接传毒结果通过菟丝子或昆虫传毒，获得野外毒源后，可以由嫁接传毒（图2-46），对毒源进行继代和繁殖。一般一个月扩繁一次。以芝麻扁茎植原体或枣疯植原体感染的长春花为接穗，嫁接健康长春花，一般3周后表症；含蓝矮植原体或泡桐丛枝植原体的接穗，嫁接后约一个星期引起症状。枣疯发病较慢，但是一旦发病后，很快死亡。从症状出现到植株死亡，整个过程不到2个月；其他三种植原体在长春花上发病后，只要控制湿度和通风，可以维持1年左右。图2-46长春花嫁接传毒Fig.2-46Transmissionofphytoplasmastoperiwinklebygraft2.4.3小结1、通过菟丝子传毒的方式，将枣疯植原体、芝麻扁茎植原体分别传播到了健康的长春花上；二者均可在长春花上引起症状，但有所差异。枣疯植原体的致死性要强于芝麻扁茎植原体。2、通过昆虫传毒的方式，将蓝矮植原体和泡桐丛枝植原体，分别传到了健康的长春花上；二者在长春花上引起的症状较相似；致死性亦相似。3、用嫁接的方式，对获得的毒源进行了室内繁殖和保存，效果良好。 84西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究第三章讨论3.1西北地区植原体病害多样性本研究采用巢式PCR扩增植原体16SrRNA基因对西北地区植原体病害种类进行了鉴定，判定标准为电泳检测是否扩增到1.2kb的目标片段。按照此标准在西北地区采集的218份植物样品中鉴定到植原体病害39种，这39种植原体病害分别是：苹果衰退病（AD）、苜蓿丛枝（AWB）、油菜绿变（BrV）、仙人掌丛枝、苦楝丛枝、狗牙根白叶（CdWL）、中华小苦荬扁茎（CiFS）、樱桃李黄化（CpY）、凌霄花丛枝（CtcWB）、菊花绿变（CV）、苦楝黄化（CY）、马唐黄化（DY）、狗尾草红叶（GbR）、狗尾草绿变（GbV）、五角枫丛枝（JmWB）、枣疯病（JWB）、紫薇扁茎（LiFS）、谷子红叶（MR）、谷子黄化（MY）、泡桐丛枝（PauWB）、普纳菊苣扁茎（PcWB）、辣椒丛枝（PepWB）、桔梗扁茎（PgFS）、马铃薯紫顶（PpT）、早园竹丛枝（PpWB）、桃黄化（PY）、凤仙花绿变（RBP）、月季绿变（RcV）、刺槐丛枝（RpWB）、甜樱桃丛枝（ScWB）、芝麻扁茎（SFS）、菲白竹丛枝（SfWB）、国槐扁茎（SjFS）、国槐丛枝（SiWB）、樱花绿变（SV）、南瓜丛枝（SWB）、樱花黄化（SY）、葡萄黄化（VvY）、酸枣丛枝（WjWB）。在本研究中共鉴定到扁茎病害四种，分别为：中华小苦荬扁茎（CiFS）、普纳菊苣扁茎（PcWB）、桔梗扁茎（PgFS）、国槐扁茎（SjFS）。在之前的很多研究中将丛枝、花器绿变、花变叶等更多的作为植原体病害的生物学标准。但是近年越来越多的植物扁茎类病害被鉴定为植原体相关。所以，在以后的研究中，这一类症状也需要引起重视。本研究中的39种植原体病害发生在17个科的34种植物上，Lee等之前的研究报道植原体可以侵染98个科的植物。我们的研究证明西北地区被植原体侵染的植物科占了全世界植物寄主总数的1/5，表现出丰富的寄主多样性；其中，禾本科和蔷薇科植物是最容易受到感染的。被侵染植物症状也呈现出多样性，丛枝、花器绿变、花变叶、叶片黄化、小叶、扁茎、腋芽增殖等症状都有发生。3.2西北地区植原体株系多样性Lee等研究报道，在全世界范围内16SrI组和16SrIII组分布最为广泛的植原体组，其中16SrI-B组和16SrIII-H是分布最为广泛的两个植原体亚组；在亚洲地区发生的植原体组有16SrI组、16SrII组、16SrIII组、16SrV组、16SrXI组和16SrXIV组等8个植原体组，在中国北方地区植原体的主流组16SrI组和16SrV组，南方地区16SrII组和16SrI组（Lietal2013）。本研究中鉴定16SrI组、16SrII组、16SrV组、16SrVI组、16SrXII组和16SrXIV等6个植原体组在中国西北地区发生，丰富了亚组内植原体株系的多样 第三章讨论85性，为世界不同地区同类植原体进化研究提供依据。在鉴定到的病害中分类地位属于16SrI-B和16SrV-B的植原体是最多的，这也符合世界范围和中国北方地区的植原体发病规律。3.2.1泡桐丛枝植原体在本研究中泡桐丛枝植原体是与16SrI-B的代表种处于同一分支，并且有相同的虚拟RFLP酶切图谱，说明在中国陕西泡桐丛枝植原体的分类地位应该属于16SrI-B亚组。Lee等之前的研究证明采自于台湾的泡桐丛枝样品在分类地位上属于16SrI-D亚组。目前泡桐丛枝植原体是危害中国泡桐产业的第一病害，明确其系统分类地位对于病害防治研究意义重大。之前的很多研究报道泡桐丛枝植原体存在两个异质的16SrRNA操纵子基因，因此在分类上应该属于6SrI-B/D亚组。我们在本研究中挑取了大量的单克隆测序，没有测到另一个基因的存在。所以在本研究中陕西泡桐丛枝植原体在分类地位上应该属于16SrI-B亚组。3.2.2枣疯植原体、酸枣丛枝植原体在本研究中枣疯病植原体和酸枣丛枝植原体在分类地位上都属于16SrV-B亚组，虚拟RFLP酶切图谱一样，核酸一致性>99.5%，在这两种植物上引起症状类似。前人的研究证明这两种病害均为凹缘菱纹叶蝉传播，所以这两种病害可能是同一病原引起，核酸差异可能是寄主差异造成。3.2.3禾本科植物植原体多样性在狗尾草、马唐、早园竹、菲白竹、狗牙根、谷子上鉴定到了植原体侵染，采自韩城的狗尾草绿变由16SrI-C亚组植原体引起，采自韩城的谷子黄化也是由16SrI-C亚组植原体引起，采自杨凌地区的马唐草黄化由16SrV-B亚组植原体引起，早园竹丛枝由16SrI-B亚组植原体引起，菲白竹丛枝由16SrI-C亚组植原体引起，采自杨凌地区的狗尾草红叶由16SrI-B亚组植原体引起，采自杨凌地区的谷子红叶也是由16SrI-B亚组植原体植原体引起，狗牙根白叶则是由16SrXIV-A亚组植原体引起，在5种禾本科植物上共鉴定到了3个植原体组，分别为16SrI组、16SrV组、16SrXIV组，证明禾本科植物非常容易受到植原体侵染。其中采自韩城的狗尾草绿变和采自杨凌的狗尾草红叶，表现症状都包括草穗绿变，唯一差异就是在杨凌地区采集的狗尾草表现红叶，分别由16SrI-C亚组和16SrI-B亚组植原体引起。之前的很多研究也证明，同一寄主在受到不同分类地位植原体侵染后表现出类似症状，如三叶草在受到16SrI组、16SrV组植原体侵染后都会变现绿变症状（Lietal2009）。序列比较发现，采自韩城的狗尾草绿变和谷子黄化核酸一致性为100%，虚拟RFLP分析图谱一致，并且二者与韩城发生的另一种植原体病害小麦蓝矮植原体的16SrRNA基因序列一致性为99.9%。狗尾草是农田杂草，在田间地头都有生长，本研究中采集的谷子样品也是洒落的种子自己长出来的自生谷子，所以我们怀疑，狗尾草和谷子可能是小麦蓝矮子植原体的田间寄主之一，因此对该病害传播有 86西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究推动作用，尤其是麦收后，狗尾草作为野外毒源经叶蝉取食物后传播到秋播麦苗上完成侵染循环。有趣的是我们在杨凌发现的马唐黄化和狗尾草红叶上也发生了类似的现象，马唐黄化植原体与酸枣丛枝16SrRNA基因一致性为100%，狗尾草红叶与苦楝丛枝和苦楝黄化一致性为100%。因此，我们推测马唐和狗尾草可能分别是酸枣丛枝和苦楝丛枝的野生寄主。鉴于此可以看出，禾本科杂草在植原体病害侵染循环中起着重要作用。狗牙根白叶植原体属于16SrXIV-A亚组，这是我们首次报道该组植原体在中国西北地区发生。3.2.4桃黄化植原体在陕西桃产区普遍发生的桃黄化植原体在分类上属于16SrV-B亚组，一致性分析显示在榆林、西安、渭南、宝鸡、咸阳、汉中六个地区发生的桃黄化植原体核酸一致性>99.8，说明桃黄化病在陕西为同一类植原体导致，这可能由于桃树多是经过嫁接繁殖有关系。3.2.5南瓜丛枝植原体的混合侵染南瓜作为蔬菜和粮食在陕西广泛种植，我们证明在关中地区发生的南瓜丛枝病是与植原体相关的。该植原体在分类上属于16SrXII-A亚组，但是我们在个别植株内克隆的16SrRNA基因测到了2种类型的16SrRNA基因，他们的一致性大于99.8%；但是虚拟RFLP分析显示，AluI这个酶的酶切图谱是不一致的，相似性系数<0.97，说明其为16SrXII组一个新亚组。这是我们首次证明16SrXII在中国北方地区发生，首次报道南瓜丛枝病在中国发生。3.2.6樱属植物植原体病害的发生我们在甜樱桃上发现了樱桃丛枝病，应该樱桃丛枝植原体属于16SrV-B亚组，在观赏樱花上鉴定到2种植原体病害分别为樱花黄化和樱花绿变，其中樱花黄化由16SrV-B亚组植原体引起，而樱花绿变则是由16SrI-B亚组植原体引起。甜樱桃丛枝和樱花黄化均由16SrV-B亚组植原体引起，在同属植物上引起了差异巨大的症状，二者虽然核酸一致性为99.8%，但是是否为同一种植原体需要进一步的实验来确定。这个研究结果表面樱属植物容易受到植原体侵染。3.2.716SrVI组植原体在中国的发生油菜绿变和马铃薯紫顶是由16SrVI组植原体引起，这次我们首次鉴定到油菜植原体病害在中国发生。之前Zhang等报道了16SrVI组引起了柳树增殖，这是首次报道16SrVI组植原体在中国发生。Mou等报道了16SrVI组在中国新疆引起番茄巨芽。本研究拓宽了16SrVI组植原体在中国的寄主范围，和发病区域，该组植原体所引起病害和危害应该引起重视3.2.8观赏植物植原体病害在凤仙花引起的绿变病是由16SrI-D亚组植原体引起的，在菊花、月季上发生的植 第三章讨论87原体病害则是由16SrI-B亚组植原体引起的。3.2.9扁茎类植原体病害中华小苦荬是由16SrI-C亚组植原体引起，普纳菊苣扁茎是由16SrV-B亚组植原体引起，紫薇扁茎是由16SrI组一个新亚组引起，国槐扁茎由16SrI组一个新亚组引起，桔梗扁茎（PgFS）也是由16SrI组一个新亚组引起。其中紫薇扁茎、国槐扁茎和桔梗扁茎三个新亚组彼此间是独立的，我们暂时没有给这三个新亚组定名，因为这个分类地位只是基于虚拟的RFLP分析得出的。不同植物虽然表现出类似的症状，但是引起病害的植原体在分类地位上是差异巨大的，扁茎将成为植原体病害生物学症状新依据。3.2.10苦楝黄化和苦楝丛枝二者16SrRNA基因核酸一致性为100%，但是表现黄化症状的苦楝没有丛枝症状，表现丛枝症状的苦楝没有黄化症状。经过连续观察发现，黄化苦楝最后均衰退死亡，表现丛枝症状苦楝有症状缓和现象。从分类地位和核酸一致性看二者为同一植原体，但是从表现类型看却又差异巨大，需要开展更深入研究。3.2.11国槐丛枝、刺槐丛枝二者16SrRNA基因核算一致性为100%，均属于16SrV-B亚组，并且表现相似症状，说明引起不同病害的病原可能相同。3.2.12葡萄黄化在欧洲由16SrV-C亚组植原体引起的葡萄金黄化病危害非常严重，严重制约了葡萄酒产业。在本次调查中，我们在荒废的葡萄园内种植的鲜食葡萄上发现了由16SrI-B亚组植原体引起的葡桃黄化病。无论在分类地位还是症状上与欧洲的葡萄金黄化都是不一样的，欧洲发生的葡萄金黄化为葡萄叶片外卷，我们发现的病害症状为叶片内卷。但是这次首次鉴定的葡萄植原体病害在我国发生应该引起我们注意，由于鉴定的植原体属于16SrI-B亚组，这可能也与我国北方地区该株系植原体普遍发生有关系。3.2.13仙人掌丛枝我们鉴定到的仙人掌丛枝植原体在分类地位上与云南发生最为普遍的植原体病害仙人掌丛枝病在分类地位上是一致的，属于16SrII-A亚组。在云南、海南16SrII植原体发生非常的普遍，但是这些我们首次鉴定到16SrII主植原体在中国北方地区发生。云南是我国花卉主产区，花卉贸易频繁，仙人掌作为盆栽花卉非常受欢迎。所以这次在陕西发生的仙人掌丛枝病很可能是花卉贸易传过来，或者是民间植物材料交流促进的北传。番茄黄化曲叶病毒由中共南方发生现在发展为全国发生，主要是气候变暖促进了烟粉虱的北传，此次16SrII组植原体在陕西发生会不会也是类似现象值得引起注意。3.2.14苹果衰退和苜蓿丛枝苹果衰退病和苜蓿丛枝病都是由16SrV-B亚组植原体引起的，二者核酸一致性为 88西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究99.8%，与枣疯植原体和酸枣丛枝植原体的一致性也高达99.8%，很可能苹果树和苜蓿就是枣疯植原体的新寄主。在陕西之前报道的三叶草绿变、菊花扁茎、李子卷叶、石竹白叶等都是由16SrV-B亚组植原体引起的，说明该植原体在陕西寄主范围广泛，可以引起多种植物病害，在防控上值得注意，一旦发现枣疯病和酸枣丛枝病应该立刻清除。3.2.15樱桃李黄化基于症状学、分子生物学和组织学我们在表现黄化症状的樱桃李上鉴定到一个16SrI组新亚组植原体。之前在陕西有报道16SrV-B亚组植原体引起李子卷叶病，可以看出李子是一类容易感染植原体的植物。3.2.16辣椒丛枝和五角枫丛枝由16SrI-B亚组植原体和16SrI-D亚组植原体引起的辣椒丛枝病和五角枫丛枝病在发病植株上引起症状是剧烈的，危害非常严重。其中辣椒感染后丧失了经济价值，五角枫感染后新生枝条不能够安全越冬，严重影响了观赏价值。16SrI-B/D亚组植原体在本研究中是最常鉴定到的植原体，先前的研究证明16SrI组植原体是世界上发生最普遍和严重的，遍布每一个国家和地区，我们的研究结果丰富了这个结论。3.3透射电子显微镜3.3.1透射电镜的作用自植原体病害被发现以来，一直在尝试给出一个准确的合理的分类地位。但是由于植原体无法培养，使得传统的用于微生物的研究方法基本不适用。近些年，随着分子生物学得发展，似乎有了新的选择，可以通过直接PCR扩增、分析植原体保守基因的方法，达到划分其分类地位的目的。但是，植原体的形态学问题却是无法通过分子手段来解决。而透射电子显微镜在植原体形态学研究方面，有着不可替代的重要作用，甚至可以称为是研究植原体形态的最主要方法。在本研究中，我们选取了一部分PCR检测为阳性的样品，取新鲜组织制作超薄切片，并应用透射电镜对这些切片样品进行了检测观察。在10个样品，看到了典型植原体粒子。典型的植原体粒子没有细胞壁，具有单层膜包被的细胞结构，在透射电镜下可以看到纤维状的基因组DNA，以及靠近单层膜的高密度的颗粒状核糖体结构。另外，还观察到了处于不同生长发育时期的植原体粒子：有的以中央缢裂的方式进行增殖，有的以出芽形式增殖，死亡的菌体单层膜破裂呈现雾状边缘。植原体可以在韧皮部筛管和伴胞内存在，并且可能是通过筛孔在植物韧皮部细胞间移动。就这一点而言，我们观察到了附着于筛孔区的植原体颗粒。3.3.2透射电镜的局限性应用透射电镜进行植原体进行植原体形态学研究固然必不可少，但也不得不提及其一些弊端： 第三章讨论891、透射电镜设备昂贵，需要专门的管理，以及专业的操作，因此无法非常普及。2、制作超薄切片周期长，必须要求新鲜样品，并且无法同时处理大量样品；切片机的使用也较为复杂，需要经过专门培训或者专业人员，才可操作。否则，很有可能损毁材料，导致切片质量过低而无法完成检测。3、就植原体诊断而言，透射电镜显然不是最佳的选择。除了上述局限性以外，还因为透射电镜检测的样品量有限，从而使其灵敏度较低。在本研究中，我们选取总共选取了15个PCR检测为阳性的样品用于电镜检测，但是仅从10个样品内观察到了植原体。造成这种结果，可能是由于植原体在样品内的浓度比较低、分布不均匀，而无法从少数切片中观察到。总之，与分子生物学的方法相比，透射电镜的灵敏度要低很多，而且花费大量人力、物力。因此，电镜不适合用于植原体的诊断。但是，理论上来看，在电镜下观察到植原体粒子的存在，才是植原体诊断的最直接、最有力的证据。就形态学研究而言，目前，透射电镜或许是最重要的工具，其能够准确、高分辨率地反映出植原体在植物细胞内的分布，以及植原体粒子本身所具有的一些列特征。因此是植原体形态学研究中，不可缺少的重要技术。3.4植原体资源保存在自然界中，植原体具有广泛的植物寄主，任何环境内都有可能发现植原体的存在。一方面，这种丰富的多样性为植原体研究提供了丰富的素材；另一方面，这样广泛性也增加了植原体研究的不确定性。由于自然环境下的植物容易受到外界干扰，如风、雨，有时这种干扰甚至还是毁灭性的，加之人为的干预等，使得植原体随寄主的变化非常大。而这种情况，是没有办法满足科学研究的严谨性以及积累性。因此植原体资源的保存很是必要。3.4.1菟丝子传毒植原体的自然寄主有可能是木本、也有可能是草本，总之种类繁多。而通常，我们仅以长春花作为其实验室寄主。用菟丝子传毒很好地在不同物种之间传播植原体，起到桥梁的作用。因此，在植原体资源保存的过程中，起到无法替代的作用。但是菟丝子传毒具有一定的局限性。首先，必须培育无毒的菟丝子，这个对温室工作能力要求很高，因为菟丝子是寄生植物，其生长习性与常规植物可能略有区别。其次，菟丝子本身为寄生性植物，对其寄主会产生严重的破坏作用。如果用菟丝子向长春花传毒，不可避免地将使长春花受到来自于菟丝子的破坏。如果管理不当有可能是传毒失败，并导致长春花死亡。此外，对于木本植物，菟丝子比较容易攀附，从而达到连接木本植物与长春花，起到桥梁的作用。但是对于草本植物而言，比如狗尾草，其本身比较柔弱无法承受菟丝子的攀附，加之菟丝子并不倾向于吸附草本植物（这一点原因不清楚，我 90西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究们做过很多尝试，均以失败告终），从而使得草本植物向长春花的菟丝子传毒尤为困难。不过总体来讲，这种方法是植原体研究中不可缺少的技术。3.4.2昆虫传毒借助昆虫向长春花传毒，不论寄主是草本或者木本，都不受到限制。而且，如果成功往往效率很高。但是就植原体资源保存而言，这种方法也有不可避免的局限性。首先，对于要保存的植原体，必须了解其昆虫介体。如果不了解昆虫介体，在同一生态环境内，存在的刺吸式口器昆虫种类很多，很有可能造成混合资源或者所获非所求。但是，就目前植原体的研究状况而言，大多数植原体的研究仅停留在系统分类学的水平，广泛的昆虫介体范围还没有非常多的数据。其次，目前已知的可以作为植原体传播介体的昆虫还没有实现室内饲养。因此，所用到的昆虫只能是“一次性的”，无法用于更深入的研究。另外，对某一植原体而言，其昆虫介体可能不是唯一的；反之，对某一昆虫而言，其可能同时传播几种植原体。因此，即便在知道某植原体介体昆虫的前提下，也有可能出现得非所求或者混合的资源。而这一点，对于研究植原体的致病性是极端致命的弊端。总之，昆虫传毒很便捷、效率很高，但是也有诸多限制因素与弊端。3.4.3嫁接传毒一旦获得室内植原体毒源，则可以通过嫁接来进行维持和繁殖。嫁接的方法比较多，根据植株的生长状况，可以选择不同的方法。经过稍微练习，就能比较好的掌握该方法。其简单、易操作、成本低，对植原体资源保存而言是很好的方法。但是嫁接后，最初阶段的管理需要格外小心。必学选择阴凉、低温、湿度适中的地方报关新嫁接的长春花。阳光强烈、温度过高，会使接穗蒸腾剧烈而干枯死亡，导致嫁接的失败。湿度太低，也会使接穗失水死亡；湿度过高，有可能造成嫁接部位的腐烂，从而使嫁接失败。对于嫁接所用刀片、封口膜等，也要注意，刀片必须经过灭菌处理。因为，刀片对植物造成较大面积的创伤，如果刀片携带有微生物，很有可能对植物造成感染，而导致嫁接的失败。总体而言，在于植原体资源的保存方面，嫁接是非常有效的保持持续繁殖的方法。3.5全文结论与创新点1、基于16SrRNA基因的巢式PCR扩增是植原体病害鉴定的快速、准确、有效方法，本研究明确植原体病害39种，明确了西北地区植原体病害种类，发现枣疯病和泡桐丛枝病发生最为广泛。凌霄花丛枝、菲白竹丛枝、早园竹丛枝、中华小苦荬扁茎、普纳菊苣扁茎、桔梗扁茎、谷子黄化（红叶）、苹果衰退等9种为世界上首次报道的植原体病害；南瓜丛枝、狗尾草绿变（红叶）、油菜绿变、五角枫丛枝、凤仙花绿变、菊花绿变、马唐黄化、葡萄黄化等8种为中国首次发现的植原体病害。 第三章讨论912、基于16SrDNA序列的系统发育分析，在西北地区发生的植原体分别与Ca.P.solani、Ca.P.trifolii、Ca.P.cynodontis、Ca.P.aurantifolia、Ca.P.asteris、Ca.P.ziziphi等6个植原体暂定种有关系，在分类上分别属于16SrI-B亚组、16SrI-C亚组、16SrI-D亚组和16SrI组新亚组、16SrII-A亚组、16SrV-B亚组、16SrVI-A亚组、16SrXII-A亚组、16SrXII新亚组及16SrXIV-A亚组，其中16SrVI-A亚组、16SrXII-A亚组、16SrXII新亚组是首次在中国北方地区鉴定到。3、通过透射电镜从10中植物的韧皮部均观察到典型的植原体粒子，大小在200-800nm之间，与寄主植物种类没有差异植原体大小，形态多样，从形态上可以作为鉴定依据，但是不能作为分类依据。4、通过条沙叶蝉保存小麦蓝矮毒源、小绿叶蝉保存泡桐丛枝毒源；通过菟丝子保存枣疯毒源和芝麻扁茎毒源，建立起植原体资源保存体系和方法。 92西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究参考文献蔡红.2007.云南省植原体株系及其相关病害的多样性研究.博士学位论文.昆明:云南农业大学常文程,李向东,邵云华,徐加利,竺晓平.2012.棣棠丛枝病相关植原体的分子鉴定.植物病理学报,42(5):541-545车海彦.2010.海南省植原体多样性调查及槟郎黄化病植原体的分子检测技术研究.博士学位论文.杨凌：西北农林科技大学顾沛雯,吴云锋,安凤秋.2007.小麦蓝矮植原体寄主范围的鉴定及rflp分析.植物病理学报,37:390-397李正男.2010.陕西省四种植原体病害的分子鉴定.硕士学位论文.杨凌:西北农林科技大学杨毅,杨旭光,林彩丽,田国忠,赵文军,李志红,朱水芳.2011.泡桐丛枝植原体染色体全长及两个rrna操纵子定位研究.植物检疫,25:5-9AbramovitchRB,AndersonJC,MartinGB.2006.Bacterialelicitationandevasionofplantinnateimmunity.NatureReviewsMolecularCellBiology,7:601-611AkimaruJ,MatsuyamaS,TokudaH,MizushimaS.1991.Reconstitutionofaproteintranslocationsystemcontainingpurifiedsecy,sece,andsecafromescherichiacoli.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,88:6545-6549Al-SaadyNA,KhanAJ,CalariA,Al-SubhiAM,BertacciniA.2008.‘Candidatusphytoplasmaomanense’,associatedwithwitches'-broomofcassiaitalica(mill.)spreng.Inoman.Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,58:461-466AlaviY,AraiM,MendozaJ,Tufet-BayonaM,SinhaR,FowlerK,BillkerO,Franke-FayardB,JanseC,WatersA.2003.Thedynamicsofinteractionsbetweenplasmodiumandthemosquito:Astudyoftheinfectivityofplasmodiumbergheiandplasmodiumgallinaceum,andtheirtransmissionbyanophelesstephensi,anophelesgambiaeandaedesaegypti.Internationaljournalforparasitology,33:933-943AlmaA,BoscoD,DanielliA,BertacciniA,VibioM,ArzoneA.1997.Identificationofphytoplasmasineggs,nymphsandadultsofscaphoideustitanusballrearedonhealthyplants.InsectMolecularBiology,6:115-121AmmarE-D,FultonD,BaiX,MeuliaT,HogenhoutSA.2004.Anattachmenttipandpili-likestructuresininsect-andplant-pathogenicspiroplasmasoftheclassmollicutes.Archivesofmicrobiology,181:97-105AndersenMT,LieftingLW,HavukkalaI,BeeverRE.2013.Comparisonofthecompletegenomesequenceoftwocloselyrelatedisolatesof‘candidatusphytoplasmaaustraliense’revealsgenomeplasticity.BMCgenomics,14:529AndersenMT,NewcombRD,LieftingLW,BeeverRE.2006.Phylogeneticanalysisof“candidatusphytoplasmaaustraliense”revealsdistinctpopulationsinnewzealand.Phytopathology,96:838-845AndrewsTD,GojoboriT.2004.Strongpositiveselectionandrecombinationdrivetheantigenicvariationofthepileproteinofthehumanpathogenneisseriameningitidis.Genetics,166:25-32AngeliniE,ClairD,BorgoM,BertacciniA,Boudon-PadieuE.2001.Flavescencedoréeinfranceanditaly-occurrenceofcloselyrelatedphytoplasmaisolatesandtheirnearrelationshipstopalatinate 参考文献93grapevineyellowsandanalderyellowsphytoplasma.Vitis,40:79-86ArnaudG,Malembic-MaherS,SalarP,BonnetP,MaixnerM,MarconeC,Boudon-PadieuE,FoissacX.2007.Multilocussequencetypingconfirmstheclosegeneticinterrelatednessofthreedistinctflavescencedoréephytoplasmastrainclustersandgroup16srvphytoplasmasinfectinggrapevineandalderineurope.Appliedandenvironmentalmicrobiology,73:4001-4010ArochaY,LopezM,PinolB,FernandezM,PicornellB,AlmeidaR,PalenzuelaI,WilsonMR,JonesP.2005.‘Candidatusphytoplasmagraminis'and‘candidatusphytoplasmacaricae’,twonovelphytoplasmasassociatedwithdiseasesofsugarcane,weedsandpapayaincuba.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,55:2451-2463BaiX,CorreaVR,ToruñoTY,AmmarE-D,KamounS,HogenhoutSA.2009.Ay-wbphytoplasmasecretesaproteinthattargetsplantcellnuclei.Molecularplant-microbeinteractions,22:18-30BaiX,ZhangJ,EwingA,MillerSA,RadekAJ,ShevchenkoDV,TsukermanK,WalunasT,LapidusA,CampbellJW.2006.Livingwithgenomeinstability:Theadaptationofphytoplasmastodiverseenvironmentsoftheirinsectandplanthosts.JournalofBacteriology,188:3682-3696BarbaraDJ,MortonA,ClarkMF,DaviesDL.2002.Immunodominantmembraneproteinsfromtwophytoplasmasintheasteryellowsclade(chloranteasteryellowsandcloverphyllody)arehighlydivergentinthemajorhydrophilicregion.Microbiology,148:157-167BergM,DaviesDL,ClarkMF,VettenHJ,MaieG,MarconeC,SeemüllerE.1999.Isolationofthegeneencodinganimmunodominantmembraneproteinoftheappleproliferationphytoplasma,andexpressionandcharacterizationofthegeneproduct.Microbiology,145:1937-1943BergM,MelcherU,FletcherJ.2001.Characterizationofspiroplasmacitriadhesionrelatedproteinsarp1,whichcontainsadomainofanovelfamilydesignatedsarpin.Gene,275:57-64BerhoN,DuretS,DanetJ-L,RenaudinJ.2006.Plasmidpsci6fromspiroplasmacitrigii-3confersinsecttransmissibilitytothenon-transmissiblestrains.Citri44.Microbiology,152:2703-2716BertacciniA.2007.Phytoplasmas:Diversity,taxonomy,andepidemiology.FrontiersinBioscience,673-89BertacciniA,VibioM,BellardiM.1996.Virusdiseasesofornamentalshrubs.X.Euphorbiapulcherrimawilld.Infectedbyvirusesandphytoplasmas.PhytopathologiaMediterranea,129-132BertaminiM,NedunchezhianN.2001.Effectsofphytoplasma[stolbur-subgroup(boisnoir-bn)]onphotosyntheticpigments,saccharides,ribulose1,5-bisphosphatecarboxylase,nitrateandnitritereductases,andphotosyntheticactivitiesinfield-growngrapevine(vitisviniferal.Cv.Chardonnay)leaves.Photosynthetica,39:119-122BishopJ,DeanA,Mitchell-OldsT.2000.Rapidevolutioninplantchitinases:Moleculartargetsofselectioninplant-pathogencoevolution.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,97:5322-5327BlomquistCL,BarbaraDJ,DaviesDL,ClarkMF,KirkpatrickBC.2001.Animmunodominantmembraneproteingenefromthewesternx-diseasephytoplasmaisdistinctfromthoseofotherphytoplasmas.Microbiology,147:571-580BoonhamN,TomlinsonJ,MumfordR.2007.Microarraysforrapididentificationofplantviruses1.Annu.Rev.Phytopathol.,45:307-328BottiS,BertacciniA.2007.Grapevineyellowsinnorthernitaly:Molecularidentificationofflavescencedoréephytoplasmastrainsandofboisnoirphytoplasmas.Journalofappliedmicrobiology,103:2325-2330 94西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究BrownDR,WhitcombRF,BradburyJM.2007.Revisedminimalstandardsfordescriptionofnewspeciesoftheclassmollicutes(divisiontenericutes).Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,57:2703-2719ChristensenNM,AxelsenKB,NicolaisenM,SchulzA.2005.Phytoplasmasandtheirinteractionswithhosts.Trendsinplantscience,10:526-535ChristensenNM,NicolaisenM,HansenM,SchulzA.2004.Distributionofphytoplasmasininfectedplantsasrevealedbyreal-timepcrandbioimaging.MolecularPlant-MicrobeInteractions,17:1175-1184ChristiePJ,CascalesE.2005.Structuralanddynamicpropertiesofbacterialtypeivsecretionsystems(review).Molecularmembranebiology,22:51-61ContaldoN,BertacciniA,PaltrinieriS,WindsorHM,WindsorGD.2012.Azeniccultureofplantpathogenicphytoplasmas.PhytopathologiaMediterrana51:607-617ContaldoN,BertacciniA,PaltrinieriS,WindsorHM,WindsorGD.2012.Axeniccultureofplantpathogenicphytoplasmas.PhytopathologiaMediterranea,51:607-617CornelisGR,VanGijsegemF.2000.Assemblyandfunctionoftypeiiisecretorysystems.AnnualReviewsinMicrobiology,54:735-774CossartP,Pizarro-CerdaJ,LecuitM.2003.Invasionofmammaliancellsbylisteriamonocytogenes:Functionalmimicrytosubvertcellularfunctions.Trendsincellbiology,13:23-31DalbeyRE,KuhnA.2000.Evolutionarilyrelatedinsertionpathwaysofbacterial,mitochondrial,andthylakoidmembraneproteins.Annualreviewofcellanddevelopmentalbiology,16:51-87DanielliA,BertacciniA,BoscoD,AlmaA,VibioM,ArzoneA.1996.Mayevidenceof16sri-group-relatedphytoplasmasineggs,nymphsandadultsofscaphoideustitanusballsuggesttheirtransovarialtransmission?IOMLetters,4:190-191DavisRE,JomantieneR,ZhaoY,DallyEL.2003.Folatebiosynthesispseudogenes,ψfolpandψfolk,andano-sialoglycoproteinendopeptidasegenehomologinthephytoplasmagenome.DNAandcellbiology,22:697-706DeitschKW,MoxonER,WellemsTE.1997.Sharedthemesofantigenicvariationandvirulenceinbacterial,protozoal,andfungalinfections.MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,61:281-293DelahayRM,FrankelG.2002.Coiled‐coilproteinsassociatedwithtypeiiisecretionsystems:Aversatiledomainrevisited.Molecularmicrobiology,45:905-916DengS,HirukiC.1991.Amplificationof16srrnagenesfromculturableandnonculturablemollicutes.Journalofmicrobiologicalmethods,14:53-61DoiY,TeranakaM,YoraK,AsuyamaH.1967.MycoplasmaorPLTgrouplikemicrorganismsfoundinthephloemelementsofplantsinfectedwithmulberrydwarf,potatowitches’broom,asteryellowsorpawloniawitches’broom.AnnalsofPhytopathologicalSocietyJapan,33:259-266DuretS,BerhoN,DanetJ-L,GarnierM,RenaudinJ.2003.Spiralinisnotessentialforhelicity,motility,orpathogenicitybutisrequiredforefficienttransmissionofspiroplasmacitribyitsleafhoppervectorcirculiferhaematoceps.Appliedandenvironmentalmicrobiology,69:6225-6234EconomouA.1999.Followingtheleader:Bacterialproteinexportthroughthesecpathway.Trendsinmicrobiology,7:315-320FessehaieA,DeBoerSH,LévesqueCA.2003.Anoligonucleotidearrayfortheidentificationand 参考文献95differentiationofbacteriapathogeniconpotato.Phytopathology,93:262-269FletcherJ,ShawME,BakerGR,DuganKJ,YeF,ShaY,ZuckPD,MyersGD.1996.Molecularcharacterizationofspiroplasmacitribr3linesthatdifferintransmissibilitybytheleafhoppercirculifertenellus.Canadianjournalofmicrobiology,42:124-131FoissacX,BovéJM,SaillardC.1997.Sequenceanalysisofspiroplasmaphoeniceumandspiroplasmakunkeliispiralingenesandcomparisonwithotherspiralingenes.Currentmicrobiology,35:240-243FoxGE,WisotzkeyJD,JurtshukP.1992.Howcloseisclose:16srrnasequenceidentitymaynotbesufficienttoguaranteespeciesidentity.InternationalJournalofSystematicBacteriology,42:166-170FrançoisC,KebdaniN,BarkerI,TomlinsonJ,BoonhamN,Castagnone-SerenoP.2006.Towardsspecificdiagnosisofplant-parasiticnematodesusingDNAoligonucleotidemicroarraytechnology:Acasestudywiththequarantinespeciesmeloidogynechitwoodi.Molecularandcellularprobes,20:64-69GoldbergMB.2001.Actin-basedmotilityofintracellularmicrobialpathogens.Microbiologyandmolecularbiologyreviews,65:595-626GouinE,GanteletH,EgileC,LasaI,OhayonH,VilliersV,GounonP,SansonettiP,CossartP.1999.Acomparativestudyoftheactin-basedmotilitiesofthepathogenicbacterialisteriamonocytogenes,shigellaflexneriandrickettsiaconorii.JournalofCellScience,112:1697-1708GrantSR,FisherEJ,ChangJH,MoleBM,DanglJL.2006.Subterfugeandmanipulation:Typeiiieffectorproteinsofphytopathogenicbacteria.Annu.Rev.Microbiol.,60:425-449GriffithsH,SinclairW,Boudon-PadieuE,DaireX,LeeI-M,SfalangaA,BertacciniA.1999.Phytoplasmasassociatedwithelmyellows:Molecularvariabilityanddifferentiationfromrelatedorganisms.PlantDisease,83:1101-1104GrohmannE,MuthG,EspinosaM.2003.Conjugativeplasmidtransferingram-positivebacteria.Microbiologyandmolecularbiologyreviews,67:277-301GundersenD,LeeI-M.1996.Ultrasensitivedetectionofphytoplasmasbynested-pcrassaysusingtwouniversalprimerpairs.Phytopathologiamediterranea,144-151GundersenDE,LeeI-M,RehnerSA,DavisRE,KingsburyDT.1994.Phylogenyofmycoplasmalikeorganisms(phytoplasmas):Abasisfortheirclassification.Journalofbacteriology,176:5244-5254HaywardRD,KoronakisV.1999.Directnucleationandbundlingofactinbythesipcproteinofinvasivesalmonella.TheEMBOjournal,18:4926-4934HebertPD,PentonEH,BurnsJM,JanzenDH,HallwachsW.2004.Tenspeciesinone:DNAbarcodingrevealscrypticspeciesintheneotropicalskipperbutterflyastraptesfulgerator.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,101:14812-14817HebertPD,RatnasinghamS,deWaardJR.2003.Barcodinganimallife:Cytochromecoxidasesubunit1divergencesamongcloselyrelatedspecies.ProceedingsoftheRoyalSocietyofLondonB:BiologicalSciences,270:S96-S99HodgettsJ,BoonhamN,MumfordR,DickinsonM.2009.Panelof23srrnagene-basedreal-timepcrassaysforimproveduniversalandgroup-specificdetectionofphytoplasmas.Appliedandenvironmentalmicrobiology,75:2945-2950HodgettsJ,BoonhamN,MumfordR,HarrisonN,DickinsonM.2008.Phytoplasmaphylogeneticsbasedonanalysisofsecaand23srrnagenesequencesforimprovedresolutionofcandidatespeciesof‘candidatusphytoplasma’.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,58: 96西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究1826-1837HodgettsJ,DickinsonM.2013.T-RFLPforDetectionandIdentificationofPhytoplasmasinPlants.In:DickinsonMandHodgettsJ.PhytoplasmaMethodsandProtocols.York,UK:HumanaPress:233-268HogenhoutSA,OshimaK,AMMARED,KakizawaS,KINGDOMHN,NambaS.2008.Phytoplasmas:Bacteriathatmanipulateplantsandinsects.MolecularPlantPathology,9:403-423HoshiA,IshiiY,KakizawaS,OshimaK,NambaS.2007.Host-parasiteinteractionofphytoplasmasfromamolecularbiologicalperspective.BulletinofInsectology,60:105HoshiA,OshimaK,KakizawaS,IshiiY,OzekiJ,HashimotoM,KomatsuK,KagiwadaS,YamajiY,NambaS.2009.Auniquevirulencefactorforproliferationanddwarfisminplantsidentifiedfromaphytopathogenicbacterium.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,106:6416-6421HughesAL,NeiM.1988.Patternofnucleotidesubstitutionatmajorhistocompatibilitycomplexclassilocirevealsoverdominantselection.Nature,335:167-170IritiM,QuaglinoF,MaffiD,CasatiP,BiancoP,FaoroF.2008.Solanummalacoxylon,anewnaturalhostofstolburphytoplasma.Journalofphytopathology,156:8-14IRPCMPhytoplasma/SpiroplasmaWorkingTeam–PhytoplasmaTaxonomyGroup.2004.‘CandidatusPhytoplasma’,ataxonforthewall-less,non-helicalprokaryotesthatcolonizeplantphloemandinsects.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,54,1243-1255JaroslavaP,JosefŠ.2013.DodderTransmissionofPhytoplasmas.In:DickinsonMandHodgettsJ.PhytoplasmaMethodsandProtocols.York,UK:HumanaPress:41-46JigginsFM,HurstGD,YangZ.2002.Host-symbiontconflicts:Positiveselectiononanoutermembraneproteinofparasiticbutnotmutualisticrickettsiaceae.MolecularBiologyandEvolution,19:1341-1349JonesJD,DanglJL.2006.Theplantimmunesystem.Nature,444:323-329JurisSJ,RudolphAE,HuddlerD,OrthK,DixonJE.2000.Adistinctiverolefortheyersiniaproteinkinase:Actinbinding,kinaseactivation,andcytoskeletondisruption.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,97:9431-9436KakizawaS,OshimaK,IshiiY,HoshiA,MaejimaK,JungH-Y,YamajiY,NambaS.2009.Cloningofimmunodominantmembraneproteingenesofphytoplasmasandtheirinplantaexpression.FEMSmicrobiologyletters,293:92-101KakizawaS,OshimaK,JungH-Y,SuzukiS,NishigawaH,ArashidaR,MiyataS-i,UgakiM,KishinoH,NambaS.2006a.Positiveselectionactingonasurfacemembraneproteinoftheplant-pathogenicphytoplasmas.Journalofbacteriology,188:3424-3428KakizawaS,OshimaK,KuboyamaT,NishigawaH,JungH-y,SawayanagiT,TsuchizakiT,MiyataS-i,UgakiM,NambaS.2001.Cloningandexpressionanalysisofphytoplasmaproteintranslocationgenes.Molecularplant-microbeinteractions,14:1043-1050KakizawaS,OshimaK,NambaS.2006b.Diversityandfunctionalimportanceofphytoplasmamembraneproteins.Trendsinmicrobiology,14:254-256KakizawaS,OshimaK,NishigawaH,JungH-Y,WeiW,SuzukiS,TanakaM,MiyataS-i,UgakiM,NambaS.2004.Secretionofimmunodominantmembraneproteinfromonionyellowsphytoplasmathroughthesecprotein-translocationsysteminescherichiacoli.Microbiology,150:135-142KawakitaH,SaikiT,WeiW,MitsuhashiW,WatanabeK,SatoM.2000.Identificationofmulberrydwarf 参考文献97phytoplasmasinthegenitalorgansandeggsofleafhopperhishimonoidessellatiformis.Phytopathology,90:909-914KillinyN,CastroviejoM,SaillardC.2005.Spiroplasmacitrispiralinactsinvitroasalectinbindingtoglycoproteinsfromitsinsectvectorcirculiferhaematoceps.Phytopathology,95:541-548KubeM,SchneiderB,KuhlH,DandekarT,HeitmannK,MigdollAM,ReinhardtR,SeemüllerE.2008.Thelinearchromosomeoftheplant-pathogenicmycoplasma'candidatusphytoplasmamali'.BmcGenomics,9:306KunkelL.1926.Studiesonasteryellows.AmericanJournalofBotany,646-705KunkelL.1932.Celeryyellowsofcalifornianotidenticalwiththeasteryellowsofnewyork.Contrib.BoyceThompsonInst,4:405-414KunkelL.1955.Crossprotectionbetweenstrainsofasteryellow-typeviruses.AdvancesinVirusResearch,3:251-273KwonM-O,WayadandeAC,FletcherJ.1999.Spiroplasmacitrimovementintotheintestinesandsalivaryglandsofitsleafhoppervector,circulifertenellus.Phytopathology,89:1144-1151LangerM,MaixnerM.2004.Molecularcharacterisationofgrapevineyellowsassociatedphytoplasmasofthestolbur-groupbasedonrflp-analysisofnon-ribosomalDNA.Vitis,43:191-199LebskyV,PoghosyanA,Silva-RosalesL.2010.Applicationofscanningelectronmicroscopyfordiagnosingphytoplasmasinsingleandmixed(virus-phytoplasma)infectioninpapaya.Julius-Kühn-Archiv,70LeeI-M,DavisRE,Gundersen-RindalDE.2000.Phytoplasma:Phytopathogenicmollicutes1.AnnualReviewsinMicrobiology,54:221-255LeeI-M,Gundersen-RindalD,DavisR,BottnerK,MarconeC,SeemüllerE.2004a.‘Candidatusphytoplasmaasteris’,anovelphytoplasmataxonassociatedwithasteryellowsandrelateddiseases.Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,54:1037-1048LeeI-M,Gundersen-RindalDE,DavisRE,BARTOSZYKIM.1998.Revisedclassificationschemeofphytoplasmasbasedonrflpanalysesof16srrnaandribosomalproteingenesequences.InternationalJournalofSystematicBacteriology,48:1153-1169LeeI-M,HammondR,DavisR,GundersenD.1993.Universalamplificationandanalysisofpathogen16srdnaforclassificationandidentificationofmycoplasmalikeorganisms.Phytopathology,83:834-842LeeI-M,ZhaoY,BottnerK.2006a.Secygenesequenceanalysisforfinerdifferentiationofdiversestrainsintheasteryellowsphytoplasmagroup.Molecularandcellularprobes,20:87-91LeeI,DavisR.1986.Prospectsforinvitrocultureofplant-pathogenicmycoplasmalikeorganisms.Annualreviewofphytopathology,24:339-354LeeM,BottnerKD,SecorG,Rivera-VarasV.2006b.‘Candidatusphytoplasmaamericanum’,aphytoplasmaassociatedwithapotatopurpletopwiltdiseasecomplex.Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,56:1593-1597LeeM,KlopmeyerM,BartoszykIM,Gundersen-RindalDE,ChouT-S,ThomsonKL,EisenreichR.1997.Phytoplasmainducedfree-branchingincommercialpoinsettiacultivars.Naturebiotechnology,15:178-182LeeM,MartiniM,MarconeC,ZhuSF.2004b.Classificationofphytoplasmastrainsintheelmyellowsgroup(16srv)andproposalof‘candidatusphytoplasmaulmi’forthephytoplasmaassociatedwithelm 98西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究yellows.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,54:337-347Leyva-LópezNE,Ochoa-SánchezJC,Leal-KlevezasDS,Martínez-SorianoJP.2002.Multiplephytoplasmasassociatedwithpotatodiseasesinmexico.CanadianJournalofMicrobiology,48:1062-1068LiZN,ZhangL,ZhaoL,WuYF.2012.Anewphytoplasmaassociatedwithwitches’-broomonJapanesemapleinChina.ForestPathology,42(5):371-376LiZ-N,LiuP,ZhangL,WuY-F.2013.Detectionandidentificationofthephytoplasmaassociatedwithchinaixeris(ixeridiumchinense)fasciation.BotanicalStudies,54:52LiZ-N,ZhangL,BaiY-B,LiuP,WuY-F.2012.Detectionandidentificationoftheelmyellowsgroupphytoplasmaassociatedwithpunachicoryflatsteminchina.CanadianJournalofPlantPathology,34:34-41ChenW,LiY,WangQ,WangN,WuY.2014.Comparativegenomeanalysisofwheatbluedwarfphytoplasma,anobligatepathogenthatcauseswheatbluedwarfdiseaseinchina.PloSone,9:e96436DengS,HirukiC.1991.Amplificationof16srrnagenesfromculturableandnonculturablemollicutes.Journalofmicrobiologicalmethods,14:53-61GundersenD,LeeI-M.1996.Ultrasensitivedetectionofphytoplasmasbynested-pcrassaysusingtwouniversalprimerpairs.Phytopathologiamediterranea,144-151LiZ,SongJ,ZhangC,YuX,WuK,WuW,WuY,XiangY.2010a.Berberisphyllodyisaphytoplasma-associateddisease.Phytoparasitica,38:99-102LiZ,WuZ,LiuH,HaoX,ZhangC,WuY.2010b.Spiraeasalicifolia:Anewplanthostof“candidatusphytoplasmaziziphi”-relatedphytoplasma.JournalofGeneralPlantPathology,76:299-301LiZ,ZhengX,WeiH,YuX,WuW,WuY.2009.Firstreportofelmyellowsphytoplasmainfectingcloverinchina.PlantDisease,93:321-321LieftingLW,KirkpatrickBC.2003.Cosmidcloningandsamplesequencingofthegenomeoftheuncultivablemollicute,westernx-diseasephytoplasma,usingDNApurifiedbypulsed-fieldgelelectrophoresis.FEMSmicrobiologyletters,221:203-211LievensB,ClaesL,VanachterAC,CammueBP,ThommaBP.2006.DetectingsinglenucleotidepolymorphismsusingDNAarraysforplantpathogendiagnosis.FEMSmicrobiologyletters,255:129-139LimP-O,SearsB.1989.16srrnasequenceindicatesthatplant-pathogenicmycoplasmalikeorganismsareevolutionarilydistinctfromanimalmycoplasmas.JournalofBacteriology,171:5901-5906MacLeanAM,SugioA,MakarovaOV,FindlayKC,GrieveVM,TóthR,NicolaisenM,HogenhoutSA.2011.Phytoplasmaeffectorsap54inducesindeterminateleaf-likeflowerdevelopmentinarabidopsisplants.PlantPhysiology,157:831-841MaejimaK,IwaiR,HimenoM,KomatsuK,KitazawaY,FujitaN,IshikawaK,FukuokaM,MinatoN,YamajiY.2014.Recognitionoffloralhomeoticmadsdomaintranscriptionfactorsbyaphytoplasmaleffector,phyllogen,inducesphyllody.ThePlantJournal,78:541-554MaramoroschK.2008.Thediscoveryofphytoplasmas:ahistoricalreminiscenceofsuccessandfailure.EgyptianJounralofvirology,5:1-19MartiniM,LeeIM,BottnerKD,ZhaoY,BottiS,BertacciniA,HarrisonNA,CarraroL,MarconeC,KhanAJ,OsierR.2007.Ribosomalproteingenebasedphylogenyforfinerdifferentiationand 参考文献99classificationofphytoplasmas．Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,57:2037-2051MarconeC,LeeI,DavisR,RagozzinoA,SeemüllerE.2000.Classificationofasteryellows-groupphytoplasmasbasedoncombinedanalysesofrrnaandtufgenesequences.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,50:1703-1713MakarovaO,ContaldoN,PaltrinieriS,BertacciniA,NyskjoldH,NicolaisenM.2013.DNABar-CodingforPhytoplasmaIdentification.In:DickinsonMandHodgettsJ.PhytoplasmaMethodsandProtocols.York,UK:HumanaPress:301-317MarkhamPG,TownsendR.1979.Experimentalvectorsofspiroplasmas.Leafhoppervectorsandplantdiseaseagents,413-445MartiniM,BottiS,MarconeC,MarzachıC,CasatiP,BiancoP,BenedettiR,BertacciniA.2002.Geneticvariabilityamongflavescencedoréephytoplasmasfromdifferentoriginsinitalyandfrance.MolecularandCellularprobes,16:197-208MartiniM,LeeI-M,BottnerK,ZhaoY,BottiS,BertacciniA,HarrisonN,CarraroL,MarconeC,KhanA.2007.Ribosomalproteingene-basedphylogenyforfinerdifferentiationandclassificationofphytoplasmas.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,57:2037-2051McCoyRE,CaudwellA,ChangCJ,ChenTA,ChiykowskyiLN,CousinMT,DaledeLeeuwGTN,GolinoDA,HackettKJ,KirkptrickBC,MarwitzR,PetzoldH,ShinaRH,SugiuraM,WhitcombRF,YangIL,ZhuBM,SeemüllerE.1989.PlantDiseasesAssociatedwithMycoplasmalikeOrganisms.In:TullyJGandWhitcombRF.TheMycoplasmas.NewYork:AcademicPress:5,545-640.MilneR,RamassoE,LenziR,MasengaV,SarinduN,ClarkM.1995.Pre-andpost-embeddingimmunogoldlabelingandelectronmicroscopyinplanthosttissuesofthreeantigenicallyunrelatedmlos:Primulayellows,tomatobigbudandbermudagrasswhiteleaf.Europeanjournalofplantpathology,101:57-67MitrovićJ,KakizawaS,DudukB,OshimaK,NambaS,BertacciniA.2011.Thegroelgeneasanadditionalmarkerforfinerdifferentiationof‘candidatusphytoplasmaasteris'‐relatedstrains.AnnalsofAppliedBiology,159:41-48MontanoHG,DavisRE,DallyEL,HogenhoutS,PimentelJoP,BriosoP.2001.'Candidatusphytoplasmabrasiliense',anewphytoplasmataxonassociatedwithhibiscuswitches'broomdisease.Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,51:1109-1118MortonA,DaviesDL,BlomquistCL,BarbaraDJ.2003.Characterizationofhomologuesoftheappleproliferationimmunodominantmembraneproteingenefromthreerelatedphytoplasmas.Molecularplantpathology,4:109-114MurrayR,BrennerD,ColwellR,DeVosP,GoodfellowM,GrimontP,PfennigN,StackebrandtE,ZavarzinG.1990.Reportoftheadhoccommitteeonapproachestotaxonomywithintheproteobacteria.InternationalJournalofSystematicBacteriology,40:213-215MusettiR,FavaliMA.2004.Microscopytechniquesappliedtothestudyofphytoplasmadiseases:Traditionalandinnovativemethods.CurrentIssuesonMultidisciplinaryMicroscopyResearchandEducation,72-80NakaiK,KanehisaM.1991.Expertsystemforpredictingproteinlocalizationsitesingram‐negativebacteria.Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,11:95-110NambaS,OyaizuH,KatoS,IwanamiS,TsuchizakiT.1993.Phylogeneticdiversityofphytopathogenic 100西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究mycoplasmalikeorganisms.InternationalJournalofSystematicBacteriology,43:461-467NicolaisenM,BertacciniA.2007.Anoligonucleotidemicroarray‐basedassayforidentificationofphytoplasma16sribosomalgroups.Plantpathology,56:332-336NicolaisenM,JustesenAF,ThraneU,SkouboeP,HolmstrømK.2005.Anoligonucleotidemicroarrayfortheidentificationanddifferentiationoftrichotheceneproducingandnon-producingfusariumspeciesoccurringoncerealgrain.JournalofMicrobiologicalMethods,62:57-69NielsenH,EngelbrechtJ,BrunakS,vonHeijneG.1997.Identificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites.Proteinengineering,10:1-6NishigawaH,OshimaK,KakizawaS,JungH-Y,KuboyamaT,MiyataS-i,UgakiM,NambaS.2002.Aplasmidfromanon-insect-transmissiblelineofaphytoplasmalackstwoopenreadingframesthatexistintheplasmidfromthewild-typeline.Gene,298:195-201OhtaT.1992.Thenearlyneutraltheoryofmolecularevolution.AnnualReviewofEcologyandSystematics,263-286OshimaK,KakizawaS,ArashidaR,IshiiY,HoshiA,HayashiY,KagiwadaS,NambaS.2007.Presenceoftwoglycolyticgeneclustersinaseverepathogeniclineofcandidatusphytoplasmaasteris.Molecularplantpathology,8:481-489OshimaK,KakizawaS,NishigawaH,JungH-Y,WeiW,SuzukiS,ArashidaR,NakataD,MiyataS-i,UgakiM.2004.Reductiveevolutionsuggestedfromthecompletegenomesequenceofaplant-pathogenicphytoplasma.Naturegenetics,36:27-29OshimaK,KakizawaS,NishigawaH,KuboyamaT,MiyataS-i,UgakiM,NambaS.2001a.Aplasmidofphytoplasmaencodesauniquereplicationproteinhavingbothplasmid-andvirus-likedomains:Cluetoviralancestryorresultofvirus/plasmidrecombination?Virology,285:270-277OshimaK,MiyataS-i,SawayanagiT,KakizawaS,NishigawaH,Hee-YoungJ,FurukiK-i,YanazakiM,SuzukiS,WeiW.2002.Minimalsetofmetabolicpathwayssuggestedfromthegenomeofonionyellowsphytoplasma.Journalofgeneralplantpathology,68:225-236OshimaK,ShiomiT,KuboyamaT,SawayanagiT,NishigawaH,KakizawaS,MiyataS-i,UgakiM,NambaS.2001b.Isolationandcharacterizationofderivativelinesoftheonionyellowsphytoplasmathatdonotcausestuntingorphloemhyperplasia.Phytopathology,91:1024-1029PacificoD,FoissacX,VerattiF,MarzachiC.2007.Geneticdiversityofitalianandfrench``boisnoir''phytoplasmaisolates.BulletinofInsectology,60:345PadovanA,GibbK,PersleyD.2000.Associationof‘candidatusphytoplasmaaustraliense’withgreenpetalandlethalyellowsdiseasesinstrawberry.PlantPathology,49:362-369PantaloniD,LeClaincheC,CarlierM-F.2001.Mechanismofactin-basedmotility.Science,292:1502-1506PelludatC,DuffyB,FreyJE.2009.DesignanddevelopmentofaDNAmicroarrayforrapididentificationofmultipleeuropeanquarantinephytopathogenicbacteria.Europeanjournalofplantpathology,125:413-423PhytoplasmaResourceCenter.2015.Diseasepictures.http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/pclass/pclass_pictures.html[2015-04-10]PURCELLBAH,RICHARDSONJ,FINLAYA.1981.Multiplicationoftheagentofx‐diseaseinanon‐vectorleafhoppermacrostelesfascifrons.AnnalsofAppliedBiology,99:283-289 参考文献101RioloP,LandiL,NardiS,IsidoroN.2007.Relationshipsamonghyalesthesobsoletus,itsherbaceoushostplantsand``boisnoir''phytoplasmastrainsinvineyardecosystemsinthemarcheregion(central-easternitaly).BulletinofInsectology,60:353SamuelsonJC,ChenM,JiangF,MöllerI,WiedmannM,KuhnA,PhillipsGJ,DalbeyRE.2000.Yidcmediatesmembraneproteininsertioninbacteria.Nature,406:637-641SchneiderB,AhrensU,KirkpatrickBC,SeemüLlerE.1993.Classificationofplant-pathogenicmycoplasma-likeorganismsusingrestriction-siteanalysisofpcr-amplified16srdna.JournalofGeneralMicrobiology,139:519-527SchneiderB,SeemüllerE,SmartCD,KirkpatrickBC.Phylogeneticclassificationofplantpathogenicmycoplasmalikeorganismorphytoplasma．1995.In：RazinRandTullyJG．MolecularanddiagnosticproceduresinMycoplasmology．SanDiego:AcademicPress:369-380SchneiderB,GibbKS.1997.Sequenceandrflpanalysisoftheelongationfactortugeneusedindifferentiationandclassificationofphytoplasmas.Microbiology,143:3381-3389TamuraK,DudleyJ,NeiM,KumarS.2007.Mega4:Molecularevolutionarygeneticsanalysis(mega)softwareversion4.0.Molecularbiologyandevolution,24:1596-1599ScottiPA,UrbanusML,BrunnerJ,deGierJWL,vonHeijneG,vanderDoesC,DriessenAJ,OudegaB,LuirinkJ.2000.Yidc,theescherichiacolihomologueofmitochondrialoxa1p,isacomponentofthesectranslocase.TheEMBOjournal,19:542-549SeemüllerE,MarconeC,LauerU,RagozzinoA,GöschlM.1998.Currentstatusofmolecularclassificationofthephytoplasmas.JournalofPlantPathology,3-26SerekJ,Bauer‐ManzG,StruhallaG,vandenBergL,KieferD,DalbeyR,KuhnA.2004.Escherichiacoliyidcisamembraneinsertaseforsec‐independentproteins.TheEMBOjournal,23:294-301ShaoJ,JomantieneR,DallyE,ZhaoY,LeeI-M,NussD,DavisR.2006.Phylogenyandcharacterizationofphytoplasmalnusaanduseofthenusageneindetectionofgroup16sristrains.JournalofPlantPathology,193-201ShenW,LinC.1993.Productionofmonoclonalantibodiesagainstamycoplasmalikeorganismassociatedwithsweetpotatowitches'broom.PHYTOPATHOLOGY-NEWYORKANDBALTIMORETHENSTPAUL-,83:671-671SmartC,SchneiderB,BlomquistC,GuerraL,HarrisonN,AhrensU,LorenzK,SeemüllerE,KirkpatrickB.1996.Phytoplasma-specificpcrprimersbasedonsequencesofthe16s-23srrnaspacerregion.Appliedandenvironmentalmicrobiology,62:2988-2993StackebrandtE.2007.Forcesshapingbacterialsystematics.MICROBE-AMERICANSOCIETYFORMICROBIOLOGY,2:283StackebrandtE,FrederiksenW,GarrityGM,GrimontPA,KämpferP,MaidenMC,NesmeX,Rosselló-MoraR,SwingsJ,TrüperHG.2002.Reportoftheadhoccommitteeforthere-evaluationofthespeciesdefinitioninbacteriology.Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,52:1043-1047StackebrandtE,GoebelB.1994.Taxonomicnote:AplaceforDNA-DNAreassociationand16srrnasequenceanalysisinthepresentspeciesdefinitioninbacteriology.InternationalJournalofSystematicBacteriology,44:846-849StretenC,GibbK.2005.Geneticvariationincandidatusphytoplasmaaustraliense.Plantpathology,54: 102西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究8-14SugioA,MacLeanAM,GrieveVM,HogenhoutSA.2011.Phytoplasmaproteineffectorsap11enhancesinsectvectorreproductionbymanipulatingplantdevelopmentanddefensehormonebiosynthesis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,108:E1254-E1263SuzukiS,OshimaK,KakizawaS,ArashidaR,JungH-Y,YamajiY,NishigawaH,UgakiM,NambaS.2006.Interactionbetweenthemembraneproteinofapathogenandinsectmicrofilamentcomplexdeterminesinsect-vectorspecificity.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,103:4252-4257SuzukiT,MimuroH,SuetsuguS,MikiH,TakenawaT,SasakawaC.2002.Neuralwiskott–aldrichsyndromeprotein(n‐wasp)isthespecificligandforshigellavirgamongthewaspfamilyanddeterminesthehostcelltypeallowingactin‐basedspreading.Cellularmicrobiology,4:223-233TanakaT,NeiM.1989.Positivedarwinianselectionobservedatthevariable-regiongenesofimmunoglobulins.Molecularbiologyandevolution,6:447-459TilneyLG,PortnoyDA.1989.Actinfilamentsandthegrowth,movement,andspreadoftheintracellularbacterialparasite,listeriamonocytogenes.TheJournalofcellbiology,109:1597-1608TjalsmaH,BolhuisA,JongbloedJD,BronS,vanDijlJM.2000.Signalpeptide-dependentproteintransportinbacillussubtilis:Agenome-basedsurveyofthesecretome.MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,64:515-547Tran-NguyenL,KubeM,SchneiderB,ReinhardtR,GibbK.2008.Comparativegenomeanalysisof“candidatusphytoplasmaaustraliense”(subgrouptuf-australiai;rp-a)and“ca.Phytoplasmaasteris”strainsoy-manday-wb.JournalofBacteriology,190:3979-3991TranVanNhieuG,CaronE,HallA,SansonettiPJ.1999.Ipacinducesactinpolymerizationandfilopodiaformationduringshigellaentryintoepithelialcells.TheEMBOjournal,18:3249-3262UrbanusML,ScottiPA,FröderbergL,SääfA,deGierJWL,BrunnerJ,SamuelsonJC,DalbeyRE,OudegaB,LuirinkJ.2001.Sec‐dependentmembraneproteininsertion:Sequentialinteractionofnascentftsqwithsecyandyidc.EMBOreports,2:524-529UrwinR,HolmesEC,FoxAJ,DerrickJP,MaidenMC.2002.Phylogeneticevidenceforfrequentpositiveselectionandrecombinationinthemeningococcalsurfaceantigenporb.MolecularBiologyandEvolution,19:1686-1694VandammeP,PotB,GillisM,DeVosP,KerstersK,SwingsJ.1996.Polyphasictaxonomy,aconsensusapproachtobacterialsystematics.Microbiologicalreviews,60:407-438WeiW,DavisRE,LeeM,ZhaoY.2007.Computer-simulatedrflpanalysisof16srrnagenes:Identificationoftennewphytoplasmagroups.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,57:1855-1867WeiW,KakizawaS,SuzukiS,JungH-Y,NishigawaH,MiyataS-i,OshimaK,UgakiM,HibiT,NambaS.2004.Inplantadynamicanalysisofonionyellowsphytoplasmausinglocalizedinoculationbyinsecttransmission.Phytopathology,94:244-250WeiW,LeeM,DavisRE,SuoX,ZhaoY.2008.Automatedrflppatterncomparisonandsimilaritycoefficientcalculationforrapiddelineationofnewanddistinctphytoplasma16srsubgrouplineages.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,58:2368-2377WeintraubPG,BeanlandL.2006.Insectvectorsofphytoplasmas.Annu.Rev.Entomol.,51:91-111 参考文献103WeisburgW,TullyJ,RoseD,PetzelJ,OyaizuH,YangD,MandelcoL,SechrestJ,LawrenceT,VanEttenJ.1989.Aphylogeneticanalysisofthemycoplasmas:Basisfortheirclassification.Journalofbacteriology,171:6455-6467WoeseC,ManiloffJ,ZablenL.1980.Phylogeneticanalysisofthemycoplasmas.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,77:494-498WoeseCR.1987.Bacterialevolution.Microbiologicalreviews,51:221WoeseCR.2000.Interpretingtheuniversalphylogenetictree.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,97:8392-8396YeF,MelcherU,FletcherJ.1997.Molecularcharacterizationofageneencodingamembraneproteinofspiroplasmacitri.Gene,189:95-100ZhaoY,DavisRE,LeeM.2005.Phylogeneticpositionsof‘candidatusphytoplasmaasteris'andspiroplasmakunkeliiasinferredfrommultiplesetsofconcatenatedcorehousekeepingproteins.Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,55:2131-2141ZhaoY,WeiW,LeeM,ShaoJ,SuoX,DavisRE.2009.Constructionofaninteractiveonlinephytoplasmaclassificationtool,iphyclassifier,anditsapplicationinanalysisofthepeachx-diseasephytoplasmagroup(16sriii).InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,59:2582-2593ZhouD,MoosekerMS,GalánJE.1999.Roleofthes.Typhimuriumactin-bindingproteinsipainbacterialinternalization.Science,283:2092-2095ZhaoY,WeiW,LeeM,ShaoJ,SuoX,DavisRE.2009.Constructionofaninteractiveonlinephytoplasmaclassificationtool,iphyclassifier,anditsapplicationinanalysisofthepeachx-diseasephytoplasmagroup(16sriii).InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,59:2582-2593 104西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究附录附录1植物样品采集信息编号寄主症状表现采集地植原体病害1泡桐花器绿变、丛枝西安市+2泡桐小叶、黄化、丛枝、枝条节间缩短咸阳市+花器绿变、小叶、叶片畸形、黄化、丛枝、枝3泡桐陕西杨凌区+条节间缩短4泡桐叶片畸形、黄化、丛枝宝鸡市+5泡桐黄化、丛枝甘肃天水市+6泡桐黄化、丛枝甘肃平凉市+7枣丛枝、黄化、榆林市+丛枝、叶片变小、枝条节间缩短，花期时出现8枣延安市+花器绿变、丛枝、黄化、叶片变小、枝条节间缩短，花期9枣西安市+时出现花器绿变、不能结果10枣丛枝、黄化、叶片变小、、不能结果咸阳市+11枣丛枝、黄化、叶片变小、不能结果陕西杨凌区+12枣丛枝、黄化、枝条节间缩短宝鸡市+13枣丛枝、枝条节间缩短宁夏银川市+14枣丛枝、黄化、枝条节间缩短宁夏盐池县+15枣丛枝、黄化、枝条节间缩短新疆和田市+16枣丛枝、黄化、枝条节间缩短新疆阿克苏地区+17枣丛枝、黄化、枝条节间缩短新疆塔里木市+18枣丛枝、黄化、枝条节间缩短甘肃天水市+19枣丛枝、黄化、枝条节间缩短甘肃平凉市+20野枣丛枝、黄化、叶片变小、枝条节间缩短榆林市+丛枝、黄化、枝条节间缩短，花期时出现花器21野枣延安市+绿变22野枣丛枝、枝条节间缩短，花期时出现花器绿变、西安市+23野枣丛枝咸阳市+ 附录10524野枣丛枝、黄化杨凌区+丛枝、黄化、叶片变小、枝条节间缩短，花期25野枣宝鸡市+时出现花器绿变、不能结果丛枝、叶片变小、花藤变短、不能开花，叶片西北农林科技大26凌霄花+向内卷曲，顶端枝条枯死学校园丛枝、花藤变短、叶片向内卷曲，顶端枝条枯杨凌区新天地设27凌霄花+死施园28樱桃丛枝、叶腋增殖铜川市的王益区+29樱桃丛枝、黄化、叶腋增殖铜川市耀州区+30樱桃丛枝、黄化、叶片变小、叶腋增殖渭南市白水县+31樱桃丛枝、叶片变小、叶腋增殖渭南市大荔县+32樱桃丛枝渭南市富平县+33樱桃丛枝、黄化、叶片变小、叶腋增殖咸阳市武功县+34樱桃丛枝、叶腋增殖咸阳市兴平县+35樱桃丛枝、黄化、叶腋增殖咸阳市礼泉县+36樱桃丛枝、黄化、叶片变小、叶腋增殖咸阳市乾县+37樱桃丛枝、叶片变小、叶腋增殖咸阳市永寿县+38樱桃丛枝、黄化、叶腋增殖咸阳市彬县+39樱桃丛枝、黄化、叶片变小、叶腋增殖西安市阎良区+40樱桃丛枝、黄化、叶片变小西安市蓝田县+41樱桃丛枝、黄化、叶腋增殖西安市周至县+42樱桃丛枝、黄化西安市户县+43樱桃丛枝、黄化、叶片变小、叶腋增殖宝鸡市扶风县+44樱桃丛枝、叶片变小、叶腋增殖宝鸡市眉县+45樱桃丛枝、黄化、叶腋增殖陕西杨凌区+46樱桃丛枝、叶片变小、叶腋增殖安康市+47樱桃丛枝、黄化商洛市+48樱桃丛枝、黄化、叶片变小、叶腋增殖汉中市+陕西杨凌区居民49仙人掌植株矮化、茎条畸形+生活区陕西杨凌区花卉50仙人掌植株矮化、茎条畸形+市场51国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退渭南市华县+ 106西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究52国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退渭南市蒲城县+53国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退渭南市合阳县+54国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退咸阳市武功县+55国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退咸阳市兴平县+56国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退咸阳市三原县+57国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退咸阳市乾县+58国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退西安市未央区+59国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退西安市碑林区+60国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退西安市莲湖区+61国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退宝鸡市金台区+62国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退宝鸡市渭滨区+63国槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退宝鸡市陈仓区+64国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝渭南市华县+65国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝渭南市蒲城县+66国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝渭南市澄城县+67国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝渭南市白水县+68国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝渭南市大荔县+69国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝渭南市合阳县+70国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝渭南市富平县+71国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝咸阳市武功县+72国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝咸阳市兴平县+73国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝咸阳市泾阳县+74国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝咸阳市三原县+75国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝咸阳市礼泉县+76国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝咸阳市乾县+77国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝西安市周至县+78国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝西安市户县+79国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝宝鸡市岐山县+80国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝宝鸡市扶风县+81国槐扁茎扁茎、茎秆扭曲、丛枝杨凌农业示范区+82刺槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退陕西杨凌区+83刺槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退西安市+84刺槐丛枝、小叶、茎秆节间缩短、植株衰退陕西杨凌区+ 附录107丛枝、小叶、茎秆节间缩短、花器绿变、果实85南瓜渭南市的合阳县+黄化丛枝、小叶、茎秆节间缩短、花器绿变、果实86南瓜咸阳市武功县+黄化丛枝、小叶、茎秆节间缩短、花器绿变、果实87南瓜咸阳市兴平县+黄化丛枝、小叶、茎秆节间缩短、花器绿变、果实88南瓜咸阳市乾县+黄化丛枝、小叶、茎秆节间缩短、花器绿变、果实89南瓜宝鸡市扶风县+黄化丛枝、小叶、茎秆节间缩短、花器绿变、果实90南瓜陕西杨凌区+黄化矮化、叶片变小、开花变少、新生枝条节间缩咸阳周至县苗木91苦楝+短基地矮化、叶片变小、开花变少、新生枝条节间缩92苦楝杨凌区+短矮化、叶片变小、开花变少、新生枝条节间缩西北农林科技大93苦楝+短学校园94苦楝黄化叶片黄化、小叶、树势衰退咸阳周至县+95苦楝黄化叶片黄化、小叶、树势衰退杨凌区+西北农林科技大96苦楝黄化叶片黄化、小叶、树势衰退+学杨凌区牧草种植97苜蓿丛枝、叶片变小、黄化+区98菲白竹叶片变小、叶腋处小枝丛生西安市兴庆公园+咸阳市咸阳湖公99菲白竹叶片变小、叶腋处小枝丛生+园100早园竹鸟巢样丛枝症状、叶片变小、叶腋处小枝丛生周至县百竹园+西北农林科技大101早园竹鸟巢样丛枝症状、叶片变小、叶腋处小枝丛生+学西北农林科技大102五角枫丛枝、黄化、顶梢枯死+学103辣椒丛枝、叶片变小、植株矮小、果实畸形杨凌区+104辣椒丛枝、叶片变小、植株矮小、果实畸形宝鸡市陇县+ 108西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角105油菜榆林市横山县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角106油菜榆林市米脂县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角107油菜榆林市吴堡县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角108油菜榆林市清涧县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角109油菜榆林市子洲县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角110油菜延安市延川县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角111油菜延安市安塞县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角112油菜延安市志丹县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角113油菜延安市吴旗县+果变短叶片变紫色、花器绿变、花变叶、花变枝、角114油菜汉中市+果变短115凤仙花叶片皱缩、植株矮小、花器绿变杨凌区+西北农林科技大116凤仙花叶片皱缩、植株矮小、花器绿变+学117月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝咸阳市武功县+西北农林科技大118月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝+学农科院家属区119月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝西安市未央区+120月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝西安市碑林区+121月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝西安市莲湖区+122月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝西安市雁塔区+123月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝宝鸡市金台区+124月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝宝鸡市渭滨区+125月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝宝鸡市陈仓区+126月季花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝汉中市+ 附录109杨凌职业技术学127菊花花器绿变、叶片畸形、变小、丛枝+院园艺农场128樱花花器绿变、叶片黄化焦枯，植株衰退、小叶杨凌区+西北农林科技大129樱花花器绿变、叶片黄化焦枯，植株衰退、小叶+学校园130桃树黄化、生长衰退、果实干瘪脱落榆林市+131桃树黄化、生长衰退、果实干瘪脱落渭南市+132桃树黄化、生长衰退、果实干瘪脱落西安市+133桃树黄化、生长衰退、果实干瘪脱落咸阳市+134桃树黄化、生长衰退、果实干瘪脱落宝鸡市+135桃树黄化、生长衰退、果实干瘪脱落汉中市+136葡萄黄化、叶缘坏死、向内卷曲宝鸡市+137葡萄黄化、叶缘坏死、向内卷曲杨凌区+138李叶片黄化、树势衰退、不能结果杨凌区+139苹果小叶、叶片内卷、生长衰退杨凌区+西北农林科技大140普纳菊苣扁茎、叶片畸形学草业科学专业+试验田141中华小苦荬扁茎、花器聚合、叶片变小、茎秆变短韩城市+142中华小苦荬扁茎、花器聚合、叶片变小、茎秆变短韩城市合阳县+143中华小苦荬扁茎、花器聚合、叶片变小、茎秆变短渭南市+144中华小苦荬扁茎、花器聚合、叶片变小、茎秆变短武功县+145中华小苦荬扁茎、花器聚合、叶片变小、茎秆变短周至县百竹园+146中华小苦荬扁茎、花器聚合、叶片变小、茎秆变短杨凌区+147中华小苦荬扁茎、花器聚合、叶片变小、茎秆变短宝鸡市+西北农林科技大148桔梗扁茎+学中草药基地西安市的西安交149紫薇扁茎+通大学校园陕西师范大学校150紫薇扁茎+园151紫薇扁茎长安大学校园+ 110西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究咸阳师范学院校152紫薇扁茎+园153紫薇扁茎医药大学校园+西北农林科技大154紫薇扁茎+学校园155紫薇扁茎杨凌高中校园+宝鸡文理学院校156紫薇扁茎+园157紫薇扁茎宝鸡一中校园+158紫薇扁茎汉中市+159芝麻叶片变小、茎秆扁平、花器绿变、无果实西安市周至县+160芝麻叶片变小、茎秆扁平、花器绿变、无果实杨凌区+161芝麻叶片变小、茎秆扁平、花器绿变、无果实宝鸡市扶风县+162自生谷子黄化韩城市+163自生谷子黄化韩城市合阳县+164自生谷子红叶杨凌区+165狗尾草草穗变绿韩城市+166狗尾草草穗变绿韩城市合阳县+167狗尾草红叶、草穗绿变咸阳市三原县+168狗尾草红叶、草穗绿变西安市蓝田县+169狗尾草红叶、草穗绿变西安市周至县+170狗尾草红叶、草穗绿变宝鸡市扶风县+171狗尾草红叶、草穗绿变杨凌区+172自生小麦矮缩、黄化、叶片卷曲韩城市+173自生小麦矮缩、黄化、叶片卷曲韩城市合阳县+174自生小麦矮缩、黄化、叶片卷曲韩城市合阳县+175自生小麦矮缩、黄化、叶片卷曲咸阳市三原县+176自生小麦矮缩、黄化、叶片卷曲西安市蓝田县+177自生小麦矮缩、黄化、叶片卷曲西安市周至县+178自生小麦矮缩、黄化、叶片卷曲宝鸡市扶风县+179自生小麦矮缩、黄化、叶片卷曲杨凌区+180小麦矮缩、黄化甘肃定西市-181小麦矮缩、黄化青海西宁市- 附录111182青稞矮缩青海玉树市-183小麦矮缩青海海东市-184狗牙根白叶、叶片套叠、黄化渭南+185狗牙根白叶、叶片套叠、黄化铜川市+186狗牙根白叶、叶片套叠、黄化西安市+187狗牙根白叶、叶片套叠、黄化宝鸡市+188狗牙根白叶、叶片套叠、黄化咸阳市+189狗牙根白叶、叶片套叠、黄化汉中市+190狗牙根白叶、叶片套叠、黄化安康市+191狗牙根白叶、叶片套叠、黄化商洛市+192马塘草黄化杨凌区+193马塘草黄化宝鸡市枣园+紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系194马铃薯榆林市横山县+坏死紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系195马铃薯榆林市米脂县+坏死、丛枝紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系196马铃薯榆林市吴堡县+坏死、丛枝紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系197马铃薯榆林市清涧县+坏死、丛枝紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系198马铃薯榆林市子洲县+坏死、丛枝紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系199马铃薯延安市延川县+坏死、丛枝紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系200马铃薯延安市安塞县+坏死、丛枝紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系201马铃薯延安市志丹县+坏死、丛枝紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系202马铃薯延安市吴旗县+坏死、丛枝紫叶、叶腋处长出来绿色不可食用薯块、根系203马铃薯延安市富县+坏死、丛枝叶片变为紫色、叶腋处长出来绿色不可食用薯+204马铃薯鄂尔多斯市块、根部薯块也为绿色没有食用价值，根系坏 112西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究死叶片变为紫色、叶腋处长出来绿色不可食用薯205马铃薯块、根部薯块也为绿色没有食用价值，根系坏宁夏固原市+死206绿豆黄化、豆角畸形、植株矮小延安市宜川县_207红薯小叶、丛枝延安市黄陵县_208黄瓜扁茎延安市宜君县_209杏叶片褪绿铜川市印台区_210杏植株衰退铜川市潼关县_211核桃丛枝、黄化咸阳市旬阳县_212核桃丛枝、黄化咸阳市淳化县_213白蜡树小叶、黄化、植株衰退西安市灞桥区_214白蜡树植株衰退、丛枝西安市临潼区_215白蜡树黄化、小叶西安市长安区_216椿树扁茎宝鸡市千阳县_217椿树扁茎、小叶宝鸡市太白县_218椿树扁茎、小叶、增殖宝鸡市凤_ 附录113附录2未提交的24个植原体株系16SrRNA基因序列>CtcWBGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGCAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTTAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAACTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAATGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAACGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGGATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->ScWBGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAAATAAAAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTTCTTCGGAGGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGCCACATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTTACCAAGATTATGATGTGTAGCTGGACTGAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCGACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATTGAAGAAGAAAAAATAGTGGAAAAACTATCTTGACGTTATTCAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAGATAAGTCTATAATTTAATTTCAGTGCTTAACGCTGTCTTGTTATAGAAACTGTCTTGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGTGTAAATATATGGAGGAACACCAGAAGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTACTAAGTGTCGGGGCAACTCGGTACTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCGAAGCT 114西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究ATAGAAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAGCGCAACCCCTGTCGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCGAGACTGCCAATTAAACATTGGAGGAAGGTGGGGATAACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGAGTAGCTGAAACGCGAGTTTTTAGCCAATCTCAAAAAGACAGTCTTAGTCCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA-------->SjWBGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAAATAAAAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTTCTTCGGAGGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGCCACATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTTACCAAGATTATGATGTGTAGCTGGACTGAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCGACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATTGAAGAAGAAAAAATAGTGGAAAAACTATCTTGACGTTATTCAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAGATAAGTCTATAATTTAATTTCAGTGCTTAACGCTGTCTTGTTATAGAAACTGTCTTGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGTGTAAATATATGGAGGAACACCAGAAGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTACTAAGTGTCGGGGCAACTCGGTACTGAAGTTAGCACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCGAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTCGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCGAGACTGCCAATTAAACATTGGAGGAAGGTGGGGATAACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGAGTAGCTGAAACGCGAGTTTTTAGCCAATCTCAAAAAGACAGTCTTAGTCCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA-------->RpWBGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAAATAAAAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTTCTTCGGAGGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGCCACATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTTACCAAGATTATGATGTGTAGCTGGACTGAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCGACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATTGAAGAAGAAAAAATAGTGGAAAAACTATCTTGACGTTATTCAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAGATAAGTCTATAATTTAATTTCAGTGCTTAACGCTGTCTTGTTATAGAAACTGTCTTGTCTAGAGTGAGATAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGTGTAAATATATGGAGGAACACCAGAAGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA 附录115GATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTACTAAGTGTCGGGGCAACTCGGTACTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCGAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTCGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCGAGACTGCCAATTAAACATTGGAGGAAGGTGGGGATAACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAGAGAGTAGCTGAAACGCGAGTTTTTAGCCAATCTCAAAAAGACAGTCTTAGTCCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCACGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA-------->SWB1GAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGATAAGAAGGCATCTTTTTATTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAAGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGACGATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTCGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAATGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTTGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAAAAGATGGTGGAAAAACCATTATGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAACGCTCAACGTTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTTGGATAGAGGCAAGTGGAATTCCGTGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATACGGAGGAACACCAGAAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGATAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTTTGCAAAGCTGTAGAAATACAGTGGAGGTTATCAGAAGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTGTTAATTGCCATCATTAAGTTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAATGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTAAAGCGTAAGCCTCTGGCGAATCTCAAAAAAGCAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTTGCGGTGAATGCGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA------------>SWB2GAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGATAAGAAGGCATCTTTTTATTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAAGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTATGGCCTACCAAGACGATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTCGAACGGCCACATCGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAATGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTTGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAAAAGATGGTGGAAAAACCATTATGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGC 116西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究GTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAACGCTCAACGTTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTTGGATAGAGGCAAGTGGAATTCCGTGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATACGGAGGAACACCAGAAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGGGTACTAAACGTTGGATAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGGCGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTTTGCAAAGCTGTAGAAATACAGTGGAGGTTATCAGAAGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCGGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTGTTAATTGCCATCATTAAGTTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAATGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTAAAGCGTAAGCTTCTGGCGAATCTCAAAAAAGCAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTTGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA------------->PpWBACGACTGCTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCCGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTAGGGACTTCAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACGAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCGCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->SfWBGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAG 附录117GGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTTAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAACTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAATGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAACGTAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->BrVGAAACGGTTGCTAAGACTGGATAGGAAACAAAAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTTCTTATGAAGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGCCACATTAGTTAGTTGGTAGGGTAAAAGCCTACCAAGACGATGATGTGTAGCTGGACTGAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATTGAAGAAGAAAAAGTAGTGGAAAAACTATATTGACGTTATTCAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCTGTTAGATAAGTCTATAATTTAATTTCAGTGCTTAACGCTGTCTTGTTATAGAAACTGTCTTGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGTGTAAATATATGGAGGAACACCAGAAGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCGTAAACGATGAGTACTAAGTGTCGGGGTAAAACTCGGTACTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAATCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCAAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAGCGCAACCCTTGTCGTTAATTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCGAGACTGCCAATTAAACATTGGAGGAAGGTGAGGATTACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTGACAAAGAGTAGCTGAAACGCGAGTTTTTAGCCAATCTCAAAAAAGCAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGTAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA----->GbV 118西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究GAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTTAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAACTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAATGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAACGTAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->RcVGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTNTGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGTTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTC 附录119AGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->CVGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->SVGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCCTTTATTAGGGAGGAATAAATGATGGAAAAATCACTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGAAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGTTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTGCGCAAGTATGAAACTTGAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG 120西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGTAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCACGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA----------->SYGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAAATAAAAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCGTCTTCGGAGGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGCCACATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTTACCAAGATTATGATGTGTAGCTGGACTGAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCGACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATTGAAGAAGAAAAAATAGTGGAAAAACTATCTTGACGTTATTCAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAGATAAGTCTATAATTTAATTTCAGTGCTTAACGCTGTCTTGTTATAGAAACTGTCTTGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGTGTAAATATATGGAGGAACACCAGAAGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTACTAAGTGTCGGGGCAACTCGGTACTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCGAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTCGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCGAGACTGCCAATTAAACATTGGAGGAAGGTGGGGATAACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGAGTAGCTGAAACGCGAGTTTTTAGCCAATCTCAAAAAGACAGTCTTAGTCCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCGCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA-------->DYGAAACGGTTGCTAAGACTGGATAGGAAATAAAAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTTCTTCGGAGGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGCCACATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTTACCAAGATTATGATGTGTAGCTGGACTGAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCGACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATTGAAGAAGAAAAAATAGTGGAAAAACTATCTTGACGTTATTCAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAGATAAGTCTATAATTTAATTTCAGTGCTTAACGCTGTCTTGTTATAGAAACTGTCTTGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGTGTAAATATATGGAGGAACACCAGAAGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTACTAAGTGTCGGGGCAACTCGGTACTGAAGTTAACAC 附录121ATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCGAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTCGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCGAGACTGCCAATTAAACATTGGAGGAAGGTGGGGATAACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGAGTAGCTGAAACGCGAGTTTTTAGCCAATCTCAAAAAGACAGTCTTAGTCCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA-------->VvYGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->MYGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTTAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAAC 122西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究TAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAATGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAACGTAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->PgFSGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->SjFSGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGTAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAA 附录123AGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTGTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAAGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCACGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCTCA------------->LiFSGAAACGACTGCTAAGACTGGGTAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTAAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAGAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTGTGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGTTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTTGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->SFS 124西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究GAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAATGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTCAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCGCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->MRGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGTTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTC 附录125AGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->GbRGAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAACTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGATACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA---------->PpTGAAACGGTTGCTAAGACTGGATAGGAAACAAAAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTTCTTATGAAGGTATGCTTAAAGAGGGGCTTGCGCCACATTAGTTAGTTGGTAGGGTAAAAGCCTACCAAGACGATGATGTGTAGCTGGACTGAGAGGTTGAACAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATTGAAGAAGAAAAAGTAGTGGAAAAACTATATTGACGTTATTCAATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCTGTTAGATAAGTCTATAATTTAATTTCAGTGCTTAACGCTGTCTTGTTATAGAAACTGTCTTGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGTGTAAATATATGGAGGAACACCAGAAGCGTAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAGTGGTCGGGGTAAAACTCGGGTACTGAAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGGCGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAATCCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCAAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGTTATCAGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGTCG 126西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究TGAGATGTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAGCGCAACCCTTGTCGTTAATTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCGAGACTGCCAATTAAACATTGGAGGAAGGTGAGGATTACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTGACAAAGAGTAGCTGAAACGCGAGTTTTTAGCCAATCTCAAAAAAGCAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGTAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCA 附录127附录3未提交的12个植原体株系rp基因序列>BrV-rpATGGTGGGTCATAAATTAGGAGAATTTTCGCCTACTCGTGTTTTTCGTGGTCATGCTAAAGGTGATAAGAAAAATCAAAAAAAATAATTTAAAGAAGGTATTTATATATGAAGGTTAAAGCGGTAGCAAGTCAAATACCTGTTACGCCTAGAAAAGTGTGTTTGGTTGTTGATTTAATTCGTGGTCAAAAAATTAAAGAAGCTGAAGCTATTTTAACTTTAAATTCAAAATCAGCTGCTCCTATTGTTTTGAAATTGTTAAAAAGTGTGGTAGCTAATGCTGTTCATAATTTTAATTTAAATAAAGATGATTTATATGTAGAAGAAATATTTGTTAATGAAAGCATTTCTTTACCTCGTTTATTTCCTAGAGCTAAAGGAAAGACAGATAAAAGAAAAAAGAGAACTAGTCATATCAAAATATTTGTTTCTAAATGTCAAAAAAAAGAAACTCAGGAGATATAATATAAATGGGTCAAAAAAGCAATCCTAATGGTTTAAGATTAGGAATTATTCGTACTTGGGAATCTAAATGGTATGCTGAAGATAAACAAGTTCCTTCTTTGGTTTGCGAAGATTTTCAAATTAGAAATTTAATTAAAAATCATTATCCTAAAGCAACTATTTCTCAAATAGAAATAAAACGTTTAAAAAAAACGAATGATGAAGTTATTGAGATCGAACTATATACTTCTAAAATAGGTTTGATTCAAGGTCCAGATAATAAAAATAAAAATAGTTTAGTTAGTAAAATAGAAAATTTAATTAAAAAGAAAATTCAAATTAATATTTTTGAAGTTAAAGCTGTTAATAAAATTGCTGTTTTAGTAGCTCAAAATATAGCAATACAACTACAACAAAGAGCTTTTTATAAAGCTGTTCAAAAATCAGCTGTTCAAAAAGCTTTAAGAAGCGGTGTTAAAGGTATTAAAATTATTATTACAGGTCGTTTGGGCGGAGCTGAAAAAGCTAGACAAGAATCTATTTCTATGGGCGTCGTTCCTTTAAACACTTTGAGAGCTGATATTGATTATGCTTGCGAAGAAGCTCATACTACTTATGGCGTCTTAGGGGTTAAAGTTATTATTAATCATGGTGAAGTTTTGCCTAATAAGACTATTTCTGATACTAGACAAATATTTGCTTCTCAATATGATAATAAAAAACATTTTAATAAAAAGAATTTTGCTGAGAAAAAATATTTTAAAAAAAATACGTCTTAATATAATAAAAGGGGTAAAAAAATCATTATGTTAATGCCAAAAAGAAC>CbWB-rpTGGACATAAGTTAGGTGAATTTTCCCCTACACGTACTTACCGCGGACACAACAAAAAAGACAAAAAAATGCAAAAAAAATAAAATAATGGGAAGGAATAACTATGGAAACCAAAAACGCCAAAGCGATTGCTAGAAAAGTTTCAATCGCCCCTCGAAAAGCACGTTTAGTTGTTGATTTAATTCGAGGAAAAAATATTGCACAAGCTCAAGCCATTTTAACTTTTACCCCTAAAGTAGCTGCTCCCGTTATTTTAAAACTTTTAAACAGTGCTGTTTCCAATGCTGTTAATAATTTAAAATTAAACCGCGAACAACTTTATGTTAAAGAAGTTTTTGTCAACGAAGGTTTGCGTTTAAAACGTATGTTTCCAAGAGCTAAAGGTTCTGGTGATATGATTAAAAAAAGAACCAGCCACATTACTTTAGTAATAACTTCTAACACAAACTTGCAAACATCAAAGGAGGAAGAACAAAGTGGGTCAAAAAACTAATCCTAACGGCTTAAGATTAGGCATTATTAGAACTTGGGAATCTCAATGGTGTGTTAATGATAAAGAAATTCCTAATTTAATTAAAGAAGATTTTTTAATTCGTAAACTAATCAATAATTTTACTAAAAAAAGTGCTATCAGTCAAATTGACATTGAACGCCTAAAAGAAAAAAATAAAAACCGTATCACTATTTCTGTCCACACCGCTAAACCAGGCGTTATTATTGGAAAAGATGGCGATACACGCAACAAATTAGTTGCCAAACTCAAAGAACCTACCCAAAAAGACGTTAATCTTAACGTGTTAGAAGTTAAAAACTCTGATAAAATCGCTTTATTAATTGCTCAAAATATGGCTGAACAACTAGAAAATCGTATGTTTTTCCGCCGTGTTCAAAAAATGGCAATCCAAAAAGCCCTAAAAGCTGGTG 128西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究CCAAAGGAGTAAAAACTTTAATTTCTGGTCGTTTGGGTGGTGCTGAAATAGCTCGTAGCGAAGGACATGCCGAAGGCAGAGTTCCTCTACACACTCTAAGAGCAGACATCGATTACGCTGCTGTTGAAGCTCACACTACTTATGGAGTTTTAGGAATTAAAGTATGGATTTTCCACGGTGAAGTTTTACCGGGACAAACCATTCTAGACACTAGAAAACCGTTTGCTTCCCAATCTTCTAACACTCCTAACAGACGCCCTCGCAATTTCAAAGGAGGCAACAATAATCATGTTAATGCCAAAAAGAACTAAATATCGTA>CtcWB-rpTTTTCCCCTACACGTACTTACCGCGGACACAATAAAAAAGACAAAAAAATCCAAAAAAAATAAAATAATGGGAAGGAATAACTATGGAAACCAAAAACGCCAAAGCGATTGCTAGAAAAGTTTCAATCGCCCCTCGAAAAGCACGTTTAGTTGTTGATTTAATTCGAGGAAAAAATATTGCACAAGCTCAAGCAATTTTAACTTTTACCCCTAAAGTAGCTGCTCCCGTTATTTTAAAACTTTTAAACAGTGCTGTTTCCAATGCTGTTAATAATTTAAAATTAAACCGCGAACAACTTTATGTTAAAGAAGTTTTTGTTAACGAGGGTTTGCGTTTAAAACGTATGTTTCCAAGAGCTAAAGGTTCTGGTGATATGATTAAAAAAAGAACCAGCCACATTACTTTAGTAATAACTTCTAGCACAAACTTGCAAACATCAAAGGAGGAAGAACAAAGTGGGTCGAAAAACTAATCCTAACGGTTTAAGATTAGGTATTATTAGAACTTGGGAATCTCAATGGTTTGTTAATGATAAAGAAATTCCTAATTTAATTAAAGAAGATTTTTTAATTCGTAAACTAATTAATAATTTTGCTAAAAAAAGCGCTATCAGTCAAATTGACATCGAACGCCTAAAAGAAAAAAATAAAAACAGTATCACTATTTCTGTCCACACCGCTAAACCAGGCGTTATTATTGGAAAAGACGGCGATACACGCAACAAATTAGTTGCCAAAATAAAAGAGCTTACCCAAAAAGATGTTAATCTTAACGTTTTAGAAGTTAAAAACTCTGATAAAATCGCTTTATTAATTGCTCAAAATATGGCTGAACAACTAGAAAATCGTATGTTTTTCCGCCGTGTTCAAAAAATGGCAATCCAAAAAGCCCTAAAAGCAGGTGCTAAAGGAGTAAAAACTTTAATTTCTGGTCGTTTGGGTGGTGCTGAAATAGCTCGAAGCGAAGGACATGCTGAAGGCAGAGTTCCTCTACACACTCTAAGAGCAGACATCGATTACGCTGCTGTTGAAGCTCACACTAATTATGGAGTTTTAGGAATTAAAATATGGATTTTCCACGGTGAAGTTTTACCAGGACAAACCATTCTAGACACTAGAAAACCGTTTGCTTCCCAATCTTCTAACAATCCTAATATACGTTCTCGCAATTTAAAAGGAGGCAACAATAATCATGTTAATGCCAAAAAGAAC>CY-rpTGGACATAAGTTAGGTGAATTTTCCCCTACACGTACTTACCGCGGACACAACAAAAAAGACAAAAAAATGCAAAAAAAATAAAATAATGGGAAGGAATAACTATGGAAACCAAAAACGCCAAAGCGATTGCTAGAAAAGTTTCAATCGCCCCTCGAAAAGCACGTTTAGTTGTTGATTTAATTCGAGGAAAAAATATTGCACAAGCTCAAGCCATTTTAACTTTTACCCCTAAAGTAGCTGCTCCCGTTATTTTAAAACTTTTAAACAGTGCTGTTTCCAATGCTGTTAATAATTTAAAATTAAACCGCGAACAACTTTATGTTAAAGAAGTTTTTGTCAACGAAGGTTTGCGTTTAAAACGTATGTTTCCAAGAGCTAAAGGTTCTGGTGATATGATTAAAAAAAGAACCAGCCACATTACTTTAGTAATAACTTCTAACACAAACTTGCAAACATCAAAGGAGGAAGAACAAAGTGGGTCAAAAAACTAATCCTAACGGCTTAAGATTAGGCATTATTAGAACTTGGGAATCTCAATGGTGTGTTAATGATAAAGAAATTCCTAATTTAATTAAAGAAGATTTTTTAATTCGTAAACTAATCAATAATTTTACTAAAAAAAGTGCTATCAGTCAAATTGACATTGAACGCCTAAAAGAAAAAAATAAAAACCGTATCACTATTTCTGTCCACACCGCTAAACCAGGCG 附录129TTATTATTGGAAAAGATGGCGATACACGCAACAAATTAGTTGCCAAACTCAAAGAACCTACCCAAAAAGACGTTAATCTTAACGTGTTAGAAGTTAAAAACTCTGATAAAATCGCTTTATTAATTGCTCAAAATATGGCTGAACAACTAGAAAATCGTATGTTTTTCCGCCGTGTTCAAAAAATGGCAATCCAAAAAGCCCTAAAAGCTGGTGCCAAAGGAGTAAAAACTTTAATTTCTGGTCGTTTGGGTGGTGCTGAAATAGCTCGTAGCGAAGGACATGCCGAAGGCAGAGTTCCTCTACACACTCTAAGAGCAGACATCGATTACGCTGCTGTTGAAGCTCACACTACTTATGGAGTTTTAGGAATTAAAGTATGGATTTTCCACGGTGAAGTTTTACCGGGACAAACCATTCTAGACACTAGAAAACCGTTTGCTTCCCAATCTTCTAACACTCCTAACAGACGCCCTCGCAATTTCAAAGGAGGCAACAATAATCATGTTAATGCCAAAAAGAACTAAATATCGTA>GbV-rpTTTTCCCCTACACGTACTTACCGCGGACACAATAAAAAAGACAAAAAAATCCAAAAAAAATAAGATAATGGGAAGGAATAACTATGGAAACCAAAAACGCCAAAGCGATTGCTAGAAAAGTTTCAATCGCCCCTCGAAAAGCACGTTTAGTTGTTGATTTAATTCGAGGAAAAAATATTGCACAAGCTCAAGCAATTTTAACTTTTACCCCTAAAGTAGCTGCTCCCGTTATTTTAAAACTTTTAAACAGTGCTGTTTCCAATGCTGTTAATAATTTAAAATTAAACCGCGAACAACTTTATGTTAAAGAAGTTTTTGTTAACGAAGGTTTGCGTTTAAAACGTATGTTTCCAAGAGCTAAAGGTTCTGGTGATATGATTAAAAAAAGAACCAGCCACATTACTTTAGTAATAACTTCTAGCACAAACTTGCAAACATCAAAGGAGGAAGAACAAAGTGGGTCAAAAAACTAATCCTAACGGTTTAAGATTAGGCATTATTAGAACTTGGGAATCTCAATGGTTTGTTAATGATAAAGAAATTCCTAATTTAATTAAAGAAGATTTTTTAATTCGTAAACTAATTAATAATTTTGCTAAAAAAAGCGCCATCAGTCAAATTGACATCGAACGCCTAAAAGAAAAAAATAAAAACAGTATCACTATTTCTGTCCACACCGCTAAACCAGGCGTTATTATTGGAAAAGACGGCGATACACGCAACAAATTAGTTGCCAAAATAAAAGAGCTTACCCAAAAAGATGTTAATCTTAACGTTTTAGAAGTTAAAAACTCTGATAAAATCGCTTTATTAATTGCTCAAAATATGGCTGAACAACTAGAAAATCGTATGTTCTTCCGCCGTGTTCAAAAAATGGCAATCCAAAAAGCCCTAAAAGCAGGTGCTAAAGGAGTAAAAACTTTAATTTCTGGTCGTTTGGGTGGTGCTGAAATAGCTCGAAGCGAAGGACATGCTGAAGGCAGAGTTCCTCTACACACTCTAAGAGCAGACATCGATTACGCTGCTGTTGAAGCTCACACTAATTATGGAGTTTTAGGAATTAAAATATGGATTTTCCACGGTGAAGTTTTACCAGGACAAACCATCCTAGACACTAGAAAACCGTTTGCTTCCCAATCTTCTAACAATCCTAATATACGTTCTCGCAATTTAAAAGGAGGCAACAATAATCATGATAATGCCAAAAAGGACTAAATATCGT>GbR-rpTGGACATAAGTTAGGTGAATTTTCCCCTACACGTACTTACCGCGGACACAACAAAAAAGACAAAAAAATGCAAAAAAAATAAAATAATGGGAAGGAATAACTATGGAAACCAAAAACGCCAAAGCGATTGCTAGAAAAGTTTCAATCGCCCCTCGAAAAGCACGTTTAGTTGTTGATTTAATTCGAGGAAAAAATATTGCACAAGCTCAAGCCATTTTAACTTTTACCCCTAAAGTAGCTGCTCCCGTTATTTTAAAACTTTTAAACAGTGCTGTTTCCAATGCTGTTAATAATTTAAAATTAAACCGCGAACAACTTTATGTTAAAGAAGTTTTTGTCAACGAAGGTTTGCGTTTAAAACGTATGTTTCCAAGAGCTAAAGGTTCTGGTGATATGATTAAAAAAAGAACCAGCCACATTACTTTAGTAATAACTTCTAACACAAACTTGCAAACATCAAAGGAGGAAGAACAAAGTGGGTCAAAAAACTAATCCTA 130西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究ACGGCTTAAGATTAGGCATTATTAGAACTTGGGAATCTCAATGGTGTGTTAATGATAAAGAAATTCCTAATTTAATTAAAGAAGATTTTTTAATTCGTAAACTAATCAATAATTTTACTAAAAAAAGTGCTATCAGTCAAATTGACATTGAACGCCTAAAAGAAAAAAATAAAAACCGTATCACTATTTCTGTCCACACCGCTAAACCAGGCGTTATTATTGGAAAAGATGGCGATACACGCAACAAATTAGTTGCCAAACTCAAAGAACCTACCCAAAAAGACGTTAATCTTAACGTGTTAGAAGTTAAAAACTCTGATAAAATCGCTTTATTAATTGCTCAAAATATGGCTGAACAACTAGAAAATCGTATGTTTTTCCGCCGTGTTCAAAAAATGGCAATCCAAAAAGCCCTAAAAGCTGGTGCCAAAGGAGTAAAAACTTTAATTTCTGGTCGTTTGGGTGGTGCTGAAATAGCTCGTAGCGAAGGACATGCCGAAGGCAGAGTTCCTCTACACACTCTAAGAGCAGACATCGATTACGCTGCTGTTGAAGCTCACACTACTTATGGAGTTTTAGGAATTAAAGTATGGATTTTCCACGGTGAAGTTTTACCGGGACAAACCATTCTAGACACTAGAAAACCGTTTGCTTCCCAATCTTCTAACACTCCTAACAGACGCCCTCGCAATTTCAAAGGAGGCAACAATAATCATGTTAATGCCAAAAAGAACTAAATATCGTA>JWB-rpTTGCCTCGTTTATTTCCGAGAGCTAAAGGTAAAACAGATAAAAGAAAAAAAAGAATGAGTCGTGTAAAAATATTTCTTTCTTCATTTAAAAAAGAAATTCAGGGGATGTAAGTAAATGGGTCAAAAGAGTAATCCTAATGGTTTGAGATTAGGAATAATTAGGACTTGGGAATCTAAATGGTATGATGTTGATAAAAAAGTTCCTTTTTTAGTCGGTGAAGATTTTAAAATTAGAACTTTGATTAAAAATCATTATCCTAAATCAACTATTTCTCAAATAGAAATTAAACGTTTAAAAAAATCAAATGATGAATTTATTGAAATCGATTTATATACTTCAAAAATAGGTATCATTCAAGGTCCAGAAAATAAGAATAAAAATAGTTTAATTAATAAAATAGAAAAATTAATTAATAAAAAAGTTCAAATTAATATTTTCGAAGTAAAAGCAATTAATAAAATTGCTGTTTTAGTTGCTCAAAATATCGCTATGCAATTACAACAAAGAGCTTTTTATAAAGCTGTTTTAAAATCAGCTATTCAAAAAGCTTTAAAAAGCGGCGTTAAAGGCATTAAGATTATTATTACAGGCCGTTTAGGCGGAGCTGAAAAAGCCAGAAGAGATTCTATTTCGATGGGAGTCGTTCCTTTGAATACTTTGAGAGCTGATATTGATTACGCTTTTGAAGAAGCCCATACTACTTATGGTGTTTTAGGCGTTAAAGTAATTATTAATCATGGTGAGGTTTTACCTAATAAAACCATAGCAGATACTAGACAAATATTTTCTTCTCAATATGAAAATAAAAAAAATAATAATAAAAGACATTTTGCTGATAAGAAAAATTTTAAAAAAAGCACGTCTTAATATAATCAAAAGAGGTACATAATATATTATGTTAATGCCAAAAAGAACTAAATATCGT>JjWB-rpTTGCCTCGTTTATTTCCGAGAGCTAAAGGTAAAACAGATAAAAGAAAAAAAAGAATGAGTCGTGTAAAAATATTTCTTTCTTCATTTAAAAAAGAAATTCAGGGGATGTAAGTAAATGGGTCAAAAGAGTAATCCTAATGGTTTGAGATTAGGAATAATTAGGACTTGGGAATCTAAATGGTATGATGTTGATAAAAAAGTTCCTTTTTTAGTCGGTGAAGATTTTAAAATTAGAACTTTGATTAAAAATCATTATCCTAAATCAACTATTTCTCAAATAGAAATTAAACGTTTAAAAAAATCAAATGATGAATTTATTGAAATCGATTTATATACTTCAAAAATAGGTATCATTCAAGGTCCAGAAAATAAGAATAAAAATAGTTTAATTAATAAAATAGAAAAATTAATTAATAAAAAAGTTCAAATTAATATTTTCGAAGTAAAAGCAATTAATAAAATTGCTGTTTTAGTTGCTCAAAATATCGCTATGCAATTACAACAAAGAGCTTTTTATAAAGCTGTTTTAAAATCAGCTATTCAAAAAGCTTTAAAAAGCGGCGTTAAA 附录131GGCATTAAGATTATTATTACAGGCCGTTTAGGCGGAGCTGAAAAAGCCAGAAGAGATTCTATTTCGATGGGAGTCGTTCCTTTGAATACTTTGAGAGCTGATATTGATTACGCTTTTGAAGAAGCCCATACTACTTATGGTGTTTTAGGCGTTAAAGTAATTATTAATCATGGTGAGGTTTTACCTAATAAAACCATAGCAGATACTAGACAAATATTTTCTTCTCAATATGAAAATAAAAAAAATAATAATAAAAGACATTTTGCTGATAAGAAAAATTTTAAAAAAAGCACGTCTTAATATAATCAAAAGAGGTACATAATATATTATGTTAATGCCAAAAAGAACTAAATATCGT>PpT-rpATGGTGGGTCATAAATTAGGAGAATTTTCGCCTACTCGTGTTTTTCGTGGTCATGCTAAAGGTGATAAGAAAAATCAAAAAAAATAATTTAAAGAAGGTATTTATATATGAAGGTTAAAGCGGTAGCAAGTCAAATACCTGTTACGCCTAGAAAAGTGTGTTTGGTTGTTGATTTAATTCGTGGTCAAAAAATTAAAGAAGCTGAAGCTATTTTAACTTTAAATTCAAAATCAGCTGCTCCTATTGTTTTGAAATTGTTAAAAAGTGTGGTAGCTAATGCTGTTCATAATTTTAATTTAAATAAAGATGATTTATATGTAGAAGAAATATTTGTTAATGAAAGCATTTCTTTACCTCGTTTATTTCCTAGAGCTAAAGGAAAGACAGATAAAAGAAAAAAGAGAACTAGTCATATCAAAATATTTGTTTCTAAATGTCAAAAAAAAGAAACTCAGGAGATATAATATAAATGGGTCAAAAAAGCAATCCTAATGGTTTAAGATTAGGAATTATTCGTACTTGGGAATCTAAATGGTATGCTGAAGATAAACAAGTTCCTTCTTTGGTTTGCGAAGATTTTCAAATTAGAAATTTAATTAAAAATCATTATCCTAAAGCAACTATTTCTCAAATAGAAATAAAACGTTTAAAAAAAACGAATGATGAAGTTATTGAGATCGAACTATATACTTCTAAAATAGGTTTGATTCAAGGTCCAGATAATAAAAATAAAAATAGTTTAGTTAGTAAAATAGAAAATTTAATTAAAAAGAAAATTCAAATTAATATTTTTGAAGTTAAAGCTGTTAATAAAATTGCTGTTTTAGTAGCTCAAAATATAGCAATACAACTACAACAAAGAGCTTTTTATAAAGCTGTTCAAAAATCAGCTGTTCAAAAAGCTTTAAGAAGCGGTGTTAAAGGTATTAAAATTATTATTACAGGTCGTTTGGGCGGAGCTGAAAAAGCTAGACAAGAATCTATTTCTATGGGCGTCGTTCCTTTAAACACTTTGAGAGCTGATATTGATTATGCTTGCGAAGAAGCTCATACTACTTATGGCGTCTTAGGGGTTAAAGTTATTATTAATCATGGTGAAGTTTTGCCTAATAAGACTATTTCTGATACTAGACAAATATTTGCTTCTCAATATGATAATAAAAAACATTTTAATAAAAAGAATTTTGCTGAGAAAAAATATTTTAAAAAAAATACGTCTTAATATAATAAAAGGGGTAAAAAAATCATTATGTTAATGCCAAAAAGAAC>RpWB-rpTTGCCTCGTTTATTTCCGAGAGCTAAAGGTAAAACAGATAAAAGAAAAAAAAGAATGAGTCGTGTAAAAATATTTCTTTCTTCATTTAAAAAAGAAATTCAGGGGATGTAAGTAAATGGGTCAAAAGAGTAATCCTAATGGTTTGAGATTAGGAATAATTAGGACTTGGGAATCTAAATGGTATGATGTTGATAAAAAAGTTCCTTTTTTAGTCGGTGAAGATTTTAAAATTAGAACTTTGATTAAAAATCATTATCCTAAATCAACTATTTCTCAAATAGAAATTAAACGTTTAAAAAAATCAAATGATGAATTTATTGAAATCGATTTATATACTTCAAAAATAGGTATCATTCAAGGTCCAGAAAATAAGAATAAAAATAGTTTAATTAATAAAATAGAAAAATTAATTAATAAAAAAGTTCAAATTAATATTTTCGAAGTAAAAGCAATTAATAAAATTGCTGTTTTAGTTGCTCAAAATATCGCTATGCAATTACAACAAAGAGCTTTTTATAAAGCTGTTTTAAAATCAGCTATTCAAAAAGCTTTAAAAAGCGGCGTTAAAGGCATTAAGATTATTATTACAGGCCGTTTAGGCGGAGCTGAAAAAGCCAGAAGAGATTCTATTTCGATGGG 132西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究AGTCGTTCCTTTGAATACTTTGAGAGCTGATATTGATTACGCTTTTGAAGAAGCCCATACTACTTATGGTGTTTTAGGCGTTAAAGTAATTATTAATCATGGTGAGGTTTTACCTAATAAAACCATAGCAGATACTAGACAAATATTTTCTTCTCAATATGAAAATAAAAAAAATAATAATAAAAGACATTTTGCTGATAAGAAAAATTTTAAAAAAAGCACGTCTTAATATAATCAAAAGAGGTACATAATATATTATGTTAATGCCAAAAAGAACTAAATATCGT>ScWB-rpTTGCCTCGTTTATTTCCGAGAGCTAAAGGTAAAACAGATAAAAGAAAAAAAAGAATGAGTCGTGTAAAAATATTTCTTTCTTCATTTAAAAAAGAAATTCAGGGGATGTAAGTAAATGGGTCAAAAGAGTAATCCTAATGGTTTGAGATTAGGAATAATTAGGACTTGGGAATCTAAATGGTATGATGTTGATAAAAAAGTTCCTTTTTTAGTCGGTGAAGATTTTAAAATTAGAACTTTGATTAAAAATCATTATCCTAAATCAACTATTTCTCAAATAGAAATTAAACGTTTAAAAAAATCAAATGATGAATTTATTGAAATCGATTTATATACTTCAAAAATAGGTATCATTCAAGGTCCAGAAAATAAGAATAAAAATAGTTTAATTAATAAAATAGAAAAATTAATTAATAAAAAAGTTCAAATTAATATTTTCGAAGTAAAAGCAATTAATAAAATTGCTGTTTTAGTTGCTCAAAATATCGCTATGCAATTACAACAAAGAGCTTTTTATAAAGCTGTTTTAAAATCAGCTATTCAAAAAGCTTTAAAAAGCGGCGTTAAAGGCATTAAGATTATTATTACAGGCCGTTTAGGCGGAGCTGAAAAAGCCAGAAGAGATTCTATTTCGATGGGAGTCGTTCCTTTGAATACTTTGAGAGCTGATATTGATTACGCTTTTGAAGAAGCCCATACTACTTATGGTGTTTTAGGCGTTAAAGTAATTATTAATCATGGTGAGGTTTTACCTAATAAAACCATAGCAGATACTAGACAAATATTTTCTTCTCAATATGAAAATAAAAAAAATAATAATAAAAGACATTTTGCTGATAAGAAAAATTTTAAAAAAAGCACGTCTTAATATAATCAAAAGAGGTACATAATATATTATGTTAATGCCAAAAAGAACTAAATATCGT>SjWB-rpTTGCCTCGTTTATTTCCGAGAGCTAAAGGTAAAACAGATAAAAGAAAAAAAAGAATGAGTCGTGTAAAAATATTTCTTTCTTCATTTAAAAAAGAAATTCAGGGGATGTAAGTAAATGGGTCAAAAGAGTAATCCTAATGGTTTGAGATTAGGAATAATTAGGACTTGGGAATCTAAATGGTATGATGTTGATAAAAAAGTTCCTTTTTTAGTCGGTGAAGATTTTAAAATTAGAACTTTGATTAAAAATCATTATCCTAAATCAACTATTTCTCAAATAGAAATTAAACGTTTAAAAAAATCAAATGATGAATTTATTGAAATCGATTTATATACTTCAAAAATAGGTATCATTCAAGGTCCAGAAAATAAGAATAAAAATAGTTTAATTAATAAAATAGAAAAATTAATTAATAAAAAAGTTCAAATTAATATTTTCGAAGTAAAAGCAATTAATAAAATTGCTGTTTTAGTTGCTCAAAATATCGCTATGCAATTACAACAAAGAGCTTTTTATAAAGCTGTTTTAAAATCAGCTATTCAAAAAGCTTTAAAAAGCGGCGTTAAAGGCATTAAGATTATTATTACAGGCCGTTTAGGCGGAGCTGAAAAAGCCAGAAGAGATTCTATTTCGATGGGAGTCGTTCCTTTGAATACTTTGAGAGCTGATATTGATTACGCTTTTGAAGAAGCCCATACTACTTATGGTGTTTTAGGCGTTAAAGTAATTATTAATCATGGTGAGGTTTTACCTAATAAAACCATAGCAGATACTAGACAAATATTTTCTTCTCAATATGAAAATAAAAAAAATAATAATAAAAGACATTTTGCTGATAAGAAAAATTTTAAAAAAAGCACGTCTTAATATAATCAAAAGAGGTACATAATATATTATGTTAATGCCAAAAAGAACTAAATATCGT 附录133附录4英文缩写全称对照缩写英文中文AFLPamplifiedfragmentlengthpolymorphism扩增片段长度多态性Ampampicilin氨苄青霉素ATPadenosinetriphosphate三磷酸腺苷bpbasepair碱基对CKcheck对照CPhCloverphyllody三叶草变叶Ctcyclethreshold域值循环数CTABcetyltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基溴化胺dday天DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6'-二脒基-2-苯基吲哚DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸EBethidiumbromide溴化乙锭EDextrachromosomalDNA染色体外DNAEDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸EF-TuelongationfactorTu延伸因子TuELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定法FAM6-Carboxyfluorescein6-羟基荧光素ggram克GUgenomeunit基因组单位hhour小时IDPsimmunodominantmembraneproteins免疫显性膜蛋白IOMTheInternationalOrganizationforMycoplasmology国际菌原体组织IRPCMTheInternationalResearchProgramof比较菌原体研究计划署kbkilobase千碱基对Mmol/L每升摩尔数mgmilligram毫克minminute分钟mlmilliliter毫升 134西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究MLOMycoplasma-likeorganism类菌原体mmmillimetre毫米mMmicromole/L每升微克分子Nested-PCRnestedpolymerasechainreaction巢式PCRngnanogram纳克ODopticaldensity光密度ORFopenreadingframe开放阅读框架PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PVPpolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮RFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性RNAribonucleicacid核糖核酸RNaseAribonucleaseA核糖核酸酶Arpribosomalprotein核糖体蛋白rpmrevolutionsperminute每分钟转速rRNAribosomalRNA核糖体RNARTFQ-PCreal-timefluorescencequantitativePCR实时荧光定量PCRRSDSsodiumdodecylsulphate十二烷基磺酸钠SEMscanningelectronmicroscopy扫描电子显微镜SRspacerregion间隔区TaqTaqDNApolymerase栖热水生菌DNA聚合酶TBETris-boricacidTris-硼酸TETris-EDTATE缓冲液TEMtransmissionelectronmicroscopy透射电子显微镜Tmmeltingtemperature解链温度TrisTris(hydrocymethyl)-aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖X-gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside苷μgmicrogram微克μlmicrolitre微升BBS3Blueberrystunt蓝莓矮化WBDWheatbluedwarf小麦蓝矮OY-MOnionyellow-Mstrain洋葱黄化M株系 附录135JWB-G1Jujubewitches’-broomG1strain枣疯病G1株系CWBCactuswitches'-broom仙人掌丛枝AYWBAsteryellowwitches’-broom翠菊黄化丛枝PaWBPaulowniawitches'-broom泡桐丛枝 136西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究致谢本论文是在吴云锋教授和项瑜研究员的联合指导下完成的。两位导师渊博的学识、严谨的治学态度、平易近人的待人方式以及忘我的工作精神是我终生学习的楷模。四年来，无论是在学业上还是生活上，两位导师都给予了我极大的支持和帮助，使我铭记在心，终生难忘。在此，向吴老师老师和项老师致以最崇高的敬意和由衷的感谢！本论文的完成还得到了植物保护学院和旱区作物逆境生物学国家重点实验室的康振生教授、黄丽丽教授、孙广宇教授、安德荣教授、井金学教授、韩青梅研究员、张国云老师、裴国亮博士在论文设计、实验过程和论文写作中提出了宝贵的意见和帮助，在此一并表示深深的感谢！感谢实验室孙丽英教授、郝兴安博士在论文修改、答辩PPT制作及文章写作中给予的帮助和提供的思路。感谢在实验室一起奋斗的师姐、师弟、师妹：武科科、张磊、宋加贵、陈伟、宋爽、赵磊、王强、陈旺、张鹏辉、陶烨、刘萍、武占敏、杨洋、李艳、王楠、刘文婷、宋维孝等，感谢在生活中给我们提供无微关怀的师母胡中凤女士。感谢在加拿大联合培养期间实验室的BasdeoBhagwat博士、MikeBernardy博士及池明、魏婷、苏丽、Jane、Donna等一起奋斗的留学生们在实验材料交流、试剂交流、文章写作及日常生活中给予的无私帮助与合作。在此，我诚挚地向他们说一声谢谢！感谢我远在家乡的父母对我学业和生活的全力支持！正是他们无私的爱使我不断成长，得以顺利完成学业！李正男二〇一五年五月于杨凌 作者简介137作者简介李正男，男，满族，吉林白城人。主要教育背景：2010.09-2015.06西北农林科技大学博士研究生植物病理学2012.12-2014.12加拿大农业与食品科学部太平洋农业与食品研究中心（AAFC-PARC）2007.09-2010.06西北农林科技大学硕士植物病理学2003.09-2007.06西北农林科技大学本科生物科学攻读学位期间研究成果：1.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Occurrenceof‘CandidatusPhytoplasmaziziphi’inappletreesinChina.ForestPathology2014,44:417-419.2.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.IdentificationofthephytoplasmaassociatedwithpeachyellowsdiseaseinnorthwestChina.CanadianJournalofPlantPathology2014,36:151-160.3.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.ANewDiseaseofCherryPlumTreewithYellowLeafSymptomsAssociatedwithaNovelPhytoplasmaintheAsterYellowsGroup.JournalofIntegrativeAgriculture2014,13:1707-1718.4.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.DetectionandidentificationofthephytoplasmaassociatedwithChinaixeris(Ixeridiumchinense)fasciation.BotanicalStudies2013,54:52.5.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Moleculardetectionandidentificationofphytoplasmasassociatedwithpepperwitches’broominChina.Phytoparasitica2013,41:429-434.6.ZhangLei,ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Detectionandidentificationofasteryellowsgroupphytoplasma(16SrI-C)associatedwithpeachredleafdisease.JournalofPhytopathology2013,161:359-362.(共同第一作者)7.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Anewphytoplasmaassociatedwithwitches’-broomonJapanesemapleinChina.ForestPathology2012,42(5):371-376.8.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.DetectionandidentificationoftheelmyellowsgroupphytoplasmaassociatedwithPunachicoryflatsteminChina.CanadianJournalofPlantPathology2012,34(1):34-41.9.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Detectionandidentificationofelmyellowsgroupphytoplasma(16SrV)associatedwithalfalfawitches’broomdisease.Journalof 138西北地区常见植物植原体病害分子鉴定及株系多样性研究Phytopathology2012,160(6):311-313.10.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Detectionandmolecularcharacterizationofcactuswitches’-broomdiseaseassociatedwithagroup16SrIIphytoplasmainnorthernareasofChina.TropicalPlantPathology2012,37(3):210-214.11.ZhangLei,ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Detectionandidentificationofgroup16SrVIphytoplasmainwillowsinChina.JournalofPhytopathology2012,160:755-757.(共同第一作者)12.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.FirstreportofanasteryellowsphytoplasmaasthecauseofRoseBalsamphyllodyinChina.JournalofPhytopathology2011(11-12),159:799-801.13.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.AdiseaseassociatedwithphytoplasmainPartheniumhysterophorus.Phytoparasitica2011,39(4):407-410.14.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Berberisphyllodyisaphytoplasma-associateddisease.Phytoparasitica2010,38(1):99-102.15.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.Spiraeasalicifolia:anewplanthostof“CandidatusPhytoplasmaziziphi”-relatedphytoplasma.JournalofGeneralPlantPathology2010,76(4):299-301.16.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.FirstReportedOccurrenceofApplestempittingvirusinShaanxi,China.JournalofPlantPathology2011,S4.63-S4.89.17.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.FirstReportofElmYellowsPhytoplasmaInfectingCloverinChina.PlantDisease2009,93(3):321-321.18.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.FirstReportofSyringaoblataandS.reticulataLeafrollDiseaseinChina.PlantDisease2009,93(3):322-322.19.ZhengnanLi,YunfengWu,etal.AnewChineseisolateofPrunusnecroticringspotvirusfromsweetcherry.JournalofPlantPathology2009,91(2):505-505.20.李正男，吴云锋等.三叶草绿变病植原体的分子鉴定.植物病理学报2012,41(6):645-648.21.李正男，吴云锋等.丁香卷叶病植原体的分子鉴定.植物病理学报2012,42(2):131-138个人荣誉：•教育部2011年博士研究生学术新人奖获•研究生国家奖学金•2012-2013学年西北农林科技大学校长奖学金•西北农林科技大学2012-2013学年优秀研究生•西北农林科技大学2011-2012学年优秀研究生 作者简介139•植保学院首届研究生教工羽毛球团体赛第一名•西北农林科技大学2011年博士生学术论坛优秀论文二等奖•西北农林科技大学2010-2011学年优秀研究生•西北农林科技大学2010-2011学年优秀研究生干部•西北农林科技大学2010年博士生学术论坛优秀论文二等奖•西北农林科技大学2010届校级优秀毕业研究生•荣获西北农林科技大学2010届毕业硕士研究生优秀学术论文校长专项基金二等奖•西北农林科技大学植物保护学院植物病理学创新奖•西北农林科技大学2008-2009学年优秀研究生•西北农林科技大学2008-2009学年优秀论
此文档下载收益归作者所有
