小鹅瘟病毒WH-12株的分离鉴定及其双抗夹心ELISA检测方法的建立

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硕士学位论文小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立邮长超指导教师茅翔教授张训海教授专业学位—兽医硕士研究领域预防兽医学研究方向动物传染病诊断与免疫答辩日期二〇一三年六月 SEPARATIONANDIDENTIFICATIONGOOSEPARVOVIRUSWH-11STRAINANDDEVELOPMENTOFSANDWICHELISAFORGOOSEPARVOVIRUSByHuanchangchaoSupervisor： 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：纷年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口,在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密钇。请在以上方框内打“”)学位论文作者(需亲笔)签名：如夂爽年〖月曰导师(需亲笔)签名：糾年月日 目录目录■缩略语及符号第一章小鹅瘟病毒生物学特性及其诊断方法旳研究进展小鹅瘟病毒的发现小鹅瘟病毒的特性小鹅瘟病毒的分类地位形态特征理化特性培养特性小鹅瘟病毒的分子生物学特性基因组结构特点基因组的转录和调节小鹅瘟病毒主要蛋白非结构蛋白结构蛋白、赃流行病学小鹅瘟的临床症状和病理变化小鹅瘟病毒的诊断方法病毒分离和鉴定血清学诊断分子生物学诊断小鹅瘟的防治研究目的及意义第二章小鹅瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定簡鼎描病料的采集及处理病料的鉴定病毒的増殖及传代病毒的分离鉴定动物回归试验各片段的扩增与测序全基因序列的拼接和分析 小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建病料的鉴定鹅胚的观察血凝试验(琼脂扩散试验(方法动物回归试验各片段的扩増克隆的鉴定基因序列的拼接全基因序列同源性的比较遗传进化分析各基因核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性比较第三章小鹅瘟病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立排斗術斗方法基因引物的设计与扩増重组表达载体—的构建蛋白的表达及鉴定蛋白浓度的测定抗多克隆抗体的制备及鉴定双抗夹心方法反应条件的建立基因扩増及鉴定蛋白的表达蛋白的纯化蛋白的鉴定蛋白的浓度抗多克隆抗体的纯化及鉴定双抗夹心方法反应条件的建立致雜二 ABSTRACT小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立摘要小鹅瘟(也被称为病,是由小鹅瘟病毒(学名为鹅细小病毒,,引起的一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的高度接触性传染病。该病传播速度快,死亡率和发病率均高达,随着雏鵝日龄的增长,发病率和死亡率都有所下降,其主要特征是小肠粘膜表层大片坏死脱落与渗出物凝成假膜栓子物堵塞于小肠,最大发病日龄为日龄,其后常成隐性感染。本病一年四季均可发生流行,具有一定的季节性和周期性。目前,该病已成为危害养鹤业和养番鸭业中最主要传染病之一,给养殖业造成重大损失。本研究对疑似小鹅瘟临床病例进行了病原的分离鉴定,半富了小鹅瘟的流行病学及病原学资料,为临床诊断提供依据。在病原分离鉴定的基拙上,扩增了该分离株的全基因序列,进行了序列分析,为小鹅瘟病毒分子流行病学的的研究提供依据。此外,本研究通过构建重组质粒,表达结构蛋白,建立了小鹅瘟病毒双抗夹心检测方法,旨在为基层防疫单位及流行病学调查提供了技术手段。主要研究内容：对来自安徽省五河县某养殖场所送检的病死和濒死小鵝进行的实验室检测,通过流行病学、临诊观察和剖检病变的检查,初步疑为小鶴疸；同时,对病例的肝、脾、心、脑、肾等组织进行细菌学初检和病原学(细菌学和病毒学)的分离与病料的保存,并采用血凝试验、琼扩试验、方法、动物回归试验等方法对该病原分离物进行鉴定,确诊为小鹅瘟病毒,命名为株。根据中已公开发表的株小鹅瘟病毒基因组序列,通过软件进行序列对比,以同源性最高的序列分别设计并合成可覆盖其全序列的对引物,分别进行扩增、凝胶电泳鉴定和克隆与测序,用软件将各片段的测序结果进行拼接,得到的全基因组序列,在上进行比对和软件作同源性分析,结果表明株与株在同一分支中,其推导的核苷酸序列同源性也最高,达而与株的同源性最低,为。此外,根据设计并合成可完全覆盖结构蛋白基因的引物,扩增的基因片段,构建了重组质粒并进行表达,表达产物经纯化和抗标签的抗体 小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立进行鉴定,用该蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,经纯化与生物活性的鉴定后进行双抗夹心的小鹅癌抗原检测方法的建立,并从包被液、醉标二抗、封闭时间、显色时间、敏感性等方面进行优化,最后对其特异性、敏感性和检测符合性进行比较。结果显示,所建立的抗原双抗夹心检测方法最佳方案为：包被液为超纯水、酶标二抗浓度为、封闭液为的明胶,封闭时间为、显色时间为,该方法不与鵝流感等发生交叉反应,敏感性较好,与检测方法的符合率为。关键词：小鹤瘟病毒(蛋白；多克隆抗体；双抗夹心 ABSTRACTSEPARATIONANDIDENTIFICATIONOFGOOSEPARVOVIRUSWH-12STRAINANDDEVELOPMENTOFSANDWICHELISAFORGOOSEPARVOVIRUSABSTRACTGoslingplague(GP)orDerzsy'sdiseaseiscausedbygoslingplaguevirus(gooseparvovirus).GPisahighlycontagiousdiseaseingoslingandmuscovyducklings.Thediseasespreadsfast.Themorbidityandmortalityare90-100%.Withthegrowingofgoslings,themorbidityandmortalitydeclines.Theday-oldofmaximumincidenceis60days,butthesymptomsaremildandthecourseislongandthemortalityislow.Thediseaseoccursthewholeyear.BecauseofthedifferentofraisingpatterninsouthernandnorthernChina, 小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的沾立： 缩略语及符号缩略语及符号简写英文全称中文全称小鹅瘟病毒酶联免疫吸附试验氨苄青霉素乙二胺四乙酸辣根过氧化物酶异丙基硫代半胱糖苷千道尔顿培养基脱氧核糖核苷三磷酸纳米吸光度聚丙烯酰胺凝胶电泳聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠,,三甲氧基苯甲醛吐温二氨基联苯胺摩尔升牛血清白蛋白三(羟)甲基氨基甲烷接血凝试验幵放阅读框十二烷基磺酸钠每分钟转数酸碱度 第一章小鹅癌病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展第一章小鹅瘟病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展小鹅瘟(是由小鶴瘟病毒(弓起的日鈴的雏鹅急性或亚急性、接触性传染病,患病雏鹤出现精神委顿、食欲废绝、严重下痢和渗出性肠炎等临诊特征气该病传播速度快,发病率和病死率较高,并具有一定的周期性。小鹅瘟在我国的一些省、市、自治区均有不同程度的流行,给养鹅业造成严重危害与重大经济损失,是危害我国养鹅业的主要疫病之一。该病也能感染雏番鸭,但不能感染其他品种的鸭小鶴痕以上病理特征与年程安春等报道的雏鹅新型病毒性肠炎(极为相似,都表现为严重的广泛性卡他性肠炎或肠栓塞,临诊上难以区分,同时,小鶴瘟一旦与鹤副黏病毒病、鸭瘟、禽流感等混合感染,病鶴几乎不表现出该特征性的病理特征,彼此也难以区分。因而在临诊上应须结合实验室的检测方可予以鉴别。小鹤癌病毒的发现与命名小鹅癌最早由我国学者方定一教授于年首先报道并于年分离得到该病原认为其是鶴的一种急性病毒性传染病,并将该病命名为小鹅痕。此后东欧、西欧及亚洲许多养鹅国家和地区陆续报道该病的存在”。年,国际禽病学会为纪念匈牙利学者的先期工作而曾将此病毒命名为病。该病在世界各个地方都有不同程度的流行,并给养殖业带来巨大的损失。国际上现称之为鹅细小病毒感染,我国将该疫病归为二级动物疫病,但仍习惯于小鹅瘟的称谓。小鹤癌病毒的特性小鹤瘟病毒的分类地位国际病毒分类委员会(将细小病毒科(分为两个亚科,即感染脊椎动物的细小病毒亚科(和感染节肢动物的浓核病毒亚科 小鹤癌病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立年之前,许多学者根据小搬瘟病毒的理化特性、培养特性、形态学和基因复制特性将其划分为细小病毒属,但也有许多学者将其分类为依赖病毒属。随着研究的深入的,年将和分类为细小病毒亚科依赖病毒属。但研究又显示了具有细小病毒的自主复制能力,即在基因表达方式上,拥有自主病毒和依赖病毒两种病毒的特征,与自主病毒的表达方式相似度更高一些,有学者推测是细小病毒进化的变异体,某个中间体或前体】。形态特征小鶴瘟病毒学名为鹅细小病毒(,属于细小病毒科、细小病毒属(的成员,有个壳粒,衣壳很有规律的排列。病毒外观呈圆形或六角形,无囊膜,二十面体对称,直径约空心内直径为,外壳厚,对角直径为。该病毒是目前已知动物病毒中结构较简单、较小的病毒之一。在电镜下可观察到完整的病毒空壳和病毒粒子,且呈晶格排列。理化特性结构紧密,对外界环境的抵抗力强,且耐热,°加热,°加热其毒力没有明显变化；能抵抗乙醚、氯仿、胰酶、苯酷、脱氧胆酸钠盐、福尔马林、的环境；对紫外线敏感《。可用于灭活该病毒最有效的消毒剂有氨水、福尔马林、—丙内醋和氧化剂等我国分离株以°加热仍能使鶴胚致死,但死亡时间较不处理的延长,下孵育,°下解育,对感染滴度无影响。小鹅痕病毒与细小病毒属的其他成员显著不同是不能凝集哺乳动物和禽类的红细胞,但可凝集黄牛精子并可用抗血清做凝集抑制试验研究表明,世界范围内所有分离毒株经细胞中和试验、琼脂扩散试验、鹅胚中和试验、免疫交叉试验、间接试验等均表明具有相近或相同的抗原性,与其他细小病毒成员无抗原相关性。有研究者发现在一些人的血清中有抗体这可能与人的肝炎有关⑻。小鹤瘟病毒核苷酸基因序列全长约为单链、线性,具有感染性的病毒粒子为,缺少的病毒粒子为。完整病毒粒子和不含的空衣壳病毒粒子在氯化铯溶液中的悬浮密度分别为和沉降系数为含有正链和负链的病毒粒子的数目基本相等,各占迄今为止,国内外分离到的毒株抗原性几乎相同,均为同一血清型。与本属其他病毒区别很大,但与依赖病毒属的腺联病毒(,和 第一章小鶴瘟病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展感染人的红病毒属成员关系密切。培养特性是一个自我复制的细小病毒。但的增殖也需细胞处在有丝分裂期,并且有研究发现腺伴随病毒型(可增强在鹤胚内的复制「。的复制主要发生在细胞核中,可形成较大的包涵体,在细胞中的隐蔽期大约是,病毒形成时,形成细胞核内抗原并形成病毒粒子细小病毒拥有较宽的宿主范围,但针对特定病毒来说都有宿主特异性多数病毒的细胞感染范围较窄,只能在自然易感的宿主细胞内增殖小鹅癌病毒在进行初代分离时,只能用播胚、番鸭胚或它们的原代细胞培养物增殖,而不能在其它禽胚或细胞培养物中增殖。将经处理的病料接种日龄无母源抗体的鹅胚或番鸭胚,天后胚体出血、充血死亡,且发育迟滞,肝脏土黄色,在鹅胚或番鸭胚中连续传十代以上,使胚体致死的时间将缩短到天左右,并且病毒的毒力明显降低。经鹤胚连续传三十代以后,毒力显著降低,接种雏鹅常不能使其发病。能在于鹅胚或番鸭胚成纤维细胞上增殖,将病毒接种在其未长满单层的原代细胞中培养—天后,细胞出现折光性增强、变小、变圆、直至脱落等病变。取这种细胞培养物经伊红一苏木素染色后,可见型核内包涵体和合胞体。对体外细胞培养物的专一性很强,除鹅胚和番鸭胚适应毒株能在鹅胚或番鸭胚成纤维细胞中复制外,在小鼠胚胎成纤维细胞、兔肾上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、猪的肾上皮和睾丸细胞以及细胞上,均未见有增殖的报道“。的复制不需要其他辅助病毒来参与,但与细小病毒属其他成员一样,其增殖需要处在丝分裂过程中的细胞提供某些机能的辅助,并且在处于有丝分裂过程中的细胞中进行,所以需要在细胞贴壁之前或最迟在内进行接毒,而且细胞数量不宜过多,否则会影响其增殖强毒可以通过接种鸭胚来弱化。在产蛋母鸡体内具有垂直传播和持续感染的特注。感染产蛋母鸡可作为一种增殖的新方法,利用此方法可以制备抗的卵黄抗体,这样替换抗的血清,从而减少了制作成本,但缺点就是抗的卵黄抗体为异源的,治疗效果有待进一步探究。小鹅瘟病毒的分子生物学特性基因组结构特点年美国学者等第一次克隆了基因组的部分序列后来匈牙利学者等在同一年首次报道了株全基因序列,并将其与番鸭细小病毒基因序列进行了同源性的比较,为分子生物学的研究打下了基础。小鹅瘟病毒基因组为线性、单链,含正链的病毒粒子和含负链的病毒粒子基本相等,在病毒提 小鹅癌病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立取过程中,两种链很容易发生退火,易形成双链互补。在基因的两端存在相同的长大约为的末端倒置的重复序列(的结构和大小与人细小病毒十分相似,与细小病毒属的大部分成员不相同。两端的个核苷酸可反折形成“”形双链发夹结构,该结构中含有个核苷酸形成的“泡”区,外形像“箭”状和个核苷酸构成的无错配“莲”部。在箭头处有一个限制性内切酶位点,可使其形成二分对称中心,在正链和负链的两端都有具有发夹结构,具有高含量的。,是活跃的重组位点,原因是完整的“泡”区在大肠杆菌中有翻转方向的互变。大约在和处都含有末端解离位点(,在病毒复制中结构蛋白以依赖的方式在末端解离位点处切割的复制起始位点的中含有大量的重复序列,如“”的衍生体和“”重复了十八次,很多其他的重复结构域和已知的转录因子识别序列相吻合,如盒、盒、盒、、、、等‘？。在中经常的发现结合蛋白的相关结构域,揭示了在病毒基因的复制调节和基因转录过程中发挥着重要的作用。对转录的还具有由形成的个四联碱基和由形成的四联碱基。这可能是小鶴癌病毒的结合结构域。的可作为复制的起点,且可为包装提供顺式信号对转录因子结合位点的研究表明,盒和盒序列同时也是转录因子和的结合识别位点序列,和宿主细胞中的某些调控因子能识别这些调控单元。基因组大约为,主要含有两个不重叠的开放阅读框(,在基因组左侧的编码非结构蛋白(,包括和,它们的起始密码子分别位于和处,终止子位于处,大小分别为和,包含。右侧幵放阅读框(编码结构蛋白(包括、、其中是主要的衣壳蛋白,、、的起始密码子位于、和处,但的起始密码子是不典型的,终止密码子都位于处,它们的大小分别为、和,包含、包含。和都有各自的启动子区域,负极性链上没有明显的。和的非重叠序列为。整个编码区互相重叠,形成套式结构。的全基因组结构见图 第一章小鹤痕病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展廬取零▼■▼图基因组结构模式图—基因组的转录和调节通过盒搜索,发现基因中存在三个启动子、、它们分别启动、和的起始密码子开始转录,转录产物都共同终止于基因组右侧处的信号处。的是一个非典型的“”序列,且与的相似,被认为是功能性的启动子。在基因组的第一个启动子下游有一个是否为功能启动子的盒单元。在基因组处有一个剪接供体位点,其位置与的相类似。在和处分别有一个剪接受体位点,该序列为保守序列,可为诊断技术提供支持,剪切受体位点比更有意义,剪接受体位点在转录和翻译中发挥重要的作用,与的剪接受体位点相似。在剪接受体位点处的转录产物被剪接成和°。的剪接有待研究,一般认为是翻译后切割加工形成的。小鹤癌病毒主要蛋白非结构蛋白左侧开放阅读框至少可编码两种非结构蛋白和,相对分子量分别大约为和,和分别大约有、个氨基酸组成,基因长度分别为和,它们有共同的羧基端。蛋白出现在病毒复制早期,其主要作用是参与病毒的复制和基因表达调节此外,还参与细胞毒性的作用,还能与结合、位点特异的结合和切割活性、的活性、解旋酶活性等各种生物化学功能的多肽序列对比发现：氨基酸的活性位点在及脊椎动物中都特别保守,其功能在复制中证明可共同参与非结构蛋白与基因组’的结合。氨基酸序列中有与抑制功能的蛋白序列相符合的保守序列,其中“”结合序列(在、和中序列完全一致。像、 小鹤瘤病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立和—样,在蛋白的變基端有粹指结构。在氨基酸序列、分子量大小、功能结构上与非结构蛋白特别相似,在中心核区氨基酸同源性最高,同时在此区有个高度保守的且相结合的具有解旋酶活性的基序在豫基端氨基酸的同源性最低,仅为但在此区这两种非结构蛋白都具有锌指结构。的蛋白与非结构蛋白一样能共价结合复合型’端,的保守序列为,且具有解旋酶活性「…。该保守序列在和蛋白多肽链上的位置是一样,迄今研究者认为该序列是相关酶的结合位点,扩展了末端区域的空间构型,有利于病毒的复制。可能参与细胞毒性作用的,并且原有肽链空间构型对维持蛋白对细胞毒性作用很重要。的蛋白是憐酸化蛋白,在其复制中起着重要的作用特异性起始线性双链的复制。与病毒复制序列高度亲和结合。具有三碟酸解旋酶的活性。通过对的研究发现细小病毒非结构蛋白不具有细胞毒性作用,但可辅助对宿主细胞发挥毒性作用,其氨基酸末端为此作用的活动区进行缺失的突变,发现感染初期衣壳蛋白可正常合成,但病毒粒子的装配受到限制,最终影响衣壳蛋白的合成。在无的情况下,也可以产生细胞毒性作用,野生型毒株的可以发挥杀细胞作用和显著延缓细胞生长。除此之外,还可能与病毒蛋白质和的合成以及增值有关。有研究表明,和有良好的抗原性。于天飞在上发现在氨基酸处有一个蛋白抗原表位区。结构蛋白基因组编码、、三种结构蛋白,根据开放阅读框推测、和的大小大约是、和。、和蛋白大约分别由个、个和个氨基酸组成。多肽氨基酸序列与、多肽链端到端方向完全重叠,大小为。含有、的全部氨基酸序列三个蛋白具有相同的羧基端,与和多肽氨基酸序列同源性很高,分别为和。研究表明不参与子带病毒的输出和衣壳的形成,但对形成感染性病毒粒子却是必不可缺少的。可协助或病毒通过核孔转运至细胞核内。等发现：与野生型相比,缺少的病毒粒子能更好的与细胞结合,但不能引起细胞的有效感染,与细胞的结合是一种特异性受体的结合,因此认为可能与宿主细胞的特殊受体相互作用。因此推测蛋白在病毒侵染细胞并产生感染性方面是一重要的结构区域。的是病毒主要的免疫功能区,可刺激机体产生中和抗体,是的表面 第一章小鹅痕病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展抗原之一,可用来制备基因工程疫苗。等。利用杆状病毒表达系统表达了的,表达产物可自发的组装成的空衣壳,接种番鸭后可检测到中和抗体,说明的具有免疫原性。在病毒感染中,蛋白参与衣壳的形成,在病毒感染细胞中起着重要的作用,并且可自发的组装成病毒样颗粒。蛋白是主要的衣壳蛋白,是主要的保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体,在诊断及防治中具有重要的意义。等对的氨基酸序列进行了分析和通过与衣壳蛋白三维结构模拟比较分析发现,发现暴露于衣壳表面的氨基酸残基序列均出现在内,表明内含有的主要抗原决定簇,是的主要免疫保护性抗原。在和编码的序列中发现各种区域,并且它们在每种细小病毒的序列中是保守在纯化的病毒的三个衣壳蛋白中是最多的,并且有高的免疫原性。小鹅瘟流行病学小鶴痕病毒(在自然感染情况下,仅发生于雏鹅和雏番鸭,其它禽类和哺乳动物均未见有发生的报道小鶴癌病毒主要侵害日龄的雏鹅和雏番鸭,随着日龄的增长,小鹅痕的死亡率和发病率会逐渐下降,日龄以上很少发病,一年四季均会发生,该病的潜伏期和感染动物的日龄有关,病程与雏鹤的日龄有关。不同地区、不同免疫状况、不同円龄的鹅群死亡率和发病率都各不相同。大鹤感染后不表现临床症状,而是带毒者且是传染源。发病雏鹅通过类便排除大量病毒,可通过间接或直接接触而迅速传播日龄内的雏鶴因免疫功能不全最易感染。可以自然感染小鹅痕病毒的禽类只有鹅和番鸭,其他禽类可以完全不被感染。该病没每年都会有不同程度的流行,长期困扰着我鹅养殖业的发展。最近几年小鶴瘟病毒感染鹅的日龄逐渐增大,现已有报道,可使日龄的雏鶴发病,这可能使毒力增强的缘故。小鹅痕既可以水平传播业可以垂直传播,主要通过消化道进行传播,感染的雏鵝、雏番鸭和隐性带毒的鹤、番鸭是该病的主要传染源,可通过类便不断向外界排毒,污染场地、饲料、饮水、环境等,经直接或间接接触导致该病的传播,也可通过垂直传播直接传到下一代。成鹅感染小鹤痕病毒后,可长达多天的带毒,患鹅各实质器官均带毒,成为主要传染源。：隐性感染的成鹅和痊愈的雏鹅都可获的坚不可摧的免疫力,这种免疫力可同过抗体将其传给下一代,从而是雏鶴获得被动免疫,因此小鹅瘟的流行有一定的周期性,一般不会在同一地区连续两年发生大流行。小踏瘟的临床症状和病理变化 小鹅癌病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立小鹤瘟的临床症状以败血性病变为主,以消化道和中枢神经紊乱为特征,但该病的症状与发病雏鹅的日龄密切相关。该病的症状表现和感染雏鶴的日龄密切相关,该病的潜伏期一般为天,一出壳就感染的雏鶴和雏番鸭潜伏期为天,一周以上的潜伏期为天。通常日龄越小,潜伏期越短。根据该病病程的长短分为最急性、急性和亚急性三种类型。最急性型：以日龄发病雏鹤常为最急性型,病鹅一般不出现明显的临床症状,死亡和传播速度快,倒地乱划死亡或衰竭死亡；肠道一般会出现急性卡他性炎症,而其他器官一般无明显变化。急性型：常发生于日龄以上,周龄以内的雏鶴,临床症状明显,食欲减退,精神萎靡,站立不稳且行动迟缓,饮水增多,严重拉稀,排出淡黄绿色或灰白色稀粪并混有纤维碎片或气泡,肛门周围沾满粪便。患鹅呼吸困难,鼻腔常流出装液性分泌物,緣端变暗。患病雏鹅显示全身败血症变化；肝脏质脆易碎,呈淡黄色,心脏发生急性心力衰竭,心肌呈灰白色；脑膜充血,肾暗红,稍微有肿大。该病的特征性病变是小肠部分呈纤维素性坏死性肠炎、急性卡他性肠炎。最典型的变化是在小肠中下段出现具有特征性的凝固性栓子,呈灰色或淡黄色,在靠近回盲部和卵黄柄处肠断发生膨大,肠壁变薄,质地坚硬,长约为几厘米,状如香肠,可将肠腔完全堵塞,但不形成馈荡,其他肠段也会出现,部分肠粘膜附着散在的纤维素性凝块。此种特征性的栓子己被认为是小鶴瘟具有的特征性的病变。亚急性型：亚急性型：常见于周龄以上的雏鵝,多出现在流行末期或低母源抗体的雏鹅,雏鶴消瘦拉稀,病程在天,虽有少数幸存者,但都生长发育不良。研究发现,感染雏鶴后,各组织器官均呈现广泛的病理损伤,小肠病变较为严重,其次为免疫系统、肝脏、心脏、肾等组织器官,耐过雏鶴未见明显的病理组织学变化。小鹅瘡病毒的诊断方法病毒分罔和鉴疋根据该病的流行病学、临床症状和病理变化等特征性病变,作出初步诊断,进一步确诊仍需进一步进行实验室诊断。在作出初步诊断后,对疑似病例进行病毒的分离与鉴定是该病最准确、最经典的诊断方法之一。的分离培养主要是使用鶴胚和鹅的成纤维细胞。在生物安全柜里以无菌操作的方法采集急性期死亡雏鹅的心、肝、脾肾等实质器官,进行无菌处理,然后接种龄的无母源抗体的鶴胚的尿囊腔,天后出现死亡,观察胚体变化,胚体出血、充血,肝脏土黄色、心肌灰白色等变化也可将病料悬液接种于未长满单层的细胞培养物中分离该病毒,接种病料后出现明显病变,经伊红苏木素染色 第一章小鹅痕病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展后可见型核内包涵体和合胞体】。为进一步检测,可通过透射电镜进行检测,该方法是是一种快速高效的方法,但由于电镜价格很贵,有一定的局限性,不适合在基层应用。血清学诊断琼脂扩散试验(琼脂扩散试验是检测的经典方法,余永建、甘孟侯、李埃宝、霍峰等都先后报道过琼脂扩散试验检测的方法,该方法简单,但灵敏度低,并且需要高效价的抗血清和高倍浓缩的尿囊液。随着研究的深入,秦爱建报道了利用小鹤瘟病毒酶标单克隆抗体对小鶴瘟进行了诊断,该方法将常规琼扩试验的灵敏度提高了大约倍,可直接检测出病料组织及尿囊液的,但由于价格和来源等缺点,该方法不适合大量检测。病毒中和试验(病毒中和试验可在鶴胚和它的成纤维细胞上进行,、、建立检测抗体的中和试验,赵坤、张耀成等建立检测抗体的中和试验。与相应抗体结合后,失去对易感雏鶴的致病力,通过计算,来检测的抗原和抗体。此种方法操作简单,灵敏度高,因此该方法可用于初步诊断。该方法的缺点是费时,因此不适合大量检测。精子凝集试验和凝集抑制试验凝集黄牛精子但不凝集红细胞,因次可以应用精子凝集试验检测。盛佩良等建立和应用精子凝集抑制试验检测。此方法检测小鹅瘟病毒必须增殖到一定浓度才可以检测出病毒。该方法的优点是操作简单、快速；缺点是敏感性和特异性不高。酶联免疫吸附试验(酶联免疫吸附试验是检测的有效方法。目前,已有间接酶联免疫吸附试验、斑点酶联免疫吸附试验(、复合物酶联免疫吸附试验的相关报道。间接—般用检测抗体,这样假阳性比较多。的优点是可适用于大批量样品的检测,便于在基层推广应用,缺点是操作繁琐、复杂。复合物酶联免疫吸附试验灵敏度高,但比较复杂。免疫焚光试验免疫焚光方法是检测体内病毒分布情况的良好方法,有较高的敏感性和特异性。此方法操作繁琐,并需要荧光显微镜,一般不用该方法来诊断。对流免疫电泳法 小鹅痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立该方法比琼脂扩散试验快,但敏感性和琼脂扩散试验差不多,仍然不能直接从病料中检测。分子生物学诊断聚合酶链式反应(鉴定的方法在国内外都有报道,该方法已经成为实验室鉴别诊断的有效方法。该方法的优点是快速、准确、灵敏。缺点是该方法对实验设备有一定要求,并且实验操作要求高,一般应用于科研,在生产实践中不宜推广。核酸探针该方法特别灵敏、快速,缺点和方法差不多,都不宜在生产实践中推广。小鶴瘟的防治小鶴瘟防治的主要方法除了加强管理外,主要靠小鹅癌抗血清和疫苗来控制该病。预防该病的最有效的方法是种鶴产蛋前进行免疫,使雏鶴一出生就获得被动免疫。目前市场上主要有小鹅痕种鹅用油乳剂苗和弱毒苗。油乳剂疫苗有产生免疫力慢、用量大等缺点,而弱毒苗却存在毒力返强现象。在治疗方面,主要以卵黄抗体和抗血清进行治疗。虽有一定效果,但也有缺陷,同源抗血清易带有鹅的病原；异源抗血清被动免疫时间变短,并易发生排斥反应,影响免疫效果。研究目的及意义小鹅痕是我国养鹅业的主要传染病之一,给养鶴业带来巨大的经济损失,小鹅痕的快速准确诊断是防控该病的基本措施。虽然已有大量的关于检测方法的报道,但都各有缺陷,小鹤瘟的鉴别诊断、流行病学等都尚待进一步的深入研究。本研究根据五河某养殖鹅场送检病例,经临诊初检后拟进行其病原的分离与鉴定,在此基础上拟对该病原分离株进行全基因序列的测序与分析,同时,本研究还拟对该病原的抗原结构蛋白进行克隆、表达与纯化,并制备其多克隆抗体,进而研究建立起该病原的双抗夹心检测方法,旨在为基层防疫单位小鹅瘟的快速诊断、鉴别诊断和流行病学调查提供支持,更好地服务当地畜牧经济发展,同时,也进一步丰富的分子流行病学资料及其变异性,并为的进一步深入研究奠定坚实基础。 第一章小鹤痕病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展参考文献方定一,小鹤痕的介绍中国畜牧兽医杂志,,卡尔尼克主编,高福,苏敬良主译北京：中国农业大学出版社,,,,,,马君,章金钢,李雪梅等鹅细小病毒主要结构蛋白的扩增、克隆与原核表达载体的构建中国兽医学报,,郭鹭抗鹤细小病毒蛋白单克隆抗体的制备与对应抗原表位的定位东北农业大学硕士研究生学位论位,,,殷震刘景华动物病学版北京：科学出版社,“,,一“”,」, 小鹅痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立。吴清民主编兽医传染病学北京：中国农业大学出版社,王世若王兴龙韩文瑜主编现代动物免疫学吉林科学技术出版社,,章金刚,向华、杜华茂禽类细小病毒的分子生物学中国兽医学报,：,“,,“” 第一章小鹅瘟病毒生物学特性及诊断方法的研究进展张雅为鹤细小病毒和检测方法的建立及抗体消长规律的测定东北农业大学硕士研究生学位论位田晋红等四丨微生物学会论文集,“”,,,,,丁 小鶴瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立,,,布日额,王君伟,吴金花,等野毒株的分离及检测方法的应用中国预防兽医学于天飞,仇铮,马波,等赠细小病毒非结构蛋白细胞线性抗原表位的鉴定及抗原表位区分子特性分析中国预防兽医学报李茂祥,李俊宝,郑玉美小鹅攝纯化及其理化特性的研究病逛学报,,： 第一章小鹅塩病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展金奇主编医学分子病毒学科学技术出版社,」,,,,,,李福伟,李惠敏,张桂红等小鶴癒的研究进展广东畜牧兽医科技丨王永坤,田慧芳小鹤痕的流行与有效防制措施现代畜牧兽医存云几种常见鶴病的防治方法湖北畜牧兽医,包金莲小鹅痕的防治内蒙古科技与经济侯洪烈小鹅癒综合防治四川畜牧兽医周景明小鹅温的发生与防治湖北畜牧兽医,：,,(王永坤,田慧芳中国家禽,,王永坤,田慧芳小鹅塩的流行与存效防制措施现代畜牧兽医苏颖,王姝小鶴臨的诊断与防制现代畜牧兽医裴颖感染鹤细小病毒雏鹤病理学研究东北农业大学硕士研究生学位论文 小鹤瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立李桂霞,刘胜旺鶴细小病毒株的分离鉴定及生物学特性的研究中国预防兽医学报秦爱建,王永坤,等免疫酶琼脂扩散试验在小鹅瘟诊断中的应用中国畜禽传染病,盛佩良雏鹅小鹅癌的诊断畜牧与兽医,杨忠友,邱第法,刘之芬,等抗小鹅瘋高免血清的制备中国兽医杂志 第二章小鹅瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定第二章小鹅癌病毒分离鉴定及全基因序列的测定摘要：对来自安徽省五河县某养殖场所送检的病死和濒死小鵝进行实验室检测,通过流行病学、临诊观察和剖检病变的检查,初步疑为小鵝瘦；采集病料,接种鹅胚进行病毒的分离,然后采用血凝试验、谅脂散试验等血清学技术和等分子生物学技术进行病毒的鉴定,并进行了动物回归试验。结果是：该病毒无血凝性；琼脂扩散试验出现明显的沉淀线,琼扩效价为用小镇疸和雏鹅新型病毒性肠炎的特异性检测引物进行检测,只有小鶴瘟的引物出现与实际相符的特异性条带；动物回归试验中的试验组第天开始死亡,天后全部死亡表明该毒株有较强的毒九研究表明送检雏鹅感染了小鹤痕病毒,将该病毒株命名为具有强的毒力。为了研究小鵝疫病毒的分子流行病学和该病毒株在遗传进化中的地位,对株进行了全基因序列的扩增,并进行基因序列分析,结果是：株与株的核苷酸序列同源性最高,高达,与株的同源性最低,为遗传进化中,株与株在同一分支中。结果表明该病毒株与株同源性最高,亲缘关系最近,确定了该病毒株在遗传进化中的地位,为小鹅疸的进一步研究提供依据。关键词：小鵝疸；小鵝痘病毒(分离；鉴定研究背景：五河某鹅场,有多只雏,鹅苗为当地坑房孵化,曾在龄接种过丨小鹅瘟抗体,在日龄发病,开始每天大约只左右死亡,主要表现每只病死鹅回肠段均有栓塞物,脾脏有少量坏死点,部分鹅有尿酸盐沉积,直肠出血。对该病例进行了诊断,并进行了分离鉴定。材料材料实验动物、菌株和载体由本实验室保存克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司。主要试剂液体培养基：称取胰蛋白胨,酵母提取物氯化钠,加蒸馈水定容至,用氧氧化钠调节值至,分装后高压灭菌。 小鹅痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立固体培养基：每升液体培养基中加入琼脂粉,高压灭菌后铺制平板。凝胶回收试剂盒购自公司；质粒小量提取试剂盒购自公司；琼脂糖购自公司；氨节青霉素(购自南京基天生物技术有限公司。主要仪器设备扩增仪(公司)微量移液器(公司)全自动数码凝胶成像系统(上海培清科技有限公司)超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)水平电泳系统(公司)手掌型离心机(江苏省海门市麒麟医用仪器厂)隔水式恒温培养箱(上海博迅实业有限医疗设备厂)型立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)电子天平(塞多利斯科学仪器有限公司)型双向定时恒温磁力揽拌器(上海沪西分析仪器厂有限公司)实验室计(梅特勒托利多仪器有限公司)海尔超低温保存箱(青岛海尔股份有限公司)超纯水系统(超高速冷冻离心机(公司)电热恒温水槽(上海医用恒温设备厂)数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限医疗设备厂)方法病料的采集及处理从五河某鹅场疑似小鹅痕的病例中采集肝脏、心脏、脑、肾、肌肉等组织,将各组织剪碎研磨后,按比例加入高压灭菌的制成悬液。反复冻融次,离心,吸取上清液,用的一次性过滤器过滤,然后保存于：保存备用。病料的鉴定各组织微量提取 第二章小鹅癌病毒分离鉴定及全基因序列的测定取病料组织块(小米粒大小,如为液体取,放置于管中。加入裂解液。使组织块浸在裂解液中,放入仪上。。°打幵仪,打开管加蛋白酶混勻。(提前拿出蛋白酶融化)。继续：。°°。产物即为提取的。该管中的在使用前用掌型离心机离心左右,取上清,即为模板。(一般建议模板用引物的设计及合成根据鶴细小病毒基因序列(登录号为设计并合成了对引物扩增基因片段。根据雏鹤新型病毒性肠炎病毒基因序列设计引物,扩增片段为,由大连公司合成。；‘』；‘；‘：‘鉴定按照下列体系向管中加入各种试剂组成体系体系模板上游引物丨下游引物酶 小鹤痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立由多到少加样,最后加酶,完成后用手指轻弹管,使液体混匀至于掌型离心机上稍稍离心。置于仪中,设定相关参数。如下：循环一一：一咖“：：‘—、■‘■“——“』一预变性变性退火延伸后延伸—产物经琼脂糖凝胶电泳分析。产物回收称量管重量,将手术刀片用酒精擦洗后在酒精灯火焰上烧烤,干燥冷却后用于切胶。将成像系统的打幵,看到目的条带后立即将目的条带所在区域胶块切下,放入称取的管中称量,并计算出胶块的重量。按胶块重量的同等量加入,放入水浴锅中孵育,直至胶完全融化,每取出震荡一次。将融化后的液体加入柱中,室温离心标准,弃去收集液。加入,室温离心标准弃去收集液。加入,静置,室温离心标准弃去收集液。重复操作步骤—次。空柱离心室温离心充分干燥柱子中的,弃去收集液。将柱子移入管中,垂直加入室温离心收集。重复步骤—次(将收集液重新垂直加入柱中,室温离心弃柱子,将管标记好,：短期保存,长期保存。 第二章小鹅痕病毒分离鉴定及全基因序列的测定注：胶回收时,电泳所用的电泳液需更新,防止其它污染。病毒的增殖及传代在生物安全柜里,将上述保存的病毒稀释后,用注射器无菌接种于枚日龄的鶴胚。取日龄的无母源抗体的鶴胚,照蛋,在胚胎旁续毛尿囊膜发育良好、无大血管处和气室交界处标记,用碘、酒精消毒。在记号处打孔,注射器吸取样品刺入壳膜约,接种,用石錯封闭注射孔。鹅接种后置于孵蛋器中孵育,每小时照蛋一次,弃去小时死亡的,记录死亡时间和死亡个数,孵育天后取出置于°冰箱过夜。收获尿囊液时,鹅胚用碘配、酒精消毒气室端,以镊子沿气室周围除去卵壳,撕壳膜。用注射器穿破续毛尿囊膜吸取尿囊液,分装于灭菌的离心管中,置于°冻存,避免反复冻融。将以上所取的尿囊液,进行稀释,过滤继续接种鹅胚,盲传三代。病毒的分离鉴定接种鹅胚的观察随机取几个死亡鹅胚观察,并取肝脏等组织,放冰箱中保存。血凝试验(红细胞的制备用注射器吸取的枸橼酸钠,为血量的,从鸡的静脉采血,将抗凝血放入离心管里,加入于抗凝血倍体积的离心弃上清,加轻轻悬起,再离心,这样洗漆三次,最后加配成的悬液,°短暂保存备用。血凝试验(将收集的鹅胚尿囊液进行血凝试验,取干净的孔形底的微量滴定平板,每孔加入吸取待检尿囊液加入第一个孔了,混匀,从第一个孔中吸取至第个孔,混勻,依次倍比稀释至稀释倍数为,为孔数,最后一孔弃去。然后每孔再加鸡红细胞悬液,振荡使其充分混匀后,室温静置大约,观察结果。谅脂扩散试验(鉴定琼扩抗原的制备取死亡鹅胚的尿囊液,反复冻融次,离心,弃沉淀；然后加等量氯仿混合均勻,剧烈震荡,离心。取上清装入透析袋 小鹅癌病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立中,置于聚乙二醇中浓缩(约使体积为原尿囊液的制成待检抗原。琼脂板的制备取氯化妈、琼脂粉,加入氯化钠溶液,加热煮沸使其融化,将融化的琼脂倒入平皿中,制成约厚的琼脂板,自然冷却。检测抗原(参考《动物免疫学实验技术》⑴)打孔：用打孔器打孔,打成梅花形孔图,挑出孔内琼脂,不要把孔边缘挑破。封底：在火焰上缓慢加热,使孔底边缘变成小,以封底,以免加样时液体从孔底渗漏。加样：中央空加抗体(琼扩效价是,在号孔内加阳性抗原,在号孔依次加入、、,、的抗原,注意各孔不要产生气泡,以加满而不溢出为宜,放入°温箱里,一般后可判断结果。鉴定用的引物,随机取个死亡鹅胚的组织和尿囊液进行鉴定,并将纯化回收的胶产物进行测序。动物回归试验取只日龄的雏鹅,将其饲养在未被小鹅痕病毒污染的环境中,观察天。确保其为健康雏鶴,并排除母源抗体。将只雏鹅随机分成试验组和对照组,试验组只雏鶴,颈部皮下注射第三代病变胚尿囊液,只,并口服只。对照组只雏鵝,颈部皮下注射无菌的,只,并口服只。逐日观察接种雏鹅的的临床症状,及时剖解死亡雏鹅,观察剖检变化。各片段的忙增与测序引物的设计及合成目前,的全基因有上海株)、台湾强毒株)、台湾强毒株)、,台湾弱毒株)、,欧洲弱毒株)、,匈牙利强度、上海株)、广东弱毒株)八株,通过软件进行序列对比,发现的同源性最高,因此,根据设计并合成了对引物如下： 第二章小鹅痕病毒分离鉴定及全基因序列的测定表引物核苷酸序列引物名称引物序列退火温度位置扩增片段长度(：—：：—：：：：—：各目的片段扩增按的方法进行的提取,然后按的操作程序,以所提的为模板进行各目的片段的扩增和凝胶电泳。产物的胶回收按照的操作程序,进行胶回收。目的片段与旳连接和转化用的管配下列溶液,体系如下：胶回收产物加入°反应长片段产物(以上)进行连接时,连接反应时间应延长至数小时)全量(加入至感受态细胞(中,冰水浴放置°加热,严格控制时间及时转入冰水浴中,勿晃动,加入培养液°摇床取出管,离心°弃上清液,剩下约残留液用枪将管上的菌体反复小心吹打均勻涂于相应抗性的平板上,将平板置于：培养箱菌液鉴定 小鹪塩病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立用灭菌的小枪头随机挑取平板上生长出的单菌落,接种于液体培养基中,并加入相应的抗生素,置°振荡培养过夜。次日以菌液为模板,用方法进行鉴定(各反应条件分别与前面一致),然后用琼脂糖凝胶电泳鉴定。测序及质粒的提取将经菌液鉴定正确的菌液送去测序,测序正确的菌液,进行质粒的提取。取柱子,加静置,室温离心,弃收集液备用。垂直加入重悬菌落(祸旋或用枪头混匀),与菌落混匀。垂直加入轻轻地上下颠倒,混匀后静置分钟。垂直加入立即上下颠倒混勻至产生白色絮状沉淀,离心分钟(一般。用枪头将上清轻轻吸入柱子中,离心,弃收集液。加离心—分钟,弃收集液。加离心弃收集液。重复步骤—次。空柱罔心,充分干燥柱子。将柱子移入新的管中,加—静置离心离心,将收集液重新吸入柱子中,离心离心。标记,°短期保存,长期保存。全基因序列的拼接和分析全基因序列的拼接用软件将各片段的测序结果进行拼接,得到的全基因组序列。全基因序列同源性的比较将的基因组序列在上进行比对,用软件对及中已发表的全基因序列上海株)、台湾强毒株)、,台湾强毒株)、,台湾弱毒株)、欧洲弱毒株)、,匈牙利强毒、上海株)、广东弱毒株)八株进行比对,分析同源性。遗传进化分析参照文献的方法,应用软件中的软件对及 第二章小鶴瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定,上海株)、台湾强毒株)、台湾强毒株)、,台湾弱毒株)、,欧洲弱毒株)、匈牙利强度、上海株)、广东弱毒株)核苷酸序列进行比较,计算遗传距离,根据遗传距离绘制系统发育进化树。各基因序列核苷酸及氨基酸序列同源性比较用软件中的软件对及,上海株)、台湾强毒株)、,台湾强毒株)、,台湾弱毒株)、,欧洲弱毒株)、,匈牙利强毒、上海株)、广东弱毒株)基因中、的核苷酸序列及推导的氣基酸序列的进行同源性比较。结果病料的鉴定取各组织病料进行方法鉴定,结果如图,脑、肝、脾、心、肌肉在处出现特异性条带,初步表明该病为小鹤癌；由于小鹤痕和雏鹤新型病毒性肠炎极为相似,因此用脑进行雏鹅新型病毒性肠炎特异性引物进行鉴定,结果没有条带,可排除雏鹅新型病毒性肠炎。——图病料的鉴定核酸与脑肝脾心肌肉— 个跑恤病每株的分尚签疋及共双仇光心检测力法的建立鹤胚的观察随机取个死亡鹤胚进行观察和剖检,并取尿囊液和肝脏(保存备用),结果如图示。胚体出血,发會迟滞,肝脏呈土黄色,‘心肌呈灰白色甚至瓷白色。繼■图鹪胚观察和剖检结果‘血凝试验(将鹤胚尿囊液进行血凝试验,结果没有血凝性,因此可排除该病为鹅副粘病毒和鹤流感的可能。琼脂『散试验( 策二章小鹤癌病毒分离鉴定及全基因序列的测定将浓缩的尿囊液进行倍比稀释和阳性小鹅痕鸡卵黄提取物(琼扩效价进行琼脂扩散试验,并设阳性对照。结果是：待检尿囊液有沉淀线,浓缩的尿囊液效价为。表明该尿囊液含有。方法随机取个死亡鹅胚尿囊液和肝脏,进行鉴定,结果如图所示,在约处出现特异性条带。将特异性条带胶回收,进行测序,该病是小鶴痕,暂将其命名为。■■■■■■—肌图检测结果核酸肝脏肝脏肝脏嵌襲液尿囊液尿囊液动物回归试验雏鹤接种后,试验组和对照组雏鹅死亡情况见表,试验组在第天开始死亡,到第天全部死亡,对照组全部存活。试验组接种天后幵始发病,表现精神萎靡, 小踏德病寿株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立食欲减退,排绿色或白色混有气泡的粪便,喜卧,常用头。剖检观察到小肠肿胀,充血,呈纤维素性、卡他性肠炎,有典型的症状小肠有栓塞,有的并有肠粘膜包裹,质地坚硬,将肠堵塞,结果如图所示。这性症状与小鹅瘟的临床症状相符合。对照组雏鹅健康无临床症状。色稀異并有气死亡难換角弓反张小肠膨大肠检塞肠栓塞横截面图死亡雏踏的剖检观察表雏踏接种试验结果組别接种后天数试验组对照组注：表中数据为存活数接种数各片段的扩増 第二章小鹅疲病毒分离鉴定及全基因序列的测定用四对引物进行的全基因序列的扩增,结果如图所示,大小约,约为,约为,约为,各片段大小与实际相符合。：等’：各片段的扩增结果克隆的鉴定将护增的片段分别与载体进行连接,然后将连接产物转化到感受态细胞￡中,涂板,挑取平板上的单个菌落到培养液中,振荡培养过夜。以菌液为模板,用方法对重组质粒进行鉴定,各段均能扩增出与目的片段大小—致的片段,结果如图所示。将鉴定正确的各阳性菌液可送去测序。隱■“”：图重组质粒的鉴定基因序列的拼接 小鹪癌病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立经鉴定后的阳性克隆菌液经南京金斯瑞生物技术有限公司测序,每个碱基至少测三次。应用软件对测序结果进行序列拼接,获得了株的全基因序列。序列见附录。株全基因序列长度为。全基因序列同源性的比较将的全基因序列与中已公布的,上海株)、,台湾强毒株)、台湾强毒株)、台湾弱毒株)、欧洲弱毒株)、匈牙利强毒、上海株)、广东弱毒株)八株全基因序列进行比对。发现与,上海株)的同源性最高,高达,与广东弱毒株)的同源性最低,为。比较结果见表。表九株全基因组核苷酸同源性比较遗传进化分析根据各毒株的全基因序列的遗传距离绘制的系统发育进化树,结果如图所示。从图中可以看出株毒株可分为两个大的分支,基因序列长度为的上海株)、广东弱毒株)在一个大的分支上,其余的在另一个大的分支上。安徽株)与上海株)处于同一进化分支上,说明与,上海株)亲缘关系最 第二章小鹤痕病毒分离鉴定及全基因序列的测定近,且与台湾强毒株)、,台湾强毒株)的亲缘关系也比较近。而,台湾弱毒株)、欧洲弱毒株),,匈牙利强毒亲缘关系较远。：—由图株全基因核苷酸序列的遗传进化树各基因核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性比较各毒株各基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列之间进行同源性比较,核苷酸序列比对结果如图和所示,氨基酸比对结果见表至。从图和表中可见：株与各毒株基因的核苷酸之间同源性为,基因所对应的氨基酸之间的同源性株与各毒株基因的核苷酸之间同源性为,基因所对应的氨基酸序列之间的同源性在。说明的编码区有高的保守性。 小鹤痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立丨丨丨丨丨丨丨■丨§丨丨丨丨丨丨丨丨丨‘日！图株基因核苷酸同源性比较表株基因氨基酸同源性比较 第二章小鹤塩病毒分离鉴定及全基因序列的测定‘—气“§丨丨丨丨：：曰丨图株基因核苷酸同源性比较表株基因氨基酸同源性比较讨论对来自安徽省五河县某养殖场所送检的病死和濒死小鹅进行的实验室检测,通过流行病学、临诊观察和剖检病变的检查,初步疑为小鶴痕,同时,对病例的肝、脾、心、脑、肾等组织进行细菌学初检和病原学(细菌学和病毒学)的分离与病料的保存, 小鹅癌病毒〗株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立然后接种日龄无抗体的鹅胚进行病毒的分离能使鹅胚产生小鶴摄的特征性症状,该症状是胚体出血,发育迟滞,肝脏呈土黄色,心肌呈灰白色甚至瓷白色,可确定该分离株可在鹅胚中较好的增殖。将该分离的病毒在日龄无抗体的鹪胚中进行增殖,收集尿囊液,将尿囊液进行反复冻融和氯仿处理,然后进行浓缩制备抗原。本研究进行血凝试验,结果无血凝性,可排除鹅副粘病毒和鹤流感；琼脂扩散试验结果表明该分离的病毒与小鶴癌鸡卵黄提取物发生反应,产生特异的沉淀线,琼扩效价为通过方法,用雏鹅新型病毒性肠炎病毒特异性引物进行鉴定,没有出现特异性条带,用特异性引物进行鉴定,出现特异性条带；进行动物回归试验,试验组只雏鹤在第天开始死亡,天后全部死亡,并出现典型的肠栓塞症状。根据以上结果可确定该病例为小鹪痕,该分离毒株为小鶴癌病毒,命名为,且具有较强的毒力。该分离鉴定的结果对安徽省疫情的控制具有指导意义,并对以后开展小鶴瘟病毒的流行分析打下基础,更为以后小鹅痕病毒的研究提供了良好的研究材料。年美国学者等第一次克隆了基因组的部分序列后来匈牙利学者等在同一年首次报道了株全基因序列,并将其与番鸭细小病毒基因序列进行了同源性的比较,为分子生物学的研究打下了基础。小鶴癌病毒基因组为线性、单链,含正链的病毒粒子和含负链的病毒粒子基本相等,在病毒提取过程中,两种链很容易发生退火,易形成双链互补。但经过近年的发展,的全基因序列仅有株,这可能的原因是在的基因序列两端大约有的并在序列中有许多重复序列。因此,本研究根据已有的全基因序列通过软件进行分析,找到同源性最高的序列,设计相关引物,进行全基序列的扩增,成功的扩增了的全基因序列,为的分子流行病学研究提供了理论依据；然后进行了全基因的序列比对和遗传进化分析,该病毒株与株的核苷酸序列同源性最高,高达,与株的同源性最低,为,并且该病毒株与株处在同一分支中,因此确定与株的亲缘关系最近,并确定了该病毒株在遗传进化中的地位且与台湾强毒株)、台湾强毒株)的亲缘关系也比较近。而台湾弱毒株)、欧洲弱毒株)、匈牙利强毒亲缘关系较远。进行了各个编码区核苷酸和氨基酸同源性的比对,株与各毒株基因的核苷酸之间同源性为,基因所对应的氨基酸之间的同源性株与各毒株基因的核苷酸之间同源性为,基因所对应的氨基酸序列之间的同源性在。这些结果表明各株的亲缘关系比较近,尽管各株病毒的基因序列 第二章小鹅媪病毒分离鉴定及全基因序列的测定有一些位点发生变异,但尚未发现的抗原及血清型的变异,。 小猶癌病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立参考文献何昭阳,胡桂学,王春凤等动物免疫学实验技术吉林：科学技术出版社,吴艳涛,悅雪霞等我国部分地区不同动物来源新城疫病毒的分子流行病学研究病違学报,, 第三章小鹤痕病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立第三章小鹅瘟病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立摘要：本研究旨在为基层防疫单位及流行病学调查提供技术手段,为及时预防小鵝疫的发生与流行提供保障。通过和的双酶切,构建了结构蛋白的重组质粒(,进行了蛋白的原核表达,进行纯化和进行鉴定,结果表明本研究成功的表达了蛋白,为下一步研究打下基础。利用蛋白免疫兔后,制备抗的多克隆抗体,进行了纯化,通过进行鉴定,所制备的多抗具有生物活性。将抗蛋白抗体作为一抗建立以检测小鹅疸病毒为目标的汉抗夹心方法,并对包被液、封闭液、封闭时间、底物作用时间、酵标二抗的稀释度等方面进行了优化,确定了包被液为超纯水,封闭液为的明胶,封闭时间底物作用时间为酵标二抗的稀释浓度为。然后通过交叉试验、灵敏试驗验证了所建立的双抗夹心方法的可行性,并与检测方法相比较。本研究为小鵝痕的及时诊断提供了技术支持,并为及时预防小鵝疸的发生与流行提供保障。关键词：小鹅痕病毒；蛋白；多克隆抗体；材料材料实验动物、菌株和载体健康雌性新西兰白兔(约只),购自南京军区南京总医院比较医学科,由本实验室保存,由本实验室保存。主要试剂凝胶回收试剂盒购自公司；质粒小量提取试剂盒购自公司；聚合酶、、等购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖购自公司；氨节青霉素(购自南京基天生物技术有限公司；鼠抗单克隆抗体购于北京康为世纪生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(标记的羊抗鼠,辣根过氧化物酶(标记的羊抗兔 小鹅痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立考马斯亮蓝,蛋白定量试剂盒,凝胶配制试剂,膜,酵母提取物、蛋白腺等,购自上海生工生物工程技术服务有限公司；主要仪器设备扩增仪(公司)全自动数码凝胶成像系统(上海培清科技有限公司)超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限医疗设备厂)手掌型离心机(江苏省海门市麒麟医用仪器厂)隔水式恒温培养箱(上海博迅实业有限医疗设备厂)型立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)电子天平(塞多利斯科学仪器有限公司)型双向定时恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂有限公司)实验室计(梅特勒托利多仪器有限公司)海尔超低温保存箱(青岛海尔股份有限公司)超纯水系统(超高速冷冻离心机(公司)水平电泳系统(公司)电热恒温水槽(上海医用恒温设备厂)微量移液器(公司)方法基因引物的设计与『增引物的设计及合成根据已有报道,从上查找的全基因序列,包括、、、、。通过软件中的进行序列对比,发现的同源性最高,因此,根据设计并合成了对引物。扩增基因片段由大连公司合成。：：酶切位点是、。扩增 第三章小鹅温病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立按照下列体系向管中加入各种试剂组成体系体系模板上游引物下游引物酶由多到少加样,最后加酶,完成后用手指轻弹管,使液体混勻至于掌型离心机上稍稍离心。置于仪中,设定相关参数。如下：循环■如：：—‘、：、—‘■预变性变性退火延伸后延伸产物经琼脂糖凝胶电泳分析。产物回收称量管重量,将手术刀片用酒精擦洗后在酒精灯火焰上烧烤,干燥冷却后用于切胶。将成像系统的打开,看到目的条带后立即将目的条带所在区域胶块切下,放入称取的管中称量,并计算出胶块的重量。按胶块重量的同等量加入放入水浴锅中孵育,直至胶完全融化,每取出震荡一次。 小糖痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立将融化后的液体加入柱中,室温离心标准,弃去收集液。加入室温离心标准,弃去收集液。加入,静置,室温离心标准,弃去收集液。重复操作步骤—次。空柱离心室温离心充分干燥柱子中的,弃去收集液。将柱子移入管中,垂直加入,室温离心收集。重复步骤—次(将收集液重新垂直加入柱中,室温离心弃柱子,将管标记好,°短期保存,长期保存。注胶回收时,电泳所用的电泳液需更新,防止其它污染。重组表达载体—的构建目的基因与载体的酶切将胶回收得到的目的基因与原核表达载体分别用和进行双酶切。酶切在：水浴中进行后,琼脂糖凝胶电泳分析。双酶切体系为：连接按照方法回收产物,将回收的产物：或°下按照以下体系连接过夜。连接酶缓冲液连接酶目的基因转化将连接样品加入到的离心管中,置于冰上。°加热严格控制时间及时转入冰水浴中,勿晃动。加入培养液,°摇床摇大约。取出管离心°弃上清液剩下约残留液用枪将管上的菌体反复小心吹打均勻涂于相应抗性的平板上,将平板置于：培养箱。 第三章小鹤瘤病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立长出的白色菌落后,挑取单个圆滑的菌落进行鉴定。的提取取柱子,加静置,室温离心,弃收集液备用。垂直加入重悬菌落(祸旋或用枪头混勻),与菌落混勻。垂直加入轻轻地上下颠倒,混勻后静置分钟。垂直加入立即上下颠倒混匀至产生白色絮状沉淀,离心分钟一般。用枪头将上清轻轻吸入柱子中,离心,弃收集液。加离心—分钟,弃收集液。加离心弃收集液。重复步骤—次。空柱离心,充分干燥柱子。将柱子移入新的管中,加—静置,离心离心将收集液重新吸入柱子中,离心离心。标记,°短期保存,长期保存。阳性表达载体的鉴定将所提取的质粒,按的方法,用和进行双酶切鉴定,体积可变为将酶切正确的质粒取用载体的通用引物,送南京金斯瑞生物公司进行测序,分析测序结果。蛋白的表达及鉴定阳性重组质粒的转化取阳性重组质粒,加入中,按的方法进行转化。的小量诱导从平板挑取生长状态良好的圆滑的单个菌落,接种于试管液体培养基中,并加入氨节抗生素溶液,°振摇培养过夜。取转接到试管液体培养基中,并分别加入氨抗生素和氯霉素溶液°振摇培养,至值达约。取菌液于已高压灭菌的管中作为对照在试管中加入终浓度为】进行诱导表达,都置于：摇床中振摇培养过夜。剩余的菌液留作菌种,放在°短期保存。离去尽上清,用重悬菌体,加入,用超声波破碎菌体。 小鶴癌病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立离心,分离沉淀和上清,用重悬沉淀,分别取对照、沉淀悬浮液和上清,各加入约凝胶上样缓冲液,煮沸。进行的分析的分析装好配置好的的凝胶,防止漏水,固定于电泳槽中,向电泳槽内加入新配置的电泳缓冲液。上样：按对照、上清、沉淀的顺序向各上样孔加入约的样品,其中一孔加入的非预染的蛋白,电泳：在电压为下进行电泳,至到蓝色染料达到分离胶的底部时,停止电泳,大约需要。考马斯亮蓝染色：将已配置好的考马斯亮蓝染料倒入约,在摇床上不断震荡进行染色,至看到清晰的蛋白条带后即可停止染色。大约。脱色：弃染色液,加入适量的脱色液,进行脱色。观察与分析：拍照记录。的大量诱导取表达目的蛋白量较高菌株的种菌,转接到试管液体培养基中,并加氨节抗生素溶液,培养过夜。将菌液加入含氨节抗生素的液体培养基中,°培养,至值达约细菌达到对数生长期)。加入至终浓度为,于°摇床中培养,大约诱导收集菌体,°,离心,去上清。用重悬菌液,加入的。用超声波破碎菌体,,离心,分离沉淀和上清。蛋白的纯化包涵体的纯化取上述包涵体,用重悬,。用包涵体洗液重悬,洗,°重复次)用包涵体洗液重悬,°洗,不断振荡,然后,°重复次)尿素重悬,°溶解,°,保留上清。亲和层析纯化倍柱体积的平衡缓冲液平衡亲和层析柱。 第三章小鹅瘟病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立将包涵体用的尿素溶解,然后透析至刚有沉淀析出,离心、过滤蛋白,将上清缓慢上柱,蛋白与层析柱能够充分接触,以便于蛋白与层析柱的结合。倍柱体积的冲洗层析柱。倍柱体积的洗脱缓冲液冲洗层析柱。洗脱液洗脱蛋白,并将蛋白收集至管中,收集。倍柱体积蒸馈水洗漆层析柱,加入乙醇,°保存层析柱。分析洗脱蛋白的成分。此方法已被本实验室优化。鉴定因为所表达纯化的蛋白带有标签,因此可用抗的抗体进行鉴定,对表达纯化的目的蛋白用免疫印迹方法进行鉴定,具体步骤如下：⑴将表达纯化的蛋白用凝胶进行电泳。剪块膜和张滤纸,与凝胶大小一致。将膜放在甲醇溶液中约后,再转移到转印缓冲液中,并震荡一会儿,滤纸放在转印缓冲液中平衡。按正极滤纸膜凝胶滤纸负极的顺序放在转印仪上,要用玻璃棒排气泡。根据室温的不同,转印时间有所不同,一般为转印。将膜放入盛有脱脂乳封闭液的平皿中,在室温(或：孵育过夜,并不断摇动。弃去封闭液,用洗次,每次大约。将单抗按：的比例用稀释,将洗漆好的膜放入其中,平放在平缓摇动的摇床平台上于室温(或°孵育,回收稀释的抗体,放°保存。洗次,每次。羊抗鼠按的比例用脱脂乳稀释,将洗涤好的膜放入其中,于室温温孵并不断摇动。弃去二抗封闭液,洗次,每次。将试剂盒中的液、液等量混合,均勻的滴在膜表面,室温作用大约左右。将其用保鲜膜包好,并用玻璃棒赶走膜上的气泡,在暗室中用光胶片进行曝光。将曝光后光片放入显影液中显影、清水中漂洗、定影液中定影。根据胶片上条带进行分析。蛋白浓度的测定应用试剂盒进行测定,方法如下：制备标准品：按照说明书图表制备一组蛋白标准标准品,将牛血清白蛋白标准品( 小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立用双蒸水稀释到几个干净的管中,制备工作液：将试剂盒中的液与试剂盒中液按的比例混合,制备工作液。测定标准曲线：取不同稀释浓度的蛋白质标准品,加入到的管中,并向每管加入工作液,适当震荡混合均匀,°孵育,然后用分光光度计测定每个标准品在处的吸光值,并绘制标准曲线。公式：为,为蛋白总量。按上述方法测定蛋白在处的吸光值,并按公式计算。抗多克隆抗体的制备及鉴定免疫兔子将小鹅痕病毒蛋白稀释至,与弗氏完全佐剂等体积混合,充分乳化,至到滴一滴到水中不分散开来为宜,背部皮下多点注射,每点,首次免疫蛋白间隔天,进行第二次免疫时,第二次免疫蛋白取的与等量的弗氏不完全佐剂混勻,充分乳化,背部皮下多点注射每点。间隔天,进行第三次免疫,第三次免疫蛋白,方法与第二次免疫相同,但最好进行静脉注射。间隔约天,进行一次加强免疫,用不加佐剂免疫蛋白进行免疫。动物米血耳缘静脉米血采血前将兔子固定在保定架上,用酒精棉球在兔的耳缘静脉进行消毒,用注射器,在耳缘静脉缓慢抽取大约血液,采完血后,用已高压灭菌的棉球按压釆血部位,至到出血停止。心脏采血首先将兔子仰卧保定,用食指触压胸骨部,寻找心脏的具体位置,当感觉到心脏的跳动时,在入针的位置,用酒精棉进行消毒,然后将的注射器缓慢推入,与皮肤约呈度,当发现回血时,立即固定针头,然后缓慢抽血。为防止兔子粹死,可分两次抽血,每次抽约。分离血清将采的血室温放置,再放入°待然后在°、离心收集上清液(血清),放°暂时保存。抗血清的纯化 第三章小鹅痕病毒蛋多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立溶液的准备：液：：液：：液：：透析液：和使用液平衡柱子,平衡量为柱子体积的倍。血清用液稀释倍后上样,每次上样不超过。上样后,使用液洗柱,为柱子体积的倍。在个管中分别加入液(目的中和液)；使用液洗脱蛋白,将洗脱下的蛋白用前面的管接,洗脱体积为柱子体积的倍。洗脱后,跑蛋白胶鉴定,透析液透析过夜,洗去杂离子。纯化的抗体测浓度(方法如,分装备用。的鉴定取病毒液和蛋白个并加,煮沸十分钟,上样,跑蛋白胶,按照的方法进行鉴定。抗多克隆抗体免疫活性的测定以最佳抗原包被浓度包被酶标板,用间接方法检测抗多抗的免疫活性。双抗夹心方法反应条件的建立酶标反应板均一性的检测随机取条反应板,以的蛋白包被酶标板,°过夜,的封闭,用洗漆次,加入多抗°孵育取出后洗三次,加入酶标二抗体,°孵育丨,取出后洗涤次,加入显色液,反应加入终止液,检测各孔的值,计算各孔的变异系数。双抗夹心操作方法包被：以小鶴癌鸡卵黄提取物包被酶标板,每孔,：过夜,次日,弃去孔内溶液,用洗漆缓冲液洗板三次,每孔,每次。冼板：弃包被液,用洗板机洗板三次,然后拍干。封闭：每孔加入封闭液,每孔°孵育,以封闭非特异性结合位点。洗板：同步骤(。加样：加入一定稀释度待检样品,同时设置阴性对照,每孔：孵育 小搏疯病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立洗板：同步骤(。加多抗：加入一定稀释度的多克隆抗体,每孔,°孵育。洗板：同步骤(。加酶标二抗：加入新鲜稀释的酶标抗体,每孔,°孵育。洗板：同步骤(。加底物显色液：于各孔中加入现配的溶液,°孵育。终止反应：每孔加入终止液终止反应。测定值：用酶标仪在波长处测定各方应孔的值,记录结果。最佳酶标二抗的浓度的确定将羊抗兔的酶标二抗进行、、、、、、、、稀释,按照操作程序分别进行检测,比较各组的值为阳性孔的值,为阴性孔的值,以确定最佳酶标二抗稀释度。底物作用时间的确定分成个组,将显色时间设定为、、、、、按照操作程序分别进行检测,比较各组的的值和值,以确定最佳反应时间时间。包被液的选择分别用超纯水、生理盐水(、磷酸盐缓冲液,、缓冲液、碳酸盐缓冲液、氢氧化钠,溶液作为包被液将小鹅瘟鸡卵黄提取物进行稀释包被,阳性和阴性用尿囊液进行稀释,抗兔的酶标二抗进行抗稀释,进行双抗夹心测定。以为阳性孔的值,为阴性孔的值值最大为判定标准。封闭液和封闭时间的确定以小鶴瘟鸡卵黄提取物包被浓度包被酶标板,洗涤后,分成组。第组：用封闭,第组：用封闭,第组：用明胶封闭,第组：用脱脂奶粉封闭。每孔,重复孔,：下反应。按照的操作程序分别进行阴性、阳性值得的检测,比较各组的的值和值,以确定最佳封闭液。以最佳封闭液进行封闭,设立三组,封闭时间分别是、、、然后分别进行检测,比较各组的的值和值,以确定最佳封闭时间。交叉性试验取鹅的常见病原体即鹅副粘病毒,进行特异性试验。取病毒液,加入的甲醛, 第三章小鹅猛病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立°孵育,进行双抗夹心检测,并设置阴性、阳性对照,按操作程序行进检测,测定各孔的并与阴性、阳性值进行比较,以判断各毒株之间有无交叉反应。敏感性试验将传代所取得尿囊液进行、、、、、稀释,按照的操作程序进行双抗夹心方法的检测,同时设置阴性对照,根据值判断最低检测量。与检测方法的比较取实验室保存的株小鹅瘟病毒(尿囊液),用的检测引物(见第一章)进行检测,然后进行双抗夹心检测。结果基因扩增及鉴定提取的以其为模板,进行的扩增,大小约如图将、载体用、进行双酶切,然后连接转化涂板,挑菌,提质粒,进行双酶切鉴定,如图。、务★、——布《—■———一—命“————■一—■图丨的扩增与重组质粒的酶切鉴定扩增酶切鉴定 小鹤痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立蛋白的表达将重组质粒转化到表达菌种中,加入诱导剂进行表达,并且设对照组(未加诱导剂的),做两个重复,在大约处出现特异性条带,如图。…体…体。—■了有零：■±：；图蛋白的表达蛋白的纯化取洗过的包涵体,进行电泳,在大约处有明显条带,结果如图所示；取亲和层析纯化后的蛋白进行电泳,如图所示,在大约处可见目的条带。亲和层析方法对蛋白纯化的效果不如直接用包涵体洗液洗效果较好,可能是常温下蛋白易降解。 第三章小鶴痕病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立包洗涵运：參—■：》參‘眷麟：—；暴氣“▲、働禽—,广沒图蛋白的纯化结果为包涵体洗液洗过的蛋白；为过亲和层析柱纯化的结果；蛋白：纯化后收集的各管蛋白蛋白的鉴定纯化后的蛋白进行电泳,转印至膜上,进行鉴定。如图所示,在约处为纯化的蛋白。 小稱痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立；—‘■图蛋白的鉴定蛋白的浓度在的值为、、,平均值为蛋白浓度：值抗多克隆抗体的纯化及鉴定抗多抗的纯化及鉴定将抗的多抗进行亲和层析纯化,取纯化后的抗多抗进行结果如图所示,在约和处出现特异性的条带,分别对应抗体的重链和轻链。将抗多抗作为一抗,进行,结果如图所示,表明抗多抗能和蛋白、小鶴瘟病毒发生特异性的结合,抗多抗具有生物活性。 第三章小糖痕病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立續爆纖續舞令—一—；身舞讀§——产冒■釋——产图抗的多抗的纯化结果：蛋白：纯化后收集的各管蛋白：；：图抗多抗的鉴定 小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立抗多克隆抗体免疫活性的测定通过间接方法检测抗多抗的免疫活性,结果如表所示。抗的免疫效价为。表间接测定抗多克隆抗体效价抗多克隆抗体的稀释度：阴性值注：为阳性孔的值；为阴性孔的值双抗夹心方法反应条件的建立酶标反应板均一性的检测酶标反应板均一性测定结果见表。对表中的数据进行统计学分析,标准差为,平均值为,那么变异系数为：标准差平均值),标板各孔间的变异系数小于,所以完全能够满足试验的要求。表标反应板均一性测定平均值最佳酶标二抗的浓度的确定将羊抗兔的酶标二抗进行、、、、、、、、稀释,分别进行的检测,结果如图所示,横坐标分别对应着以上稀释度,纵坐标为值。结果表明最佳酶标二抗稀释度为。 第三章小鹅塩病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立——“——系列一—■上―—一一…—、飞薛标二抗樣较度图羊抗兔酶标二抗的选择底物作用时间的确定将显色时间设定为、、、、、分别进行检测,结果如表所示,最佳显色时间为。表底物作时间的选抒项目显色时间包被液的选择分别用超纯水(,、生理盐水(、憐酸盐缓冲液,,、缓冲液、碳酸盐缓冲液、氢氧化钠溶液作为包被液,按照的操作程序进行测定,结果如表,表明当包被液为值为的超纯水时,能使其产生最高的值,故选用纯水(作为包被液。 小鹅痕病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立表包被液的选择生理盐水碳酸盐缓冲液阳性值阴性值注：为阳性孔的值；为阴性孔的值封闭液的选择分别以、、明胶、脱脂奶粉作为封闭液,分别进行封闭,结果如表所示,的明胶为最佳选择。表封闭液的选择项目封闭液明胶脱脂奶粉封闭时间的确定分别以、、、四个时间进行封闭,结果如表所不,确定最佳封闭时间。表封闭时间的选择封闭时间交叉性试验用建立的双抗夹心方法进行小鹅痕病毒、鹅副粘病毒的检测,只有小癌病毒检测为阳性,而鹅副粘病毒为阴性,结果表明,抗的多抗只能与相应的抗原 第三章小鹅癌病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立反应,具有特异性。敏感性试验将传代所取得尿囊液进行、、、、、稀释,进行双抗夹心方法的检测,结果如表所示,抗原稀释度为时,仍为阳性,所以抗原的最低检测量为。表敏感性试验结果尿囊液的稀释度阴性值与检测方法的比较用检测方法鉴定株小鶴瘟病毒,见图。再将这株进行双抗夹心方法检测,结果表明检测方法检测该株病毒全为阳性,与检测结果的符合率一致,如表所示。图分离株分离株检测结果 小鹅癌病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立表双抗夹心与检测结果的比较方法检测数阳性数阳性率符合率讨论是小鹅癌病毒的主要结构蛋白,是主要的保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体,在的诊断和防治中起着重要的作用。等对的氨基酸序列进行了分析和通过与衣壳蛋白三维结构模拟比较分析发现,发现暴露于衣壳表面的氨基酸残基序列均出现在内,表明内含有的主要抗原决定族,是的主要免疫保护性抗原。已有学者证明蛋白具有个抗原表位并且具有高的保守性。有高的免疫原性。因此,具有重要的诊断价值,选择其多抗进行双抗夹心方法的可以快速诊断小鹅癌病毒的感染,也可应用于流行病学和疫情监测等方面。本研究选择了小鶴瘟病毒的主要结构蛋白为抗原,进行重组质粒的构建,原核表达蛋白,制备抗的多克隆抗体,以抗的多克隆抗体为一抗,行进双抗夹心方法的建立。目前,国内外关于小鶴癌病毒的研究较少,尤其在各毒株之间的差异研究不深。在国内外,对小鹅癌病毒的检测方法主要有琼脂扩散试验和检测方法。琼脂扩散试验是检测的经典方法,但灵敏度较低,并且需要高效的抗血清和高倍的浓缩的尿囊液,因此不宜大量检测。随着生物分子生物学的迅速发展,诊断方法以其敏感、快速、特异的特点已成为当今病毒分子生物学检测中最有应用价值和最有发展潜力的方法,但仪器设备花费高,不适用于基层防疫单位。因此,本实验利用多克隆抗体建立了双抗夹心检测方法,多克隆抗体的优点是抗原识别位点多、生产周期短、结合力强等,缺点是特异性和稳定性方面不如单抗。本实验对检测方法的包被液、封闭液、封闭时间、底物作用时间、酶标二抗的稀释度等方面进行了优化,建立了最佳的的反应条件。本研究建立的双抗夹心检测方法也存在不足,如在敏感性、特异性不高,以后可通过制备单克隆抗体来进行改进,并进行抗体方面的优化。双抗夹心对小鹅痕进行抗原水平的检测,对临床检测更有说服力。为小鶴癌的及时诊断的提供了技术支持,并为养鹅的健康发展提供了技术保障。 第三章小鹅癒病毒蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心方法的建立参考文献,,,,,：刘平黄利兩病毒重组蛋白建立诊断试剂盒的研究硕士学位论文北京：中国农业大学,沈月雷,邱平,王剑锋,等极性小分子抗原包被条件的摸索细胞与分子免疫学染志,于天飞,马波,邪明伟,等鹤细小病毒非结构蛋白和结构蛋白的二级结构及细胞抗原表位预测中国家禽,,,,, 小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立全文总结对五河某养殖厂的疑似小鹅瘟的病例进行剖检和观察,根据临床症状和病理变化,作出初步诊断,采集病料,进行方法鉴定,在处有特异性条带；通过病毒的增殖,对致死鹅胚的观察,血凝试验,琼脂扩散试验,动物回归试验,确定该病毒为,并将该毒株命名为。将的全基因进行扩增,进行全基因序列的比对,确定了株在遗传进化中的地位。将与质粒进行重组,进行重组质粒—的表达；进行抗多克隆抗体的制备,通过鉴定该多克隆抗体有免疫原性,并通过间接方法确定该抗体的效价为。利用抗多克隆抗体进行检测方法的建立,并从包被液、封闭液、封闭时间、底物作用时间、酶标二抗的稀释度等方面进行了优化。通过交叉试验、敏感试验验证了所建立的双抗夹心方法的可行性,并与检测方法相比较,符合率为。 附录一附录一中主要试剂的配制电泳缓冲液：甘氨酸加至上样缓冲液：溴酸蓝甘油加入至并混匀,等量分装成丁°贮存备用。丙烯酰胺单体贮液：丙烯酰胺双甲叉丙烯酰胺加至完全溶解后过滤,棕色瓶°保存备用。：调为加至°保存备用。：调为,加至保存备用。：加至,°温水温浴溶解,而后存于室温备用。过硫酸按：过硫酸铵加至冻存于。备用。 小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建立甘氨酸凝胶的配方分离胶(丙烯酰胺溶液过硫酸铵分离胶(丙烯酰胺溶液过硫酸铵浓缩胶丙烯酰胺溶液过硫酸铵用试剂包被液(碳酸钠缓冲液)：无水去离子水加至洗涤液磷酸盐缓冲液)： 附录一吐温去离子水加至封闭液：明胶显色液：无水乙醇终止液：去离子水分析中主要溶液的配制：转移缓冲液：甘氨酸碱甲醇至总量为。缓冲液：缓冲液：缓冲液加封闭液：脱脂乳的缓冲液其他常用试剂的配制培养基的配制：胰化蛋白胨酵母提取物加至摇匀后用°高压蒸汽灭菌后室温放置备用 附录二附录二 小鹅瘟病毒株的分离鉴定及其双抗夹心检测方法的建」丁 附录二丁丁丁丁 致谢致谢衷心感谢导师茅翔教授两年来在学业上的谆谆教诲和生活上的关心呵护。导师渊博的科学知识、严谨求实的科学态度和坚持不懈的敬业精神都是我学习的榜样。本论文从选题到实验再到文章撰写的过程中无不凝聚着导师大量的心血,在此论文完成之际深深地感谢我的导师。衷心感谢张训海教授、王旋老师在平时指导中所给予的深切期望、大力支持和亲切关怀。他所提供的宽松环境和精心指导是我完成论文的重要条件。我不但从他们身上学到许多科学知识,而且他们甘为人梯的高尚品德、严谨的科学态度也是我学习的榜样。感谢家禽疫病防控监测安徽省重点实验室的龚争老师、胡元庆和赵磊老师。感谢他们在实验和生活中给予我的关心、指导和帮助。感谢黄丽、李晨、孙明霞、、尼博、郝洪平、王蕊、李鹏鹏、于亚玲、胡晓春、花婷等师兄师姐的热情指导。感谢王月、葛玲玲、杨骁等同学的无私帮助。感谢王新、李佳荣、周胜、张怀康、陶裴裴、李尚德、纪锋等诸位学弟学妹对我的支持和帮助。在南农学习和生活的两年中,传染病组的许多老师和同学在我学习、研究工作中都曾给予了极大的帮助和热情的指导,在此衷心地说声谢谢！我要深深的感谢我的父母和家人。一直以来,你们给予我的鼓励和支持,使我敢于去面对和克服学习与生活中的困难,披荆斩棘,勇往直前！焉得谖草,言树之背,养育之恩,无以回报,你们永远健康快乐是我最大的心愿。最后,向所有给予我关心和支持的人们表示深深的感谢！郇长超二零一三年三月