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分类号：R6单位代码：10752密级：公开学号：2009183宁夏医科大学硕士研究生学位论文腺病毒介导的rHSG对大鼠迟发性脑血管痉挛作用的实验研究学位申请人：王保江指导教师：沈冰教授申请学位门类级别：医学专业名称：外科学研究方向：脑血管病学所在学院：临床医学院论文完成日期：二0一二年四月宁夏医科大学研究生院 NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeAdenovirus-mediatedgenetransferofrHSG-1inhibitsproliferationofvascularsmoothmusclecellsfromdelayedcerebralvasospasmratsStudent’sName：WangBaojiangSupervisor:ChifephysicianShenBingSubjectCategory:MedicalscienceMajor:SurgerySpecialty:CerebrovasculardiseaseSchool:NingxiaMedicalUniversityCompletionDate:Apr.2012 宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日 腺病毒介导的rHSG基因转染对大鼠迟发性脑血管痉挛影响摘要目的：采用外源性腺病毒介导rHSG绿色荧光蛋白载体(Adv-rHSG-GFP）感染大鼠基底动脉平滑肌细胞(VSMCs)，观察外源性rHSG的表达部位和效果，以及过表达对SAH后血管壁的增殖和DCV的作用。方法：120只SD大鼠随机分为正常对照组（12只）和模型组（108只）。模型组分为三个亚组：蛛网膜下腔出血组（A组）、SAH+Adv-rHSG-GFP（B组）、SAH+Adv-GFP组（C组）。A组采用枕大池二次注血法诱发，B组和C组手术方法同上，以等量自体血混合Adv-rHSG-GFP或Adv-GFP注入枕大池，分别在首次注血后4d、7d、10d各处死12只，一半灌注处死取基底动脉（BA）行HE染色后测量其内径周长，血管壁厚度，观察血管结构改变，免疫组化检测BA中增殖细胞核抗原PCNA及rHSG蛋白表达；另一半用RT-PCR法检测BA中rHSGmRNA。结果：正常对照组BA血管结构正常。A﹑C组各时相BA有不同程度的内膜增厚皱折、平滑肌层增厚等增殖性改变。与A组及C组相比B组各个时间点的血管痉挛明显缓解。rHSG蛋白及rHSGmRNA表达均增高(P<0.05)，第7天显著增高(P<0.05)。PCNA标记指数AC组在各时间段均高于B组差异有显著意义，与血管痉挛程度一致，AC组之间无统计学意义。结论rHSG的过度表达可以减轻SAH后血管壁的增殖和DCV。关键词大鼠；蛛网膜下腔出血；迟发性脑血管痉挛；大鼠增殖抑制基因；I Adenovirus-mediatedgenetransferofrHSG-1inhibitsproliferationofvascularsmoothmusclecellsfromdelayedcerebralvasospasmratsABSTRACTObjectiveUsingadenovirus-mediatedexogenousrHSGgreenfluorescentproteinvectors(Adv-rHSG-GFP)infectedratbasilararterysmoothmusclecells(VSMCs),toexploretheeffectofexogenousgeneexpressionrHSGlocation,andover-expressionontheproliferationofvascularwallafterSAHandDCVrole.Method120Sprague-Dawleyratswererandomlydividedintotwogroups:normalcontrolgroup(n=12)andmodelgroup(n=108).ThemodelgroupincludeSAHgroup(n=36);SAH+Adv-rHSG-GFPgroup(n=36)andSAH+Adv-GFPgroup(n=36).SAHwasdevelopedwithtwiceinjectionsof0.3mlarterialbloodintocisternamagna,theoperationoftheB﹑Cgroupastheabove,usethesameamountofAutologousbloodmixedwithAdv-rHSG-GFPorAdv-GFPintothecisternamagna,afterthefirstinjectionofbloodof4d,7d,10dweresacrificed12respectively.Halfofthemwereexecutedperfusionandthebasilararteries(BA)wereharvestedon4d,7d,and10dafterexperimentsBAwerestainedbyhematoxylin-eosininformeasurementsofperimeterwallthicknessandobservationofstructuresrespectively.ProteinsofrHSGandPCNAinBAwereevaluatedbyimmunohistochemicallytaining.ExpressionchangesofrHSGmRNAintheBAwereidentifiedbyreversetranscriptionpolymerasechainreactionRT-PCR).ResultTherewerenostructuralchangesandDCVofBAinnormalcontrolgroup.InA,Cgroupstheuminalnarrowingincreasedwallthickness,andcorrugationofthetunicaintimainarteriescanbeseenfromvarioustimesafterSAH.ComparedwiththeAandCgroups,theDCVweresignificantlyreduced,theexpressionofrHSGproteinandmRNAwereincreased(P<0.05)atdifferenttimepointsofAdv-rHSG-GFPgroupandsignificantlyhigher(P<0.05)onthe7thday.PCNAlabelingindexatalltimeinthegroupofAandCweresignificanthigherthaninthegroupofB(P<0.05).theextentconsistentwiththebloodvesselinthegroupofAandChavenostatisticalsignificance.Conclusion（1）theoverexpressionoftherHSGgreencanreducetheproliferationofthevascularwallafterSAHandDCV.II Keywords:rats;subarachnoidhemorrhage;delayedcerebralvasosp.III 中英文缩略词表缩略词英文全称中文全称bPbasepair碱基对BAbasilarartery基底动脉VSMCsvascularsmoothmusclecells血管平滑肌细胞CVScerebralvasospasm脑血管痉挛DCVdelayedcerebralvasospasm迟发性脑血管痉挛DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯HEhematoxylineosin苏木素伊红HSGHyperplasiaSuppressorGene增殖抑制基因IODintegratedopticaldensity积分光密度DMeandensity阳性区域的平均光密度LIlablingindex阳性细胞标记指数rHSGratsHyperplasiaSuppressorGene大鼠增殖抑制基因MAPKmitogen-activatedproteinkinase丝裂原活化蛋白激酶Mfn2mitochondrialfusion2线粒体融合基因2mRNAmessengerribonucleicacid信使核糖核酸NSnormalsaline生理盐水PCANproliferatingcellnuclearantigen增殖细胞核抗原BSphosphatebufferedsaline磷酸缓冲盐液DGFplatelet-derivedgrowthfactor血小板衍化生长因子RT-PCRreversetranscriptionpolymerasechain逆转录－聚合酶链反reactionβ‐巯基乙醇BMEβ-Mercaptoethanol壹 目录前言………………………………………………………………………………………1材料与方法…………………………………………………………………………………4结果………………………………………………………………………………………14讨论………………………………………………………………………………………25结论………………………………………………………………………………………32参考文献……………………………………………………………………………………33综述………………………………………………………………………………………39综述参考文献………………………………………………………………………………46致谢………………………………………………………………………………………49攻读硕士学位期间发表的学术论文………………………………………………………50个人简介……………………………………………………………………………………51壹 前言蛛网膜下腔出血(SAH)后有30%～90%的病人发生脑血管痉挛(Cerebralvasospasm)，导致大脑供血不足，可引起严重的并发症如：脑梗塞甚至死亡等，[1]是蛛网膜下腔出血患者的主要死亡和致残原因。CVS表现为双相性，一种是早发性，多发生于SAH后0.5h～3d内，但常在4h内缓解，也称急性CVS。迟发性脑血管痉挛(delayedcerebralvasospasm,DCV)，发生于SAH后4d～15d，7d～[2]10d为高峰期，2～4周逐渐缓解。迟发性脑血管痉挛对血管扩张剂的反应性较[3,4]差，很难逆转，因此DCV是SAH致残与致死的主要并发症之一。目前对于DCV的病理机制尚不明确。预防和治疗DCV已成为治疗SAH病人的主要目标，也是目前研究的焦点。[5,6]过去有研究者认为，蛛网膜下腔出血后DCV的发生是一个复杂的过程，这些因素主要包括：活化的蛋白激酶C，一氧化氮含量减少，内皮素活性增加，细胞内钙离子浓度改变，痉挛的动脉血管壁结构改变，以及其他炎症因素等。近年来的研究认为蛛网膜下腔出血后DCV的发生是血管壁结构改变引起的结果[7]，其中血管平滑肌细胞增殖尤为重要。[8]Mitsuo等在犬“二次注血”的蛛网膜下腔出血模型中发现在SAH后发生的迟发型脑血管痉挛中，血管平滑肌细胞的增殖和表型改变扮演了重要的角色。[9]Borel等在小鼠蛛网膜下腔出血的试验中观察发现：出血部位脑动脉血管平滑肌细胞和成纤维细胞增殖细胞核抗原表达明显增加；而且在体外培养的人脑微动脉试验中发现，血凝块能刺激脑血管内皮细胞出现增殖。[10,11]Chen等最近发现的细胞增殖抑制基因（HyperplasiaSuppressorGene,HSG）在正常VSMCs中有广泛分布，但在血管增殖性疾病中表达量明显下降，而且其产物主要在细胞膜和胞质中表达。HSG可以抑制raf和MAPK的活性，是一种新的与细胞增殖相关的信息传递分子研究表明，过表达细胞增殖抑制基因不但可以上调周期调控蛋白p27Kip1和p21Cip1的表达、而且可以下调PCNA[12,13,14]的表达、使细胞受阻滞于G0/G1期，从而抑制细胞增殖。但是目前对HSG1 的研究仅限于心血管疾病、部分肿瘤性疾病及线粒体疾病。位于细胞核内增殖细胞核抗原是DNA聚合酶的一种辅助蛋白，主要功能是[15,16]促进DNA合成和延伸，与细胞的增殖周期关系密切，PCNA量的变化反映细胞的增殖状态。因此检测PCNA对于防治血管增殖性疾病具有重要意义。我们在前期完成的课题《大鼠蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛和rHSG表达相关性的实验研究》中发现：SAH后随着DCV严重程度的增加,BA中rHSGmRNA的转录水平明显下降,之后随着血管痉挛的缓解,其表达逐渐增加,提示rHSG的低表达和DCV有一定的相关性,该基因的过度表达有可能防止或减轻DCV的发生。本次试验在完成了重组复制缺陷型腺病毒载体Adv-rHSG-GFP和Adv-GFP的构建的基础上，利用腺病毒介导rHSG绿色荧光蛋白载体(Adv–rHSG–GFP)转染大鼠基底动脉；观察外源rHSG基因在基底动脉的表达部位和效果，以及过表达对SAH后血管壁的增殖和DCV的作用。2 材料和方法1材料1.1实验动物和分组prague-Dawley大鼠120只，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(宁)2005-0001，雌雄不拘，体重320g±80g，随机分为两大组：正常对照组（12只）和模型组（108只）。模型组又分为三个亚组：蛛网膜下腔出血组（A组）、SAH+Adv-rHSG-GFP（B组）、SAH+Adv-GFP组（C组）。A组采用枕大池二次注血法诱发，B组C组手术方法同上，以等量自体血混合50µl9滴度为2.5×10pfu/ml的SAH或Adv-GFP病毒悬液，注入枕大池。分别首次注血后4d、7d、10d各处死12只，6只用于组织病理学和免疫组织化学检测，6只用于rHSGmRNA检测。1.2主要药品、试剂及来源Mfn2(xx-1)多克隆抗体购自santacruz公司（Catalog#:sc-100560）；小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体购自武汉博士德公司；SP免疫组织化学试剂盒购自北京博奥森公司；DAB显色试剂盒购自北京天根生化科技公司；rHSG和β-actin上下游引物由北京赛百盛生物合成；SVTotalRNAIsolationSystem(Z3100)及AccessRT-PCRIntroductorySystem(A1260)均购自Promega公司；腺病毒介导绿色荧光蛋白载体Adv-rHSG-GFP和Adv-GFP由本组实验人员在宁夏医科大学中心实验室构建完成。1.3实验仪器4.5倍手术显微镜（北京福凯仪器有限公司），电热手提压力蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂），电热恒温水浴箱（北京长源实验设备厂），Leica2015型石蜡切片机（德国Leica公司），石蜡自动包埋脱水机（德国Leica公司），微波炉（中国Galanz公司），摊片烤片机（孝感市宏业医用仪器有限公司），烤箱（南京欣华公司），OlympusBH2-RFCA显微镜（日本奥林巴斯公司），MoticBA400生物显微镜（德国），超净工作台（江苏安泰公司），可调微量加样器（芬兰Finnpipette3 公司），高速低温离心机（美国Bio-RAD公司），DYY-Ⅲ电泳仪（北京六一仪器厂），核酸浓度测定仪（美国Bio-RAD公司），PCR仪（美国Bio-RAD公司），凝胶成像仪（美国Bio-RAD公司），电子天平BP110S（德国Sartoris公司），电热鼓风干燥箱（重庆万达仪器有限公司），Z383K型高速泛用冷冻型离心机(德国HERMLE公司)，超低温冰箱（美国ThermoForma公司），压力蒸气灭菌器（上海博迅实业有限公司），微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂），纯水仪（法国Millipore公司）1.4主要溶液配制①0.1mol/l的PBS（pH7.4）：用总量为900ml的蒸馏水溶解NaCl分析纯8.5g、NaH2PO4·2H2O分析纯2.96g和Na2HPO4·12H2O分析纯29.01g，用0.5mol/l的NaOH调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000ml。②0.1mol/l的PBS-多聚甲醛（4%）：多聚甲醛40g、0.1mol/l的PBS(pH7.4)800ml，加热至60℃，充分搅拌溶解后定容至1000ml。③0.01mol/l枸椽酸盐缓冲液（pH6.0）：用总量为900ml的蒸馏水溶解枸橼酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）分析纯3.0g枸橼酸（C6H8O7·H2O）分析纯0.4g，再用蒸馏水定容至1000ml。④50×TAEbuffer：Tris24.2g、冰乙酸5.7ml、0.5mol/l的EDTA(pH8.0)10ml，去离子水定容至100ml。⑤6×DNA上样缓冲液：蔗糖4g、溴酚蓝2.5mg、1mol/l的Tris-HCl(pH8.0)100μl、0.5mol/l的EDTA20μl，TEbuffer定容至10ml。⑥1.5%琼脂糖凝胶：琼脂糖0.75g、10mg/ml的溴化乙锭1.5μl、50×TAE1ml，蒸馏水定容至50ml。2实验方法2.1大鼠蛛网膜下腔出血动物模型的制备大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，头部及左侧股动脉区备皮，常规消毒铺巾，鼠仰卧位，3倍手术显微镜下暴露左侧股动脉备用；取枕下正中4 切口，长2cm，暴露环枕膜(在左右耳根连线处中点可摸到枕外隆凸，往下大约0.5cm可感觉一凹陷（小脑延髓形成的夹角），沿中线纵行剪开项部皮肤)，用自制枕大池穿刺针刺破环枕膜，进针2.5mm，有脑脊液流出后，A组抽取自体股动脉血0.3ml，以0.lml/min的速度缓慢注入枕大池，注血后环枕膜穿刺处填塞明胶海绵一块，以小棉球压迫数分钟后缝合肌肉及皮肤，俯卧位头低30度约30min，48h后二次注血。B组C组手术方法同上，以等量自体血混50µl滴度为2.5×109pfu/ml的Adv-rHSG-GFP或Adv-GFP病毒悬液，注入枕大池。大鼠术后置于干净的空饲养盒内，保温，待动物翻正反射恢复后送回笼中，单独卫生饲养。2.2.1BA形态学检查三组分别在首次注血(或注入自体血混合基因载体或空腺病毒载体)后4d、7d、10d各处死12只大鼠。形态学检测标本采用灌注法处死获得：10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，剑突下胸骨旁开1.0cm向上剪开胸腔及心包，暴露心脏及主动脉，剪开左心室，将套管插入升主动脉约1cm固定后开始灌注，同时剪开右心房放血；灌注压力120cm水柱，依次用37℃NS300ml及44%℃多聚甲醛0.1molPBS250ml，至少30min；灌注完毕立即开颅取出带完整BA的脑干，观察脑底血凝块分布情况，然后浸于福尔马林固定液中继续固定24h。2.2.2苏木素伊红（hematoxylineosin，HE）染色BA形态学观察及测量⑴HE染色：①切片脱蜡至水：依次为二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、100%酒精Ⅰ1min、100%酒精Ⅱ1min、95%酒精Ⅰ1min、80%酒精1min、70%酒精1min、自来水洗1min、蒸馏水洗1min；②氧化苏木素染液染细胞核10min，自来水洗10min；③1%伊红浸染5min；④脱水、透明：依次为70%酒精30s、80%酒精30s、95%酒精Ⅰ30s、95%酒精Ⅱ30s、100%酒精Ⅰ3min、100%酒精Ⅱ3min、二甲苯Ⅰ7min、二甲苯Ⅱ7min；⑤中性树胶封固。[7]⑵BA血管壁厚度及血管内径周长测定：参照文献方法，采用测定BA血管壁厚度及血管内径周长来判断DCV程度。切片HE染色后，在MoticBA400显5 微镜下拍照，在不知道分组的情况下将图象录入MoticImagesPlus2.0计算机图像分析系统计算BA血管内径周长及血管壁厚度。测量内径周长时，紧贴血管内壁进行，测量血管壁厚度时，取相对位置的4个点测量，血管外层的包膜不计算在内，将4个位置测量值的平均值作为该血管的壁厚值。2.2.3免疫组织化学染色检测大鼠BA中PCNA及rHSG蛋白的表达㈠石蜡标本切片后用过氧化物酶标记的链霉卵白素（Streptavidin/Peroxidase）染色试剂盒SP法作免疫组化染色，分别检测PCNA和rHSG蛋白在各组BA中的表达，操作严格按照北京博奥森生物技术有限公司试剂盒说明进行，具体步骤如下：1.石蜡切片，60℃烤片2小时，常规脱蜡至水（二甲苯脱蜡15分钟，三次。水化：依次经过无水乙醇、95%、90%、80%、70%，各5分钟）。2.蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟后行抗原修复（将切片浸入0.01mol/l的枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中，煮沸（沸水浴）修复15分钟，自然凉至室温后用0.01mol/l的PBS（pH7.4，以下同）漂洗5分钟，三次。3.3%H2O2去离子水卵育10-15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。4.滴加正常山羊血清工作液室温卵育10-15分钟，倾去，勿洗。5.滴加Mfn2(xx-1)多克隆抗体（工作浓度1:150）））或小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体（工作浓度1:100），置37℃恒温箱孵育3小时。6.0.01mol/l的PBS洗3min×3次。7.滴加生物素化二抗工作液（lgG/Bio）。8.室温卵育10-15分钟。9.滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液10室温卵育10-15分钟。11.DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中显色剂A（DAB，20×浓缩液）及显色剂C（20×TBS浓缩缓冲液）各1滴，待显色前再加入显色剂B（H2O2，20×浓缩液）1滴，混匀后加至切片，室温显色，适时终止，镜下观察结果12自来水充分冲洗。13苏木素轻度复染；14脱水依次经过70%、80%、90%、95%、无水乙醇，各5分钟，二甲苯15分钟，三次，中性树胶封片，显微镜观察。㈡免疫组化结果分析：以已知肝Ca阳性片作阳性对照，DAB显色，镜下控制反应时间苏木素复染。PCNA以细胞核染成棕色为阳性细胞，其标记指数(labling[6]index，LI)计算公式如下:PCNALI=(阳性细胞数/细胞总数)×100%。rHSG以神6 经胶质细胞质有黄色阳性，在OlympusBH2-RFCA显微镜下(×400)对切片进行[16]拍照，按照参考文献的方法，图片导入Image-ProPlus6.0图像分析统，计算每张切片阳性区域的平均光密度(Meandensity)和积分光密度(integratedopticaldensity，IOD)作为评价阳性信号强弱的指标。㈢RT-PCR技术检测BA中rHSGmRNA的表达1标本获取实验开始后4d、7d、10d，每组每一时相各取6只大鼠，用10%水合氯醛(350mg/kg体重)腹腔注射麻醉动物后，快速断头取脑;剥离基底动脉置入1.5ml埃彭道夫管中，液氮转运于-80℃冰箱保存。2BA中总RNA的提取基底动脉总RNA提取采用SVTotalRNAIsolationSystem(Z3100)，详细步骤如下：1.在一个无菌小离心管中加入175ul的RNALysisBuffer(加了BME的)，要用无RNA酶的枪头，带着手套操作。2.称量上述装有RNALysisBuffer的离心管，记录重量3.用一个无菌刀片迅速将BA组织切成小块，用研棒研磨，然后将磨碎的组织转进装有175ulRNALysisBuffer的离心管中，颠倒几次，彻底混匀。4.称量装有组织和RNALysisBuffer的离心管，将第2步的重量从新重量中减去，就得到组织量的值。一般，组织量和RNALysisBuffer之比应大约是30mg/175ul。5.向175ul裂解物中加入350ul的RNADilutionBuffer(蓝色)，颠倒3-4次混合。70℃，3分钟。6.14000xg离心10分钟。7.用移液枪将澄清裂解液移到一无菌离心管中。8.向澄清裂解液中加入200ul95%乙醇，用移液枪吸放3‐4次以混合。将此混合物转移到离心柱装配体。13，000xg离心1分钟。9.从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体。将离心柱装回到收集管上。加600ulRNAWashSolution于离心柱装配体。12，000xg离心1分钟。10.像前次一样清空收集管并置之于试管架上。对于每管RNA提取，在无菌试管中按顺序混合下列试剂以制备DNase孵育混合物：（YellowCoreBuffer40ul0.09MMnCl25ulDNaseI5ul）。将50ul这样新鲜制备的DNase孵育混合7 物直接加到离心柱内的膜上。11.于20‐25oC孵育15分钟。然后向离心柱中加入200ulDNaseStopSolution，12，000xg离心1分钟。不须清空收集管。12.加入600ulRNAWashSolution（已加入乙醇），离心12，000xg，1分钟。13.清空收集管，向离心柱内加入250ulRNAWashSolution（已加入乙醇），高速离心2分钟。14．从离心柱上扭掉盖子。15．为每一个样品从袋中取出一个1.5ml带盖洗脱管。将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100ul无核酸酶水。12，000xg离心1分钟。丢弃离心柱。盖好盛有RNA的洗脱管，存于‐70oC。16RNA质检及纯度测定：总RNA提取后，配制1.5%的琼脂糖凝胶，取10ul的RNA在120V电压下水平电泳20min，然后在紫外透视仪下观察，若所提取的RNA完整，没有被降解，则可见清晰的28SrRNA和18SrRNA条带，28SrRNA的亮度约为18SrRNA的2倍，且无拖带。再进一步分析RNA纯度，取总RNA提取液2ul，加入998μl的DEPC水，用紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度（opticaldensity,IOD）值，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间时表明RNA纯度高，含杂质少，适合RT-PCR用。将质检合格的总RNA分装保存在-80℃。3.rHSG和β-actin引物序列[11]rHSG引物序列引自文献，由北京赛百盛生物合成，上游序列为：5’-GGAGCTGGACAGCTGGATTGAT-3下游序列为：5’-AGCTCCAGCTGCTTGTCC[17]ATGA-3’，扩增片断长度609bp；β-actin引物序列亦参照文献，由上海生工合成，上游序列为：5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，下游序列为：5’-GCTCAGTAACAGTCCGCCTA-3’，扩增片断长度278bp。4RT-PCR⑴配制反应混合物：采用Promega一步法RT-PCR反应系统，在冰上依次将AMV/Tfl反应缓冲液、MgSO4、DNTP混合物、特异性上下游引物加入0.2m1薄壁EP管中，反复吹吸混匀，然后向反应体系中加入AMV反转录酶和TflDNA聚合酶，轻柔振荡混匀，加入RNA模版启动反应，各成份浓度及加样量见表1。8 ⑵反应条件：48℃45min，94℃2min，1个循环，合成第一条cDNA链；94℃30s，61℃45s，72℃80s，35个循环，合成第二条cDNA链及PCR扩增；72℃最终延伸7min后终止反应。.5RT-PCR反应产物分析⑴2%的琼脂糖凝胶制备：将1.0g琼脂糖溶于50m1的1×TAE电泳缓冲液中，加热溶化后，冷却至50-60℃；加入的溴化乙锭0.3ul，摇匀后缓慢倒入模具，放入梳子，冷却凝固30min后将梳子轻轻拔出；将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液，使电泳缓冲液刚好盖过胶面约0.5cm左右。表1RT-PCR反应成分表（50μ1体系）成分初始浓度体积终浓度AMV/Tflbuffer5×10µl1×MgSO425mmol/l2µl1mmol/lDNTPs10mmol/l1µl0.2mmol/lβ-actinp150µmol/l1µl1µmol/lβ-actinp250µmol/l1µl1µmol/lrHSGp150µmol/l1µl1µmol/lrHSGp250µmol/l1µl1µmol/lTflDNA聚合酶5U/µl1µl0.1U/µlAMV反转录酶5U/µl1µl0.1U/µl无RNA酶H2O28µlRNA模板1ug/µl3µl终体积50µlβ-actin上下游引物在另一组反应体系中（50ul）进行⑵上样：取RT-PCR产物10µl（β-actin及rHSG各5ul）与2µl的6×上样缓冲液混匀后加入点样孔中，600bpDNALadder作分子量标准。⑶电泳：打开电源，调节电压至120V，溴酚兰电泳至胶带约2/3处时，紫外灯9 下观察扩增条带，Quantityone4.3.1凝胶成像系统照相。⑷结果分析：Quantityone4.3.1凝胶分析系统对对各电泳带的亮度和面积进行分析，最后得出各电泳条带扣除本底后的总信号量AdjustVolume（Adj.Vol）；rHSGmRNART-PCR产物的Adj.Vol值与内参照β-actinmRNART-PCR产物的Adj.Vol值的比值（rHSG/β-actin）即为rHSGmRNA相对表达量。㈣统计学处理结果以x±s表示，样本均数间比较采用One-wayANOVA检验(Bonferroni)，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性。10 结果1HE染色BA病理形态观察1光镜下BA的大体形态学改变及内径周长、血管壁厚度的时相变化A组及C组不同时相BA血管均有明显DCV发生：血管内径明显变小，管壁增厚弹力纤维皱缩，向血管腔内隆起，呈增值相改变。B组见BA血管无明显缩窄性改变：各时间点管腔增及管壁改变不明显，提示无明显痉挛发生。正常对照组大鼠BA血管结构正常，管腔圆滑，平滑肌细胞排列整齐，弹力明显。(图1-3，表1)表1：大鼠基底动脉内径周长及基底动脉壁厚(n=6,μm,x-±s)Tab1LuminalperimeterandWallthicknessofthebasilararteriesinratsofthebasilararteriesinrats(n=6,μm,x-±s)GroupWallthicknessLuminalperimeterA416.09±0.20596.00±12.00A725.90±0.36511.00±14.00A1023.59±0.60547.00±12.00★■B415.82±0.20599.00±8.00★■B715.08±0.10605.00±11.00★■B1017.35±0.20597.00±8.00C415.90±0.10604.00±21.00C724.8±0.40501.00±19.00C1021.01±0.70562.00±10.00Normal14.00±2.00610.00±7.00★■P<0.01与A,C组相应时间点比较；A；(SAHgroup)B；(SAH+Adv-rHSG-GFPgroup)C；SAH+Adv-GFPgroup)4(4thafterinjectionofblood)7(7thafterinjectionofblood)10(10THafterinjectionofblood11 ACBDEFGHIJ图1：HE染色测量各组BA血管内径周长、血管壁厚度A：出血组4天；B：出血组7天；C：出血组10天；D：空腺病毒组4天；E：空腺病毒组7天；F：空腺病毒组10天；G：rHSG转染治疗组4天；H：rHSG转染治疗组7天；I：rHSG转染治疗组10天；J：正常大鼠12 图2：血管壁厚度P<0.01;A;CvsBgroup差异有显著性图3：血管周径P<0.01;A;CvsBgroup差异有显著性2.2SAH后大鼠BA中PCNArHSG蛋白的表达蛋白染色（SP法）[18]采用文献方法，利用光密度对PCNA及rHSG进行量化分析。以PBS代替一抗作阴性对照，以已知肝Ca阳性片作阳性对照。PCNA以细胞核染成棕黄色为阳性细胞，A组及C组神经胶质细胞中PCNA表达较B组明显增高可见大13 多数细胞的细胞核黄染与血管痉挛，管壁增厚一致。且A.C组之间差异度不大(P›0.05)与B组比较差异有统计学意义(P<0.01)。rHSG以神经胶质细胞膜或细胞质有棕黄色或棕褐色着色为阳性，A.B.C三组均可见rHSG蛋白的表达，以胞膜或胞浆出现棕黄色或棕褐色为阳性信号。B组以增殖相对不活跃区域着色较强，rHSG的蛋白表达明显强于对照A.C组。半定量分析：每标本切片4张，染色后在高倍镜下(×400)照相，图片导入Image-ProPlus6.0图像分析系统，计算每张切片rHSG蛋白表达阳性区域的平均光密度(Meandensity)D值和积分光密度(integratedopticaldensity)IOD值，同一时间组内，及不同时间组之间均见B组表达增强。各组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。（见图4-8，见表2）表2：PCNA和rHSG的表达(x±s,n=6)Table2ExpressionsofPCNAandrHSGGroupnLIofPCNA/%rHSGD(Meandensity)IODA4d632.5±0.020.24±0.0210.81±0.9＃7d646.8±0.020.178±0.018.07±0.710d637.1±0.010.211±0.028.45±0.5B4d628±0.040.272±0.0412.58±1.37d620.3±0.010.375±0.0320.7±1.0▽10d629.3±0.040.324±0.0313.49±1.6C4d632±0.050.242±0.0310.19±1.2＃7d647.4±0.030.181±0.17.95±0.810d635±0.050.205±0.018.7±0.5normal0d600.25±0.0411.7±0.4▽＃P<0.01与A,C组相应时间点比较；LI:Lablingindex;IOD:Integratedopticaldensity,A(SAHgroup)B(SAH+Adv-rHSG-GFPgroup)C(SAH+Adv-GFPgroup)4(4thafterinjectionofblood)7(7thafterinjectionofblood)10(10THafterinjectionofblood14 ACBDEFGHIJ图4：PCNA蛋白免疫组化染色（DAB显色，OLYMPUSBH2-RFCA显微镜，×200）A：出血组4天；B：出血组7天；C：出血组10天；D：空腺病毒组4天；E：空腺病毒组7天；F：空腺病毒组10天；G：rHSG转染治疗组4天；H：rHSG转染治疗组7天；I：rHSG转染治疗组10天；J：肝癌PCND阳性对照；15 ABCDEFGHIJ图5：rHSG蛋白免疫组化染色（DAB显色，OLYMPUSBH2-RFCA显微镜，×200）A：出血组4天；B：出血组7天；C：出血组10天；D：空腺病毒组4天；E：空腺病毒组7天；F：空腺病毒组10天；G：rHSG转染治疗组4天；H：rHSG转染治疗组7天；I：rHSG转染治疗组10天；J：肝癌RHSG阳性对照16 图6：免疫组化PCNA蛋白阳性细胞数图图7：免疫组化HSG蛋白IOD值对比图17 图8：免疫组化HSG蛋白Meandensity值对比图3.大鼠BA血管壁rHSGmRNA的表达A组及C组不同时相大鼠BA中rHSGmRNA的相对表达量偏低，但同时相组间无明显差异(P>0.05)。B组rHSGmRNA相对表达量明显高于其他组，与A组、C组不同时相相比差异显著(P<0.01)，提示目的基因外源性转染后含量增加。A组与C组注血后7drHSGmRNA相对表达量最低，同时相组间无明显差异。证实BA中rHSGmRNA的相对表达量随血管痉挛程度及管壁增殖程度有差异，与管壁增殖有关，而与腺病毒感染无关。（图10-11，表3）18 表3：BA中rHSG/β-actin的相对表达量组别adjustVolume(rHSG/β-actin)A40.2744±0.231A70.2394±0.017A100.2849±0.06B40.2841±0.057B70.3667±0.013B100.3094±0.016C40.2731±0.005C70.232±0.013C100.2863±0.013Nor0.2813±0.017P<0.01;ACvsBgroup;A;(出血组)B;(基因治疗组)C;(空载体对照组)4(4thafterinjectionofblood)7(7thafterinjectionofblood)10(10THafterinjectionofblood19 图9：总RNA质检及纯度测定结果总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳后，28SrRNA和18SrRNA2条带清晰，28SrRN的亮度约为18SrRNA的2倍，无拖带（图IB-1）。D260/D280比值为1.78。M12345678910600609bp400278bp100图10：三组大鼠BA血管壁rHSGmRNA的表达M：DNALadder600；1-10分别为：1.正常大鼠2.3.4.出血组5.6.7基因治疗组8.9.10空腺病毒组20 图11：BA中rHSG/β-actin的相对表达量21 讨论蛛网膜下腔出血是一种严重的破坏性疾病，可导致严重并发症，它的致死率很高，据统计一般约12.4％的患者在SAH初次发作当时就出现突然死亡以至于来不及救治，约40％的SAH患者会在初次出血后在48小时内死亡。1.SAH与脑血管痉挛目前认为决定蛛网膜下腔出血患者愈后的原因可归纳为：（1）脑缺血甚至脑梗死，是蛛网膜下腔出血患者死亡或者致残的主要病因；（2）再出血，2周内发病率约为20％；（3）急性脑损伤，是蛛网膜下腔出血造成的直接结果，包括：脑水肿、颅内压增高、血脑屏障功能损害、急性缺血性神经功能障碍和颅内血肿等等。脑血管痉挛是蛛网膜下腔出血后患者致死、致残的主要因素之一。根据脑血管造影，CVS可分为：(1)弥漫性：在动脉瘤临近部位血管狭窄范围可达2cm以上，其中轻度狭窄患者血管直径缩小在50%以内，严重患者血管直径缩小可超过50%；(2)周围性：责任血管在远端部分狭窄范围达2cm；(3)局灶性：单个局部狭窄；(4)多个局灶性：多个局部狭窄。蛛网膜下腔出血后发生的急性脑血管痉挛发生早，持续时间较短，约数分钟至数小时，而且具有可逆性，能起到生理性止血的作用。目前对于急性脑血管痉挛的发病机理认识基本相同，认为是由于各种因素导致的血管平滑肌收缩而引起的。颅内各种出血性原因导致血液进入蛛网膜下腔，凝固后激活血小板并释放细胞因子、炎症介质。血凝块溶解产物包括HGB、HbO2、MHB等等。这些物质进入脑脊液后通过氧自由基反应，释放强效致痉挛物质，增加非生理性的细胞内2+Ca，不仅导致脑血管平滑肌的持续性收缩，并且引起脑血管平滑肌细胞功能的紊乱和损害，引发以脑血管为中心的免疫炎症反应的发生，促进了CVS的发生和发展。SAH后发生的迟发性脑血管痉挛一般在出血后3天左右开始出现，7-8天达[19,20,21]到高峰，持续2-3周后逐渐缓解是目前临床治疗上的难题。无论是血管内22 成形术，3高治疗（提高血压、高容量、血液稀释），钙离子通道拮抗剂、动脉内滴注婴粟碱、鞘内注射尿激酶等溶栓药物等，都无法有效地治疗脑血管痉挛[22-28]，极大影响患者的治疗效果。通过DSA检查发现，SAH后大约有70％的患者出现迟发性CVS，而且约36％的患者因迟发性CVS而出现迟发性缺血性神经功能障碍（delayedischemicneurologicaldeficit）。目前虽然对于迟发性脑血管痉挛的病因和发病机理做了大量的试验、研究，但至今仍没有完全阐明，包括红细胞分解的产物、血管平滑肌细胞的功能障碍、一氧化氮的消耗及合成酶合成减少、内皮素的合成及释放增加、NO/ET平衡结构的破坏、蛋白激酶C活性增强、磷酸二酯酶-5活性增强以及表达增加、Ras蛋白的活性及表达增加：以及动脉平滑肌细胞钾离子通道活性改变、氧自由基的产生和反应、免疫炎症反应和炎症介质、降钙素基因相关肽、神经肽Y、血管壁增殖引起管腔狭窄、5-羟色胺释放增加、前列腺素合成减少等等，这些综合性因素均参与了迟发性CVS的发生，但是对于具体的发病机制一直无定论。近年来，对脑血管痉挛的病理机制认为是多种机制共同作用的结果，可综合归纳在以下3个方面：平滑肌主动性收缩导致功能改变、脑血管壁的构型改变和脑血管舒张功能的改变。一些学者认为SAH后迟发型脑血管痉挛的发生是血管[30,31,32]壁结构改变的结果，其中VSMCs增殖尤为重要。但在过去有些研究者认为蛛网膜下腔出血后导致的迟发型脑血管痉挛仅仅是脑血管持续收缩的结果，而与血管壁细胞的增殖程度无关，单纯、有限的血管壁细胞增殖不能导致血管腔的[29][9]狭窄。Borel等在小鼠SAH后观察，发现出血部位脑动脉血管平滑肌细胞和成纤维细胞增殖细胞核抗原表达明显增加；在体外培养的试验中，也发现血凝块[33]可以导致脑血管出现增殖反应。晋军等研究表明：由于不同浓度PDGF-AA刺激，可导致血管平滑肌细胞中增殖细胞核抗原表达出现明显增高。研究发现PDGF-AA可明显促进血管平滑肌细胞中转录调节因子c-myb/c-mycmRNA浓度，而且随PDGF-AA浓度的增加c-myb/c-mycmRNA表达出现增强趋势。c-myb和c-myc在细胞周期、增殖、分化和凋亡，以及肿瘤发生转移等生理病理过程中23 发挥着至关重要作用。研究发现这种途径通过三种机制来刺激VSMCs出现增殖反应：(1)通过与其羧基端与特异的DNA序列结合，达到使细胞增殖有关的基因开放；(2)结合抑制基因，从而使其抑制基因被解除，达到刺激细胞增生的作用；[34][35](3)诱导p34cd2的产生。丁圣鹏、Zhou等在一些其它的研究中，也间接发现DCV时血管壁出现了增殖性改变，且DCV的严重程度及血管壁增厚程度相一致。因此，我们认为探索、研究新的针对迟发型脑血管痉挛的预防及治疗方法对于降低蛛网膜下腔出血患者的病死率、病残率具有重大的意义。2.HSG与脑血管痉挛高血压相关基因（hypertensionrelatedgene，HRG）是1997年我国学者陈光慧等利用差异显示技术对正常WKY(WistarKyoto)大鼠和自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypersensitiverat)血管壁平滑肌细胞的基因文库进行筛查时分离发现一个新基因。此后研究发现这一基因可以通过对Ras-Raf-ERK-MAPK途径的抑制，达到有效地阻遏细胞周期及细胞增殖反应，从而表明该基因可以达到明显抑制血管、细胞的增殖、迁移和重塑。2004年Chen正式将其命名为细胞增殖[36,37,38]抑制基因(hyperplasiasuppressorgene，HSG)，并在Nature上公开发表。[39-43]Chen等研究发现rHSG的表达位置位于5号染色体，而人类该基因则位于1号染色体短臂的36.3位置。rHSG全长序列表现为4160个核苷酸，在5′端非编码区长度为452个bp、3′端非编码区长度为2460bp，可编码阅读框架是1653个bp，可以编码的氨基酸为551个。其分子量是62644，最适pH值5.5，其N端不含有信号肽序列及跨膜疏水氨基酸序列，因此它不是一个可分泌蛋白质，亦不是一种G蛋白偶联受体，所以它可能是一种新的信号传递体蛋白。这个基因广泛分布在血管平滑肌细胞和心脏、肾脏、大脑等不同组织中。研究发现在增殖性疾病的病变的血管中，rHSG的表达相当低；相反，该基因过度表达，却能显著抑制血管内膜及血管平滑肌细胞的增生。Santel等在肺组织中克隆出的线粒体融合蛋白2（mitochondrialfusion）基因的核苷酸序列与HSG的核苷酸序列完全[16]相同。而且，通过反复试验、研究表明，相对高表达rHSG可以通过上调周期24 调控蛋白p27Kip1和p21Cip1的表达量，降低增殖细胞核抗原的表达量，使细胞受阻滞于G0/G1期，表明该基因是一种新的与细胞增殖相关的信息传递分子。另有研究证实，大鼠增殖抑制基因在SHR的心脏、肾脏、大脑、肝脏等组织中呈的表达量显著降低，而且在增殖的血管平滑肌细胞中表达量也明显下降，血管紧张素II(angiotensinII)、内皮素-1(endothelin-1)、白介素-1(interl-eukin-1)等促VSMCs增殖的因素可以抑制这一基因的表达，其作用可被相应的拮抗剂所消除；ANP、CGRP、肾上腺髓质降压素等抑制血管平滑肌细胞增殖的因素却能增加这[44]一基因的表达的表达量。[45]2001年，Santel等通过试验在肺组织中也克隆出其核苷酸序列与HSG完全相同的同一基因序列，并证明这一基因可以促进线粒体的融合，所以将其命名[46,47]为线粒体融合蛋白-2。Santel等发现，线粒体融合相关蛋白中的线粒体融合蛋白2的核苷酸序列与HSG完全相同，为同一基因。而且对HSG/Mfn2研究发现大鼠Mfn2与人的Mfn2的同源性达到95%，不仅在血管平滑肌细胞中有表达,而且在心脏、大脑组织、肺组织、肾脏、肝脏组织中亦有广泛的分布，其中以大脑组织、肾脏组织和心脏组织的含量最高。HSG/Mfn2是调控线粒体融合的主要分子，在线粒体融合过程中发挥着非常重要的作用，主要表现在线粒体融合反应的后期起作用，例如促进线粒体融合，使其有利于内膜对接等。实验表明：过表达Mfn2能促进线粒体融合，同时还可抑制凋亡。线粒体的抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax和Bak是Bcl-2家族中的重要成份，在细胞凋亡的很多途径中起重要作用，而且在所有的凋亡细胞的研究中发现，Mfn2与Bax定位一致。此外，Bcl-2也与Mfn2在凋亡细胞中也有相同定位。还有研究发现，过表达的线粒体融合蛋白-2基因可以通过线粒体凋亡途径来促进大鼠血管平滑肌细胞的凋亡，而且这种促凋亡作用还具有明显的时间依赖性。同时还伴随着Bcl-2蛋白表达的下降、Bax蛋白表达的增高、胱天蛋白酶9的活化反应。这些试验结果提示Mfn2在促进大鼠血管平滑肌细胞凋亡过程中的主要分子靶点是Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶-9。通过参与了Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK细胞信号途径对细胞周期进展的25 驱动，发挥其抑制血管平滑肌细胞增殖的作用，其过度表达可显著抑制血管增生的发生。另有研究表明，HSG/Mfn2在增生性病变的血管中表达明显降低，与血管平滑肌细胞增殖具有反相关关系。HSG/Mfn2不仅在SHR的心脏组织、肾脏组织、大脑组织等的表达降低，而且在增殖的血管平滑肌细胞中的表达量也明显降低，AngII、ET-1、IL-1等促VSMC增殖的因素均能降低这一基因的表达量，其作用可被相应的拮抗剂所消除。相反心钠素及降钙素基因相关肽，以及肾上腺髓质降压素等抑制VSMC增殖的因素却能够提高这一基因的表达量。3.PCNA细胞的增殖过程是细胞生命的基本特征之一，与机体的生长、再生、创伤修复、细胞凋亡及肿瘤发生等病理生理过程密切相关。在上世纪七十年代末，[15]Miyachi等在系统性红斑狼疮患者的血清检测中发现了PCNA。血管壁增殖细胞核抗原是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，位于细胞核，其分子量为36ku，共由261个氨基酸组成，其中酸性氨基酸数目多于碱性氨基酸，因此等电点为4.8-4.9，半衰期大约20-37小时；对它的晶体结构分析表明：PCNA为包绕双链DNA形成的环形蛋白结构，同时将与它功能有关的蛋白圈束在双链DNA上，它的其内径为34A。它的作用主要是是协调DNA前导链和后随链的合成，因此是DNA复制过程中必不可少的因子。它通过参与调节DNA的合成，与细胞的增殖周期密切相关。它的数量的变化与DNA合成一致，因此PCNA的含量变化可以反映细胞的增殖状态，可以作为反应细胞增殖活性的有效标志之一。PCNA在G。期表达非常少，由G1早期开始上升，到晚期迅速增高，至S期达顶峰，是G1期表达量的2-3倍，在G2-M期出现持续下降，主要表达在细胞增殖周期的S期，除与DNA复制有关外，还与DNA修复、DNA甲基化以及染色质重组有关。它的表达程度反映了细胞增殖活性的高低。检测PCNA对于防治血管增殖性疾病具[48]有重要意义。Zubkov等在试验中最早报道了临床上因脑血管痉挛而死亡者尸体基底动脉内膜中存在凋亡细胞的事实，随后又在狗二次注血的蛛网膜下腔出血模型中检测基底动脉发现血管内皮细胞存在凋亡反应。在其后的另一项研究中26 [49-52]发现，血管内皮细胞的损害必然导致其功能障碍，伴随着蛛网膜下腔出血后的炎性反应过程、血管壁细胞增殖过程与凋亡反应共同导致的血管壁出现的器质[53-54]性损害可能是CVS发生的关键病理途径。随后的研究进一步证实脑血管内皮细胞凋亡被阻止后，脑血管痉挛得到明显缓解，表明VSMCs的凋亡与CVS[55,56]的发生关系密切。近年来，Cahill等在大鼠蛛网膜下腔出血的模型中亦证实平滑肌增殖的是其中的关键因素，其抑制剂有可能缓解，甚至阻止CVS的发生。4.基因与腺病毒载体腺病毒载体(adenovirusvector)是基因治疗研究中重要的载体，具有病毒滴度高、宿主细胞范围广、转染效率高和无插入突变危险等特点。随着分子生物学领域的迅猛发展，特别是重组DNA技术的建立，使得导入各种目的基因成为可能，已经成为基因治疗研究中应用最多的载体之一。目前，用于医学研究的荧光蛋白主要有绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein）和红色荧光蛋白（redfluorescentprotein）两种。依据腺病毒载体发展的先后此序，可将载体分为3代。包括：第一代为E1和或E3区缺失的腺病毒；第二代为进一步缺失E2或E4区的基因腺病毒载体，可使病毒复制能力更低，但是提高了载体的安全性；第三代是去掉了所有编码序列的腺病毒，只含有与复制相关的某些顺式作用的元件，如ITR和包装信号。当前越来越多的研究者通过构建介导目的基因的腺病毒载体达到治疗疾病，完成基因转移的目的。其中，由于重组腺病毒载体因其基因组大小合适、转导高效、安全可靠，还能刺激机体产生强烈的体液、细胞免疫反应等特点，而被普遍的应用于研究工作中。我们为rHSG目的基因选择了pAidxs复制缺陷型腺病毒载体系统，该载体能高效把增殖抑制基因导入细胞，保证该基因准确的表达。该表达载体人为去除病毒El区基因，在复制时使病毒完全丧失了复制功能，达到形成完整的腺病毒颗粒，对真核细胞只具有感染的功能，而不能在细胞内复制增殖。在腺病毒生活周期中使转染组织局部的蛋白表达浓度大大增高，而且毒性低，不会因为介导的外源基因和宿主染色体发生整合导致宿主的基因突变。27 在前期试验中我们构建的HSG的腺病毒载体(Adv-rHSG-GFP)，及空载体病毒(Adv-GFP)（作为对照研究HSG对蛛网膜下腔出血后BA的影响），由于携带的表达绿色荧光蛋白的GFP基因，可以通过荧光显微镜观察不同时间细胞绿色荧光蛋白表达，判断有无包装成功。我们插入目的基因的是带全开放读码框的rHSG部分片段，全长2309bp，为保证插入片段的准确性，在克隆入pShuttle-CMV穿梭质粒后进行了测序鉴定，结果全开放读码框无误。而且经XhoI酶切pAdxsi-rHSG重组载体，阳性克隆被XhoI酶切后可见2.66kb为含目的基因的片段。PCR扩增及酶切证实了目的基因正确插入到骨架质粒；重组腺病毒PCR扩增出rHSG的基因片段经测序与GENEBANK报道序列一致，证明插入的rHSG开放读码框完全正确。此次试验，我们的结果显示通过腺病毒介导的外源性基因Adv-rHSG-GFP转染大鼠蛛网膜下腔出血后的基底动脉VSMCs，可显著抑制BA平滑肌增值，缓解了平滑肌痉挛。另外，腺病毒介导的外源基因表达是暂时性的，维持数天一数周，（迟发性脑血管痉挛通常发生在出血后的3-14天）和脑血管痉挛的时程基本吻合的，采用基因治疗有足够的时间窗；由此可得出rHSG/Mfn2腺病毒基因转染可能会是血管增殖失调过程的高效的治疗性干扰措施。希望在不久的将来随着腺病毒应用技术的逐步成熟，应用人工合成的血管生成抑制因子调节过低的HSG活性或通过转染介导HSG做基因治疗，将成为治疗DCV的重要手段，rHSG/Mfn2腺病毒基因转染能够在人类SAH后迟发性脑血管痉挛的预防和治疗中发挥作用。28 结论（1）rHSG的过度表达可以减轻SAH后血管壁的增殖和缓解DCV。（2）建立大鼠SAH后DCV模型，重组复制缺陷型腺病毒载体介导外源性rHSG转移至基底动脉，观察rHSG的过表达是否可以减轻SAH后血管壁的增殖和缓解DCV，国内外没有文献报道。29 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文献综述综述一：大鼠蛛网膜下腔出血模型制作蛛网膜下腔出血(SAH)是神经系统致死、致残率相当高的一种出血性脑血管疾病。继发性脑血管痉挛(CVS)是其主要危害之一，但至今对CVS的发生机制仍无一种令人信服的解释其中一个重要原因是无法进行人体实验，因此活体动物实验[1-4][5]成为研究的焦点。一个良好的SAH后DCV动物模型需具备以下条件：必须将血凝块置于脑底血管周围；而且能诱发持续几天的DCV；DCV出现和消失的时间与临床相似；脑血管造影可检测到DCV；模型制成后动物可耐受治疗方法和毒性试验观察；制作方法简单、可重复和价格低廉等。本文就SAH活体动物模型的制作谈几点体会。1大鼠SAH后CVS模型选择一个理想的SAH动物模型应当能模拟人SAH后出现的脑动脉剧烈收缩，并[6]具有两方面特性：一是收缩血管发生形态学改变，二是血管收缩的过程具有阶段性。[7]㈠大鼠大鼠种系曾被认为是非理想SAH模型，其原因在于：㈠在解剖结构上，大鼠脑动脉与人类有明显差异，其脑血管壁缺乏外膜，因此大鼠脑血管更能抵抗SAH后的动脉收缩。㈡大鼠脑血管的侧支循环比人类丰富，在大鼠模型中很难获得SAH后脑局部缺血的结果。㈢因为体形小，血管纤细，因此在大鼠模型上实施血管造影很困难。但随着技术的进步，大鼠模型又成为研究SAH常用的动物模型，这是因为:㈠大鼠SAH模型表现出CVS两个阶段的化，与人类相似。㈡大鼠模型能显示与人类相似的脑动脉血管病理变化。㈢能更好地研究SAH后CVS相关分子水平的变化，因为大部分被证明的相关基因均来自大鼠。㈣与其他动物比较，大鼠价格便宜，更容易饲养。[8]㈡狗虽然是最早报道的SAH动物模型。但有研究证明狗并不适合SAH后脑36 血管的研究，因其基底动脉对去甲肾上腺素和血红蛋白的反映与人明显不同，去甲肾上腺素能使人基底动脉收缩，而对狗却无收缩作用;血红蛋白能使狗的基底[9]动脉收缩，但对人却无作用。猴灵长类动物的病理生理过程和解剖结构均与人类十分相似，因此猴SAH模型被认为是最理想的SAH动物模型，主要用于SAH后持续性CVS的治疗研究。但是由于动物保护主义的呼声及昂贵的代价使其不[10]能广泛应用于临床。兔脑内丰富的侧支血管代偿作用致使兔SAH后很少出现类似于临床的神经缺损症状。但是目前应用改良模型作为比较理想的症状性CVS模型的研究，尤其适用于研究CVS导致的脑梗死。2大鼠SAH后CVS模型建立方法[11-13]SAH动物模型的建立常采用以下三种方法：㈠刺破动脉，使血液聚集于周围。㈡外科暴露动脉，抽取自体其他部位动脉血注于周围。㈢抽取其他部位动脉血注入蛛网膜下腔，并积聚于动脉周围。各种方法均有优缺点，其共同特点是出现痉挛的实验动脉周围均有持续性的血凝块存在。在所有已报道的SAH活体动物模型中，应用较多的是脑池注血法及动脉周围置血法，血管刺破法因出血不[14]容易控制，病死率高，报道相对较少;“两次注血法”被认为是最理想的方法。本实验模型就是采用SD大鼠枕大池二次注血法作为SAH后CVS的研究模型。3大鼠SAH后CVS模型制作体会⑴实验者要改变心态SD大鼠是我们的实验对象不同于普通大鼠，它为了我们的试验以及人类的医学发展作出了大量的贡献甚至生命的代价，我们因该对SD大鼠有爱心尽量减少大鼠实验中的痛苦，妥善处理大鼠的尸体及实验标本。⑵饲养过程中为了最大限度使实验结果接近临床，我们因该首先保证大鼠有充足的食物和水源，少供勤换，而且饲料的质量要有一定的要求否则大鼠生长缓慢而且身体条件差实验结果偏差大。其次实验室温度要有一定要求最好保持在22-27℃左右。夏季多洒水开窗，冬春季采用暖气和电热扇保温以减少试验中大鼠的死亡率。再次要保持大鼠生长环境干净舒适勤换底料及打扫卫生保持干燥环境，定期通风，被尿液浸湿的肢体及时用温肥皂水清洗，并擦干。避免制造过多37 噪音使大鼠受到惊吓.恐惧。⑶捕捉大鼠过程中要迅速轻柔避免大鼠激怒大鼠造成大鼠烦躁.惊叫增加死亡率及影响实验结果。麻药注射尽量做到量化——根据大鼠体重单个计算或对大鼠体重估算误差尽量减小。第一次麻醉一定要深一些，由于手术的刺激，大鼠一旦发生抖动，模型的制作就会失败，甚至造成动物死亡。二次注血时由于大鼠身体状态较差麻药应选小量避免死亡。15]⑷手术操作过程参照Konczalla方法[，在显微镜下沿头颈部交界处作一长约3~4mm的纵切口，暴露环枕筋膜，要求首先要加强无菌、轻柔操作减少副损伤提高成功率。股动脉抽血后压迫点要准确，时间要充足10-20秒，术者实验过程中几例术中死亡大鼠与大出血有关。术中注血0.2ml以下大鼠脑血管痉挛率低，[16]0.3-0.5ml死亡率高，最好在0.2-0.3之间。注血过程要控制在2分钟左右，偏长血易凝固，太短大鼠死亡率高与国内外文献报道一致。注血时尽量要求手法要稳避免间断性快注快停，如遇针头阻塞及时将针柄适度震荡数次均能再通。术后最好腹腔注射5-10毫升生理盐水及青霉素钠补充水分及抗炎。保持大鼠头低为30分钟促进血液聚集在基底动脉周围促进痉挛。模型制作成功后，尽量不要搬动大鼠，减轻震动，使大鼠俯卧。⑸术后部分大鼠清醒后可以正常饮食但是出现倦怠.嗜睡.易惊毛发稀松，应将饲料饮水置于动物可及范围。部分条件差着需要人工饲养新鲜牛奶提高抵抗力预防应激性溃疡。实验大鼠应激性溃疡死亡率国内外文献均有报道。由于模型建立后个别大鼠不同程度的瘫痪，每天要给大鼠做肢体按摩，增加大鼠肢体的血液循环，还要定期给瘫痪严重的翻身，以免造成褥疮感染。在术后7d内，大鼠的生理机能受到严重影响，如不加强护理，密切观察，大鼠会出现营养不良、褥疮等，严重者心肺衰竭，甚至死亡。术后严格保暖，给大鼠安静、适宜的环境，尽量不要搬动也是提高生存率的必要措施。⑹基底动脉的取材胸部备皮，自剑突下沿胸骨两侧旁向上U型打开胸腔及心包，暴露心脏及主动脉根部并分离，在左心室剪一小孔，将连接盐水的套管从左38 心室插入升主动脉，在右心耳剪开一小孔放血，灌入生理盐水300~400mL，灌注时速度要快，生理盐水最好在20min内灌完，冲洗至肝脏变白，4%中性多聚[17-18]甲醛PBS400mL灌流，灌注时出现大鼠全身四肢抽搐效果最好；灌注高度需在120cm直到动物四肢抽搐，变硬，然后开颅取脑，取包含脑干的基底动脉上1/2段作标本，置于4%中性多聚甲醛中24h固定，取材时切记保持管壁断面和血管壁垂直，石蜡包埋切片HE染色。综上所述，虽然脑血管痉挛的模型制作日益成熟，各种SAH动物模型对SAH后CVS的机制及治疗研究提供了极大帮助，但现有的模型与临床的发病尚有很[19]大差距，尚无一种动物模型能完全等同于人SAH的动物活体模型要求。SAH仍是神经科医生面临的难题。因此，不断寻找和建立一种趋于完美的SAH动物模型，对深入研究SAH病理生理学和CVS机制及其治疗研究具有重要意义。39 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综述二：脑血管痉挛发生机制研究进展脑血管痉挛(eerebralvasCvs)是蛛网膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage，SAH)后最常见的并发症之一，可造成脑缺血性损害甚至脑梗死，尤其是迟发性脑血管痉挛是导致迟发性脑缺血性损坏、脑梗死，甚至造成病人死亡或重残的主要原因[1][2]。它的高致死率(15%一20%)、致残率(约50%)严重威胁到人类的健康。[3]Mayberg将CVS定义为SAH后脑底大动脉延迟出现的狭窄，常常伴有受累血管远端分布区灌注减少。下面简要综述近年来有关CVS治疗的研究进展。一、脑血管痉挛的病因CVS不仅见于动脉瘤性SAH患者，也见于任可能引起SAH的疾病中，如脑动静脉畸形(AVM)、肿瘤出血、高血压性出血、急性脑外伤和手术后等引起的SAH。此外，脑部炎症、颅内压(ICP)增高其他不明原因也可伴有CVS。二、脑血管痉挛的分类（一）CVS按发生时间分为两种：一是发生在蛛网膜下腔出血后0.15-lh，发生迅速，可以起到生理止血的作用，称为暂时性CVS，也叫急性CVS，蛛网膜下腔中的血液对脑血管的机械性刺激作用所致;二是迟发性脑血管痉挛(delayedcerebralvasospasm，DCV)，在蛛网膜下腔出血后4-15d发生，7-8d为高峰期，2周后逐渐缓解，也是临床上最常见的CVS。一旦发生，对血管扩张剂的反应较差，往往难以逆转，可导致进一步的缺血性脑损害，对患者的预后影响较大，是[4,5]目前研究的重点。（二）根据脑血管造影，CVS可分为：(1)弥漫性:在动脉瘤近端和远端部分血管狭窄范围达2cm以上，其中轻微者直径缩小25%～50%，严重者直径缩小超过50%；(2)周围性:在远端部分血管狭窄范围达2cm；(3)局灶性:单个局部狭窄；(4)多个局灶性:多个局部狭窄。（三）根据TCD检查的MCAVm，CVS可分为轻度(>120cm/s)、中度(140~200cm/s)和重度(>200cm/s)。42 （四）Khanna等根据CT和脑血管造影结果将CVS分为0~Ⅲ级:(1)0级:CT未发现SAH，血管造影Willis动脉侧支功能良好;(2)Ⅰ级:CT显示SAH积血≤3mm，血管造影显示前交通动脉(ACoA)或后交通动脉(PCoA)狭窄，侧支循环差，A1或P1有早期痉挛;(3)Ⅱ级:SAH积血≥3mm，脑血管造影ACoA或PCoA不显影，A1或P1存在痉挛;(4)Ⅲ级:CT示SAH积血很厚，脑血管造影Willis动脉环无侧支循环。这一分级方法可较为准确地估计有症状CVS的发生率，预测价值高于Fisher分型。三、脑血管痉挛的病理学研究（一）CVS的病理形态表现为：生在主干动脉和蛛网膜下腔积血较厚的区域，可表现为局限性、节段性或弥漫性痉挛。多数由载瘤动脉的近端向远端扩展，痉挛程度也以近端最为严重，离动脉瘤较远的部分痉挛较轻或不发生痉挛。这种血管管径的微小变化即可产生严重的不良后果。如局部血流量低于维持膜完整性的临界水平，则会导致脑梗死。另外，CVS也可通过继发性血管扩张引起脑血容量增加和脑肿胀。在CVS和ICP增高的共同作用下，进一步促进脑血管自动调节功能的损伤和脑缺血的出现。（二）CVS的诱发因素包括：(1)蛛网膜下腔凝血块;(2)血块溶解和致痉红细胞释放;(3)强效致痉物质；(4)免疫炎性反应。（三）SAH后CVS的病理机制：以往研究认为SAH后血凝块的一些分解产物，如氧合血红蛋白(HbO2)、内皮素(ET)、凝血酶(而ombi)等能引起脑血管收缩，但并不能完全解释CVS的致病机制。近来年研究发现，血管壁本身的器质性病理[6-8]增殖损害是DCVS的主要原因。SAH后痉挛动脉壁的病理性增殖的发生机制可能包括①血管平滑肌细胞[9](vascularsmoothmuseleeellsVSMCs)表型改变。②血管平滑肌细胞增殖活性的改变，③氧合血红蛋白(oxyhemoglobin，oxyHb)的致痉作用。蛋白激酶是介导细胞[10,11]增殖的最主要信号转导通路，在血管平滑肌细胞的增殖中起到重要作用。增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuelearantigen,pCNA)是一种细胞周期所必43 [12-14]需的物质，目前公认为是评价细胞增殖活性的一个重要指标。四、脑血管痉挛的临床诊断标准目前，较一致的CVS诊断标准为：(1)在SAH后5~12d发生，患者出现意识水平下降、局灶性神经功能缺损、ICP增高、脑膜刺激征、血压升高、头痛、发热和低钠血症等，提示可能有CVS；(2)排除再出血、颅内血肿、脑积水和电解质紊乱等原因；(3)TCD检查显示MCA平均流速(Vm)>120cm/s、大脑后动脉Vm>90cm/s，椎基底动脉系统Vm>60cm/s可诊断为CVS；(4)脑血管造影显示CVS。（五）脑血管痉挛的预防和治疗1、在SAH后尽早预防CVS；最佳方法是防止动脉瘤形成和在动脉瘤破裂前手术夹闭动脉瘤。[15](1)吸烟史、吸毒和网膜下腔出血均为症状性血管痉挛的独立危险因素。若吸烟者同时患有高血压，更易发生动脉瘤性蛛网膜下腔出血。更有迹象表明，仅有吸烟史就能增加SAH后症状性血管痉挛的危险性。吸烟可影响颅内血管内皮细胞功能而致脑血管痉挛，其机制类似于动脉粥样硬化性血管痉挛。戒烟可显著降低动脉瘤性蛛网膜下腔出血的危险性，并可预防继发性脑血管痉挛。可卡因可引起急性高血压，可能对脑动脉瘤的自然史有不良作用。(2)筛选危险个体：对于虽然无出血表现，但患者出现单侧动眼神经麻痹等症状时应考虑到是动脉瘤渗漏的预警，并给予积极治疗。(3)对于体检发现的无症状动脉瘤、有神经症状或体征的未破裂动脉瘤或是伴其他破裂动脉瘤的未破裂动脉瘤，因进行风险评价，积极夹闭并进行治疗。2、发生CVS后纠正动脉狭窄：(1)化学药物治疗：由于脑血管痉挛病因的多因素性，学者们针对可能导致血管痉挛各种因素，对包括（钙通道阻滞药、免疫抑制剂和抗炎药、氧自由基清除剂）等各种药物进行了广泛的实验和临床研究，但直至目前尚无一种药物可有效地解除血管痉挛。44 (2)3H治疗即：高血压（Hypertension）、高血容量（Hemodilution）和血液稀释（Hemodilution）疗法，是改善SAH后脑血管痉挛引起的脑供血不足和防治DIND有效的方法。具体方法为(1)扩容：可用液体、白蛋白和血浆；(2)血液稀释：与扩容相同的溶液输入为扩容稀释；(3)升压：可用多巴胺或多巴酚丁胺使收缩压较治疗前升高20~40mmHg，或维持在150~160mmHg，可使有症状CVS显著减轻。适应证为动脉瘤已早期手术夹闭;禁忌证为脑梗死、ICP增高和严重贫血。主要的副作用是容易引起肺水肿、充血性心力衰竭、颅内压升高和脑水肿加重。(3)开颅手术治疗：“没有SAH，就没有CVS”。蛛网膜下腔积血是导致CVS发生的根本原因，因此早期处理动脉瘤，清除蛛网膜下腔凝血块是防止CVS的重要措施。早期手术(72h内)能有效防止SAH后再出血和CVS等并发症，改善预后。虽然早期手术风险较晚期手术大，但由于SAH后早期的再出血发生率较高，部分患者可能会因再出血而死亡，因此目前多主张早期手术。(4)脑脊液引流：其机制包括：(1)清除蛛网膜下腔的血性脑脊液以及其他有害物质；(2)降低ICP以减少因ICP增高造成的脑循环不足的加重；(3)改善脑脊液循环，预防脑积水形成。(5)基因治疗：基因治疗是指向体细胞内导入一种新的基因物质，或应用反义寡核苷酸抑制某些基因的表达。目前是分子生物学时代，CVS的基因治疗也成为热点。已出现大量研究采用基因工程方法预防和治疗SAH后CVS。目前于基因表达和调控的研究主要限于动物实验，所以，从基因水平上研究SAH后CVS发生机制并寻找治疗手段，这将充满希望和挑战。[16,17](6)血管内治疗：主要包括动脉内应用婴粟碱和血管内气囊成形术。多数情况下可以超选择性的应用婴粟碱或联合应用血管内气囊成形术，也可用持续小量动脉内注入或重复注射婴粟碱。适应症为严重的经治疗后没有效果的血管痉挛，但是接受该治疗的患者状态一般都比较差，因此对疗效仍有争议。综上所述，CVS是多因素和多环节所致，虽然对于CVS的研究已取得重大进展，然而由于其发病机制复杂，治疗仍处于基础研究和初期临床阶段，故有待45 进一步研究。46 综述二参考文献[1]SuarezJI,TarrRW,SelmanWR.Aneurysmalsubarachnoidhemorrhage[J].NEnglJMed,2006,354(4):387-396.[2]QureshiAI,SuriMF,NasarA,etal.TrendsinhospitalizationandmortalityforsubarachnoidhemorrhageandunrupturedaneurysmsintheUnitedStates[J].Neurosurgery,2005,57(1):1-8.[3]MaybergMR.Cerebralvasospasm[J].NeurosurgClinNAm,2004,9(3):615-627.[4]王真,张建民.颅内血栓性动脉瘤[M].国外医学(脑血管疾病分册),2005(5):382-385.[5]沈建康.脑血管痉挛的机制和防治[J].国际脑血管病杂志,2006(7):481-493.[6]MiwaK,FujitaM,SasayamaS.Recentinsightsintothemechanisms,predisposingfactors,andracialdifferencesofcoronaryvasospasm[J].HeartVessels,2005.20(1):1-7.[7]LandsbergJW,YuanJX.CalciumandTRPchannelsinpulmonaryvascularsmoothmusclecellproliferation[N].n.NewsPhysiolSci,2004,19:44-50.[8]VatterH,WeidauerS,KonczallaJ,etal,Timecourseinthedevelopmentofcerebralvasospasmafterexperimentalsubarachnoidhemorrhage:clinicalandneuroradiologicalassessmentoftheratdoublehemorrhagemodel[J].Neurosurgery,2006.58(6):1190-1197.[9]MiwaK,FujitaM,SasayamaS.Recentinsightsintothemechanisms,predisposingfactors,andracialdifferencesofcoronaryvasospasm[J].HeartVessels,2005.20(1):1-7.[10]ZubkovAY,RollinsKS,ParentAD,etal.,Mechanismofendothelin-1-inducedcontractioninrabbitbasilarartery.Stroke,2006.31(2):526-533.47 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致谢三年紧张的学习生活即将结束，回首学习、研究之路，不禁感慨万千，值此论文完成之际，谨对所有给予我关心、指导、帮助和支持的领导、老师、同学、朋友及家人表示最诚挚的谢意。衷心感谢我的导师沈冰教授三年来在专业理论、实验技能、科研方法等诸多方面的谆谆教诲。在论文选题、实施、撰写及修改的全过程中自始至终都凝聚着导师的心血。导师严谨的治学态度、渊博的专业知识、忘我的工作精神时刻激励着我，必将使我受益终身。感谢宁夏医学院中心实验室的赵巍教授及王亚娜老师；感谢实验动物中心高级实验师杨卫东、刘伟忠及助理实验师徐秀琴、马丽琴老师；感谢病理教研室徐永辉、郭雅琪老师。感谢他们在实验中给予的指导和帮助。感谢研究生部在教学和生活中给予的帮助。感谢罗卫、张斌、乔伟军硕士以及赵伟、孙伯坚、李颜辉、徐进、孟磊等同学对我的帮助。最后，感谢我的父母以及和我同舟共济的妻子对我求学的理解和支持，因为他们，让我的努力变得更有价值。49 攻读学位期间发表的学术论文1.王保江，罗卫,郭辉，沈冰.rHSG基因转染对蛛网膜下腔自体血注入模型大鼠基底动脉形态学的影响[J].宁夏医科大学学报，2012,(7)已录用.2.王保江，罗卫,沈冰.腺病毒介导的rHSG对大鼠迟发性脑血管痉挛作用的实验研究[J].待发表.50 个人简历一般情况：姓名王保江性别男年龄34岁民族汉族籍贯陕西宝鸡学习、进修与工作经历：1993.9-1997.7宝鸡市卫生学校就读临床医学1997.10-2005.1宝鸡市眉县人民医院参加临床工作2002-2004.7函授西安交通大学医学院临床系专科2005.1-2007.7脱产学习延安大学临床医学本科2009.9-2012.7宁夏医科大学研究生院51
