猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株的分离鉴定、全基因序列测定及分析

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河南农业大学学术硕士学位论文题目猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株的分离鉴定、全基因序列测定及分析学位申请人姓名李炎林导师姓名田克恭学科专业预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治中国郑州2018年06月 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目：猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株的分离鉴定、全基因序列测定及分析英文题目：IsolationandIdentificationofNADC30-likePorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusstrainsandSequencingandanalysisofWholeGenomes学位申请人：李炎林导师：田克恭专业：预防兽医学研究方向：动物传染病诊断与防治论文提交学位授予日期：日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书＾学位论猪繁殖与呼吸综合征病毒类ＮＡＤＣ３０毒株学位文题｜｜人目病毒分离、全基因序列测定及分析类别麵兽医；田克恭ＳＩＩＳＩｔｉｌ｜学位论文否如需保密，解密时间年月日独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得研宂成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一，指导教师对此进行了审定。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。特此声明。研宄生签名：导师签名：＾木访錄日期：年《月Ｉ日日期年＆／日学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同、传播学位论文的全部或部分内容媒体上发表。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业大学后一，就在校署期间从事的科研工作，发表的所有论文第名单位为河南农业大学，、、试验材料原始数据申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，承。，否则担相应的法律责任：。注保密学位论文在解密后适用于本授权书研签名导究生师签名学院领导签名：１曰期：日年月日期：年日：月曰期年月日 致谢光阴似箭，一去不返，研究生的三年学习生涯即将结束。抚今追昔，与三年前的自己相比，判若两人。回忆起来三年的研究生生活，有快乐，有压力，有悔恨，也有不舍。在这三年里，除了完成学业之外，在人格独立，工作执行能力，沟通能力，抗压能力等各个方面得到了很大的提高。而这些发自内心感受到的成长正是因为老师、同学的无私的帮助，在此向你们表达最衷心的感谢和最诚挚的谢意。首先感谢我的导师田克恭教授对我在学业和生活上无微不至的帮助，田老师渊博的知识、严禁的治学态度、宽厚仁爱的胸襟令学生铭感终生。在这三年的学习过程中，田老师不仅教授了我做学问的技巧，还传授了我做人的准则，在此衷心的向导师致以崇高的敬意和衷心的感谢！还要特别的感谢李向东博士、谭菲菲博士对我平时实验和生活的关心和照顾，感谢他们为我课题选题、方案设计、推进以及论文撰写提供的大力帮助，感谢他们在百忙之中对我的论文进行指导修改。同时感谢他们为我在工作态度、职业修养、以及敬业精神方面提供的指导，这必定会有益于我未来的职业道路。同时，感谢国家兽用药品工程技术研究中心这个平台，这里提供给我的良好的实验条件以及先进的仪器设备，保证了我课题的顺利进行。感谢国家兽用药品工程技术研究中心基因工程室王同燕主任在生活、研究以及学习方面给予的帮助和支持。感谢姬郭彪、李英英、张超林、相双双、代珊、颜世君、闪伊红、李伟国、汪志艳、孙哲、杨青原、吴洪超等师兄师姐在实验过程中提供的无私的帮助。非常感谢同一课题组的李玉芳、徐晓东和师兄常亚飞，师弟张帅、邢广源、刘攀、邓跃和师妹张霞、王妍在工作中给予的协助和无私的帮助，感谢他们对整个课题组的做出的贡献，同时感谢刘鹏飞、周金龙师兄给予的指导和帮助！由衷的感谢参加我论文评阅和答辩的各位专家教授的指导；感谢同班同学给予的帮助和支持，感谢2015级全体研究生同学。感谢我的母校河南农业大学提供的良好的学术氛围和生活条件，再此对母校的所有领导和老师表示深深的谢意。最后，再一次衷心的感谢所有支持、爱护我的老师、家人、朋友和同学们，谢谢你们对我的帮助和支持！ 目录中文摘要...........................................................................................................................................1英文缩略表.......................................................................................................................................3第一章文献综述.............................................................................................................................41.1PRRSV病原学特点..................................................................................................................41.1.1PRRSV分类及理化性质........................................................................................................41.1.2抗原性......................................................................................................................................51.1.3体外培养特性.........................................................................................................................61.1.4病毒基因组结构特征.............................................................................................................61.1.5病毒主要编码的蛋白.............................................................................................................71.1.5.1PRRSV非结构蛋白.............................................................................................................71.1.5.2PRRSV结构蛋白.................................................................................................................81.2流行病学.....................................................................................................................................91.3PRRSV的致病机理.................................................................................................................101.4我国PRRSV的变异演化及其分子机制...............................................................................101.5PRRSV的诊断与检测技术.....................................................................................................101.5.1血清学诊断方法....................................................................................................................111.5.2分子生物学诊断方法............................................................................................................121.6猪繁殖与呼吸综合征疫苗.......................................................................................................121.6.1灭活疫苗................................................................................................................................131.6.2减毒活疫苗............................................................................................................................141.6.3DNA疫苗..............................................................................................................................141.6.4亚单位疫苗............................................................................................................................141.6.5活载体疫苗...........................................................................................................................15第二章PRRSV分型PCR方法的建立.........................................................................................16 2.1引言...........................................................................................................................................162.2材料与方法..............................................................................................................................162.2.1材料........................................................................................................................................162.2.1.1病毒及细胞.........................................................................................................................162.2.1.2主要试剂............................................................................................................................162.2.1.3培养基与抗生素的配制....................................................................................................172.2.1.4主要设备.............................................................................................................................182.2.2方法........................................................................................................................................182.2.2.1区分PRRSV类NADC30、HP-PRRSV和经典毒株的RT-PCR引物设计...................182.2.2.2样品的准备.........................................................................................................................182.2.2.3提取核酸.............................................................................................................................182.2.2.4反转录.................................................................................................................................192.2.2.5RT-PCR鉴别检测方法的建立及条件优化.......................................................................192.2.2.6PCR产物基因序列测序....................................................................................................202.2.2.7PCR鉴别检测方法的特异性实验....................................................................................212.2.2.8RT-PCR鉴别检测方法的敏感性实验..............................................................................212.2.2.9区分PRRSV类NADC30、HP-PRRSV和经典毒株的RT-PCR临床样品检测结果..212.3结果与分析...............................................................................................................................212.3.1RT-PCR鉴别检测方法的反应体系优化结果.....................................................................212.3.2RT-PCR鉴别检测方法的PCR产物测序鉴定...................................................................212.3.3RT-PCR鉴别检测方法的特异性实验结果.........................................................................222.3.4RT-PCR鉴别检测方法的敏感性试验结果.........................................................................222.3.5分型RT-PCR临床样品检测结果........................................................................................232.4讨论..........................................................................................................................................23第三章2016-2017年河南省及周边部分地区PRRSV分子检测及nsp2、ORF5基因变异分析........................................................................................................................................................253.1引言...........................................................................................................................................25 3.2材料与方法..............................................................................................................................253.2.1材料........................................................................................................................................253.2.1.2主要试剂.............................................................................................................................253.2.1.3主要仪器设备....................................................................................................................253.2.2方法.......................................................................................................................................253.2.2.1PCR引物............................................................................................................................263.2.2.2样品的准备........................................................................................................................263.2.2.3提取核酸.............................................................................................................................263.2.2.4反转录................................................................................................................................263.2.2.5病原检测及GP5、nsp2基因扩增、克隆与序列测定..................................................263.3结果与分析...............................................................................................................................273.3.1病原检测结果.......................................................................................................................283.3.2nsp2及ORF5的扩增结果.................................................................................................293.3.3nsp2基因的变异特征..........................................................................................................293.3.4ORF5基因的变异特征.........................................................................................................333.4讨论...........................................................................................................................................383.5小结...........................................................................................................................................38第四章类NADC30毒株的分离与鉴定.....................................................................................404.1引言...........................................................................................................................................404.2材料与方法..............................................................................................................................404.2.1材料.......................................................................................................................................404.2.1.1病料的收集........................................................................................................................404.2.1.2细胞....................................................................................................................................404.2.1.3主要试剂.............................................................................................................................414.2.1.4主要仪器设备....................................................................................................................414.2.2方法.......................................................................................................................................424.2.2.1PCR引物的设计................................................................................................................42 4.2.2.2样品的准备........................................................................................................................424.2.2.3PRRSV的分离与培养.......................................................................................................424.2.2.4PRRSV的分离病毒的检测...............................................................................................424.3结果与分析..............................................................................................................................444.3.1PRRSV分离培养结果...........................................................................................................444.3.2PRRSV的分离病毒的检测..................................................................................................454.3.2.1RT-PCR检测......................................................................................................................454.3.2.2IPMA鉴定..........................................................................................................................454.4讨论...........................................................................................................................................464.5小结...........................................................................................................................................46第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因序列测定与分析.......................................................475.1引言..........................................................................................................................................475.2材料和方法...............................................................................................................................475.2.1材料.......................................................................................................................................475.2.1.1病毒样品.............................................................................................................................475.2.1.2主要试剂.............................................................................................................................485.2.2方法........................................................................................................................................485.2.2.1引物设计.............................................................................................................................485.2.2.2分子生物学分析软件.........................................................................................................505.2.2.3RNA提取与PCR扩增、克隆及测序...........................................................................505.2.2.4全基因序列同源性分析.....................................................................................................505.2.2.5全基因序列遗传进化分析.................................................................................................505.2.2.6序列重组分析....................................................................................................................505.3结果与分析..............................................................................................................................505.3.1全基因扩增............................................................................................................................505.3.2同源性分析............................................................................................................................505.3.320株类NADC30毒株的全基因序列遗传进化分析..........................................................51 5.3.4类NADC30毒株基因重组分析.........................................................................................525.4讨论..........................................................................................................................................535.5小结..........................................................................................................................................53第六章结论...................................................................................................................................54参考文献.........................................................................................................................................57Abstract.........................................................................................................................................68 中文摘要本研究旨在对类NADC30毒株进行病毒分离和全基因组测序，了解类NADC30毒株的分子特征和遗传进化情况，对类NADC30毒株进行深入的研究。同时对河南及周边地区流行的PRRSV毒株的ORF5及nsp2的基因变异情况进行检测，揭示PRRSV毒株的最新流行动态，以期为临床诊断、新疫苗的研发及抗病毒药物的研发提供科学的参考依据。一、PRRSV分型PCR方法的建立为了更快捷准确地对类NADC30毒株进行检测，本实验针对PRRSV类NADC30毒株、HP-PRRSV毒株、经典PRRSV毒株在nsp2区域分别缺失131个氨基酸、30个氨基酸无缺失这一分子特征，设计一对引物建立PCR方法对这3类毒株进行分型。本实验完成该RT-PCR方法的建立，及敏感性和特异性的验证，并对临床样品进行检测。实验结果证明：该方法能够同时将经典PRRSV毒株、HP-PRRSV毒株以及类NADC30毒株这三种类型的毒株进行区分，并具有良好的敏感性和特异性。二、对2016-2017年河南省及周边地区的PRRSV的分子检测，及ORF5、nsp2基因的变异分析本研究对756份临床样品进行RT-PCR检测，共检出阳性样品139份，阳性率18.4%，扩增得到42个nsp2序列和50个GP5序列，遗传进化表明，河南地区的流行株主要为美洲型毒株，其中有20份与NADC30毒株高度同源，且在nsp2区域有131个氨基酸的不连续缺失。其余的22份序列与HP-PRRSV高度同源，均在nsp2区域有30个氨基酸的不连续缺失。与2016年相比，2017年河南及周边地区类NADC30毒株的比例急剧增加，且PRRSV流行毒株的GP5和nsp2均发生了很大的变异，因此有必要对PRRSV流行和变异进行持续的检测，以期为临床诊断和疫病防控提供科学的参考依据。三、20株类NADC30样品的分离与鉴定对检测为类NADC30的样品接种PAM细胞进行病毒分离，共分离获得20株类NADC30毒株，RT-PCR鉴定结果表明分离到的毒株均能扩增出目的条带，IPMA鉴定结果表明分离到的样品均PRRSV阳性。四、PRRSV类NADC30毒株全基因序列测定及分析本研究获得了20株类NADC30毒株的全基因序列，并对其进行遗传进化分析及同源性分析。分析结果显示：20株全基因组核苷酸之间的同源性86.8%-93.8%，与VR2332的同源性为85.1%-88.2%，与CH-1a的同源性为84.2%-90.8%，与NADC30的同源性为88.3%-96.7%，与JXA1的同源性为83.5%-93.0%。遗传进化表明，19株毒株属于第5亚型，1株属于第4亚型。对20株毒株进行重组分析结果表明19株发生重组，1株未发生重组，重组位置多发生在非结构蛋白，重组毒株以HP-PRRSV毒株为主。本研究为深入研究类NADC30毒株在中国的变异和遗传进化提供了参考。1 关键词：PRRSV;nsp2基因；ORF5基因；HP-PRRSV毒株；类NADC30毒株；变异；重组2 英文缩略表缩写英文名称中文名称Ampampicillin氨苄青霉素ADEantibodydependentenhancement抗体依赖性增强作用bpBasepair碱基对cDNAcomplementary互补DNAdday天DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸EAVEqinearterivirus马动脉炎病毒E.coliEscherichiacoli埃希式大肠杆菌FBSfetalbovineserum胎牛血清ggramorunitofgravityforce克或离心力单位hhour小时IPMAimmunoperoxidasemonolayerassay免疫过氧化物酶单层细胞试验IPTGIsopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代半乳糖苷kbkilobasepair千碱基对Lliter升minminute分钟mLmilliliter毫升molmole摩尔ntnucleotide核苷酸ORFOpenreadingframe开放阅读框PAMporcinealveolarmacrophages猪肺泡巨噬细胞PCRPolymerasechainreaction多聚酶链式反应PPRSporcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征syndromePPRSVporcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征syndromevirus病毒rpmrevolutionsperminute转/分钟RNAribonucleicacid核糖核酸RPMI-1640RoswellParkMemorialInstitute-1640RPMI-1640培养基RTreversetranscription反转录Ssecond秒UTRUntranslatedRegions非翻译区X-gal5-Bromo-4-chloro-3-indolyl5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-β-D-galactoside半乳糖苷3 第一章文献综述猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)感染引起的一种以怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍和仔猪、育肥猪呼吸系统紊乱和生长迟缓为主要症状的高度接触性传染病，是严重危害养猪业的传染病之一[1-2]。该病于1987年和1991年首次出现在美国和荷兰[3-4]，随后在多个国家被报道出现[5]。在1991和1992，Wensvort和Collins等分别用猪肺泡巨噬细胞（porcinealveolarmacrophage，PAM）以及传代细胞系CL2621分离到PRRSV，分别命名为Lelystandvirus（LV）和ATCC-VR2332。在此之后该病在各地广泛流行，在世界范围内给养猪业带来了巨大的经济损失[6-7]。1992年，国际猪病学术会议将其正式统一命名为“猪繁殖与呼吸综合征”。根据毒株间的基因组特性，PRRSV可以分为两个基因型，即以VR2332株为代表的美洲型和以LV株为代表的欧洲型[8-9]。1996年，郭宝清等人在国内疑似发病猪群首次分离出PRRSV，并命名为CH-1a，从而证实PRRS在我国的存在[10]。耳部皮肤发绀是该病在临床上的一个标志性特征，因此俗称“蓝耳病”。随后，该病在我国各地广泛传播，成为影响我国养猪业重大的疫病之一。2006年春末夏初，临床以“三高”（持续高热、高发病率和高死亡率）为特征的一种新型传染病在我国的江西、浙江、江苏、安徽等多个省份出现。该病发展迅猛、发病率高、死亡率高、传播快、治愈率低，不到半年便传遍我国的大部分地区，给我国的养猪业带来巨大的经济损失。对采集的临床样品进行病理学、免疫组化检测和动物实验，证实高致病性PRRSV（HP-PRRSV）为本次猪“高热病”疫情的病原[11]。2012年起，一类具有非常独特的遗传背景，与2008年在美国分离到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV毒株在我国养猪场广泛发现，命名为PRRSV类NADC30株，已对我国养猪业造成一定的经济损失[12-13]。1.1PRRSV病原学特点1.1.1PRRSV分类及理化性质PRRSV属于尼多病毒目（Nidovirales），动脉炎病毒科（Arteriviridae），动脉炎病毒属（Arterivirus），同属于该属的病毒还有鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（Mouselactatedehydrogenaseincreasevirus，LDV）、马动脉炎病毒（Arteritisvirus，EAV）以及猴出血热病毒（Monkeyhemorrhagicfevervirus，SHFV）[14]。该属病毒存在的一个共同特点是不断的发生变异和重组，从而导致病毒的多样性显著[15-16]。PRRSV属于单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球形，直径约50-65nm，有囊膜结构，表面有明显的纤突。核衣壳直径约为25~30nm，4 呈二十面体对称，结构见图1-1，内部含有病毒核酸[17]。病毒粒子在pH6.5-7.5环境中相对稳定，而在小于pH6.5或大于pH7.5的条件下则会丧失感染力[18-19]。PRRSV热稳定性差，对干燥及高温条件特别敏感，在56℃放置45min或者37℃条件下放置48h即可失去活性。病毒在低潮的环境下可长期保存，可在-70℃保存一年左右，并表现出良好的稳定性。病毒粒子易溶于有机溶剂，对乙醚和氯仿等脂溶剂比较敏感，其在氯化铯和蔗糖梯度中的浮密度分别为1.19g/cm3和1.14g/cm3[20]。PRRSV不凝集哺乳动物（猪、羊、牛、马、山羊等）和禽类（鸡和鸭）的红细胞，没有血凝活性，但经非离子去垢剂和脂溶剂处理后，可凝集小鼠的红细胞。图1-1PRRSV粒子示意图[21]Fig1-1SchematicstructureofPRRSV[21]1.1.2抗原性PRRSV虽然与动脉炎病毒属的其它成员在遗传关系方面具有一定的亲缘关系，但是在血清学上没有交叉反应，目前仍未发现PRRSV具有不同的血清型。不同年代，不同地域分离到的PRRSV在抗原性、基因序列和致病性方面存在一定的差异。根据遗传进化的差异，目前将PRRSV分为两种基因型，分别是以Lelystadvirus（LV）为代表的欧洲型和以VR2332为代表的美洲型。两种类型的毒株基因组同源性仅为60%左右[22]，M蛋白和N蛋白在两种基因型间相对比较保守，氨基酸的同源性分别为79%~81%和66%~68%。而非结构蛋白nsp2以及结构蛋白GP5和GP3差异较大，其氨基酸的同源性分别为30%~33%、57%~60%和55%~59%，因此常将非结构蛋白nsp2、结构蛋白GP5和GP3作为流行病学调查的对象，在疾病防控和了解病毒的变异趋势方面发挥着重要的作用[23-25]。欧洲型主要在欧洲大部分国家流行，也有相关报道在部分北美和亚洲国家出现。美洲型主要在美洲和亚洲地区流行。我国PRRSV流行主要是以美洲型为主，先后出现经典株5 （C-PRRSV）、HP-PRRSV以及类NADC30毒株。PRRSV变异速度快且易发生重组，继而导致不同毒株的抗原性和毒力均存在一定的差异[26-29]，大量事实表明，PRRSV在流行的过程中不断地发生变异，遗传多样性趋于复杂化，重组现象趋于常态化，在同一个亚型中存在多种不同的进化分支。1.1.3体外培养特性PRRSV具有严格的宿主范围，在猪体内，最早人们发现其能在猪肺泡巨噬细胞中生长[30]，后来实验证明病毒感染公猪之后还能在公猪的睾丸细胞和精母细胞中生长[31]。在猪体外，同时能够在非洲绿猴肾传代细胞CL2621、MA104及其克隆株Marc-145细胞中增殖[32-34]，但是PRRSV不能在鸡胚及以下细胞增殖：猪的肺和呼吸道上皮细胞、心和肾的内皮细胞、骨髓、甲状腺和牛的上皮等原代细胞，以及鸡的内皮和鸡胚成纤维细胞。除此之外也不能在许多传代细胞上增殖，如猪的鼻甲骨、PK-15、Vero、BHK-21、MDCK、CRFK等也不能支持PRRSV的增殖。在PRRSV出现早期，传代细胞MA104很难对PRRSV进行分离。由于PAM是PRRSV重要的靶细胞，因此利用该细胞容易进行PRRSV病毒分离，包括难以分离的毒株。病毒在PAM上增殖快，病变（cytopathiceffect，CPE）出现较早（1~4天），主要表现为细胞圆缩、聚集、崩解。但是在CL2621及Marc-145病变较慢，主要表现为细胞变圆、皱缩、细胞核固缩、最后崩解脱落。虽然不同的PRRSV对PAM细胞具有较高的亲嗜性，但是由于PAM细胞制备成本较高且技术复杂，并且日龄及个体差异都会影响所制备细胞的敏感性。而大多数PRRSV都对Marc-145细胞具有较高的敏感性，且病变明显，成本适宜，因此Marc-145细胞在PRRSV流行毒株的分离鉴定及致病性等方面有更为广泛的应用。2006年爆发的PRRSV变异株HP-PRRSV对Marc-145细胞有很强的适应能力，2-3代在就能适应Marc-145并可产生明显的病变。而2015年在我国爆发的类NADC30毒株，部分毒株能在Marc-145上增殖，而部分无CPE，这种现象背后的机理有待继续研究。1.1.4病毒基因组结构特征PRRSV为有囊膜的RNA病毒，其基因组为单股正链，不分节段，全长大约15kb。基因组5'端有“帽子”结构和非编码区（5'Untranslatedregion,5'UTR），3'端有Poly（A）尾巴以及非编码区（3'Untranslatedregion,3'UTR）。基因组含有至少10个开放阅读框（ORFs），如图1-2，多数相近的ORF之间有部分重叠。5'端有一段非编码序列（5'Untranslatedregion,，5'UTR），紧接着是ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7以及3端非编码区。ORF1a和ORF1b长约12kb，约占整个全基因组总长度的80%，编码病毒复制必须的RNA依赖的RNA聚合酶和复制酶等非结构蛋白。PRRSV基因组的转录和表达是通过形成一系列6 亚基因组mRNAs来进行的。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5、ORF6、ORF7依次编码病毒的结构蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5、GP5a、M、N。GP2-GP5是PRRSV的糖基化结构蛋白，M和N是病毒的非糖基化结构蛋白，M是非糖基化的囊膜基质蛋白、N是核衣壳蛋白[35]。图1-2PRRSV的基因组结构[21]Fig1-2ThegenomicstructureofPRRSV[21]1.1.5病毒主要编码的蛋白1.1.5.1PRRSV非结构蛋白，PRRSV的非结构蛋白位于5端，由约占病毒基因组2/3的ORF1编码。ORF1由两个ORF组成：ORF1a和ORF1b，分别编码pp1a和pp1ab。正常翻译产生的pp1a后来被水解为10个非结构蛋白（nsp1α，nsp1β，nsp2，nsp3，nsp4，nsp5，nsp6，nsp7α，nsp7β，nsp8）。其中四个非结构蛋白（nsp1α，nsp1β，nsp4，nsp6）具有水解活性。nsp1α和nsp1β具有类木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶活性，可以介导自身从多聚蛋白上切割下来。Nsp2是整个病毒最大的非结构蛋白，也是欧洲型PRRSV与美洲型PRRSV差异最大的蛋白，氨基酸相似度不超过40%。Nsp2具有高度的变异性、免疫原性及切割Nsp2/Nsp3活性等多种特性。其至少含有5个结构域：N端半胱氨酸蛋白酶结构域（PLP2），2个高变区（HVs），跨膜区（TMs）及C端区域。Nsp2的高变区可以承受100aa-300aa缺失，最多可承受400aa的缺失[36]。研究表明：Nsp2蛋白的变异会导致毒株多样性的显著，在病毒的遗传进化过程中发挥着重要的作用，因此常用于PRRSV的流行病学调查和检测新毒株的出现。Nsp4含有3C蛋白酶结构域（3C-Likeserineproteinases,3CLSP），具有蛋白水解酶活性，能够对多聚蛋白酶进行加工，同时具有IFN抑制作用和引起细胞的凋亡[37-38]。Nsp9编码RNA依赖性RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase，RdRp），且不同毒株间的保守性很高，阐明其功能对动脉炎病毒RNA合成机制和抗病毒药物或疫苗的研发具有非常重要的作用[39]。Nsp10是重要的RNA解旋酶（RNAhelicase），包含有锌指结构（Zincfinger，ZF），ZF包含13个很保守的组氨酸和半胱氨酸残基，是维持ATPase和解旋酶活性所必需的[40]。Nsp11具有内切核糖核酸酶活性（Endoribonucle-ase，NendoU），目前NendoU只在尼多病毒目中出现，还未在其它病毒中发现，因此NendoU核酸内切酶被认为是套式病毒目的遗传标志[27]。Nsp12的变异较大，目前研究发现该蛋白仅在冠状病毒、动脉炎病毒中存在[41]。7 1.1.5.2PRRSV结构蛋白GP2a是由ORF2a编码的糖基化膜蛋白，含有两个高度保守的糖基化位点，可通过二硫键与其它蛋白形成多聚体，在病毒入侵的过程中起到非常重要的作用。该蛋白粒子在PRRSV中含量非常很少且诱导产生的免疫原性较差，因此很难从病毒裂解液中检测到该蛋白。E蛋白是新发现的一个结构蛋白，为糖基化非疏水性囊膜蛋白，由ORF2b编码，研究表明E蛋白可能与其它蛋白形成聚合体参与病毒颗粒的组装，还可能是介导细胞嗜性的关键蛋白[42-43]。GP3是由ORF3编码的高度糖基化蛋白，分子量40-50KDa，有7个N-糖基化位点，这些糖基化位点在不同的毒株中十分的保守。VR2332和LV株中的ORF3全长分别为765nt和798nt，分别编码254aa和265aa，两种基因型GP3的氨基酸同源性低于55%，它的膜拓扑结构还处于推测的过程中[44]。研究表明，在LDV中GP3为非结构可溶性蛋白，能够从感染的细胞中分泌出去。而在EAV中清楚表明其被组装进病毒粒子。GP4是一种N-糖基化蛋白，分子量31-35KD，共含有四个保守的糖基化位点。GP4含有5'信号序列，胞外区、C末端跨膜区和胞浆尾。VR2332和LV两种基因型的GP4蛋白同源性为70%，同时在GP4均存在中和表位，产生的中和抗体水平较低。GP5蛋白分子大小为25KD，由ORF5编码，是所有结构蛋白中变异最为显著的糖基化囊膜蛋白。PRRSV欧洲型的GP5共有201个氨基酸，美洲型有200个氨基酸，包括N信号肽区域、诱骗表位（Decoy）、中和表位（PNE）、两个高变区（HVRs）及三个跨膜区。欧洲型LV含有2个相对保守的糖基化位点分别为N46和N53，美洲型VR2332含有4个相对保守的糖基化位点分别为N30，N33（有些毒株是N34或N35），N44，N51。其中位于胞外区的2个糖基化位点（N44和N51）高度保守，且N44与病毒的复制密切相关。研究表明，在GP5的膜外结构域存在一个非中和表位A和中和表位B，但是B不是免疫优势表位(immunodominant)，非中和表位A虽然具有高变异性，但却为优势免疫表位。感染PRRSV的猪首先产生抗表位A的抗体，然后产生中和表位B的抗体，因此认为抗表位A可能是一个诱饵(decoy)，延缓中和抗体的产生[45]。PRRSV的主要抗原表位位于GP5的N端，蛋白内的诱骗表位以及数量不等的糖基化使重要的中和抗原位点变得不明显，从而阻止了中和抗体的产生，以及PRRSV抗原与中和抗体的反应[46]。M蛋白是非糖基化的膜基质蛋白，由ORF6编码，含有三个疏水性跨膜区，在病毒出芽和装配的过程中起着十分重要的作用。M蛋白在欧洲株和美洲株都是最保守的蛋白，主要聚集在粗面内质网上，与主要结构蛋白GP5形成异源二聚体，共同组装进病毒粒子[47]。M蛋白有16个氨基酸暴露在病毒表面，这可能与病毒的结合有关。同时，在PRRSV感染8 后10天即可在猪的血清中检测出针对M蛋白的抗体反应，表明该蛋白具有很强的免疫原性。目前M蛋白的功能还不清楚，可能在病毒组装，维持病毒形态中发挥着重要的作用。N蛋白即核衣壳蛋白，非糖基化，分子量14-15KD，由ORF7编码，为碱性、亲水、不含信号肽的的结构蛋白。N蛋白相对保守，在欧洲型和美洲型间的同源性较高，分别达到了94%以上和96%以上，但是欧洲型与美洲型之间的同源性较低，仅为63%。N蛋白是PRRSV主要的免疫原性蛋白，在感染第六天即可检测出针对N蛋白的抗体，但是针对N蛋白的血清抗体及单克隆抗体均为非中和抗体。快速产生抗体的原因可能与N蛋白在病毒粒子中的含量有关，N蛋白是病毒粒子中含量最高的蛋白，占总量的20%-40%。在病毒感染初期，N蛋白可诱导机体产生高水平的非中和抗体，且持续时间较长，因此在生产的过程中常根据N蛋白的免疫特性来建立诊断方法并对猪群进行抗体水平检测[48,49]。1.2流行病学现在PRRSV几乎流行在全球所有的养猪国家，许多国家包括美国已将将其列为危害最大的传染病。目前国际兽疫局（OIE）已经将其列为B类传染病，我国也将其列为二类疾病。猪是PRRSV唯一的天然宿主，不同性别年龄、品种的猪均可发生感染，但以妊娠母猪和初生猪的症状最为明显，育肥猪一般耐过，不表现临床症状。目前尚未发现其它物种感染PRRSV。发病猪和带毒猪是PRRSV的传染源，耐过猪在临床症状消失8周后可长期带毒并不断向外界排毒。病毒可通过鼻涕、唾液、乳汁、粪便、胎儿、尿和子宫以及公猪的精液向外排毒[50-53]。研究表明，这种排毒具有间歇性。PRRSV具有高度的感染性，可以通过口、眼、鼻、阴道等多种途径感染猪，导致其广泛分布并具有很强的感染性。PRRSV主要的传播途径是呼吸道水平传播和垂直传播[54]。怀孕母猪感染病毒之后可经胎盘直接将病毒传染给胎儿，从而导致母猪在妊娠的后期产弱胎、死胎、木乃伊胎。公猪感染本病后可以长期带毒，研究表明感染后的公猪可长期带毒长达43天，因此PRRSV可经过精液在猪群中水平传播，同时人工授精则使本病毒传播范围进一步扩大。此外，空气传播也是本病传播的一个重要的作用。持续感染也是PRRSV流行病学上的一个重要的特征，研究表明攻毒后210天尚能在猪体内检测到PRRSV的RNA，在PRRSV爆发一年后猪体内还能检测到抗PRRSV的抗体，这表明在猪群中存在持续感染现象[55]。与此同时，猪场的环境条件差，环境恶劣，养殖密度高等条件均会促进本病的流行，发病猪多继发有其它疾病，且PRRSV的亚临床感染比临床感染更为普遍。PRRSV目前没有特效药治疗，猪群一旦感染即成为疫源地。不同阶段的猪感染率不同，病猪可长期排毒，即使症状消失，也持续排毒，一般可达2-3月左右。9 1.3PRRSV的致病机理猪肺泡巨噬细胞（porcinealveolarmacrophagesPAM）是病毒入侵的关键，PRRSV通过GP5蛋白借助唾液黏附素等受体完成与PAM受体的结合，通过内吞作用进入细胞内，PRRSV在细胞内不断增殖，最终导致全身的淋巴结感染和病毒血症的发生并造成组织器官损伤，从而导致全身的免疫系统的崩溃。在整个入侵经过血液进入全身并造成组织器官损伤的过程中，PRRSV的变异、免疫抑制、持续感染以及PRRSV抗体依赖性增强作用（antibodydependentenhancementADE）等特性起着重要的作用。研究表明，PRRSV的基因组保守性很低，除了M蛋白和N蛋白之外，其余均易发生变异，另外临床表现上，由于不同PRRSV导致的繁殖障碍以及呼吸道症状均不太相同，可以判定PRRSV不同毒株之间的致病性差异较大。另外由于PRRSV具有较强的变异性，导致机体识别PRRSV和免疫应答的能力降低，从而导致PRRSV能够逃避机体的先天性免疫识别以及细胞毒性T细胞的杀伤作用。PRRSV感染猪后，T细胞的亚型中，CD4+细胞数目减少，CD8+增加，CD4+/CD8+呈下降之势。PRRSV感染之后会引起免疫抑制，进而导致猪伪狂犬病毒、猪圆环2型、猪细小病毒等继发感染。PRRSV可以导致感染的细胞凋亡，但是凋亡的机制和感染机理暂时还不清楚[56-58]。1.4我国PRRSV的变异演化及其分子机制目前我国主要的流行毒株为美洲型。1996年在华北地区首次分离到第一株PRRSV，并命名为CH-1a。全基因遗传进化表明该毒株与VR2332差异较大，无法证明该毒株是来自北美还是我国本土。2000年在我国分离到的BJ-4毒株基因与VR2332毒株的同源性高，分析表明其可能是由于引种等原因从北美传入。与CH-1a遗传关系较近的HB-1(sh)/2002和HB-2(sh)/2002毒株，演化关系分析表明HB-1(sh)/2002是CH-1a与HP-PRRSV的中间过渡毒株[59]。2006年我国爆发HP-PRRSV，极高的临床发病率和死亡率给我国养殖业带来了极大的损失，该毒株与经典PRRSV相比在nsp2不连续缺失了30个氨基酸，尽管研究表明缺失与致病性无关[60]，但是nsp2高频的遗传变异情况仍具有重大的研究价值。通过对大量的HP-PRRSV全基因序列的分析表明：HP-PRRSV是由早期的PRRSV基因组变异、经过重组突变而来[61]。2012年，周峰等[62]首次发现与NADC30毒株的高度同源的新变异株HENAN-HEB和HENAN-XINX，证实了该类毒株在国内的出现，其基因特点是在经典株的基础上，nsp2区域缺失了131个氨基酸，氨基酸缺失模式为“111+1+19”，缺失位置分别在323-433、481和533-551位，这类毒株与2001年美国分离到的变异株MN184A、MN184B、MN184C以及之10 后分离到的NADC30、CA-2和KNU-12-KJ4具有相似的缺失特征。从2012年开始国内检测机构和学者将分离到的此类毒株统称为类NADC30毒株(NADC30-like毒株)。2013年Zhao[63]报道在黑龙江和吉林检测到类NADC30毒株的流行，并分离到毒株JL580，致病性评价结果显示具有较强的致病性。Sun等[64]对HNjz15（未发生任何重组现象的类NADC30毒株）进行评价结果显示致病性较经典株相近，远低于高致病性毒株。2014年Zhou[65]等在我国北京、山西、河南、天津等地检测到类NADC30毒株并分离到毒株CHsx1401，对它的同源性分析发现与NADC30高度同源。随后Zhang等[66]发现FJ1402具有与高致病性PRRSV（HP-PRRSV）同样的致病性，同时选用目前市场上的疫苗进行攻毒保护实验证明TJM-F92和R98商品苗能够提供部分的保护。Bian等[67]分离毒株TJnh1501，其重组特点是NADC30与MLV发生重组，致病力结果显示低于HP-PRRSV毒株JXwn06。Liu等[68]对在福建分离到的14LY01-FJ,14LY02-FJ15LY01-FJ,和15LY02-FJ类NADC30毒株进行致病性评价，他们均与HP-PRRSV发生重组，结果发现他们与对照组相比造成明显的肺脏病理损伤以及明显的体重下降，与HP-PRRSV毒株的致病性相近。SunYF等[69]研究发现用TJnh1501进行攻毒保护试验中，用MLV疫苗进行免疫可以有效的缩短发热时间，降低血液中的病毒载量，结果显示用MLV疫苗可以针对类NADC30提供部分交叉保护，在野外可以通过MLV疫苗来控制类NADC30的感染。WangHM等分别对无重组类NADC30SD-A19、与HP-PRRSV毒株发生重组的类NADC30毒株SC-d，以及HP-PRRSV毒株HuN4进行致病性实验，结果发现SC-d可以明显的产生发热、胸腺萎缩、肺部明细损伤及体温降低现象，其中SC-d病变情况明显高于SD-A19低于HuN4。总结发现，类NADC30的致病力情况与它的重组有着密切的联系。1.5PRRSV的诊断与检测技术PRRSV可以感染各个年龄段的猪群，主要是引起机体免疫系统的损伤，猪群一旦感染即呈持续性，感染猪场可成为疫源地。该病可以通过母猪流产、仔猪死亡等临床观察作出初步的诊断，但是我国猪场的现状十分的复杂，常为多种疾病引起的混合感染，并且其它病毒（猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒等）也能引起猪繁殖障碍等疾病并与PRRS的症状十分的相似。同时，不同猪场和个体感染PRRSV后，临床症状有很大的差异，给临床诊断带来了很大的困难。因此PRRSV的确诊需要借助实验室的诊断技术。1.5.1血清学诊断方法11 血清学诊断方法具有特异性强，操作简单，灵敏度高的特点，可以适时地对猪群抗体水平进行检测评估，因此广泛应用于实际生产中。主要的实验方法包括酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）、间接免疫荧光实验（immunofluorescenceassay,IFA）、免疫过氧化物酶单层细胞实验（immunoperoxidasemonolayerassay,IPMA），血清中和实验（serumneutralizationtest,SNT）和胶体金免疫层析法(goldImmunochroma-tographyassay,GICA）[70-72]酶联免疫吸附实验可以检测血清样本中的抗原和抗体，具有操作简单、特异性和敏感性高的特点，且结果容易判定，广泛地用于大规模血清样品的检测。目前国内外主要针对GP5和N蛋白建立了多种ELISA检测方法（如间接ELISA和竞争ELISA等）[73]。研究表明目前有学者以N-GP5c重组融合蛋白和重组N蛋白为抗原建立了一套特异性和敏感性均高于IDEXX-ELISA试剂盒的间接ELISA方法[74-75]。免疫过氧化物酶单层细胞实验是最早建立的针对PRRSV血清抗体的诊断方法，还可用于PRRSV抗原以及病毒的鉴定，具有良好的敏感性和特异性，;在欧洲国家得到了广泛的应用。但是该实验需要培养细胞以及显微镜观察，结果判定具有主观性，不适合于大规模的临床样品的鉴定。间接免疫荧光实验（IFA）可在感染早期猪体内检测到PRRSV抗体，敏感性较好，但是与IPMA具有相同的缺点，因此不适用于推广应用。血清中和试验检测PRRSV抗体的特异性较强，可以区分不同类型PRRSV毒株。但是血清中和试验检测与IFA以及IPMA相比，敏感性较低，而且结果判定同样具有一定的主观性。同时中和试验耗时耗力且试验成本较高，因此多用于实验室研究。胶体金免疫层析法是一种新型免疫标记技术，主要以胶体金作为免疫示踪物应用于抗原抗体，敏感性高特异性强，操作简单快速，结果易于判断[76]，很适合进行现场诊断。目前已有学者成功研究出能够成功区分美洲型的经典PRRSV和HP-PRRSV的胶体金试纸条[77]。1.5.2分子生物学诊断方法血清学诊断方法虽然具有特异性强敏感度高等优点，但是在区分病毒变异情况、区分疫苗株与野毒株方面却很难发挥出作用。而病毒分离鉴定和分子生物学技术不仅具有特异性高、重复性高以及成本低等优点，并且可以区分不同类型的PRRSV以及美洲型不同的变异株，在PRRS临床病例确诊中发挥着重要的作用。目前分子生物学的技术主要包括核酸探针原位杂交技术（insituhydridization,ISH）、环介导等温扩增反应（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）和反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），其中前两种技术目前应用范围较小，RT-PCR现在普遍应用于PRRSV的诊断。12 核酸探针原位杂交技术是应用地高辛标记方法制备PRRSV特异性cDNA探针（ORF7-433bp）,建立检测PRRSV的原位杂交技术。该技术在检测出PRRSV病原的同时，还能检测出PRRSV在各组织器官的分布情况，对研究PRRSV的动态分布具有重要的意义。但该实验条件要求高，成本高，因此难以推广使用。环介导等温扩增反应是针对目的基因的特定区域设计的特异性引物以及对链置换DNA聚合酶的应用而建立的一种新型的核酸扩增方法，在一定的条件下可以自动循环置换完成PCR的扩增反应。30min即可检测出病原，将RT-PCR与其相结合就成为了RT-LAMP检测技术。有学者研究表明通过设计特定的引物建立起能成功区分经典株和HP-PRRSV的RT-LAMP方法比RT-PCR敏感100倍[78]。但是较多且复杂的引物设计、更易发生的实验污染、专利限制等现状，使RT-LAMP的发展受到了制约。RT-PCR是目前应用最为广泛，技术最为成熟的检测方法，同时兼具较高的敏感性和特异性，短时间即可完成对病例的确诊。目前应用于PRRSV的RT-PCR检测主要包括常规RT-PCR、实时定量PCR、（real-timefluorescencequantificationPCR,QT-PCR）、多重PCR以及巢式PCR等。根据PRRSV在我国的流行情况，研究者分别建立起了区分欧洲型与美洲型、美洲型的经典型（VR2332为代表）与高致病性（在nsp2高变区30个氨基酸的不连续缺失）PRRSV的RT-PCR方法[79-81]。目前我国流行的PRRSV优势毒株为类NADC30，其特征是在nsp2区域存在131个氨基酸的不连续缺失，目前诸多研究根据该特征已经建立起来了区分类NADC30、HP-RRSV及经典株的方法，给临床确诊提供了重要的技术保障[82]。基于常规RT-PCR而建立的多重PCR，能够同时对多种病原微生物进行鉴定，更快捷，更经济，广泛应用与流行病学调查。与常规的RT-PCR相比，实时荧光定量PCR的特异性敏感性更高[83-84]，不易发生污染，自动化程度高检测速度快。1.6猪繁殖与呼吸综合征疫苗PRRS的科学防控是是确保我国养猪业健康发展的一个重要条件，自1996年该病在我国首次出现，特别是2006年夏HP-PRRSV的爆发给我国养猪业带来了巨大的经济损失。目前该病没有特别有效可靠的治疗措施，只有在加强饲养管理以及疫苗免疫这两个方面来确保猪群的稳定。养殖的集约化程度越来越高，PRRSV的出现对我国乃至世界养猪业的影响越来越大，国内外的研究人员对PRRSV疫苗的研究投入了大量的人力物力。目前除了市场上广泛使用的灭活苗以及减毒活疫苗以外，各种新型的疫苗也在不断的出现。1.6.1灭活疫苗13 灭活疫苗是指先对病毒或细菌进行培养，然后用物理或化学方法(通常是福尔马林)将其灭活并通过添加佐剂研制的疫苗，其制备简单并且易于操作，并且具有良好的保护力[85]。PRRSV灭活苗是用来防控PRRSV较早的疫苗，1997年首次被Bayer公司推出，我国针对经典PRRSV的商品化疫苗主要是哈尔滨维科等生产的经典株灭活苗，该灭活苗使用的毒株是我国本土分离的CH-1a株，而针对HP-PRRSV的灭活疫苗是农业部兽医诊断中心分离的毒株NVDC-JXA1株[86]。目前，灭活苗是运输方便、安全、不散毒、无毒力返强等优势于一体的理想疫苗之一，但是自身也存在着抗体水平较低、产生抗体时间较晚、免疫后猪群应激较大等缺点。1.6.2减毒活疫苗减毒活疫苗又称弱毒疫苗，弱毒疫苗是指一种病原致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗，也就是用人工致弱或自然筛选的弱毒株，经培养后制备的疫苗。目前，市场上应用的活疫苗大多为弱毒疫苗。该苗的优点是病原可在免疫动物体内繁殖，用量小，免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便。缺点是弱毒株的毒力易返强，对一些极易感动物存在一定的危险性，其免疫效果易受多种因素的影响，且运输和保存有一定的条件限制。1997年德国BoehringerIngelheim公司的NOBL实验室就已经研制出PRRSV弱毒活疫苗，2007年以我国本土毒株CH-1a株为亲本致弱并商品化的PRRSV疫苗（CH-1R株）正式投放，紧接着PRRSV活疫苗R98株相继投放。2006年我国爆发高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRSV）以来，针对HP-PRRSV的商品化减毒活疫苗相继涌现，如JXA1-R、HUN4-F112、TJM-F92活疫苗等，这些PRRSV活疫苗在维持猪群稳定、有效预防等方面起到了不可或缺的的重要作用。然而，PRRSV弱毒活疫苗也存在许多问题如对动物有一定的致病性[87]，也有学者认为弱毒株存在毒力返强的危险[88-89]。1.6.3DNA疫苗DNA疫苗也被称为核酸疫苗。DNA疫苗是基于分子生物学技术开发的新型疫苗，是近年来治疗疾病的一种新型免疫防治剂。它是将编码某种抗原蛋白的外源基因与真核表达载体重组后，直接导入体内，并通过宿主细胞的转录翻译合成抗原蛋白，宿主被激活产生免疫应答，从而使身体获得相应的免疫保护，使其在疾病的预防和治疗中发挥作用。周井祥等[90]研究表明DNA疫苗产生的抗体水平低于灭活苗产生的抗体水平。陈希文等[91]研究表明不同注射方式能够对疫苗抗体产生影响。薛江东等[92]研究表明M蛋白能诱导免疫应答产生抗体。但是目前DNA疫苗在基因整合、自身免疫病、生殖毒性、环境安全等方面具有潜在的危险，影响了疫苗的推广应用。14 1.6.4亚单位疫苗亚单位疫苗，即通过化学分解等方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出具有免疫活性的片段制成的疫苗。有学者将热休克蛋白Gp96N串联PRRSV的B、T细胞表位表达制成合成肽疫苗，对小鼠进行攻毒实验表明能够产生体液免疫和细胞免疫[93]。刘义等将N蛋白进行表达并与TJM-F92同时进行免疫效果评价，发现N蛋白可以诱导体液免疫但是不能提供充足的保护。目前亚单位疫苗生产成本较高，抗原、佐剂、表达系统的筛选难度大等因素阻碍了推广使用及商品化。1.6.5活载体疫苗PRRSV活载体疫苗是将PRRSV免疫基因与异源病毒相结合的一种新型疫苗，能够长期的诱导免疫应答。仇玉等[94]利用重组鸡痘病毒连接表达GP5蛋白、M蛋白和GP5-M融合蛋白，接种小鼠表明重组鸡痘病毒表达GP5-M融合蛋白能刺激免疫小鼠产生高水平的特异性中和抗体和ELISA抗体，显着促进IFN-γ分泌和特异性T淋巴细胞增殖。同时有报道[95-96]表明在禽痘病毒载体上成功的对N蛋白和ORF3进行了表达。15 第二章PRRSV分型PCR方法的建立2.1引言猪繁殖与呼吸综合征是由PRRSV引起的猪病毒性传染病，临床主要以母猪的流产、弱胎、死胎以及生长育肥各阶段的猪群呼吸道为主要的症状[1,2]。目前我国流行的PRRSV主要为美洲型，且经典PRRSV、HP-PRRSV以及类NADC30毒株在我国均有不同程度流行。与经典PRRSV相比，HP-PRRSV在nsp2区域不连续缺失了30个氨基酸，而类NADC30毒株不连续缺失了131个氨基酸。为了有效地区分这3种不同的亚型，本实验设计了一对引物，建立RT-PCR检测方法，可以同时将这三种不同的亚型区分开。实验结果表明，通过扩增条带的大小可以对这3种不同亚型的PRRSV进行有效区分，并且该RT-PCR具有良好的敏感性和特异性，能够对临床样品进行有效的检测。2.2材料与方法2.2.1材料2.2.1.1病毒及细胞JXA1株（HP-PRRSV毒株）、VR2332株（经典PRRSV）、HNjz15株(类NADC30毒株)，这三种毒株的具体信息见下表2-1。表2-1目的序列比对参考的序列来源及GenBank登录号Table2-1SequencesourceandGenBankaccessionnumberoftargetalignmentreference毒株登录号分离地毒株年份JXA1EF112445China2006HNjz15KT945017.1China2015VR-2332U87392U.S.A1993猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）、猪瘟（classicalswinefevervirus，CSFV）、传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）、伪狂犬病毒(pseudorabiesVirus，PRV)细胞培养物。11份PRRSV临床阳性样品的研磨液，具体信息同下表2-2。置于-80℃超低温冰箱中保存备用。16 表2-2临床样品信息Table2-2Clinicalsampleinformation序号样品名称样品类型采集地点120160817-1肺脏河南22016-32#血清河南32016060756扁桃体河南42016030277肺脏河南5201600213肺脏河南62016010082肺脏河南72016010063肺脏河南816124-1扁桃体山东916124-3扁桃体山东1016214-1肺脏陕西1116214-2淋巴结陕西2.2.1.2主要试剂ViralNucleicAcidExtractionKit购自Geneaid公司；M-MLVReverseTranscriptase（含5×Buffer）、dNTP、RRI购自Promega公司；高保真的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase购自宝生物工程有限公司；dNTPMixture、DNAMarker、pEASY-Blunt克隆载体、Trans-T1感受态细胞、2×TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)购自北京全式金生物技术有限公司、琼脂糖购自TAKARA公司；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；2×TaqPCRMasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司；核酸染料购自Biotum公司；IPTG、X-gal、氨苄青霉素（ampicillin,Amp）均购自上海生工生物工程股份有限公司；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出物（YeastExtract）购自OXOID公司；其它普通生化试剂均为国产分析纯试剂。2.2.1.3培养基与抗生素的配制RPMI-1640基本培养基（配制1L）：将RPMI-1640培养基粉剂（10.4g）溶于900mL超纯水中，加入2gNaHCO3，溶解后定容至1000mL，调节pH至6.5~6.8，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成500mL/瓶，4℃保存。RPMI-1640生长培养基（配制100mL）：在89mLRPMI-1640基本培养基中添加1mL青链霉素贮存液（终浓度青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL），10mL胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）。RPMI-1640维持培养基（配制100mL）：在95mLRPMI-1640基本培养基中添加1mL青链霉素贮存液（终浓度青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL），4mL胎牛血清（fetalbovineserum,17 FBS）。LB液体培养基：将胰蛋白胨（Tryptone）10g、酵母浸出物（YeastExtract）5g、NaCl10g，溶于适量ddH2O中，完全溶解后用，定容至1000mL，121℃蒸气灭菌20min，4℃保存备用。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入15g琼脂粉，在121℃高压下蒸气灭菌20min。待培养基温度降至50℃左右，加入相应的抗生素，铺制平板，待培养基凝固后，倒放置于4℃保存备用。氨苄青霉素（Amp）：用灭菌ddH2O配成贮存浓度50mg/mL，0.22μm滤膜过滤后，-20℃保存备用。2.2.1.4主要设备Mini台式离心机购自德国Eppendorf公司；PCR仪购自ABI公司；紫外透射分析仪，购自其林贝尔公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自美国Hoefer公司，紫外成像仪，购自美国UVP公司；恒温培养箱购自德国MMM公司；循环水浴锅购自PRIMA公司；旋涡混合器购自SCIENTIFICINDUSTRIESINC；恒温水浴锅购自上海一恒公司；空气浴震荡摇床购自美国NBS公司；冰箱购自青岛澳柯玛公司；微波炉购自广东美的公司。2.2.2方法2.2.2.1区分PRRSV类NADC30、HP-PRRSV和经典毒株的RT-PCR引物设计参考PRRSVNADC30株(JN654459)、VR2332株（U87392）和JXA1株（EF112445）基因序列，针对nsp2基因的缺失特性应用primer5.0软件，设计一对特异性引物N681F/N681R，这三种类型的毒株扩增长度分别为681bp、1074bp、984bp，所有的引物由金维智生物公司合成，具体引物信息见下表2-3。表2-3PCR检测引物Table2-3PrimersofPCRdetection引物序列(5'-3')N681-FCTTTGATTGGGATGTTGTGCTN681-RCAATGATGGCTTGAGCTGAGT2.2.2.2样品的准备将病毒JXA1、VR2332、HNjz15及PEDV、CSFV、TGEV、PRV等细胞培养物及11份PRRSV阳性临床样品研磨液12000rpm4℃离心10min，取上清备用。2.2.2.3提取核酸按照核酸提取试剂盒ViralNucleicAcidExtractionKit的操作说明提取2.2.2.2所有样品的核酸，包括DNA和RNA。具体操作步骤如下：（1）取200μL上述处理过的血清样品，转移到1.5mL离心管中，加400μLVBLysisBuffer,漩涡震荡，室温放置10min。18 （2）向离心管中加450μLADBuffer（加入无水乙醇），剧烈震荡。（3）转移600μL至RNaseyspincolumn中，12000rpm离心1min，若液体大于600μL，重复离心一次，弃去洗脱液。（4）将RNaseyspincolumn放入一个新的2mL的收集管中，向RNaseyspincolumn中加400μLW1Buffer，12000rpm离心30s，弃去洗脱液。（5）向RNaseyspincolumn加600μLWashBuffer，12000rpm离心30s，弃去洗脱液。（6）12000rpm离心3min。（7）将RNaseyspincolumn的柱子放在一个新的灭菌的1.5mL的离心管中，加入50μLRNase-free的水于膜上，静置3min，12000rpm离心1min，离心管中即为RNA样品和DNA样品（PRV），RNA样品可以用于反转录反应或者将所有样品-80℃保存。2.2.2.4反转录按照M-MLVReverseTranscriptase说明书进行，将2.2.2.3提取的所有RNA样品PRRSV、PEDV、CSFV、TGEV分别进行反转录。使用20µL反转录反应体系，具体如下：取12.5μLRNA与1μLOligo(dT)18混匀，70℃水浴5min，立即冰上冷却5min。瞬时离心后，向其中加入如下反应成分：M-MLV5×ReactionBuffer4μL10mMdNTPs1μL40U/μLRNaseinhibitor0.5μL10U/μLM-MLVReverseTranscriptase1μL轻弹离心管混匀溶液，42℃水浴反应1h，即得到cDNA模板，然后立即进行PCR反应或置于-20℃储存备用。2.2.2.5RT-PCR鉴别检测方法的建立及条件优化反应体系如下（20μL）:2×TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)10μLN681F/N681R0.5μLcDNA1μL1μLddH2Oto20μL共20μL体系PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20s55℃退火20s72℃延伸30s循环30次；19 72℃延伸10min其中退火温度设置温度梯度进行条件优化，分别为50℃、55℃、60℃、65℃。在退火温度优化完成的条件下，对其中引物N681F/N681R添加量分别再进行0.25μL，1μL，1.5μL，2μL的条件摸索，均补充ddH2O至20μL体系。取8μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。2.2.2.6PCR产物基因序列测序根据2.2.2.5体系的优化结果，用高保真酶对获得的JXA1、VR2332、HNjz15的cDNA分别进行PCR扩增，采取50μL的反应体系。将50μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳纯化，紫外灯下切下目的片段。将上述基因扩增产物按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行纯化，按照pEASY-BluntCloningKit的说明书进行克隆，将回收的PCR产物、pEASY-Blunt载体按照如下体系进行连接。在微型离心管中依次加入：PCR产物4μLpEASY-Blunt载体1μL轻轻混合，25℃反应20min，反应结束后，将离心管置于冰上。（1）在Trans1-T1感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物，轻弹混匀，冰浴20min。（2）42℃热激30s，立即置于冰上2min。（3）加500μL平衡至室温的LB培养液，200rpm、37℃孵育1h。（4）取8μLIPTG（500mM）、40μL20mg/mLX-gal混合，均匀地涂于回温至室温的琼脂平板上，在37℃放置30min。（5）待IPTG、X-gal吸收后，取200μL菌液涂布平板，将平板在37℃恒温培养箱中倒置，培养过夜，观察菌落生长情况。挑选白色克隆至10μL无菌水中，涡旋混合。取1μL混合液用作PCR反应的模板，采用2×TaqPCRMasterMix（TIANGEN）扩增条件如下:2×TaqPCRMasterMix10μLM13F0.4μLM13R0.4μL模板1μLddH2O8.2μL共20μL体系PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s55℃退火30s20 72℃延伸1min循环30次；72℃延伸7minPCR产物进行电泳鉴定，挑选鉴定为阳性的克隆，加1mL含氨苄的LB培养液摇菌6h后送金唯智公司进行测序验证。利用DNAstar、MegAlign对测序公司反馈的序列进行拼接，并与参考毒株(见表2-1)的鉴别片段的基因进行序列比对。2.2.2.7PCR鉴别检测方法的特异性实验分别以PRRSV类NADC30毒株HNjz15、VR2332株、JXA1株及PEDV、CSFV、TGEV的cDNA和PRV的DNA为模板进行PCR扩增，验证引物的特异性。2.2.2.8RT-PCR鉴别检测方法的敏感性实验将提取的PRRSV类NADC30毒株HNjz15、VR2332株、JXA1株的cDNA用核酸蛋白分析仪测定其浓度，然后进行10倍系列稀释后PCR扩增，检测其敏感性。2.2.2.9区分PRRSV类NADC30、HP-PRRSV和经典毒株的RT-PCR临床样品检测结果对临床上的11份阳性样品通过设计的引物进行PRRSV分型检测，并将PCR检测结果与条带测序的结果进行比对，验证该引物是否可用于临床样品检测。2.3结果与分析2.3.1RT-PCR鉴别检测方法的反应体系优化结果通过对不同条件的RT-PCR条带比较，确定最佳反应体系为2×TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)10μL，cDNA1μL及H2O8μL，N681F/N681R各0.5μL；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，循环30次;72℃延伸10min。JXA1、VR2332、HNjz15扩增结果如图2-1，PCR结果显示：VR2332扩增条带略大于JXA1，二者均大于HNjz15的扩增条带，初步表明RT-PCR鉴别检测方法可以区分类NADC30、以JXA1为代表的HP-PRRSV和VR2332为代表的经典株。图2-1RT-PCR检测结果ThetestresultsofRT-PCRmethodM：Marker2000;1:VR2332细胞培养物；2：JXA1细胞培养物:3：HNjz15细胞培养物；4：正常细胞培养基。M:Marker2000;1:VR2332cellculture,2:JXA1cellculture:3:HNjz15cellculture;4:normalcellculturemedium.2.3.2RT-PCR鉴别检测方法的PCR产物测序鉴定21 对2.3.1的PCR产物经过切胶、回收、连接转化、挑菌鉴定之后送金唯智公司进行测序，HNjz15、JXA1、VR2332分别能扩增出681bp、984bp、1074bp的片段，测序的结果与GenBank公布的序列完全一致，说明扩增的结果与对应的毒株相吻合。2.3.3RT-PCR鉴别检测方法的特异性实验结果用该检测方法对PRRSVVR2332株、JXA1株、HNjz15株以及PEDV、CSFV、TGEV、PRV进行特异性检测，如图2-2。检测结果表明VR2332株、JXA1株、HNjz15株分别扩增到1074bp、984bp、681bp的条带，其余样品均不能扩增出条带，说明建立的分型检测方法具有良好的特异性。图2-2RT-PCR鉴别检测方法的特异性试验结果Fig.2-2ThespecificitytestresultsofRT-PCRmethodM：Marker2000;1:VR2332细胞培养物;2：JXA1细胞培养物;3：HNjz15细胞培养物；4：PRV细胞培养物;5：PEDV细胞培养物;6:CSFV细胞培养物；7：TGEV细胞培养物；M:Marker2000;1:VR2332cellculture,2:JXA1cellculture:3:HNjz15cellculture;4:PRVcellculture;5:PEDVcellculture;6:CSFVcellculture;7:TGEVcellculture;2.3.4RT-PCR鉴别检测方法的敏感性试验结果在优化的最佳RT-PCR条件下，对PRRSV类NADC30样品HNjz15、JXA1株、VR2332株的cDNA通过核酸蛋白分析仪分析均为1µg，通过倍比稀释后进行RT-PCR扩增，结果表明最少的检出剂量均为原样品的100倍稀释，均为0.01µg，如图2-3。图2-3RT-PCR鉴别检测方法的敏感性试验结果Fig.2-3ThesensitivitytestresultsofRT-PCRmethodA:VR2332样品的敏感性实验结果：cDNA浓度从左到右的浓度依次为1µg、0.1µg、0.01µgB:JXA1样品的敏感性实验结果：cDNA浓度从左到右的浓度依次为1µg、0.1µg、0.01µg22 C:HNjz15样品的敏感性实验结果：cDNA浓度从左到右的浓度依次为1µg、0.1µg、0.01µgA:SensitivityofVR2332samples:TheconcentrationofcDNAfromlefttorightwas1μg,0.1μg,and0.01μg,respectively.B:SensitivitytestresultsofJXA1samples:TheconcentrationofcDNAfromlefttorightwas1μg,0.1μg,and0.01μg,respectively.C:SensitivitytestresultsofHNjz15samples:TheconcentrationofcDNAfromlefttorightwas1μg,0.1μg,and0.01μg,respectively.2.3.5分型RT-PCR临床样品检测结果对2016年通用PCR检测为阳性的部分样品（共11份）进行检测，JXA1和HNjz15作为阳性对照。检测结果表明6、8、10、13号样品为HP-PRRSV，其余样品均为类NADC30（图2-4），对扩增出来的目的条带进行测序，结果证明：测序结果与PCR检测结果一致。说明该方法可以对临床样品也进行有效的检测。图2-4RT-PCR鉴别检测方法的部分临床样品检测结果Fig.2-4TheresultsofclinicalsamplesdetectionsbyRT-PCRmethod注：3-13为临床阳性样品，1，2为阳性对照JXA1和HNjz15。Note:Note:3-13areclinicallypositivesamples,and1and2arepositivecontrolsJXA1andHNjz15.2.4讨论自从1996年PRRSV在我国首次确定存在以来，研究人员建立了很多种针对PRRSV的检测方法[97-100]，毫无疑问，RT-PCR依然是目前最高效、准确易操作的检测方法。如今PRRS在我国的疫情极其复杂，2006年HP-PRRSV在我国爆发，成为流行毒株，给我国的养猪业带来了巨大的经济损失，2012年PRRSV类NADC30在我国首次报道[62]更是加剧了我国PRRSV的防控复杂程度。本研究在引物的设计上根据这三种不同亚型的nsp2基因的缺失情况进行，统筹考虑了类NADC30131个氨基酸的缺失以及HP-PRRSV30个氨基酸的缺失，建立的RT-PCR检测方法具备良好的特异性和敏感性。通过对PCR条带大小的判断即可有效区分美洲型PRRSV的不同亚型。通过对临床上的样品进行分型检测，成功运用到实际检测中并为PRRSV流行病学研究提供辅助手段和方法。23 2.5小结建立了一种能够区分经典PRRSV、HP-PRRSV、类NADC30毒株的方法，具备良好的特异性和敏感性，并能够应用到临床样品的检测中。24 第三章2016-2017年河南省及周边部分地区PRRSV分子检测及nsp2、ORF5基因变异分析3.1引言2001年，美国分离到PRRSV变异株MN184,全基因分析发现在nsp2基因的第323-433位，第481位和533-551位分别存在111、1和19个氨基酸的不连续缺失[101-102]。2008年美国动物疫病研究中心分离到同种缺失类型的PRRSV毒株并命名为NADC30。2012年，周峰等[62]在我国首次分离到与NADC30高度同源的新变异株HENAN-XINX以及HENAN-HEB，确定该类型毒株毒株已在我国流行，2014年以来PRRSV在我国的流行呈现加剧之势，北京、天津、河北、河南、山东、山西、江苏、浙江、福建、四川、湖北、广东等地均成为疫情地区[87]。感染该类病毒的猪临床表现形式为生长育肥猪出现严重的呼吸道症状，死淘率10%-20%，并容易继发细菌感染，感染母猪出现流产等繁殖障碍，流产率高达30%-40%，给我国的生猪养殖业带来了巨大的经济损失[63]。目前我国的PRRSV类NADC30毒株已经逐步取代HP-PRRSV成为优势的流行毒株，且经典株依旧存在，我国PRRSV流行呈现多样化。因此有必要对PRRSV分子流行病学特点等方面进行持续跟踪调查研究，以便对疫情保持实时的监控，并采取有效的防控措施。本研究主要对2016至2017年采自河南及周边地区的145个养殖场的756份PRRSV疑似临床样品进行RT-PCR的检测，并对PRRSV阳性样品的nsp2及GP5进行测序及分析，揭示河南及周边地区PRRS最新的流行动态及病原的变异情况，为PRRSV的防控提供科学的参考依据。3.2材料与方法3.2.1材料采集河南及周边地区145个养殖场共756份疑似PRRS发病猪的组织（肺、淋巴结、扁桃体等）。3.2.1.2主要试剂ViralNucleicAcidExtractionKit购自Genaid公司；M-MLVReverseTranscriptase、dNTP、RRI购自Promega公司；pEASY-Blunt克隆载体、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；高保真的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase、dNTPMixture、DNAMarker、琼脂糖购自TAKARA公司；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司。3.2.1.3主要仪器设备同2.2.1.325 3.2.2方法3.2.2.1PCR引物利用实验室已建立的PRRSV通用性PCR检测方法（引物PRRSV-F/R）用于鉴定PRRSV是否为阳性；用已建立的分型PCR方法（引物N681F/N681R）对PRRSV阳性毒株进行分型检测。针对nsp2设计三对引物覆盖nsp2的全长，针对ORF5设计一对引物（表3-1）。表3-1PCR检测引物Table3-1PrimersofPCRdetection引物序列(5'-3')扩增长度（bp）PRRSV-FGAATGGCCAGCCAGTCAATC436PRRSV-RGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACN681-FCTTTGATTGGGATGTTGTGCT681N681-RCAATGATGGCTTGAGCTGAGTnsp2-F1GGCAAGTACCTACAGCGGAG2171nsp2-R1GATGATGGCTTGAGCTGAGTATnsp2-F2CCCGTGTCGTCAAGCAGCTC1026nsp2-R2TGCGAACAGGGTCCCAAGGTnsp2-F3GCTGTTGGTTTGTTCAAGCCTAC1132nsp2-R3TCAGCCTTACAACTCAACCTATGORF5-FATGGTTTCTCAGGCGTTCG1493ORF5-RACGACAAATGCGTGGTTATCA3.2.2.2样品的准备取适量的样品剪碎、研磨，冻融后，经12000rpm4℃离心10min，上清液使用0.22微米滤器过滤除菌待用。3.2.2.3提取核酸同第二章2.2.2.3提核酸步骤。3.2.2.4反转录同第二章2.2.2.4反转录步骤。3.2.2.5病原检测及ORF5、nsp2基因扩增、克隆与序列测定用高保真的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase进行PCR扩增，采用如下50μL体系进行：26 PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL5×PrimeSTARBuffer10μL2.5mMdNTPMix4μL10pM上游引物1μL10pM下游引物1μLcDNATemplate1μLddH2O32.5μL共50μL体系PRRSV-F/R反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30S，循环33次；72℃延伸7min;N681-F/R反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸45S，循环33次；nsp2-F1/R1反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，循环33次;nsp2-F2/R2反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火1min，72℃延伸2min，循环33次;nsp2-F3/R3反应条件:94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环33次。ORF5-F/R反应条件:94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环33次。将50μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下切下目的片段。将上述nsp2、ORF5基因扩增产物按照GelExtrationMiniKit说明书进行纯化，克隆入pEASY-Blunt克隆载体，取PCR鉴定为阳性的克隆送北京金唯智生物科技有限公司测序。具体操作同2.2.2.6。利用DNAstar对测序公司反馈的ORF5、nsp2序列进行拼接，并与参考毒株(见表3-2)的ORF5、nsp2基因进行序列比对，登录http://www.cbs.dtu.dk/services/使用NetNGlyc1.0Server在线软件预测本研究中PRRSV流行毒株及参考毒株ORF5基因推导的氨基酸序列的糖基化位点。表3-2参考毒株信息Table2-2Referencestrainsinformation编号名称国家分离时间登录号1LelystadvirusNetherlands1992M962622VR-2332USA1992U873923CH-1aChina1996AY0326264BJ-4China2000AF3318315MN184CUSA2001EF4887396HB-1(sh)China2002AY1503127HB-2(sh)China2002AY2623528P129U.S.A2002AF4940429RespPRRSMLVUSA2005AF06618310HEB1China2006EF11244727 11TJChina2006EU86024812JXA1China2006EF11244513JXwn06China2006EF64100814HUN4China2007EF63500615S1China2007DQ45947116SY0608China2007EF53435717NADC30USA2008JN65445918JXA1-P10China2008FJ54885419JXA1-P15China2008FJ54885520JXA1-P45China2008FJ54885121JXA1-P70China2008FJ54885222JXA1-P80China2008FJ54885323JXA1-P100China2009KC42272524GDChina2009GU1439132510-10GX-2China2010JQ66355926JXChina2010JX31764927XW071USA2010KP28343728GD-2011China2011KC52783029YN-2011China2011KP77176730XW005USA2011KF72439831Minnesota16USA2011KP28340432Minnesota5USA2012KP28341033NT1China2012KP17940234NT2China2012KP17940335NT3China2012KP17940436HENAN-HEBChina2012KJ14362137HENAN-XINXChina2012KF61190538JL580China2013KR70634339XW006USA2013KF72441240XW015USA2013KF72440941KNU-12-KJ4Korea2013KF55545142FJZ03China2014KP86090943FJY04China2014KP86091044CHsx1401China2014KP86162545HNjz15China2015KT9450173.3结果与分析3.3.1病原检测结果28 从756份临床疑似样品中检测出PRRSV阳性样品139份，阳性率18.4%；所有的阳性样品中，类NADC30占55份，HP-PRRSV占84份，分别占比39.6%、60.4%，未检测出经典株。3.3.2nsp2及ORF5的扩增结果对检测结果总结发现，鉴定为PRRSV阳性的样品分别来自50个不同的猪场。每个猪场选1份进行ORF5和nsp2基因的扩增及克隆测序，最终获得了42个nsp2序列和50个ORF5基因序列。类NADC30和HP-PRRSV在这50个不同猪场的分布情况如图3-1所示:数量:908480706055504030302020100HP-PRRSV类NADC30样品数猪场图3-1PRRSV不同类型样品的分布图Figure3-1DistributionofdifferenttypesofPRRSVsamples3.3.3nsp2基因的变异特征3.3.3.1nsp2基因的核苷酸及推导的氨基酸序列的同源性分析42株nsp2基因的核苷酸序列的同源性为74.5%-99.9%，其推导的氨基酸序列的同源性为68.4%-99.7%；与欧洲型LV的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为39.8%~47.3%和22.1%-26.4%；与美洲型国内外经典株CH-1a及VR2332核苷酸的同源性分别为75.8%-92.9%和64.8%~82.1%，氨基酸的同源性分别为69.8%-89.6和57.6%~78.2%；与我国HP-PRRSV的代表株JXA1的核苷酸及推导的氨基酸的同源性分别为75.0%-99.5%和70.9%-89.5%；与类NADC30的核苷酸及氨基酸的同源性分别为75.1%-93.7%和74.3%-92.2%；其中20份与类NADC30的核苷酸及氨基酸的同源性分别为86.3%-93.6%和87.4%-94.5%，而与JXA1的核苷酸及推导的氨基酸的同源性仅为74.6%-80.3%和70.9%-81.1%；其中22份与JXA1的核苷酸及氨基酸同源性为97.6%-99.5%和96.7%-98.9%，与类NADC30的氨基酸及核苷酸的同源性仅为72.6%-73.1%和75.2%-76.7%。29 3.3.3.2nsp2基因推导的氨基酸序列变化特征42个推导的氨基酸序列，与CH-1a和VR2332相比，具有大量的氨基酸位点的突变。与JXA1和类NADC30相比，除了氨基酸位点的突变，还存在着其它特殊的变异特征(图3-2)。其中22个毒株与JXA1有着高度的同源性，都具有同样的1+29个氨基酸的不连续缺失,具有HP-PRRSV的遗传特征。其余的20株与类NADC30相比，在322aa-432aa、483aa及504aa-522aa位共缺失131个氨基酸，这些毒株与国内外报道的类NADC30毒株具有相似的缺失特征。除此之外，毒株161343-1、161433-57有着额外的5个氨基酸的缺失，分别位于nsp2蛋白的465aa-469aa和463aa-467aa，毒株20160063有着30个氨基酸的额外缺失位于nsp2蛋白的775aa-804aa，毒株170010-4存在着两个额外的氨基酸缺失，位于nsp2蛋白586aa-587aa。A30 BC图3-242个PRRSV流行毒株nsp2基因推导的氨基酸序列比对分析Fig.3-2Alignmentofdeducedaminoacidssequencesofnsp2genesof42PRRSVprevalentstrains31 注：缺失部分用黑色方框注。根据序列同源性，测序毒株分别与NADC30（A和B）和JXA1（C）进行比对分析。Note:thedeletionregionsaremarkedwithblackboxesTheprevalentstrainssequencedarecomparedwithNADC30(AandB)andJXA1(C)basedonthehomology，respectively.3.3.3.3nsp2基因的遗传进化分析文献研究[103]通过nsp2基因的系统发育分析，可将美洲型PRRSV分为5个亚型，包括以VR2332、CH-1a、HB-1(sh)/2002为代表的亚型1、亚型2、亚型3，以JXA1为代表的亚型4和以NADC30为代表亚型5。本文对获得的42个nsp2序列进行分析，表明均属于美洲型毒株序列，其中22个分布于以HP-PRRSV株JXA1、TJ和HEB1为代表的第4亚型，20株分布于以NADC30代表的第5亚型，并且位于与毒株JL580、HENAN-XINX和HNjz15不同的分支上（图3-3）。图3-3基于nsp2基因核苷酸序列的遗传进化分析Fig.3-3Phylogeneticanalysisbasedonnucleotidesequencesofnsp2genes注：代表性参考毒株用黑色三角标注；测序毒株用白色圆圈标注；32 Note:Therepresentativereferencestrainsaremarkedwithblacktriangle;theprevalentstrainssequencedaremarkedwithwhitefilledcircles;.Thetwomainsubgroupsaremarkedwithdifferentcolour.3.3.4ORF5基因的变异特征3.3.4.1ORF5基因的核苷酸及推导的氨基酸序列的同源性分析50株ORF5基因的核苷酸序列的同源性为83.7%-99.8%，其推导的氨基酸序列的同源性为83.1%-99.5%；与欧洲型LV的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为61.6%~65.8%和54.2-59.4%；与美洲型国内外经典株CH-1a及VR2332核苷酸的同源性分别为85.1%-95.4%和83.4%-89.6%；氨基酸的同源性分别为84.6%-93.0%和83.0%-88.1%与我国HP-PRRSV的代表株JXA1的核苷酸及推导的氨基酸的同源性分别为83.3%-99.7%和82.6%-99.5%；与类NADC30的核苷酸及氨基酸的同源性分别为84.4%-95.4%和84.6%-95.5%；其中20份与类NADC30的核苷酸及氨基酸的同源性分别为87.1%-96.2%和84.1%-90.5%，而与JXA1的核苷酸及推导的氨基酸的同源性仅为83.9%-86.9%；其中22份与JXA1的核苷酸及氨基酸同源性93.0-99.7%和91.0%-99.5%，与类NADC30的核苷酸及氨基酸的同源性仅为84.4%-86.1%和84.6%-86.1%。3.3.4.2ORF5基因推导的氨基酸序列变化特征对50个GP5蛋白序列进行比对（图3-4）发现，毒株161392-2在34位缺失了1个氨基酸，毒株161402-2在37位缺失了1个氨基酸。在GP5的第13和151位与毒力相关的氨基酸处，位于第5亚型的20个序列中，17个序列均与类NADC30Q13K151保持一致，有3株在151位发生突变，分别是161392-2、161302-14、2016-32#突变为K151R；其余30个序列中有28个与JXA1保持一致（R13和R151），仅有161080-1、161080-3发生R151K的突变。所有获得的50个序列与NADC30和JXA1相比，他们的序列均在N端信号肽区域、高变区（HVR1和HVR2）存在较大变异，在诱骗表位（27aa-30aa）、中和表位（37aa-44aa）存在少量的氨基酸置换。33 AB34 CD图3-450个PRRSV流行毒株ORF5基因推导的氨基酸序列比对分析Fig.3-4AlignmentofdeducedaminoacidssequencesofORF5geneof50PRRSVprevalentstrains35 注：信号肽区域、高变区和跨膜区用黑色方框标注；诱骗表位和主要中和表位用红线标注。根据序列同源性，测序毒株分别与JXA1（A和B）和NADC30（C和D）进行比对分析。Note:Signalpeptideregions，hypervariableregions，andtransmembraneregionsaremarkedwithblackboxes;decoyepitopesandmajorneutralizingepitopesaremarkedwithredlines.Basedonsequencehomology，thesequencingstrainswerecomparedwithJXA1(AandB)andNADC30(CandD)，respectively.3.3.4.3ORF5基因序列的遗传进化特征文献研究[103]表明，利用ORF5基因进行遗传进化（图3-5）PRRSV也可以分成5个亚型，与nsp2分析基本相一致。本研究中，50个测序的毒株均为美洲株，分离到的20株类NADC30毒株位于同一个独立的分支，与NADC30的关系较近。其余的30个毒株属于亚型4，分别与国内的HEB1、HuN4、JXA1、JX等分布在一起。图3-5基于ORF5基因核苷酸序列的遗传进化分析Fig.3-5PhylogeneticanalysisbasedonnucleotidesequencesofORF5gene注：代表性参考毒株用黑色圆圈标注；测序毒株用白色圆圈标注。Note:Representativereferencestrainsaremarkedwithblackcircles;sequencingstrainsaremarkedwithwhitecircles.3.3.4.4GP5蛋白N-糖基化位点的变化特点36 利用NetNGlyc1.0Server在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）预测本研究中50株PRRSV流行毒株ORF5基因推导的氨基酸序列的糖基化位点(图3.8)，结果表明：推导的氨基酸序列均在N44，N51糖基化位点存在糖基化位点，可见N44，N51是十分保守的糖基化位点。在糖基化位点数目方面，30个第4亚型的序列中，10个序列含5个糖基化位点，17个序列含4个糖基化位点，仅3个序列含3个糖基化位点。位于第5亚型的序列中，11个序列含有3个糖基化位点，8个序列含有4个糖基化位点。N33糖基化位点仅在位于第5亚型的序列中存在。表3-3N-糖基化位点的预测结果Table.3-3PredictionresultsofN-glysitesN-糖基化位点分离株亚型数量N30N32N33N34N35N44N51170241-24√√√√√5161246-24√√√√√5161080-54√√√√4161080-14√√√√4161020-34√√√√√516690-14√√√√416690-24√√√√4166284√√√316494-44√√√√416494-34√√√√416494-14√√√√416354-124√√√√416354-24√√√√416156-14√√√√416319-394√√√316319-354√√√316319-374√√√√416224-14√√√√√516214-34√√√√√516214-44√√√√√516214-24√√√√√516214-14√√√√√516124-64√√√√416124-54√√√√√516124-34√√√√416124-14√√√√√516105-14√√√√41693-74√√√√437 1693-34√√√√41693-14√√√√4161302-145√√√√4170051-45√√√√4161433-575√√√√4201600825√√√√420160302135√√√√4161401-35√√√√4161402-25√√√√42016-32#5√√√320160817-15√√√320160817-25√√√320160100635√√√320160302775√√√320160607565√√√3161343-15√√√3161390-25√√√3161405-15√√√3161448-25√√√3170028-25√√√3170051-45√√√√43.4讨论从我国1996年首次报道PRRSV，到2006年高致病性蓝耳病在我国南方地区开始爆发，随后在我国大部分地区开始流行，再到2012年类NADC30在我国首次报道及近年的流行，历经30多年的时间，PRRSV在我国经历了传播、变异、爆发、再变异流行等复杂过程[59，61，62]。本研究从河南及周边地区756份临床样品中检测出来139份PRRSV阳性样品，阳性率达18.4%。其中类NADC30、HP-PRRSV毒株在临床同时存在，提示目前PRRSV流行的多样性。与2016年相比，2017年类NADC30的比重有所上升，并逐渐成为优势流行毒株。另外，在某些养殖场同时检测出HP-PRRSV与类NADC30两种不同的毒株，并且在同一个动物体内也检测出这两种不同毒株的同时存在，这种现象暗示目前PRRSV毒株在临床的复杂性。研究表明，同一个基因型不同分离毒株之间存在着明显的差异，nsp2是整个高度变异的PRRSV基因组中突变最大的部分，同时又具有很高的耐缺失和耐插入的能力，因此nsp2可以作为检测PRRSV变异的独特标记，用于对PRRSV的流行病学分析。GP5作为分析PRRSV多样性的靶基因，不仅是PRRSV重要的免疫原性蛋白，同时还含有重要的抗原和诱骗表位。因此在研究nsp2缺失和突变的同时，ORF5基因的遗传多样性同时也受到了广泛的关注。对50株GP5序列进行测序并进行系统发育分析，结果表明，所有测序毒株均为美洲型毒株，亚38 型为第5亚型和第4亚型，在位于第4亚型的30个毒株中，其中有16株与JXA1、HEB1、GD、TJ等不同年份的毒株分布在一起，有14个毒株与和报道的返强毒株[104]NT1，NT2，NT3形成独立的进化分支，表明这些毒株可能是疫苗返强毒株。大量研究证明GP5上存在的中和抗原位点诱导产生的中和抗体能明显缩短PRRSV引起的病毒血症持续期，对PRRSV在宿主体内的清除至关重要[105-108]，研究表明LDV的N45糖基化位点被T取代消除之后，能够在小鼠和巨噬细胞中增殖[109]。同时研究表明N-糖基化位点与中和表位的抗原性也有密切的联系，通过对毒株突变使N34或N51的糖基化位点移除可以有效增加中和抗体产生的水平，然而N34或N51的存在可以起到屏蔽中和抗体产生的作用。对LDV研究表明，与N44相比，消除GP5的N45糖基化位点可以更加强烈的增强中和抗原表位对诱导中和抗体产生的敏感性，目前针对N44糖基化位点的作用暂未研究清楚[110-111]。本研究中，位于第5亚型的毒株（NADC30为代表）与第4亚型毒株（JXA1为代表）相比存在糖基化位点N34至N33漂移的现象，这其中的原因有待继续研究，同时存在N-糖基化普遍减少的现象（多发生在N32-N34之间），这可能会导致N34的遮蔽效应消失，诱导产生更多的中和抗体。3.5小结1、对756份临床样品进行RT-PCR检测，共检出阳性样品139份，阳性率18.4%。2、对139份PRRSV阳性样品进行分型检测，结果表明其中55份为类NADC30，84份为HP-PRRSV，所有阳性样品共分布于50个猪场，每个猪场选1份进行GP5、nsp2扩增，最终获得42个nsp2序列和50个GP5序列。3、对50个毒株测序后进行遗传进化分析，流行毒株分别属于以JXA1为代表的亚型4和以NADC30为代表的亚型5。39 第四章类NADC30毒株的分离与鉴定4.1引言PRRSV具有严格的宿主特异性和细胞嗜性，猪肺泡巨噬细胞（PAM细胞）是其主要靶细胞[30]。病毒的分离与体外培养可用PAM细胞、非洲绿猴肾细胞MA104以及其衍生细胞系（CL262、Marc-145等），其中Marc-145细胞是常用于分离和培养PRRSV的传代细胞系。病毒感染Marc-145细胞的细胞病变（CPE）是以细胞聚堆和脱落为特征，经常用于HP-PRRSV毒株的分离。目前已有文献[112]报道采用Marc-145进行类NADC30毒株的分离，但是成功率并不高，部分类NADC30毒株可以在Marc-145细胞上增殖，而部分毒株并不能产生CPE。猪肺泡巨噬细胞（PAM细胞）是PRRSV的主要靶细胞，具有较高的亲嗜性。为了高效的对类NADC30的毒株进行分离，本实验采用PAM细胞进行病毒分离。本研究对20份来自不同猪场和地区的发病猪组织进行研磨过滤处理后，用PAM细胞进行病毒的分离，然后通过RT-PCR、IPMA等进一步鉴定，最终分离到了20株类NADC30毒株。4.2材料与方法4.2.1材料4.2.1.1病料的收集3.3.1中检测为类NADC30的20份PRRSV临床样品，具体信息如表4-1。表4-1类NADC30临床样品信息Table4-1NADC30-likeclinicalsampleinformationNO.样品名称样品类型采集地点120160817-1肺脏河南22016-32#血清河南32016060756扁桃体河南42016030277肺脏河南5201600213肺脏河南62016010082肺脏河南72016010063肺脏河南820160817-2肺脏河南40 9161402-2肺脏河南10161401-3肺脏河南11161392-2肺脏山东12161390-2肺脏河南13161343-1肺脏河南14161302-14扁桃体河南15170051-4淋巴结河南16170028-2肺脏河南17170010-4肺脏天津18161448-2淋巴结河南19161433-57肺脏山东20161405-1肺脏江苏4.2.1.2细胞猪肺泡巨噬细胞（PAM）由国家兽用药品工程技术研究中心制备保存。4.2.1.3主要试剂RPMI-1640干粉培养基购自GIBCOTM公司；胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；ViralNucleicAcidExtractionKit购自Geneaid公司；M-MLVRecerseTranscriptase（含5×Buffer）购自Promega公司；pEASY-Blunt克隆载体、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金公司；高保真的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase、dNTPMixture、DNAMarker、琼脂糖购自TAKARA公司；GelExtrationMiniKit购自OMEGA公司、2×TaqPCRMasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司；核酸染料购自Biotum公司；IPTG、X-gal、氨苄青霉素（ampicillin,Amp）均购自上海生工生物工程股份有限公司；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出物（YeastExtract）购自OXOID公司；其它普通生化试剂均为国产分析纯试剂。4.2.1.4主要仪器设备CO2细胞培养箱，购自ThermoScientific公司；生物安全柜，购自美国Nuaire公司；Mini台式离心机，购自德国Eppendorf公司；PCR仪，购自ABI公司，紫外透射分析仪，购自其林贝尔公司；琼脂糖凝胶电泳仪，购自美国Hoefer公司；紫外成像仪，购自美国UVP公司；pH计，购自梅特勒-托利公司；恒温培养箱，购自德国MMM公司；旋涡混合器，购自SCIENTIFICINDUSTRIESINC；恒温水浴箱，购自上海一恒公司；循环水浴箱购自PRIMA公司；倒置显微镜，购自奥林巴斯公司；空气浴震荡摇床，购自美国NBS公司；-20℃冰箱，购自青岛澳柯玛公司；微波炉，购自广东美的公司。伊红染液、盐酸、辣根过氧化物41 （HRP）标记的羊抗鼠lgG购自德国Sigma公司，苏木素染液购自北京雷根公司；二甲苯购自天津市凯通公司；中性树胶购自北京中杉金桥公司。4.2.1.5培养基配制RPMI-1640维持培养基（配制100mL）、RPMI-1640生长培养基（配制100mL）配制见2.2.1.3。4.2.2方法4.2.2.1PCR引物同3.2.2.1，见下表4-2。表4-2PCR检测引物Table4-2PrimersofPCRdetection引物序列(5'-3')扩增长度（bp）PRRSV-FGAATGGCCAGCCAGTCAATC436PRRSV-RGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACN681-FCTTTGATTGGGATGTTGTGCT681N681-RCAATGATGGCTTGAGCTGAGT4.2.2.2样品的准备在生物安全柜中，将4.2.1.1的20份组织用灭菌的剪刀各剪取1g左右的组织样品，剪碎后加入4ml的RPMI-1640基本培养基，震荡混匀。置于-40℃冷冻，组织完全冷冻之后，取出放室温融化，然后12000rpm离心5min，取上清用0.22微米滤器过滤除菌，滤液放置-40℃待用。4.2.2.3PRRSV的分离与培养4.2.2.3.1PAM细胞复苏将20份研磨液以每次1份的方式进行病毒分离，每次取两支PAM细胞，一支接种，一支作为空白对照组。具体操作如下：从液氮中取出2支PAM细胞于37℃恒温水浴锅中轻微摇动，解冻后在生物安全柜中将其分别移入已加入9mLRPMI-1640生长培养基的离心管中，室温800rpm离心5min，离心过后可见底部白色沉淀。在生物安全柜中，弃去培养基，向每支离心管中加入6-7mLRPMI1640生长培养基，吹打混匀至无肉眼可见细胞团块，各移入一个T25细胞瓶中，标记后放于37℃、5%CO2的培养箱培养。4.2.2.3.2接种研磨液在细胞复苏约24h后，显微镜观察，细胞呈单层分布，细胞形态为边缘光滑的圆球状。确定细胞状态良好后，弃去培养基，一瓶对照细胞换新鲜的培养基，一瓶细胞接种1ml研磨后的样品，轻轻水平晃动细胞瓶令研磨液液均匀覆盖细胞。37℃、5%CO2的培养箱中吸附1h，结束后，弃去样品，用无血清RPMI1640培养基轻轻洗涤1次，每个T25细胞瓶中42 补加6-7mL4%RPMI1640维持培养基，放入37℃、5%CO2的培养箱继续培养。逐天在显微镜下观察细胞病变，至接种瓶细胞病变效应达80%时，收获细胞培养物。所收获细胞培养物均置于-20℃冻存。将冻存细胞培养物标记为P1代，然后用P1代细胞培养物取1ml接种新复苏的PAM细胞中，待病变达80%，收获细胞培养物标记为P2代。如此反复接种至P3代收获冻存，完成1株病毒的分离。通过这个方式完成对20株类NADC30毒株的分离。4.2.2.4PRRSV的分离病毒的检测由4.2.2.3PAM细胞分离收获的P1、P2、P3代细胞培养物，取200μL提核酸、反转录。步骤同2.2.2.3，2.2.2.4。4.2.2.4.1RT-PCR检测以PAM病毒分离获得的P1代、P2代、P3的cDNA代为模板进行PCR检测，分别用引物PRRSV-F/R、N681F/R进行扩增，这两对引物反应体系及程序相同。RT-PCR的反应体系为：2×TaqPCRMasterMix10μLddH2O8μL10pM上游引物0.5μL10pM下游引物0.5μL共20μL体系反应程序：94℃预变性3min94℃变性30s55℃退火30s72℃延伸40循环30次72℃延伸7minPCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳。4.2.2.4.2免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）鉴定（1）将4.2.2.3获得的20株PRRSV类NADC30毒株进行IPMA鉴定，以毒株20160817-1为例，将PAM细胞分离的一株类NADC30毒株与阴性对照组接种在铺满单层PAM细胞的24孔细胞培养板（孔内放上爬片）（1.1×105个细胞/孔）；接种24h后，弃掉细胞培养上清，用PBS洗涤3次，室温干燥10min；每孔加350μL80%冷丙酮固定20min（4℃进行），用PBS43 洗涤3次；每孔加350μL0.25%Trition（PBS配制）作用10min后弃去，PBS洗涤3次，弃去PBS后将细胞板甩干净，然后将爬片取出进行后续试验。（2）爬片的固定：取出爬片，滴一滴中性树胶于载破片中央，将细胞爬片反面盖在中性树胶上，使两者粘贴牢固；（3）爬片与抗体作用：用免疫组化笔在细胞爬片周围画圈，防止单抗溢出。滴加40倍稀释的PRRSV单抗于爬片表面，湿盒内37℃孵育1h，甩去一抗，PBS洗涤5次，每次5min；滴加100倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，湿盒内37℃孵育50min，甩去一抗，PBS洗涤5次，每次5min；（4）显色：滴加DAB至爬片上，室温下避光显色4min（显微镜下控制显色时间），水洗，苏木素复染10s，水洗；（5）脱水：70%乙醇1min，80%乙醇1min，90%乙醇1min，100%乙醇1min；（6）透明：二甲苯I3min，二甲苯II5min；（7）封片：滴一滴中性树胶于载破片中央，将细胞爬片正面盖在中性树胶上，避免产生气泡；（8）光学显微镜下观察，拍照保存；结果判定：阴性对照本地清晰，背景无特异着色；样品细胞胞质见黄色至棕黄色着染判定为阳性。4.3结果与分析4.3.1PRRSV分离培养结果将测序结果确定为类NADC30的20份组织样品分批次（每次1株）接种PAM细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞接种组织样品后24h、36h、48h、72h对细胞进行观察，发现36h可观察到轻微CPE，48h后表现为变圆、皱缩、折光性增强、聚堆等典型病变特征，72h细胞逐渐脱落，收获细胞培养物。对照细胞正常（见图4-1）。通过这种方法一共完成20株PRRSV类NADC30的分离。AB图4-1类NADC30分离株20160817-1在PAM细胞上的CPEFig.4-1CPEofPAMcellsinfectedwithNADC30-likeisolate20160817-1注：A：PAM细胞对照，B：接种PAM细胞72h;Note:A:PAMcellcontrol,B:PAMcellsinoculated72h;44 4.3.2PRRSV的分离病毒的检测4.3.2.1RT-PCR检测从PAM的P1、P2、P3代细胞培养液中抽提RNA，反转录，采用PRRSV检测引物PRRSV-F/R进行PCR，可扩增出436bp的特异性条带（图4-3）；用分型引物N681F/N681R进行PCR，可扩增出681bp的特异性条带，用本实验室已分离鉴定的JXA1、以及类NADC30毒株HNjz15（图4-2）作阳性对照，表明该分离株20160817-1为类NADC30毒株。图4-2类NADC30毒株分离样品的RT-PCR检测Figure4-2RT-PCRdetectionofisolatedNADC30strains4.3.2.2IPMA鉴定对20份完成分离的类NADC30毒株进行IPMA鉴定，以分离株20160817-1为例操作如下：将20160817-1P3代细胞培养液以及空白对照组分别接种24孔板中的PAM细胞，接种24h后用80%冷丙酮固定，然后进行IPMA鉴定，显微镜下观察，PRRSV感染细胞孔染色呈棕红色，正常对照细胞对照孔无着色反应（图4-3）。表明PRRSV类NADC30毒株20160817-1能够在PAM细胞中增殖，病毒分离成功。AB图4-3类NADC30毒株20160817-1的IPMA鉴定试验（200×）Figure4-3IPMAtestofPRRSVNADC30-like（200×）注：A为对照PAM细胞，B为类NADC30毒株20160817-1Note:A：controlPAMcell，B：NADC30strain20160817-145 4.4讨论病毒分离和鉴定是最准确的疾病诊断方法，也是疫苗研发，疾病预防控制和治疗机制研究和开发的基础和前提。PRRSV具有严格的宿主细胞特异性，只能感染体外培养的猪肺泡巨噬细胞和来源于MA-104（Marc-145，CL2621，HS.2H）的几种亚细胞系。通常，Marc-145细胞优先用于PRRSV的分离和鉴定。然而，PRRSV毒株的细胞嗜性是有很大不同的。并非所有毒株都可以在Marc-145细胞上增殖。研究表明，大多数欧洲毒株PRRSV主要在PAM上分离。对于PRRSV美洲型毒株，HP-PRRSV能在感染Mars-145细胞后快速产生CPE，然而研究表明HB（sh）/2002只能适应PAM细胞。2012年，中国开始报道类NADC30毒株的出现。张洪亮[112]等对17株类NADC30进行全基因进化分析并对毒株进行分离，结果发现17株毒株中仅有2株能能感染Marc-145细胞并产生明显的CPE。赵蕾[113]对全国部分地区的PRRSV进行分析并对34株类NADC30通过感染Marc-145细胞进行分离，仅成功分离到3株。由此可见，类NADC30毒株能否在Marc-145细胞上增殖可能与类NADC30毒株感染的分子机制有关，因此为了进一步对类NADC30毒株的嗜性进一步研究，大量的数据收集是十分必要的。本研究通过PAM细胞对20株类NADC30毒株进行分离，结果20株在PAM细胞上均观察到CPE。在本实验研究中，完成病毒分离后，又通过RT-PCR以及IPMA对毒株进行鉴定检测，结果显示成功分离获得20株类NADC30毒株。本研究对河南及周边地区的发病猪场及采集到的病料进行前期处理鉴定，接种PAM细胞进行病毒分离，病毒接种PAM后第一代即可观察到明显的病变，对第三代病毒液进行RT-PCR以及IPMA鉴定，RT-PCR通过用设计的PRRSV-F/R、N681-F/R引物进行分析鉴定，结果显示为PRRSV毒株分型鉴定为类NADC30。4.5小结对检测为类NADC30的样品接种PAM细胞进行病毒分离，RT-PCR和IPMA鉴定表明成功分离获得20株类NADC30毒株。46 第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株全基因序列测定与分析5.1引言猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的急性高度传染性疾病。自2012年以来，国内学者和机构分离到与美国NADC30毒株同源性较高的毒株如HENAN-XINX、HENNAN-HEB、JL580、HNjz15等毒株[62-64]，2014年以来，类NADC30在我国流行已成加剧之势，给我国的养殖业带来了巨大的经济损失[65]。本实验通过河南及周边地区分离到的20株类NADC30毒株进行全基因测序，并对遗传性和重组性进行分析，进一步明确了类NADC30毒株的全基因组特征，为该类毒株的研究和防控提供数据支持。5.2材料和方法5.2.1材料5.2.1.1病毒样品4.3中PAM细胞分离的类NADC30病毒的P3代细胞培养物，共20份。具体信息见表5-1。表5-120株类NADC30PRRSVs的分离信息Table5-1Theinformationofthe15NADC30-LikePRRSVs序号分离株采集时间采集地点120160817-12016河南22016-32#2016河南320160607562016河南420160302772016河南52016002132016河南620160100822016河南720160100632016河南820160817-22016河南47 9161402-22017河南10161401-32017河南11161392-22017山东12161390-22017河南13161343-12017河南14161302-142017河南15170051-42017河南16170028-22017河南17170010-42017天津18161448-22017河南19161433-572017山东20161405-12017江苏5.2.1.2主要试剂同3.2.1.2。5.2.2方法5.2.2.1引物设计参考PRRSVNADC30株（GenBankaccessionno.JN654459）全基因序列应用Primer5.0软件设计12对引物（见表5-2）用于全基因扩增，12对引物由金唯智生物科技有限公司合成。表5-2PRRSV全基因扩增引物Table5-2PRRSVwholegeneamplificationprimers片段长序号引物名称引物序列(5'-3')扩增位置度(bp)ATGACGTATAGGTNADC1F1-21GTTGGCT1438bpGGAAAGATCGCAGNADC1R419-439AAAGCCAGCAGGGTGTTTRTGNADC2F233-252GCRGAGG21617bpCAGTCAAGGCARGNADC2R1830-1849CAGGRTCGGGCGACTGATGA3NADC3F1594-16141598bpAGATCTTG48 ACCAACGGTAAGGNADC3R3171-3191TCGCTCTCCAAGCAGTTCCCTNADC4F2815-2834GTCAAGC41653bpGGACGAGGTTTGANADC4R4445-4467GGTAGAGTAGGCCGRAGYCCCATNADC5F4153-4171TGAGCA51906bpAGAGCTGCTGTTANADC5R6036-6058GAAGCCTGATTTCCTCCTGTGGANADC6F5874-5895GAATGATGG61500bpTCTTTACCGCTGTCNADC6R7349-7373TCAGTAACAACCAGGGCCTGACTANADC7F7275-7295AGGAGCAG71737bpCTGCGAGAATCCTNADC7R8992-9011GTCACGGTTTCAGACAGACCNADC8F8903-8926CAAAGAAGACA81501bpCCAGGTTGACAGGNADC8R10385-10403YGTGCYCATTCAACCAGATNADC9F10084-10108TACAGAGACAAG91824bpCATAGGATCTTCTGNADC9R11883-11907TAATTGCTCAGCCATTTTGTTTGGCNADC10F11787-11805TTCAC101760bpCAGCTCACATATCNADC10R13526-13546GTCARGTTTGTGGTGTATCGTNADC11F13446-13464GCCGTT111565bpGCATGGTTCTCGCNADC11R14992-15010CAATTAGCCCCATTTTCCTCNADC12F14653-14675TAGCGACTG12368bpTTTTTTTTTTTTTTNADC12R15020TTTTTTTTTTTTTT49 5.2.2.2分子生物学分析软件lasergenepackage(DNASTARInc.)：用于对测序的目的序列进行拼接、序列比对、同源性分析。PrimerPremier5：用于设计引物序列。MEGA6.0：用于进行遗传进化分析。SimPlotv3.5.1：用于进行重组分析5.2.2.3RNA提取与PCR扩增、克隆及测序按照ViralNucleicAcidExtractionKit进行20株类NADC30毒株的RNA提取，将反转录获得的cDNA用于全基因各个片段的扩增，克隆及测序的具体方法参照2.2.2.1。5.2.2.4全基因序列同源性分析利用lasergenepackage(DNASTARInc.)软件对获得的全基因序列进行遗传进化分析。5.2.2.5全基因序列遗传进化分析利用MEGA6.0绘制遗传进化树，进行系统发育学分析。5.2.2.6序列重组分析采用SimPlotv3.5.1对PRRSV代表病毒进行基因重组分析。分别选取每种类型毒株地代表株包括国内外经典株CH-1a和VR2332、HP-PRRSVJXA1株、NADC30作为参考序列。5.3结果与分析5.3.1全基因扩增根据所设计的12对特异性引物，采用RT-PCR，对20个毒株基因组序列进行分段扩增。以161390-2为例，经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下观察到12条与预期片段大小一致的电泳条带（见图5-1）。经转化克隆送测序后，拼接获得161390-2全基因组序列，长度为15047bp，通过这种方法一共获得了20株类NADC30全基因序列。图5-1RT-PCR扩增PRRSV161390-2全基因组各片段Fig.5-1AmplificationofPRRSV161390-2genomebyRT-PCR注：1：1~12分别为12对引物扩增片段，M：Marker20005.3.2同源性分析利用lasergenepackage(DNASTARInc.)软件对获得全基因序列与国内外常见PRRSV代表毒株的全基因序列同源性分析（图5-2），20株全基因序列的核苷酸之间的同源性为50 86.8%-93.8%，与VR2332的同源性为85.1%-88.2%，与CH-1a的同源性为84.2%-90.8%，与NADC30的同源性为88.3%-96.7%，与JXA1的同源性为83.5%-93.0%。图5-220株类NADC30PRRSVs的同源性分析Fig.5-2Homologyanalysisof20strainsofNADC30PRRSVs5.3.320株类NADC30毒株的全基因序列遗传进化分析利用MEGA6.0软件对20株类NADC30全基因序列与国内外报道中常用代表毒株进行系统进化树分析（见图5-3），基于全基因组核苷酸序列的遗传进化分析结果表明，分离到的20株类NADC30毒株其中19株均位于第5亚型，1株（161433-57）位于第4亚型。51 图5-320株类NADC30PRRSVs和45株参考株的全基因组遗传进化分析Fig.5-3Phylogenetictreebasedonthewholegenomeofthe20NADC30-LikePRRSVsand45referencestrains注：20株PRRSV类NADC30毒株以及中国和美国的参考毒株分别用▲，●and○表示Note:Theisolatesof20NADC30-LikePRRSVand45referencestrainsisolatedfromChinaandUSAindicatedby▲，●and○，respectively5.3.4类NADC30毒株基因重组分析采用Simplot软件，对代表病毒的全基因组序列进行分析，DistanceOptions选择Kimura。Windowsize设为500bp，stepsize为20bp。将获得的一株类NADC30毒株作为Query序列（见图5-4），与国内外报道的美洲型代表株（CH-1a、JXA1、VR2332、NADC30）共同做Simplot分析。结果显示:对20株类NADC30毒株进行全基因序列的分析，其中有19株发生重组现象，在这19株中只有1株仅与次要结构蛋白发生重组，其余样品中4株在结构蛋白和非结构蛋白处均发生重组，14株仅与非结构蛋白发生重组。在重组的毒株类型方面，19株中有11株与HP-PRRSV毒株发生重组，有3株与经典株发生了重组，其余5株与经典株和HP-PRRSV均发生了不同程度的重组现象(见表5-3)。52 图5-4PRRSV毒株161433-57的重组分析Fig.5-4RecombinationanalysisofPRRSV161433-57strains.表5-3以NADC30毒株为亲本病毒株的20株类NADC30PRRSVs的重组信息分析结果Table.5-3Recombinationanalysisofthe20NADC30-LikePRRSVbasedonparentalstrainNADC30提供重组片段病毒株重组位置重组区域的毒株20160817-1402-2094;5668-9053ORF1a;ORF1bJXA1JXA1/VR23322016-32#6007-8330ORF1a;ORF1bCH-1aVR2332/201606075612564-13114ORF3-ORF4CH-1a20160302771-1396;5520-82285'UTR-ORF1bJXA1/CH-1a201600213465-656ORF1aJXA12016010082NoneNoneNone20160100631-4655'UTR-ORF1aJXA120160817-2444-2115;5690-9095ORF1a-ORF1bJXA1161402-21-1861;7932-83125'UTR-ORF1bCH-1a、JXA11-2179;7889-82705'UTR-ORF1b161401-3JXA112331-13875;14213-15419ORF4;ORF6-3'UTR161392-27995-8270ORF1bVR2332161390-21-4235'UTR-ORF1aVR2332161343-1677-1163ORF1aJXA11-1861;5499-6874;5'UTR-ORF1b;161302-14VR2332、JXA17983-8249;14086-15715ORF6-3'UTR170051-4508-1375;12521-13262ORF1a；ORF3-ORF4CH-1a、JXA153 5'UTR-ORF1b；ORF3-170028-2-2094;5668-7995;12394-13177JXA1ORF4170010-40-3285'UTR-ORF1aJXA15'UTR-ORF1a；ORF3-161448-21-1502;12331-13769JXA1ORF5161433-571-2221;4146-125005'UTR-ORF3JXA1161405-11-423;5986-6980;11252-115065'UTR-ORF1bJXA1本表采用的参考毒株仅代表可能发生重组的毒株类型。5.4讨论PRRSV是对我国养殖业造成巨大损失的疾病之一，该病主要引起母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸困难。为了进一步了解该毒株的基因组特点，本实验对20株类NADC30进行全基因组测序及序列分析。本实验分离到的19株类NADC30毒株均为第5亚型，1株（161433-57）位于第4亚型。20株全基因序列的核苷酸之间的同源性仅为为86.8%-93.8%，且不同地区分离到的PRRSV同源性较低，因此，这种广泛流行于我国的PRRSVs的来源值得进一步的研究。PRRSV的重组现象一直是广泛关注的焦点之一，目前文献对类NADC30的报道主要集中在其重组特性上，Li等[114]报道HNyc15为NADC30与PRRSV经典株的重组毒株，Zhao等[63]报道JL580是NADC30与HP-PRRSV的重组毒株，Bian等[67]报道TJnh1501是MLV与NADC30发生重组的毒株。本研究利用Simplot软件对20株类NADC30毒株进行重组分析，除了2016010082之外，其余的19株均存在重组现象，这20株毒株均是以NADC30为亲本进行重组，可见重组已成为类NADC30毒株的突出特点。其中最特殊的毒株161433-57重组分析表明：在0-2221；4146-12500片段均与HP-PRRSV毒株大片段发生重组，重组位置包含了5‘UTR、部分ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、部分ORF3，涵盖了HP-PRRSV大部分的非结构蛋白和结构蛋白，然而分子特征上其具有类NADC30毒株的131个氨基酸不连续缺失的分子特征。该毒株的出现暗示着HP-PRRSV毒株与类NADC30毒株的遗传关系由于PRRSV重组能力的增强而变得模糊。总之，本研究对20株类NADC30PRRSVs进全基因序列的详细分析，对这类毒株进行详细的研究和阐述，一方面丰富了该类毒株的基因组信息，另一方面为这类毒株的进一步研究和防控提供了重要的数据支持。5.5小结测序获得20株类NADC30毒株的全基因组序列，遗传分析表明19株位于第5亚型，1株（161433-57）位于第4亚型。重组性分析结果显示20株类NADC30毒株有19株发生重54 组，1株（2016010082）未发生重组。其中大部分与HP-PRRSV发生重组，重组位置多分布在非结构蛋白。55 第六章结论一、建立了PRRSV分型PCR方法，该RT-PCR检测方法可以区分PRRSV经典株、HP-PRRSV、类NADC30毒株，具有良好的敏感性和特异性，能够有效地检测临床样品。二、本研究对756份临床样品进行RT-PCR检测，共检出PRRSV阳性样品139份，阳性率18.4%。139份阳性样品中类NADC3055份，HP-PRRSV84份，分布于50个不同的猪场，每个猪场选1份进行GP5、nsp2扩增，最终扩增得到42个nsp2序列和50个GP5序列。三、利用肺泡巨噬细胞（PAM）分离获得20株类NADC30病毒，RT-PCR和IPMA鉴定表明分离成功。四、获得的20株类NADC30的全基因组序列进行遗传进化分析表明19株位于第5亚型，1株（161433-57）位于第4亚型。重组分析显示有19株发生重组，2016010082未发生重组。其中大部分与HP-PRRSV发生重组，重组位置多分布在非结构蛋白。56 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IsolationandIdentificationofNADC30-likePorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusstrainsandSequencingandAnalysisofWholeGenomesSupervisor:Prof.TianKe-gongMasterCandidate:LiYan-linABSTRACT:ThisstudywasconductedtoisolatetheNADC30-likevirusstrainsandsequencethewholegenomeofthem,sothatwecouldunderstandthemolecularcharacteristicsandgeneticevolutionofthevirusstrainsandconductafurtherstudyonthem.Atthesametime,detectingthegenovariationofORF5andnsp2genesinPRRSVstrainswhichweretheepidemicstrainsinHenanandsurroundingareas,torevealthelatestdevelopmenttrendofPRRSVstrains,andprovideascientificevidenceforclinicaldiagnosisandthedevelopmentofnewvaccinesandantiviraldrugs.I.EstablishthePCRmethodsofPRRSVtypingvirusstrainsInordertodetectNADC30-likestrainsmorequicklyandaccurately,thisexperimentwasbasedonthemolecularcharacteristicsofthedeletionof131aminoacidsandtheno-deletionof30aminoacidsinthensp2regionofthePRRSVNADC30strain,theHP-PRRSVstrainandtheclassicalPRRSVstrain,todesignapairofprimersandestablishaPCRmethodtoclassifythesethreetypesofstrains.ThisexperimentcompletedtheestablishmentoftheRT-PCRmethod,andverifiedthesensitivityandspecificityofit,andtestedtheclinicalsamples.TheresultsoftheexperimentshowedthatthismethodcandistinguishtheclassicalPRRSVstrains,HP-PRRSVstrainsandNADC30strainsatthesametimewithgoodsensitivityandspecificity.II.MoleculardetectionofPRRSVinHenanprovinceanditssurroundingareasduring2016to2017,andtheanalysisofmutationsinORF5andnsp2genesInthisstudy,756clinicalsamplesweredetectedbyRT-PCRmethodwhile139positivesamplesweredetectedwithapositiverateof18.4%,and42nsp2sequencesand50GP5sequenceswereamplified.Geneticevolutionshowedthatthe68 predominantstrainsinHenanweremainlyAmericantypestrains,20strainsarehighlyhomologoustotheNADC30strainsandthereisadiscontinuousdeletionof131aminoacidsinthensp2region.Thesequencesoftheremaining22strainsarehighlyhomologoustoHP-PRRSVstrains,withadiscontinuousdeletionof30aminoacidinnsp2region.Comparedto2016,theproportionofNADC30-likestrainsinHenanandsurroundingareashadincreaseddramaticallyin2017,andGP5andnsp2ofthePRRSVepidemicstrainshadasignificantvariation,soitisnecessarytocontinuouslydetecttheprevalenceandvariationofPRRSVandprovideascientificevidenceforclinicaldiagnosisanddiseasecontrolandprevention.III.Isolationandidentificationof20samplesofNADC30-likestrainsAfterthevirusisolationofthesampleswhichweredetectedasNADC30-likestrainsinoculatewithPAMcells,20NADC30strainswereobtained.TheRT-PCRresultsshowedthattheisolatedstrainsweobtainedcouldamplifythetargetbands,andtheIPMAidentificationresultsshowedthatallthesampleswerepositiveforPRRSV.IV.SequencingandanalysisofthewholegeneofNADC30-likestrainsofPRRSVInthisstudy,thewholegenesequencesof20NADC30-likestrainswereobtained,andtheirgeneticevolutionanalysisandhomologyanalysiswereperformed.Theresultsshowedthatthehomologyofwholegenomenucleotidesbetween20strainswas86.8%-93.8%,thehomologywithVR2332was85.1%-88.2%,andthehomologywithCH-1awas84.2%-90.8%.ThehomologywithNADC30is88.3%-96.7%,andthehomologywithJXA1is83.5%-93.0%.Thegeneticevolutionanalysisshowedthat19strainsbelongtosubtype5and1strainbelongstosubtype4.Theresultsofrecombinationanalysisof20strainsshowedthat19strainswererecombined,1strainwasnotrecombinedwhiletherecombinationsitesmostlyoccurredinnon-structuralproteinsandtherecombinantstrainwasmainlyHP-PRRSVstrains.ThisstudyprovidesareferenceforfurtherstudyonthemutationandgeneticevolutionofNADC30-likestrainsinChina.69 Keywords:PRRSV;nsp2gene;ORF5gene;HP-PRRSVstrains;NADC30-likestrains;mutation;recombination70