资源描述：
《“益肾调督”法电针对阿尔茨海默病模型大鼠海马炎性细胞因子的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
中图分类号密级公开ＵＤＣ学号１巧１５１２１２５．測巧中度综大ｆ＠）Ｈｕｂ＾ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ预±穿值巧文ＭＡＳＴＥＲＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ＂＂益督调督法电针对阿尔茨海默病模型大鼠海马炎性细胞因子的影响ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎＨｉｐｐｏｃａｍｐａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｔｏｋｉｎｅｓｂｙｔｈｅｙＫ＿ｆｏｒｃ－ｉｄｎｅｙ巧ｉｎｉ打ａｎｄＤｕＭｅｒｉｄｉａｎｒｅｕｌａｔｉｎｇｇｇＥｌｅｃｔｒｏａｃｕｕｎｃｔｕｒｅｉｎ乂Ｉｚｈｅｉｍｅｒ含ｄｉｓｅａｓｅｒａｔｐ研究生姓名：王文杰指导教师独名、职称：杜艳军教授申请学位：區学硕壬学科（专业）名称：针灸推拿学研究方向：针灸防治脑病的研究学位类型：学术学位型湖北中医药大学二〇—六年五月Ｈ十曰 湖化中医药大学学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了论文中特别加ｗ标注和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖北中医药大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在论文中作了明确的说明。本人完全意巧到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年月曰Ｊ扣？关于学位论文使用授权的声明本人完全了解湖北中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，印：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可１＾义公布学位论文的全部或部份内容，可Ｗ采用复印、缩印或其他手段保留学位论文；学校可１＾乂根据国家或湖北省有关部口的规定送交学位论义。同意《中国优秀博硕去论文全文数据库出版章程》的内容。同意授权中国科学技术信息研究所将本人学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保密论文在解密后遵守此规定）论文作者签名：至＾４＾贫＞导师签名：－＾＾＾＾＾＞／知Ｉ月如曰 本课题来源于国家自然科学基金（81473786）国家自然科学基金（81273864） 目录中文摘要.....................................................I英文摘要...................................................III英文缩略词对照表............................................VI前言.......................................................1材料与方法...................................................41实验材料................................................42实验方法................................................5结果......................................................121电针对AD模型大鼠行为学的影响..........................122电针对各组大鼠血清炎性因子的影响.......................133电针对各组大鼠海马区IL-10、IFN-γ表达的影响...........134电针对各组大鼠海马区IL-10、IFN-γ蛋白水平表达的影响...165电针对各组大鼠星形胶质细胞与IL-10共定位表达的影响.....17讨论......................................................201祖国医学对阿尔茨海默病的认识...........................202现代医学对阿尔茨海默病的认识...........................243动物模型选择依据.......................................274选穴依据...............................................275外周及中枢炎性因子与AD................................276星形胶质细胞与AD神经炎症..............................287“益肾调督”法电针治疗AD的机理探讨.....................30结语......................................................32参考文献....................................................33综述......................................................37致谢......................................................45 中文摘要目的：阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD），是一种发病于老年期的原发性大脑退行性疾病，多隐匿起病，以进行性认知功能障碍和精神异常为主要临床表现。AD的确切病因与发病机制至今不明，但持续性炎性反应是AD形成与发展的重要机制之一。本课题采用微量注射法,向双侧大鼠海马微量注射Aβ1‐42来制备AD大鼠模型，通过观察电针对AD模型大鼠行为学的改变、血清及脑内炎性因子的水平，来探讨星形胶质细胞在AD模型大鼠中的作用机制以及针刺干预的影响，以期为AD的针刺治疗提供新的依据。方法：将40只健康雄性Wistar大鼠，随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组。每组10只。用微量注射法向大鼠海马注射Aβ1‐42制备AD大鼠模型,假手术组以生理盐水替代Aβ1‐42进行微量注射。正常组、模型组、假手术组不做任何治疗；电针组在造模的基础上电针“百会”“肾俞”穴，采用连续波，频率5Hz，强度1mA,持续20min,一日一次，6天一个疗程，共2个疗程，疗程间休息一日。电针治疗结束后，（1）用Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力，（2）运用ELISA法检测血清中IL‐10、IFN‐γ的水平，（3）运用免疫组化法、Western‐Blot法检测大鼠海马IL‐10、IFN‐γ蛋白的表达变化，（4）采用荧光双标法检测大鼠海马星形胶质细胞++GFAP/IL‐10表达的变化。结果：（1）行为学观察：与模型组比较，电针组逃避潜伏期明显缩短（P<0.01），通过平台次数明显增加（P<0.05）。（2）血清炎性因子：与正常组比较，模型组IL‐10明显减少（P<0.01），IFN‐γ明显升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组IL‐10明显升高（P<0.01），IFN‐γ明显降低（P<0.05）。（3）海马炎性因子：与正常组比较，模型组IL‐10蛋白表达明显减少（P<0.01），IFN‐γ蛋白表达显著升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组IL‐10蛋白表达明显升高（P<0.01），IFN‐γ蛋白表达明显降低（P<0.05）。I （4）星形胶质细胞与炎性因子共定位表达：与正常组比较，模型组++++GFAP/IL‐10表达显著升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组GFAP/IL‐10表达显著升高（P<0.05）。结论：AD模型大鼠促炎因子IFN‐γ表达上调，抗炎因子IL‐10表达下调：即存在抗炎因子/促炎因子表达失衡现象，同时伴随星形胶质细胞的激活；电针可以有效的改善AD大鼠的学习记忆能力，增加抗炎因子IL‐10的表达，减少促炎因子IFN‐γ的表达，并且炎症因子的水平在脑中和血清中（中枢和外周）变化趋势相一致；同时激活星形胶质细胞表达抗炎性因子IL-10。提示星形胶质细胞的激活参与了AD的发生发展，介导了抗炎因子/促炎因子的失衡状态；电针干预可以下调促炎细胞因子的表达，上调抗炎因子的表达，并激活星形胶质细胞表达抗炎性因子，从而有效抑制AD炎症级联反应的发展，达到改善AD症状的目的。关键词：阿尔茨海默病；电针；星形胶质细胞；炎性细胞因子II InfluenceonHippocampalAstrocyteinflammatorycytokinesbytheKidney-reinforcingandDuMeridian-regulatingElectroacupunctureintheAlzheimer'sdiseaseratSpeciality:AcupunctureandMassageAuthor:WangWenJieSupervisor：ProfessorDuYanJunABSTRACTObjective:Alzheimer'sdisease(Alzheimer'sdisease,AD),isakindofdiseasesonsetinoldagewhichisprimarydegenerativebraindisease,mostlyhiddenonset,progressivecognitivedysfunctionandabnormalspiritasthemainclinicalmanifestations.TheexactetiologyandpathogenesisofADisunknown,ButpersistentinflammatoryreactionisoneoftheimportantmechanismsfortheformationanddevelopmentofAD.ThissubjectadoptsthebilateralhippocampalmicroinjectioninwithinAβ1-42tothepreparationofADmodelrats,byobservingtheelectroacupunctureforADmodelratsbehaviorchange,thelevelofinflammatoryfactorsserumandbrain,ToexploretheroleofastrocytesinADmodelratsandtheeffectofacupunctureintervention,inordertoprovideanewbasisforthetreatmentofAD.Methods:40healthymaleWistarrats,wererandomlydividedintonormalgroup,electroacupuncturegroup,Shamoperationgroup,modelgroup.10ratsineachgroup.ADratmodelwaspreparedbyIII micro-injectionofAβ1-42intorathippocampus,andtheShamoperationgroupwithnormalsalineinsteadofAβ1-42microinjection.Thenormalgroup,modelgroup,theshamoperationgroupwithoutanytreatment;Theratsintheelectroacupuncturegroupacupuncture"Baihui"and"Shenshu"point,USESthecontinuouswave,frequencyof5Hz,theintensityof1mA,for20min,onceaday,6daysacourseoftreatment,atotalof2coursesoftreatment,between2courseshasadaytorest.Aftertheelectroacupuncturetreatment,(1)usingMorrisWaterMazetoobservethelearningandmemoryabilityofrats,(2)usingthemethodofELISAtodetectthelevelsofserumInflammatoryfactorsIL-10、IFN-γ,(3)TheexpressionchangesofIL-10andIFN-γinrathippocampusweredetectedbyimmunohistochemicalmethodandWestern-Blotmethod,(4)Usingdoubleimmunofluorescencelabelingmethoddetectionofrat++hippocampalastrocytesGFAP/IL-10expressionchanges.Results:(1)thebehavioralobservation:comparedwithmodelgroup,theelectroacupuncturegroupescapelatencywassignificantlyshortened(P<0.01)thenumberofacrossplatformobviouslyincreased(P<0.05).(2)Seruminflammatoryfactors：comparedwithnormalgroup,themodelgroupserumIL-10decreasedsignificantly(P<0.01),IFN-γincreasedsignificantly(P<0.05);Comparedwithmodelgroup,theserumlevelsofIL-10electroacupuncturegroupwasobviouslyincreased(P<0.01),IFN-γsignificantlydecreased(P<0.05);(3)hippocampusinflammatoryfactors:comparedwithnormalgroup,modelgroupIFN-γproteinexpressionwassignificantlyincreased(P<0.05),IL-10proteinexpressiondecreasedsignificantly(P<0.01);Comparedwithmodelgroup,thecurativegroupofIL-10proteinexpressionwassignificantlyIV increased(P<0.01),IFN-γproteinexpressiondecreasedsignificantly(P<0.05).(4)Co-locationexpressionofastrocytesandinflammatoryfactors:comparedwithnormalgroup,modelgroup++GFAP/IL-10expressionincreasedsignificantly(P<0.05),compared++withmodelgroup,theelectroacupuncturegroupGFAP/IL-10expressionsignificantlyincreased(P<0.05).Conclusion:ADmodelratspro-inflammatoryfactorIFN-γexpressionincreased,anti-inflammatoryfactorIL-10expressdecreased,withtheexcessiveactivationofastrocytesatthesametime;ElectroacupuncturecaneffectivelyimprovethelearningandmemoryabilityofADrats,increasetheexpressionofanti-inflammatoryfactorsIL-10,reducetheexpressionofpro-inflammatoryfactorIFN-γ,andinflammatoryfactorlevelsinthebrainandserum(centralandperipheral)consistenttrends;Atthesametime,activatedastrocytesexpressanti-inflammatorycytokineIL-10.IndicatedthatAstrocyteactivationisinvolvedintheoccurrenceanddevelopmentofAD,mediatedbyimbalanceofpro-inflammatory/anti-inflammatoryfactor;Electroacupuncturecandownregulatetheexpressionofproinflammatorycytokinesandexpressionofanti-inflammatorycytokines,andactivatetheexpressionofastrocytesexpressanti-inflammatoryfactor,thuseffectivelyinhibitADinflammatorycascadedevelopment,ToachievethepurposeofADsymptomaticimprove.Keywords:Alzheimer'sdisease;Electroacupuncture;Astrocytes;Inflammatorycytokines.V 英文缩略词对照表缩略词英文全称中文全称ADAlzheimer'sdisease阿尔茨海默病AβAmyloidβ-protein淀粉样蛋白SPsenileplaques老年斑NFTsneurofibrillarytangles神经原纤维缠结AcAstrocytes星形胶质细胞CNScentralnervoussystem中枢神经系统BBBbrainbloodbarrier血脑屏障NVUnervevascularunit神经血管单元GFAPglialfibrillaryacidicprotein胶质原纤维酸性蛋白IL-10Interleukin-10白细胞介素-10IFN-γInterferon-γγ干扰素BACE1β-secretaseβ-分泌酶APPamyloidprecusorprotein淀粉样前体蛋白CAAcerebralamyloidangiopathy脑血管淀粉样变性ACEangiotensinconvertingenzyme血管紧张素转换酶NEPneprilysin脑啡肽酶VI 前言阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）是一种发病于中老年的原发性大脑退行性疾病，多隐匿起病，以进行性认知功能障碍和精神异常[1]为主要临床表现。AD脑内的主要病理改变为：神经元外的淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）聚集形成老年斑（senileplaques,SP）、神经元内Tau蛋白异常磷酸化形成神经原纤维缠结（neurofibrillarytangles,NFTs），及大量的神经元丢失。主要发生在大脑的新皮质、海马、Meynert基底核和蓝斑核等部位。另外，神经元突触功能异常，线粒体功能紊乱，锥体神经细胞丢失以及乙酰胆碱等神经递质的大量降解也是较为[2]常见的病理改变。AD的病因与发病机制至今未明，目前提出的假说包括，基因突变、Aβ过度累积、慢性炎症反应、氧化应激、蛋白酶体抑制和高胆固醇水平等，另外细胞自噬也是当前的研究热点。最近的研究表明，所有这些发病机制假说是有内在联系的，神经炎症是所有这些因素的主要调[3]节因子。有研究表明，在AD患者和动物模型的海马区，除了神经元缺失，同时伴有星形胶质细胞（Astrocytes，Ac）的大量激活，和神经炎症互为[4]因果，最终导致AD的病理进程。星形胶质细胞是中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）中数量最多、种类最多的胶质细胞。星形胶质细胞最主要的形态特点是表达有参与形成细胞骨架的中间丝蛋白神经胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP），因此GFAP常被作为鉴别体外培养的星形胶质细胞的特异性标志物。星形胶质细胞在维持血脑屏障（brainbloodbarrier，BBB）的通透性、构成神经血管单元（nervevascularunit，[5]NVU）、协调神经元能量代谢的平衡等方面发挥重要作用。研究显示，星形胶质细胞在AD中可能有两方面的作用：一方面，星形胶质细胞可分泌[6]神经营养因子，支持神经元存活促进突触形成；另一方面，过度激活的星形胶质细胞大量分泌促炎性因子，如TNF-α、IFN-γ等，导致AD病情进[7]一步恶化。星形胶质细胞参与AD病理状态下神经炎症的发生发展，在不1 同病理状态下，星形胶质细胞既能够发挥神经保护作用又能导致AD病情恶化，其中的机制有待进一步阐明。IL-10是一个主要的免疫抑制性细胞因子。在维护对抗病原体侵袭和控制有害病理损伤快速免疫应答的精细平衡方面发挥重要作用。几乎所有参加适应性和固有免疫应答的细胞都能够产生IL-10，包括树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK（自然杀伤）细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、++B细胞、CD8T细胞、CD4Th1/Th2细胞、Th17细胞和调节性T（Treg细胞）细胞。IL-10的主要作用是控制固有和适应性免疫细胞的激活，以保持稳态。IL-10的这一作用在保护宿主免受感染相关免疫病理性自身免疫和过敏，如败血症、关节炎、胰岛炎、炎性肠病（IBD）等疾病的损害方面至[8][9]关重要。在中枢神经系统疾病中，IL-10是一种主要的抗炎细胞因子，在神经元稳态和细胞存活方面发挥重要作用。1957年Isaack和Lindenmann发现细胞被感染以后，产生一组具有广泛生物学作用的糖蛋白，命名为干扰素。干扰素包括α、β、γ。IFN-α主要来源于白细胞，当白细胞接触B细胞抗原、病毒、外来细胞或肿瘤细胞时产生。IFN-β主要来源于纤维细胞，当它接触病毒或外源性核酸时产生。IFN-γ主要来源于T淋巴细胞，当它接触淋巴细胞、致有丝分裂因子、特[10]异性抗原或IL-1α刺激时产生。在CNS中，IFN-γ除了已知的促炎和破[11]坏效果，它也是一个保护性和调节性的细胞因子。IFN-γ在CNS疾病中的作用有待进一步阐明。AD的确切病因与发病机制至今不明，临床上缺乏疗效令人满意的药物，主要根据AD的某一特定病理环节进行干预，包括胆碱酯酶抑制剂、神经营养剂、抗炎和抗氧化剂等。临床单一靶点药物治疗的乏效，提示AD病因和发病机制的复杂性，药物治疗策略应当转向多靶点的综合治疗。以整体观念和辨证论治为鲜明特点的中医药学在这方面有独特的的优势。AD属于中医学“呆病”“健忘”等范畴，以呆、傻、愚、笨为主要临床特征，病位在脑，而与心、肝、脾、肾等脏病变密切相关。基本病机为肾虚精亏、髓海不足，伴有血瘀、痰浊、脏腑功能失调。治疗上主要采2 取补肾填精以治其本，活血化瘀、化痰通络以治其标等法。由于针灸疗法对神经系统调节的特殊作用，使得它在脑部疾病领域的治疗有一定的优势。临床上，针灸对AD疗效肯定，但作用机理尚不明确。慢性神经炎症在神经退行性病变的发生和发展中发挥重要作用。在炎症早期，促炎因子和抗炎因子大致处于平衡状态，激活的胶质细胞能够加强对病理碎片（如Aβ）的清除，从而有利于神经细胞的生存。但是随着炎症的进展，伴随促炎细胞因子过度表达等因素，使得促炎因子和抗炎因子处于失衡状态，结果导致神经元的老化和死亡。针灸疗法具有双向良性调整作用，可以调节免疫功能，并能有效地抗击炎症反应，具有抑制促炎因子[12]的生成和提高抗炎因子水平的作用。由此推测，“益肾调督”法电针能够使促炎因子和抗炎因子之间的失衡状态重新恢复平衡。为了进一步探讨针灸治疗AD的作用机理，本实验拟基于针灸抗炎机制对AD病理发展的影响作一初步探讨，为临床进一步推广针灸治疗AD提供实验依据。3 材料与方法1实验材料1.1实验动物选用SPF级的健康雄性Wistar大鼠共50只，体重为（300±20）g，购于湖北省实验动物中心[许可证号SCXK（鄂）2008-0005]，实验动物饲养于湖北中医药大学针灸经络研究所实验动物房，环境温度21-25℃，湿度40-60％，光照时间12h/d，大鼠自由饮食饮水，５只/笼，大鼠饲料由湖北省实验动物研究中心提供。整个实验过程严格遵守国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。1.2主要试剂及仪器Aβ1-42美国Sigma公司多聚甲醛国药集团水合氯醛（固体）国药集团青霉素粉剂国药集团氯化钠（固体）国药集团兔抗大鼠IL-10单克隆抗体abcam，ab9969兔抗大鼠IFN-γ多克隆抗体abcam，ab133566RatIL-10ELISA试剂盒欣博盛生物科技有限公司RatIFN-γELISA试剂盒欣博盛生物科技有限公司免疫组化试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司DAB显色试剂盒(黄)武汉谷歌生物公司RIPA裂解液碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天PVDF膜Millipore蛋白MAKER北京全式金生物技术公司β-actin抗体武汉谷歌生物公司4 GFAP抗体SantaCruz羊抗兔二抗(HRP标记)武汉谷歌生物公司羊抗兔二抗(HRP标记)武汉谷歌生物公司电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司电热恒温水浴锅北京市长风仪器仪表有限公司凝胶成像分析系统Syngene图像分析软件美国Image-Pro-Plus6.0电子天平上海第二天平仪器厂，MP120-2型高速冷冻离心机成都彼岸生物科技有限公司TGL-21牙科钻成都康发医疗器械有限公司脑立体定位仪成都泰盟科技有限公司Morris水迷宫视频跟踪系统成都泰盟科技公司，MT-200型针灸针（0.30×25mm）苏州环球针灸医疗器械有限公司HANS-100A韩式电针治疗仪上海泰成公司超薄切片机瑞典BROMMA公司，型号：LKB—V荧光正置显微镜日本OLYMPUSBX532实验方法2.1动物模型制备方法2.1.1Aβ1‐42寡聚体制备0.1mg的Aβ1‐42单体用二甲基亚砜50μl溶解后，再加入0.1mol/L的PBS(磷酸盐缓冲液)50μl稀释配制成1μg/μl的溶液，37℃水浴箱孵育一周，使其变成寡聚状态而具有神经毒性，-20℃分装保存。2.1.2AD模型复制方法经10%的水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上，并保持前后囟在同一水平。无菌环境下，颅顶区备皮，剥开皮下筋膜暴露顶骨，进行手术区皮肤消毒，于两侧冠状缝后钻出小孔，5 ［13］取出碎骨屑，保持硬脑膜的完整。按照大鼠脑立体定位图谱选择大鼠海马区域，用5μL微量注射器缓慢将药物Aβ1-42(双侧各5μL）注入双侧海马（前囟后3.3mm，中线左右各旁开1.5mm，深度3mm），5min内注完,注射后留针5min，按1.0mm/min的速度缓慢出针，以免拔针时药物溢出。术后牙托粉封固颅骨孔，缝合皮肤，3日内每日肌注青霉素G10万U防止感染，并经Morris水迷宫进行模型评价，剔除不合格者，并相应补充符合评定标准的大鼠代替剔除的大鼠。2.2模型评价实验前及模型复制后各组大鼠经Morris水迷宫（Morriswatermaze，[14]MWM）筛选，参照有关文献操作，测试大鼠在Morris水迷宫实验中逃避潜伏期的长短和跨越原平台区位置的次数，观察各组大鼠的学习和记忆能力，从而进行模型评价。对不合格者（逃避潜伏期较长和跨越原平台次数较少）允以剔除，补充相应合格者。2.2.1定位航行实验定位航行试验(placenavigation)共计5天，每天上午8-10点将大鼠面向池壁分别从4个入水点（N、E、S、W）放入水中，并记录其寻找到隐藏在水下平台的时间，即为逃避潜伏期（escapelatency)。评定前1天将大鼠放入水池自由游泳120s，使其熟悉水迷宫环境，并对没有搜寻到平台的大鼠进行适当引导，以便获知平台信息，帮助记忆的储存和整理。定位航行试验每天的入水点顺序分别为E-S-W-N；S-W-N-E；W-N-E-S;N-E-W-S；E-W-N-S，共计5天，记录逃避潜伏期，以秒为单位。若期间大鼠未在120s内找到平台，则将其引上平台，潜伏期记为120s，每次间隔5min让大鼠休息，再行下次实验。2.2.2空间探索实验定位航行实验结束后撤除平台，任选一个非平台象限（不含有测试用平台的区域）入水点将大鼠面向池壁放入水池，记录其在120s时间内的游泳轨迹，观察各组大鼠对原平台的记忆能力，即为跨越原平台次数和有效区停留时间。6 2.3动物分组与处理实验前所有大鼠置于鼠笼常规适应性喂养一周；实验时，经Morris水迷宫测试筛选（具体方法见2.2），剔除先天性不符合评定标准的大鼠后，随机将大鼠分为正常组、模型组、假手术组和电针治疗组，每组10只，分笼饲养，并用苦味酸给予染色编号。各组处理如下：①正常组：经Morris水迷宫测试筛选合格后的大鼠，在(24±2)℃室温中常规饲养，不做任何处理，定时给予充足清洁饮水和大鼠专用饲料。②模型组：经Morris水迷宫测试筛选合格后的大鼠，于第1天进行模型复制（具体方法见2.1.2），模型复制成功后不予任何处理，常规饲养，定时给予充足清洁饮水和大鼠专用饲料。③假手术组：经Morris水迷宫测试筛选合格后的大鼠，于实验第1天进行颅内注射等量生理盐水（具体方法同模型组），假手术处理后，常规饲养，定时给予充足清洁饮水和大鼠专用饲料。④电针治疗组：经Morris水迷宫测试筛选合格后的大鼠，于第1天[15]模型复制成功后（具体方法同模型组），根据《实验针灸学》中的大鼠穴位定位方法，定位大鼠“百会”（顶骨正中）和“肾俞”（第2腰椎下两旁)穴；分别针刺百会穴（向前平刺3～5mm），双侧肾俞穴（稍向内斜刺5mm）后。百会和肾俞（两侧肾俞每日交替）接HANS-100A韩式电针治疗仪，选择连续波，频率为5Hz，强度1mA，留针20分钟。每日1次，6天为一个疗程，共计2个疗程，疗程间休息1日。治疗结束后，再次用Morris水迷宫测试各组的学习记忆能力。测试结束后，将所有大鼠全部处死进行标本取材。2.4标本采集与检测方法2.4.1标本采集①腹主动脉取血：用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，使大鼠仰卧于操作台上，打开腹腔；用镊子将腹腔脏器向左或向右翻转到一侧，钝性分离脂肪和筋膜，找到腹主动脉。然后用采血针穿刺（穿刺针斜面向上，动作要轻柔，否则容易直接刺穿动脉）动脉，见到回血后，另7 一端插入真空采血管，即可采集约5ml全血。采集的血液样本于室温静置4h凝固析出血清后，用高速冷冻离心机2000转/分钟离心10min，吸取血清至EP管，待检。②甲醛灌注固定后取脑：各组大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉（350mg/kg）后，固定于清洁的手术板上，无菌环境下开胸，游离出心脏，并切开右心耳放血，眼科剪剪开左心室并插入灌流针进行灌注，先快速灌注4℃无菌生理盐水350-400ml至肝和肺脏颜色转白，且右心房流出液澄清，然后再灌注4%多聚甲醛（4℃）200-250ml（先快后慢），待肝脏和四肢变硬后，断头取全脑，迅速在冰盘上剥离脑膜，切去延髓、小脑以及多余组织后将所需的海马部分放入4%多聚甲醛（4℃）浸泡固定，待检。2.4.2检测方法2.4.2.1ELISA法严格按照试剂盒说明书操作。2.4.2.2免疫组化法（1）各待检组织经70%、80%、95%、100%酒精溶液中浸泡脱水，常规石蜡包埋。对包埋好的海马组织，行冠状面连续切片，切片厚度约4μm。然后将切片按顺序放入二甲苯Ⅰ溶液、二甲苯Ⅱ溶液、无水酒精Ⅰ溶液、无水酒精溶液、95%酒精溶液、90%酒精溶液、80%酒精溶液、70%酒精溶液中脱蜡处理，最后放入足够的蒸馏水中浸泡2分钟。（2）微波修复抗原：使用微波炉对抗原进行修复，将充分脱蜡处理过的和水化处理过的海马组织切片，放置在修复盒中的不锈钢切片架上，再向修复盒内加入适量的pH为6.0的0.01M枸橼酸缓冲液，液面要浸过切片组织一定的高度，先将微波炉调到高档加热，使液体沸腾，当加热至沸腾时再调到中档，于此时开始计算时间，抗原修复的时间为10分钟，在这个过程中修复液要足量，不要让组织干片。时间到了以后，从微波炉中把修复盒取出来，然后放入足量的冷水中冷却降温，当修复液降到同室温以后取出玻片，用PH为7.4的PBS溶液充分冲洗3遍，每次3分钟，在冲洗过程中不要直接对着组织冲洗，以免弄破组织。8 （3）阻断内源性过氧化物酶：用配制好的3%的H2O2（一般用甲醇或蒸馏水稀释）滴加在切片组织上，用以阻断内源性过氧化物酶，然后于室温下孵育15分钟，最后用PBS冲洗3次，每次3分钟。（4）加一抗：用吸水纸将玻片组织周围的液体擦干，再用油性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗，加完一抗后于4℃湿盒环境下孵育过夜。（5）加聚合物辅助剂：把切片用PBS冲洗3次，每次3分钟，然后用吸水纸擦干切片，再滴加聚合物辅助剂，于室温或37℃环境下孵育20分钟。（6）加二抗：把切片用PBS冲洗3次，每次两分钟，然后用吸水纸擦干切片，再滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗，于室温或37℃环境下孵育20到30分钟。（7）加DAB显色液：把切片用PBS冲洗四次，每次3分钟，用力甩去PBS液，然后用吸水纸擦干切片，在每张切片上滴加新鲜配制的DAB显色液，然后于显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，要控制好时间，不要使显色过深，当达到染色要求时，用自来水冲洗切片终止显色。（8）Harris苏木素复染：用Harris苏木素复染，一般30秒到1分钟左右，于水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用PBS水洗返蓝。（9）封片：将中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好的切片平躺置于通风橱中晾干。（10）镜检拍照：晾干的切片可以在显微镜下观察或者采集图像。2.4.2.3免疫荧光双标法（1）石蜡切片脱蜡：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。（2）抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火至沸后断电间隔10min中低火9 至沸，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（3）加一抗：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用5%BSA按一定比例稀释好的一抗覆盖组织。切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（4）加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加二抗（CY3或FITC标记）覆盖组织，避光室温孵育50min。（5）DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片甩干后圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。（6）封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。（7）镜检拍照：切片于OLYMPUS正置荧光显微镜下观察并采集图像。每个视野依次拍照红光、绿光（目的指标）；蓝光（细胞核）三张图片，然后用软件合成荧光双标照片。应用Image-Pro-Plus6.0软件先将荧光照片转换为黑白图片，然后对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值（IOD值）和灰度值。2.4.2.4免疫蛋白印迹（Western-Blot）法（1）总蛋白的提取：将低温冰箱中保存的海马组织取出，用组织剪细细的剪碎，然后倒入1ml的匀浆器中，加入1ml的裂解液，放在冰盒中反复的捻转使组织尽量碾碎。将充分裂解之后的液体转到EP管中，在4℃温度下，转速12000r/min，离心30分钟,然后取离心过后的上清液，转移到另一个EP管中，放于-20℃冰箱保存，需长期保存的放置在-80℃冰箱中保存。（2）蛋白浓度测定：采用Bradford法，通过标准曲线计算各样本的蛋白浓度。（3）SDS-PAGE电泳：各个待检的样品取50μg的总蛋白，将样品加10 入点样孔中，按浓缩胶75V、分离胶120V进行恒压电泳，当溴酚蓝跑至分离胶底部时停止电泳。（4）转膜（湿转法）：取出凝胶，然后用足量的蒸馏水充分冲洗，把PVDF膜在甲醇中浸泡数秒后，再同滤纸一起浸泡于电转缓冲液中。按照阴极碳板、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、阳极碳板的次序依次放好，把板夹紧后放入转膜仪内，并用玻棒小心取出海绵垫中的气泡，按照200mA、1小时条件进行转膜。（5）封闭：用TBST封闭液（含5%脱脂奶粉）浸泡PVDF膜，于室温下摇床封闭2小时。（6）加一抗：把一抗用封闭液稀释，然后把PVDF膜浸泡在一抗的孵育液中，于4℃环境下孵育过夜。（7）加二抗：用TBST充分的洗涤PVDF膜5到6次，5分钟一次。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2h。（8）发光、显影、定影：将PVDF膜放于器皿中，用ECL化学发光液反应一定时间后，将膜移至一张干净的塑封膜上，封膜，放入X-光片夹中曝光，根据不同的光强度调整曝光条件，进行显影与定影。（9）凝胶图像分析：将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度比值。3统计方法所有数据输入SPSS20.0进行统计分析，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）,以P<0.05为差异具有统计学意义。11 结果1电针对AD模型大鼠行为学的影响在造模过程中，模型组与电针组各有5只死亡；用Morris水迷宫测试筛选后，模型组和电针组各有4只和3只不合格。治疗后再次进行Morris水迷宫测试，统计各组大鼠120s内的逃避潜伏期、通过平台次数。模型组同正常组相比，逃避潜伏期明显延长（P<0.01），通过平台次数明显减少（P<0.01）;电针组同模型组相比，逃避潜伏期明显缩短（P<0.01），通过平台次数明显增加（P<0.05）；电针组同正常组相比，逃避潜伏期延长（P<0.01），通过平台次数减少（P<0.01）。见表1,图1。表1各组大鼠Morris水迷宫测定结果比较(x±s)组别N逃避潜伏期（s）通过平台次数正常组106.34±3.237.82±1.66假手术组107.32±3.117.16±1.27**模型组1022.16±4.323.84±1.25#▲#▲电针组108.73±1.545.24±1.15*#▲注：与正常组相比，P<0.01;与模型组相比P<0.05；与正常组比较，P<0.01。图1各组大鼠Morris水迷宫测定结果比较*#▲注：与正常组相比，P<0.01;与模型组相比P<0.05；与正常组比较，P<0.01。12 2电针对各组大鼠血清炎性因子的影响电针治疗结束后，用ELISA法检测各组大鼠血清炎性因子的水平。结果显示，模型组和正常组相比，血清抗炎因子IL-10含量明显降低（P<0.01），血清促炎因子IFN-γ含量明显升高（P<0.01），提示AD模型大鼠外周存在抗炎/促炎失衡状态；电针上调抗炎因子IL-10的水平，下调促炎因子IFN-γ的水平，显著地改善了外周的炎症失衡状态。见表2，图2。表2各组大鼠血清IL-10、IFN-γ水平比较[x±s]（pg/ml）组别鼠数（只）IL-10IFN-γ正常组1036.34±3.238.00±1.66假手术组1038.32±3.116.76±0.27**模型组1020.58±6.2810.84±1.25#▲#▲电针组1028.71±6.459.24±1.15*#▲注：与正常组比较，P<0.01；与模型组比较，P<0.05；与正常组比较，P<0.01。图2各组大鼠血清IL-10、IFN-γ水平比较*#▲注：与正常组和假手术组比较，P<0.01；与模型组比较，P<0.05；与正常组比较，P<0.01。3电针对各组大鼠海马区IL-10、IFN-γ表达的影响3.1免疫组化图片光密度分析用Image-ProP1us6.0分析各组大鼠IL-10、IFN-γ免疫组化图片，各组分别选取海马CA1、CA3和齿状回各10个高倍镜（400倍）视野，统13 计各组10张图片的平均光密度值。结果显示，模型组和正常组相比，抗炎因子IL-10表达降低，促炎因子IFN-γ表达升高；电针组和模型组相比，抗炎因子IL-10表达升高，促炎因子IFN-γ表达降低；电针组和正常组比较，抗炎因子IL-10表达降低，促炎因子IFN-γ表达升高。见表3，图3。表3各组大鼠海马IL-10、IFN-γ平均光密度比较[x±s]组别鼠数（只）IL-10IFN-γ正常组100.264±0.0640.112±0.018假手术组100.257±0.0750.124±0.046**模型组100.205±0.0150.161±0.036#▲#▲电针组100.231±0.0260.143±0.072*#▲注：与正常组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05；与正常组比较，P<0.05。图3各组大鼠海马IL-10、IFN-γ平均光密度比较*#▲注：与正常组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05；与正常组比较，P<0.05。3.2电针对各组大鼠海马区IL-10表达的影响如图4所示，在正常组与假手术组的海马齿状回，均可见到呈棕褐色的阳性表达，且细胞核的密度较高，数目较多,轮廓较清晰。由图可知，在海马齿状回，IL-10主要表达于海马部神经元和胶质细胞的细胞核。模型组同正常组比较，细胞核数量上较少，染色偏淡；电针组同模型组比较，阳性表达细胞增多，且染色偏浓。说明电针能够促进AD模型大鼠海马区抗炎因子IL-10的表达，抑制脑内炎性反应的增强。14 图4各组大鼠海马、齿状回IL-10阳性表达的变化（光镜400×）3.3电针对各组大鼠海马区IFN-γ表达的影响如图5所示，在正常组与假手术组的海马齿状回，可见到呈棕褐色的阳性表达。由图可知，IFN-γ主要表达于海马部神经元和胶质细胞的胞浆。模型组同正常组比较，阳性胞浆数量上较多，染色偏浓；电针组同模型组比较，阳性表达胞浆较少，且染色偏淡。说明电针能够抑制AD模型大鼠海马区促炎因子IFN-γ的表达，抑制脑内炎性反应的增强。15 图5各组大鼠海马、齿状回IFN-γ阳性表达的变化（光镜400×）4电针对各组大鼠海马区IL-10、IFN-γ蛋白水平表达的影响用Western-Blot法检测海马IL-10、IFN-γ蛋白表达。IL-10、IFN-γ的目的条带分别为17KD、19KD。图像分析结果发现，模型组与正常组和假手术组比较，IL-10表达水平明显降低、IFN-γ表达水平明显升高；16 电针组与模型组比较，IL-10表达水平明显升高、IFN-γ表达水平明显降低；电针组和正常组比较，抗炎因子IL-10表达降低，促炎因子IFN-γ表达升高（均P<0.05）。见表4，图6、7。表4各组大鼠海马IL-10、IFN-γ表达的比较(x±s)组别NIL-10IFN-γ正常组100.587±0.0260.855±0.007假手术组100.596±0.0120.987±0.003**模型组100.523±0.0311.189±0.026#▲#▲电针组100.563±0.0030.963±0.009*#▲注：与正常组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05；与正常组比较，P<0.05。图6各组大鼠海马IL-10、IFN-γ表达的比较*#▲注：与正常组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05；与正常组比较，P<0.05。图7Westernblot法检测各组大鼠海马IFN-γ、IL-10蛋白表达5电针对各组大鼠星形胶质细胞与IL-10共定位表达的影响++用免疫荧光双标法检测GFAP/IL-10的表达：绿色代表IL-10阳性反应细胞，红色代表GFAP阳性反应细胞（星形胶质细胞），蓝色表示用DAPI17 ++复染的细胞核，箭头所示橘红色表示GFAP/IL-10双染色细胞。见图8。++图8各组大鼠海马齿状回GFAP/IL-10阳性表达的变化（光镜200×）从图中可以看出，模型组同正常组比较，绿光（IL-10）的亮度与密度增强，红光（由GFAP表征的星形胶质细胞）的亮度与密度增强；电针组同模型组比较，绿光（IL-10）的亮度与密度增强，红光（由GFAP表征的星形胶质细胞）的亮度++与密度减弱。GFAP/IL-10共定位表达情况：模型组和正常组相比，共定位数目和强度增加；电针组和模型组相比，共定位数目和强度增加；电针组和正常组相比，共定位数目和强度略有增加。说明电针可能通过激活Ac释放抗炎因子IL-10，同时IL-10促进Ac的进一步激活来发挥治疗效应。应用Image-ProP1us6.0软件先将Merged荧光照片转换为黑白图片，然后对每张照片进行分析得出每张照片阳性的积分光密度值(IOD值)。IOD值越大，阳性表达越强。阳性IOD值除以阳性面积即为平均光密度值。模型组同正常组比较，IL-10降低，GFAP升高；电针组同模型组比较，IL-10升高，GFAP升高；电针组18 同正常组相比，IL-10降低，GFAP升高。见表5，图9。表5各组大鼠海马IL-10、GFAP平均荧光强度比较[x±s]组别鼠数（只）IL-10GFAP正常组101.282±0.0921.146±0.014假手术组101.266±0.0761.176±0.053**模型组101.105±0.0841.359±0.061#▲#▲电针组101.227±0.0461.428±0.057*#▲注：与正常组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05；与正常组比较，P<0.05。图9各组大鼠海马IL-10、GFAP平均荧光强度比较*#▲注：与正常组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05；与正常组比较，P<0.05。19 讨论1祖国医学对阿尔茨海默病的认识1.1病因病机的认识阿尔茨海默病属中医“痴呆”的范畴。晋代《针灸甲乙经》、明代《针灸大成》均以“呆痴”命名。明以前痴呆专论极少，直至张景岳《景岳全书·杂证谟》中才论述了有关内容：“痴呆证，凡平素无痰而或以郁结，或以不遂，或以思虑，或以疑惑，或以惊恐而渐致痴呆⋯⋯此其逆气在心，或肝胆二经有不清而然。”清代陈士铎《辨证录·呆病门》云：“大约其始也，起于肝气之郁；其终也，由于胃气之衰。肝郁则木克土，而痰不能化，胃衰则土不制水而痰不能消，于是痰积胸中，盘踞于心外，使神明不清，而成呆病矣。”王清任在《医林改错·脑髓说》中说：“小儿无记性者，脑髓未满；高年无记性者，脑髓渐空”。老年性痴呆的病因病机较为复杂，历代医学著作均对其有着较全面的论述。如《灵枢·海论》：“髓海有余，则轻劲多力，自过其度；髓海不足，脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”《医学心悟》认为“肾主智，肾虚则智不足，故喜忘其前言。”《类证治裁》“因病善忘者，或精血亏损，或思虑过度⋯⋯或心火不降，肾水不升⋯⋯或素有痰饮⋯⋯或心气不足，怔忡健忘⋯⋯或禀赋不足，神志虚扰⋯⋯或年老神衰。”唐容川在《中西汇通医经精义》中指出：“事物之所以不忘，赖此记性，记在何处，则在肾精。益肾生精，化为髓，而藏之于脑中。”可见，古代医家关于本病病因病机的认识是一个渐进的过程，大致来说，认为本病病位在脑，与五脏皆有关系，基本病机为髓减脑消，神机失用，病理因素以痰瘀为标，乃本[16]虚标实之证。现代医家在继承前人的基础上对本病的认识不断完善。目前较为一致的观点为：老年性痴呆病位在脑，和肾精亏虚，血瘀、痰浊，心、肝、脾、[17]肾等脏的功能失调有关。临床多为虚实交错，虚、瘀、痰互见。一方面20 肾虚为主的五脏虚衰可导致痰浊、瘀血等的产生，即因虚而致实；另一方面，痰瘀为患又可影响气血津液的化生和运行，致本虚更甚，此所谓因实[18]而致虚。两者互为因果，形成恶性循环，以致病程缠绵，见症多端。1.2中医药治疗概况根据老年性痴呆临床表现，属于中医学的“呆证”、“善忘”等病证。整体观念和辨证论治是中医治疗疾病的鲜明特色。临床上治疗本病通常分[19-20]为以下几型：（1）髓海不足。老年痴呆皆因肾中精气不足，髓海失于充养，故现[21]记忆减退，神情呆滞等症。方药可选河车大造丸加减；（2）心脾两虚。老年人心脾两虚，气血不足，则脑失所养，使人渐发健忘、痴呆等症，治当补益心脾，方可选用归脾汤；（3）瘀血内阻。中医素有“老人多瘀”、“久病必瘀”、“虚久致瘀”的说法。因虚可以致瘀，而瘀久则使虚更甚，血瘀为老年性痴呆的重要致病因素，可予血府逐瘀汤或通窍活血汤加减治疗；（4）痰浊阻窍。痰浊与肺脾肾关系密切，随着年龄增长，五脏虚衰逐渐发生，导致气机不利，津液运行障碍，因而内生痰浊，所以痰浊的产[22]生是衰老过程中的重要变化之一，与老年性痴呆关系密切。周仲瑛等认为痰浊为患在痴呆辨为痰火上扰证和脾虚痰盛证。痰火上扰者，应清肝泻火，化痰开窍。可予羚角钩藤汤，温胆汤加减。脾虚痰盛者，应健脾益肾，化痰开窍。可予指迷汤加减；（5）肝肾阴亏。老年人头晕耳鸣，须发早白，牙齿松动，兼有心中烦热、腰膝酸软、颧红盗汗所致痴呆，方可选杞菊地黄丸加减。总之，对老年性痴呆的中医治疗多在辨病的基础上，辨证论治，标本同治，以补肾填精为主，兼以活血化瘀、祛痰开窍、补益心脾、交通心肾，清心平肝等。1.3针灸治疗概况近年来，针灸治疗痴呆在临床和实验方面均有较多进展：1.3.1针灸临床研究概况21 关于AD的治疗，根据辨证侧重点的不同，取穴各有特色。肾虚为AD之本，补肾益髓多取百会、肾俞、关元、命门、悬钟等穴；心主神志，痴呆乃为神志之病变，益气养心、宁神定志则取四神聪、神门、本神、神庭、内关等穴；痰浊、瘀血为AD之标，活血化瘀则取血海、膈俞等穴，豁痰祛浊则取丰隆等穴。兼脾胃气虚，则取足三里、脾俞、三阴交等穴；肝肾亏虚，则取肝俞、肾俞、太溪等穴；肝胆郁火则取太冲、侠溪、阳陵泉等穴。阳气亏虚明显，则配合艾灸。结合现代研究，亦有选用头针穴，结合电针、穴位埋线与穴位注射等法。[23]管月帆采用针灸联合中医辨证治疗老年痴呆，选取四神聪、丰隆；用3年陈艾绒加少量人工庸香，做成艾炷直接灸，每穴3～5壮。结果34例患者，显效20例，有效10例，观察组的总有效率为88.2%，优于对照［24］组的67.6%。叶江琳等选择78例符合纳入标准的患者进行对比研究，观察针刺配合中药与单纯中成药治疗的疗效差别。选取的穴位有风池、四神聪、足三里(双)、太溪(双)、内关(双)等。经6个月的治疗后，比较发现针药组神经心理量表平均得分20.27，优于对照组15.52；脑电图正常［25］率35.90%，优于对照组17.95%。佟琦媛等采用针刺配合补肾益髓化痰通瘀方治疗36例AD患者。穴位选取内关(双)、神门(双)、百会、三阴交(双)，针刺后服用补肾益髓化痰通瘀汤，治疗12周后，治疗组总有效率[26]83.33%，对照组总有效率76.67%。周友龙等采用穴位埋线治疗26例轻中度AD患者，选取神门、丰隆、太溪和足三里,穴位刺激组用相同操作方法刺激穴位,但埋线针不穿入羊肠线,每个月治疗1次,共治疗6次。结果发现，穴位埋线组简易精神状态量表(MMSE)治疗后评分较治疗前评分显著[27-28]升高。杨氏等用人参注射液、复方当归注射液含当归、川芎、红花,使两液混合,取肾俞（双）、足三里（双）、三阴交（双）进行穴位注射。收到较好疗效。表明各种方法综合运用，能够取得较显著的临床疗效，充分体现了针灸治疗的优越性。1.3.2针灸实验研究概况纵观近几年的实验研究可以发现，针灸防治AD的主要效应机制大致22 可以归纳为以下几种：（1）提高胆碱能功能［29］望庐山等电针AD模型大鼠后，检测海马及皮质部位Ach、ChAT、AchE的含量和活性，发现电针治疗可提高ChAT的活性，抑制AchE的活性，从而促进Ach的合成，抑制Ach的分解，增加脑组织的Ach含量，最[30]终改善大鼠记忆力功能。戴思思等对老年痴呆模型SAMP8小鼠针刺百会、血海、肾俞，提高了大鼠的学习记忆能力，认为可能与抑制胆碱酯酶（AchE）的活性有关。（2）对抗炎症、自由基损伤[31]唐纯志等采用化学损毁的方法建立老年性痴呆大鼠模型,放射免疫分析方法检测大鼠脑组织中IL-1、IL-6的含量。结果显示模型组大鼠脑组织中IL-1及IL-6水平明显高于假手术组(P＜0.01),电针组和喜得镇组IL-1及IL-6明显低于模型组(P＜0.05),但明显高于假手术组(P＜0.05),而电针组和喜得镇组比较,IL-1及IL-6水平无显著性差异(P＞0.05)。提示电针降低老年性痴呆大鼠脑组织中IL-1及IL-6水平可能是其治疗老年[32]性痴呆起效的重要机制。罗玳红等采用放射免疫分析方法检测老年性痴呆模型大鼠血清Aβ、TGF-α（转化生长因子）及IGF-Ⅱ（胰岛素样生长因子）的含量,结果提示电针治疗AD模型大鼠能有效地降低其血清Aβ水平,这可能是电针改善AD大鼠学习记忆能力的作用机制之一。本研究结果还显示,电针治疗能明显降低AD模型大鼠血清TGF-α水平,亦能降低血清IGF-Ⅱ水平。综合其他研究者的研究成果分析,这一结果提示电针降低血清Aβ水平可能主要是通过降低血清TGF-α水平起作用的,与血清IGF-Ⅱ水平也有明显关系。［33］王少锦等通过实验得出与模型组相比较，针刺组大鼠大脑皮质中丙二醛(MDA)含量明显下降，而谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高，表明针刺能够起到抗自由基氧化作用，［34］减少神经元损伤，延缓疾病发生发展进程。柯红等采用针灸预刺激疗法研究阿尔茨海默病(AD)大鼠脑内MDA含量、GSH-Px活性的变化。实23 验表明针刺可使AD模型大鼠MDA含量得到下降(P＜0.01)，GSH-Px活性显著升高(P＜0.01)，具有统计学意义。表明针刺能够影响体内自由基系统的酶活性，使机体的抗自由基氧化能力提高，脑内神经元的损伤得到控制，进而在AD防治中发挥作用。（3）抑制细胞凋亡［35］豁银成等观察针刺对AD大鼠神经元凋亡相关蛋白Bcl-2及NF-κB（核因子-κB）的影响，结果表明针灸预处理可通过抑制NF-κB表达，增加Bcl-2的表达，保护神经细胞减少细胞调亡，从而改善AD模［36］型大鼠学习记忆行为功能，使AD的发展进程延缓。张翠翠通过针刺疗法观察凋亡相关蛋白Caspase-3对AD模型大鼠海马的影响。结果表明模型组大鼠海马Caspase-3表达增加，与对照组比较有显著差异(P＜0.01)；而针刺组Caspase-3表达明显减少，与模型组比较(P＜0.01)从而证实针刺可以减少Caspase-3的表达，细胞凋亡得到控制。（4）改善线粒体功能［37-39］孙国杰等在针灸治疗AD改善线粒体超微结构方面采取“益肾调督”疗法，实验表明该法可增加沉默信息调节因子1(SIR1)表达，减少线粒体损伤、起到保护线粒体功能的目的。该法还可以使海马线粒体内细胞色素C氧化酶(COXIV)表达提高，改善线粒体呼吸链功能，从而能够使ATP产生增多，达到保护线粒体损伤的作用。益肾调督针灸法还可以在抑制海马线粒体亲环蛋白D(CypD)表达方面起作用，有效减少线粒体通透性转换孔的形成，保护线粒体，从而达到延缓脑功能衰退的进程。2现代医学对阿尔茨海默病的认识2.1发病机制的认识既往的研究已明确AD的部分发病机制，但尚无一种理论能够圆满地解释本病的真正的发病机制。伴随医学影像技术、基因工程技术、组织病理学技术的发展，从神经生化、分子免疫、遗传基因等角度使人们对AD可能的发病机制有了更加深入地认识。24 2.1.1遗传学说目前已经确定四种基因的突变或多态性与AD有关。包括21号染色体的淀粉样蛋白前体（APP）基因、14号染色体的早老素1（PS1）基因、1号染色体的早老素2（PS2）基因、19号染色体的载脂蛋白E（ApoE）基因。其中，APP、PS1、PS2基因与家族型AD有关，ApoE基因与散发型AD[40-41]有关。新近研究表明,血管紧张素转换酶（ACE）基因、脑啡肽酶（NEP）基因等基因的多态性与AD发病相关。2.1.2免疫缺陷学说Michaelson在AD病人血清中发现了胆碱能神经抗体，不少研究均发现AD患者血清中存在自身免疫抗体，Roy等学者亦发现AD病人存在抗神经生长因子抗体等，均提示免疫尤其是自身免疫机制可能与AD有关。此外，有报道AD患者淋巴细胞及单核细胞明显低于对照组，也有报道AD患者B淋巴细胞明显增高。近年来，神经系统疾病与红细胞免疫的关系亦[42]开始为人们所重视。2.1.3Aβ神经毒学说Aβ假说认为，AD患者脑内SP中的Aβ是AD发病的根本原因，并且和[43]AD的严重程度相关。脑内自然存在的Aβ来自于一种跨膜蛋白——淀粉样前体蛋白(APP)，Aβ是在β-和γ-分泌酶的酶切作用下从APP上剪切下来的多肽片段，由40-42个氨基酸残基组成。虽然Aβ1-42和Aβ1-40均已在大[44]脑中发现，但是有证据表明Aβ1-42比Aβ1-40的毒性更强，且寡聚体较单体[45]的毒性强。APP、PS-1和PS-2基因的突变，特别是PS-1突变造成Aβ产[46]生增加，是早发性AD的主要病因。Aβ作为AD病理改变中SP的主要成分，在AD的发病中起到重要的作用。2.1.4炎性学说Aβ的大量沉积能够诱导神经胶质细胞的激活，激活的胶质细胞能够25 释放炎性因子和神经毒性物质，从而导致神经元的损伤。目前，越来越多[47]的证据表明，脑内神经炎症的持续进展是AD发病的重要因素。另外，炎性损伤似乎是以Aβ为中心的各种发病机制引发AD的共同途径。2.1.5自由基损伤学说研究表明：AD脑组织SOD(超氧化物歧化酶)活性高于对照组；脑脊液中CuZn-SOD活性明显高于对照组；ADS-A4淀粉蛋白的基因位区与SOD的基因相当接近等，均提示超氧自由基损伤对AD脑组织进行性退化起重要作用。先天性基因异常导致自由基代谢异常，可产生内源性神经毒；脑内神经递质5-HT(5-羟色胺)、DA(多巴胺)也可与自由基反应产生内源性神经毒而参与AD发病。同时，外源性神经毒性物质铝的水平与SOD活性呈显著负相关，提示铝能明显抑制SOD的活性而加重超氧自由基损伤。2.2现代医学治疗概况尽管老年性痴呆的发病机制尚不明确，但是随着现代医学研究逐渐深化，临床上还是具有一定的疗效。临床上用于治疗AD的药物主要包括胆碱酯酶抑制剂、脑血管扩张剂和钙拮抗剂、氧化剂、激素、防止β淀粉样[48]蛋白形成的药物和抗炎药等。大致可以分为以下几类：（1）提高胆碱功能的药物。包括胆碱酯酶抑制剂，如他可林、多奈哌齐等；胆碱能受体激动剂，主要是M和N受体，尤其是M1受体的选择性激动剂；胆碱能替代治疗，主要有单胺氧化酶抑制药如丙炔苯丙胺，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)[49]受体拮抗药等；（2）β淀粉样蛋白形成抑制剂。主要包括有α-分泌酶[50]激动剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和Aβ的免疫治疗剂等；（3）抗氧化剂。最常用的抗氧化剂维生素E（Eocopherol，VitE)可消除[51]自由基，减少过氧化脂质的生成；（4）神经营养因子、性激素治疗等。目前应用到临床上治疗AD的药物还是以抑制胆碱酯酶，提高脑内胆碱能神经元活性为主。但是从治疗AD的长远来看，提高胆碱能神经元活性的药物大多副作用较突出，不利于患者的长期服用，因此应大力挖掘中医学的治疗方法。26 3动物模型选择依据目前阿尔茨海默病模型复制方法有损伤性动物模型、Aβ诱发AD动物模型、三氯化铝动物模型、复合型动物模型、炎症免疫动物模型、自然衰[52-53]老动物模型、快速老化小鼠动物模型、转基因动物模型等。每一种模型复制方法能够在一定程度上模拟AD发病的特定病理环节，但都有各自的缺陷，均无法反映AD病理特征的全貌。由于AD的神经病理学标志物老年斑的主要成分是Aβ，所以最普遍采用、最经典的模型复制方法是Aβ诱发AD动物模型。本法即根据Aβ的理化性质，在特定条件下使Aβ成为寡聚态而具有神经毒性，采用双侧海马微量注射Aβ1-42来制作动物模型，能够较好的模拟AD的核心病理环节，因此本实验采用本法。4选穴依据针对AD的病因病机及治疗法则，本研究以益肾调督为治疗原则，重点选择百会、肾俞(双侧)穴治疗该病。百会又名三阳五会，乃督脉与足太阳、手少阳、足少阳、足厥阴等经脉交会处，具醒神开窍、补脑益智之功。[54]经临床和实验证实本穴具有保护大脑组织，改善脑血液供应，增强记忆力等方面的功效。同时，肾虚乃本病之发病基础，而肾又为先天之根本，藏精、主骨生髓，故本研究选取背腧穴肾俞进行防治。肾俞穴具有补肾益精生髓充脑之功效，并具有调督使髓上冲于脑，脑得其养，则思维意识记忆等能力恢复[55]正常。现代研究发现，本穴具有抗自由基损伤，提高人体免疫力，延缓衰老等作用。因此本研究结合前期基础，选取肾俞和百会合用，共奏填精益髓、醒神开窍之功，针对本病病因病机，调整阴阳，标本同治。5外周及中枢炎性因子与AD具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的复杂的防御反应，称为炎症。炎症是人类疾病中的一种最常见的病理过程，也是最重要的保护性27 反应，炎症是损伤、抗损伤和修复三位一体的综合过程。神经炎症即发生在神经系统（尤其是中枢神经系统）的炎症。一般认为神经炎症主要是慢性炎症。在脑内，神经元和胶质细胞是神经系统的两大细胞成分。神经元是神经系统功能的主体，实现大脑复杂信息的传递、传导、分析、调节和整合等重要功能。胶质细胞分为星形胶质细胞、小胶质细胞和寡突胶质细胞。炎症状态下，小胶质细胞是脑中的“单核巨噬细胞”，能够分泌炎症介质，维护和修复损伤的神经元。激活的小胶质细胞又能够激活星形胶质细胞的[56]活化。传统的观点认为，由于有血脑屏障的存在，外周炎症和中枢炎症是相分离的。新近的研究发现，TNF-α,IL-6,IL-1β和其他炎症因子可以改[57-58]变血脑屏障内皮细胞间的紧密连接，损害闭合蛋白，而破坏血脑屏障的完整性导致通透性增高，通过主动转运进入脑内，说明外周炎症和中枢炎症是相互关联的。研究发现：与对照组相比，AD患者的脑脊液IL-10[59]水平升高，而血清IL-10水平没有显著差异。另一项研究表明，AD患者血清IL-10水平和病情严重程度相关，即血清IL-10水平可以作为判断[60]病情的生物标志物之一。这些研究说明，外周高水平的炎症因子能够改变血脑屏障的通透性，从而波及中枢神经系统，引发慢性中枢炎症。同理可以推测：中枢炎症的慢性进展，也能够改变血脑屏障的通透性，使得通过测定外周血清中的炎症因子水平来监测中枢神经系统疾病成为可能。AD是一个脑组织变性的持续进行性过程，脑部异常的Aβ沉积与神经元纤维缠结为触发剂，引发脑内炎症反应和神经胶质细胞激活。聚集的淀粉样蛋白与由胶质细胞分泌的炎症介质可致神经元营养不良。短期内，炎症对脑组织的修复有一定的作用，但是随着炎症的进展，炎症介质的释放增加，导致脑组织变性进一步恶化。6星形胶质细胞与AD神经炎症神经系统中除了神经元外，还有大量的胶质细胞，广泛分布于中枢神28 经和周围神经。中枢神经胶质细胞有Ac、少突胶质细胞、小胶质细胞，其中Ac占大部分，几乎囊括了所有胶质细胞的功能。Ac与神经元之间存[61]在复杂的相互作用，以维持神经系统内环境的稳定。近年的研究发现，Ac表面分布着很多神经递质、神经肽、激素及神经营养因子受体，在维持神经元内外环境、生存、免疫调节、信号转导、轴突生长及功能整合等方面发挥重要作用。但在病理条件下，各种病理因素使得Ac活化，活化的Ac对神经元起保护或神经毒性作用，发挥“双刃剑”效应。目前研究认为，Aβ能够直接激活Ac、小胶质细胞，激活的Ac能够释[62-64]放大量的炎症介质来调节AD病情的进展。一方面，激活的Ac能够吞噬Aβ，从而对Aβ的清除有利。另一方面，吞噬Aβ的Ac进一步激活，释放更多的炎症因子，可能导致神经炎症失衡，从而导致AD病情进一步[63]恶化。研究发现，用TNF-α和IFN-γ联合刺激C57BL/6J小鼠原代星形胶质细胞可增加内生性BACE1、APP、Aβ40的水平。特殊炎症细胞因子[64]的数量与AD转基因小鼠的病理进程高度相关,通过分析共同培养液中的细胞因子发现Aβ可促进Ac释放细胞因子，如IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-13、IL-17、IP-10（interferon-inducibleprotein-10,趋化因子）等。虽然现在的研究普遍接受炎症因子同AD的病程进展密切相关，[65]但是AD不同阶段炎症细胞因子的作用有待进一步阐明。Yeh等研究转基因小鼠(3xTg-AD)内嗅皮层Ac表面和体积形态，发现病程早期(此时尚未出现AD的典型病理改变)Ac表面积及体积即明显缩小，持续到病程晚期。表明病程早期的Ac萎缩可能导致了Ac突触覆盖面减少，突触间的连接减少，改变了神经网络联系，影响了认知及记忆功能。因此内嗅皮层Ac萎缩导致的突触功能下降可能是AD早期认知和记忆损伤的病理基础。[66]活化的Ac能够产生TNF-α、IL-1β、IFN-γ等促炎性因子，这些[67]因子能够诱导人原代星形胶质细胞和星形胶质细胞瘤产生Aβ。过度产生的Aβ又会进一步激活Ac，炎性介质长期存在将发展成一种慢性“细[68]胞因子循环”，这对AD治疗的进展很不利。因此，细胞因子诱导的反馈回路可通过抗炎策略予以干预治疗。IL-10是主要的抗炎性细胞因子之29 [69]一，实验研究发现，Ac亦可分泌IL-10，在神经元的稳态和细胞的存活方面扮演重要的角色。活化的Ac既可以分泌促炎因子IFN-γ，又可以分泌抗炎因子IL-10，其中的机制有待进一步阐明。7“益肾调督”法电针治疗AD的机理探讨7.1“益肾调督”法电针对中枢与外周IL-10、IFN-γ的调节作用AD的标志性病理改变之一是Aβ的沉积形成老年斑。异常沉积的Aβ既是神经元与神经胶质细胞异常代谢的结果，又是激活神经胶质细胞释放炎症介质引发神经炎症的始作俑者。释放的炎症介质主要包括抗炎因子和促炎因子。在AD的早期，抗炎因子的效应是主导，使得神经炎症向有利[70]于Aβ清除的方向发展。但是，随着病情的进展，当释放的抗炎因子不[71]足以清除Aβ，会导致炎症进一步恶化。此时，促炎因子的效应占主导，反而导致Aβ的生成进一步增加。我们的研究结果发现，不论是中枢还是外周，模型组和正常组比较，抗炎因子IL-10含量降低；促炎因子IFN-γ含量升高。而“益肾调督”法电针能上调抗炎因子IL-10，抑制促炎因子IFN-γ。提示，电针能够调节AD中枢炎症和外周炎症的失衡状态，使得神经炎症向有利于Aβ清除的方向发展，从而保护海马神经元，改善AD症状。7.2“益肾调督”法电针对海马星形胶质细胞的调节作用星形胶质细胞围绕并填充于神经元和轴突之间，并且与神经元之间存在广泛的代谢偶联，在维持神经元形态和功能方面起着重要作用。随着对星形胶质细胞研究的不断深入，已有研究提示其在AD发病及发展过程中起着关键的作用。星形胶质细胞的突起密布包绕于神经元周围，成为其发挥众多病理生理作用的解剖学基础。近年来，神经生物学家发现星形胶质+细胞具有多层次多样化的功能：组成血-脑屏障、调节K浓度、调节神经递质的传输和能量代谢的平衡、调节突触的发生、参与信息传递活动、参[72]与免疫反应、参与大脑损伤与修复过程等。总之，星形胶质细胞与脑内其他细胞协同作用，几乎参与了脑内所有的生理和病理过程，它的重要性30 及其关键作用不断被科学家所逐步认识，它已成为当代神经生物学研究中重要的研究对象。当中枢神经系统处于损伤、感染及罹患免疫性疾病时，星形胶质细胞将被反应性地激活，激活的星形胶质细胞表现为细胞增殖与肥大、RNA合成增多、胶质细胞酸性纤维蛋白(gliafibrillaryacidicprotein，GFAP)含量增高、谷氨酰胺合成酶及糖原合成增加，并伴随其他多种基因表达的[62]改变和细胞迁移等，这些表现统称为星形胶质细胞胶质化。胶质化的星形胶质细胞不仅能及时地参与在损伤过程中对神经元的保护作用，而且还影响损伤后组织的修复与再生。GFAP是Ac的特异性标记蛋白，本课题采用免疫荧光双标技术检测大++鼠海马GFAP/IL-10的表达，来探讨Ac在AD神经炎症中的作用。结果发现，模型组同正常组相比，GFAP表达显著降低（P<0.05）；电针治疗组同模型组相比，GFAP表达显著升高（P<0.05）。同时在海马CA1-3、齿状回各个区域均可以见到GFAP和IL-10的共同表达。提示AD病情的进展伴随星形胶质细胞的激活，激活的星形胶质细胞能够释放抗炎因子IL-10。电针治疗后GFAP表达增强，表明电针能够激发Ac的神经保护作用，有效释放抗炎因子IL-10来改善AD症状。充分体现针灸的特异性调节作用。31 结语本研究采用微量注射法向大鼠双侧海马注射Aβ1-42制作AD模型大鼠，运用电针百会、肾俞穴进行治疗，用Morris水迷宫观察大鼠的学习记忆能力，运用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-10、IFN-γ的含量，运用免疫组化检测各组大鼠海马IL-10、IFN-γ的表达，采用Western-Blot法检测海马IL-10、IFN-γ蛋白表达的变化，运用免疫荧光双标法检测各++组大鼠海马GFAP/IL-10共定位的表达。研究结果表明：电针能够明显改善AD模型大鼠的学习记忆能力；使血清中和大脑海马区抗炎因子IL-10水平上调，并下调促炎因子IFN-γ水平；抗炎因子水平的上调伴随星形胶质细胞的激活。这些结果表明，电针能够改善海马抗炎因子/促炎因子失衡状态，抑制中枢炎症级联的发展，从而达到改善AD症状的目的。而电针发挥这些作用的机制可能是通过激活星形胶质细胞释放抗炎因子来发挥抗炎效应。本研究基本阐明了电针对AD炎症状态的影响、中枢炎症和外周炎症的关系，初步分析了电针发挥作用的可能机制。不足之处是中枢炎症和外周炎症究竟是怎样相互影响的，换言之，究竟谁是始作俑者；以及虽然炎症在AD发生和发展过程中发挥重要作用，但为何临床抗炎治疗乏效等问题都有待将来进一步研究。32 参考文献[1]安明,赵国君,刘东明等.阿尔茨海默病与炎症[J].内蒙古医学院学报,2008,S1:680-684.[2]谢雨礼.老年痴呆药物研究进展[J].药学与临床研究,2011,01:1-7.[3]NiranjanR.MolecularbasisofetiologicalimplicationsinAlzheimer'sdisease:focusonneuroinflammation.[J].MolecularNeurobiology,2013,48(3):1-17.[4]ZhangF,JiangL.NeuroinflammationinAlzheimer'sdisease[J].LancetNeurology,2015,14(4):388-405.[5]BatarsehYS,DuongQV,MousaYM,etal.Amyloid-βandAstrocytesInterplayinAmyloid-βRelatedDisorders[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2016,17(3):338.[6]LanaM.Osborn,WillemKamphuis,WytseJ.Wadman,EllyM.Hol,Astrogliosis:AnintegralplayerinthepathogenesisofAlzheimer'sdisease,ProgressinNeurobiology,Availableonline12January2016.[7]ZhaoJ,O'ConnorT,VassarR.ThecontributionofactivatedastrocytestoAβproduction:ImplicationsforAlzheimer'sdiseasepathogenesis[J].JournalofNeuroinflammation,2011,8(1):150.[8]MaX,YanW,ZhengH,etal.RegulationofIL-10andIL-12productionandfunctioninmacrophagesanddendriticcells[J].F1000Research,2015,4.[9]StrleK,,ZhouJH,ShenWH,etal.Interleukin-10inthebrain.[J].CriticalReviewsinImmunology,2001,21(5):427-449.[10]杜宝恒主编.生物治疗学[M].天津：天津科技翻译出版公司.2003:177.[11]OttumPA,ArellanoG,ReyesLI,etal.OpposingRolesofInterferon-GammaonCellsoftheCentralNervousSysteminAutoimmuneNeuroinflammation[J].FrontiersinImmunology,2015,6(4).[12]张耀,杨涵棋,刘旭光.胆碱能抗炎通路调节机制在针灸研究中的应用[J].山西中医,2013,29(1):45-47.[13]PaxinosG,WatsonC.TheRatBraininStereotaxicCoordinates.(CompactThirdEdition)[M].AcademicPress:SanDiego,California,USA;2007.[14]胡镜清,温泽淮.Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探[J].广州中医药大学学报,2000,17(2):117-119.[15]郭义.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社.2008:360.[16]宋筱靓.老年性痴呆病因病机探析[J].辽宁中医药大学学报,2008(6):70-71.[17]白慧梅.中医药治疗老年性痴呆临床研究概况[J].河北中医,2008,30(6):658-660.[18]闫敬来,陈燕清.老年痴呆病机的中医学认识概述[J].中华中医药杂志,2008,23(7):640-642.[19]叶佳文.老年性痴呆的中医证治[J].西部中医药,2003,16(3):45-48.[20]杨昕,何明大.中医对老年性痴呆的认识和治疗[J].中医药导报,2009,15(8):82-84.[21]张怀亮，崔书克主编.脑病辨证施治策略与案例[M].郑州：郑州大学出版社.2012:224.[22]周仲瑛主编.常见病中医临床手册第3版[M].北京：人民卫生出版社.2004:242-245.[23]管月帆.针灸联合中医辩证治疗老年痴呆的临床观察[J].中华全科医学,2015,03:472-474.33 [24]叶江琳,刘光.针刺配合补肾益气活血方治疗老年性痴呆疗效观察[J].四川中医,2012,08:138-139.[25]佟琦媛,谢春荣,陈少军.补肾益髓化痰通瘀方配合针刺治疗阿尔茨海默病36例临床观察[J].河北中医,2009,02:188-189.[26]周友龙,贾建平.穴位埋线治疗阿尔茨海默病临床观察[J].中国针灸,2008,01:37-40.[27]杨树成.水针治疗老年性痴呆症26例[J].浙江中医杂志,1995,08:357.[28]杨定荣,彭力,穆敬平.针刺结合穴位注射治疗老年痴呆症临床探讨[J].针灸临床杂志,2007,07:7-8.[29]望庐山,周丽莎.电针治疗对阿尔茨海默病大鼠Ach、ChAT、AchE的影响[J].针灸临床杂志,2009,06:40-42+54.[30]戴思思,董克礼,朱宏.“补肾活血”针刺法对老年性痴呆模型SAMP8小鼠学习记忆能力和脑组织AChE活性的影响[J].上海针灸杂志,2010,01:57-59.[31]唐纯志,赖新生,林展弘,等.电针对老年性痴呆大鼠脑组织中IL-1、IL-6的影响[J].中国中医基础医学杂志,2005,07:532-533.[32]罗玳红,赖新生,唐纯志.电针治疗对老年性痴呆大鼠血清β淀粉样蛋白及生长因子水平的影响[J].中国中医药信息杂志,2003,10:22-23.[33]王少锦,李爱英.针刺对拟痴呆大鼠脑内自由基系统酶活性的影响[J].中国老年学杂志,2004,01:47-49.[34]柯红,孙国杰,周华.针灸预刺激对AD大鼠脑内自由基影响的实验研究[J].湖北中医学院学报,2009,02:14-16.[35]豁银成,孙国杰,杜艳军.针灸预刺激对AD大鼠神经元凋亡相关蛋白Bcl-2、NF-κB的影响[J].湖北中医学院学报,2010,03:16-18.[36]张翠翠.针刺对AD模型大鼠海马凋亡相关蛋白Caspase-3的影响[J].四川生理科学杂志,2014,02:62-63.[37]孙国杰,罗磊,杜艳军,孔立红.针灸对AD模型大鼠海马神经元线粒体保护机制研究[J].中国针灸,2014,02:157-162.[38]崔翔,马冉,唐萁等.益肾调督针灸法对AD模型大鼠海马线粒体COXⅣ的影响[J].成都中医药大学学报,2014,02:29-32.[39]崔翔,马冉,唐萁等.益肾调督针灸法对AD大鼠海马线粒体CypD的影响[J].中华中医药杂志,2014,07:2374-2376.[40]张淑萍,宣兆博,黄作义,等.血管紧张素转换酶基因多态性与佳木斯地区阿尔茨海默病的关系[J].中国组织工程研究,2014,18(2):259-264.[41]张皓春,秦伟,刘春平,等.脑啡肽酶基因启动子多态性与散发性阿尔茨海默病的相关性研究[J].四川医学,2015,36(1):44-47.[42]李智杰编著.老年期痴呆[M].北京：中国医药科技出版社.2010:50.[43]HardyJ,SelkoeDJ.TheamyloidhypothesisofAlzheimer'sdisease:progressandproblemsontheroadtotherapeutics[J].science,2002,297(5580):353-356.[44]Boyd-KimballD,CastegnaA,SultanaR,etal.ProteomicidentificationofproteinsoxidizedbyAβ(1–42)insynaptosomes:implicationsforAlzheimer'sdisease[J].Brainresearch,2005,1044(2):206-215.[45]DrakeJ,LinkCD,ButterfieldDA.OxidativestressprecedesfibrillardepositionofAlzheimer’sdiseaseamyloidβ-peptide(1–42)inatransgenicCaenorhabditiselegansmodel[J].Neurobiologyofaging,2003,24(3):415-420.34 [46]SelkoeDJ.Alzheimer'sdisease:genes,proteins,andtherapy[J].Physiologicalreviews,2001,81(2):741-766.[47]宗楠,李菲,邓媛媛,等.神经炎症在阿尔茨海默病发病中的作用研究[J].现代医药卫生,2015,31(6):844-846.[48]杨娜.抗老年性痴呆药物的研究进展[J].中国疗养医学,2011(9):820-821.[49]赵琨,苏红军.老年性痴呆治疗进展[J].华北煤炭医学院学报,2005(2):173-175.[50]OlsonRE,CopelandRA,SeiffertD.Progresstowardstestingtheamyloidhypothesis:inhibitorsofAPPprocessing.[J].CurrentOpinioninDrugDiscovery&Development,2001,4(4):390-401.[51]郭远,苗懿德.阿尔茨海默病的药物治疗研究进展[J].药物流行病学杂志,2004,13(6):309-312.[52]谢宁,宋琳莉,牛英才,等.老年性痴呆动物模型研究进展及其评价[J].实验动物与比较医学,2006,26(1):50-53.[53]徐剑文(综述),俞昌喜(审校).阿尔茨海默病实验性动物模型的研究进展[J].国际老年医学杂志,2008,29(3):97-103.[54]何在坤，尤艳利．百会穴在脑部疾病中的应用[J]．中医药导报，2010，16(9)：116-118．[55]国兰琴，陈汉平，吴焕淦，等．肾俞穴延缓衰老的应用与研究[J]．辽宁中医杂志，2007，34(6)：732-734．[56]窦肇华等主编.免疫细胞学与疾病[M].北京：中国医药科技出版社.2004:410.[57]TerrandoN,LarsI.ErikssonMDPhD,RyuJK,etal.Resolvingpostoperativeneuroinflammationandcognitivedecline.[J].AnnalsofNeurology,2011,70(6):986–995.[58]LaflammeN,LacroixS,RivestS.Anessentialroleofinterleukin-1βinmediatingNF-κBactivityandCOX-2transcriptionincellsoftheblood–brainbarrierinresponsetoasystemicandlocalizedinflammationbutnotduringendotoxemia[J].TheJournalofneuroscience,1999,19(24):10923-10930.[59]ER.IncreasedintrathecalTGF-beta1,butnotIL-12,IFN-gammaandIL-10levelsinAlzheimer'sdiseasepatients.[J].NeurologicalSciencesOfficialJournaloftheItalianNeurologicalSociety&oftheItalianSocietyofClinicalNeurophysiology,2006,(1):33-39.[60]LeungR,ProitsiP,SimmonsA,etal.InflammatoryProteinsinPlasmaAreAssociatedwithSeverityofAlzheimer’sDisease[J].PlosOne,2013.[61]蔡志友,吴芳,晏勇.星形胶质细胞与阿尔茨海默病[J].重庆医学,2009,06:733-735.[62]PeknyM,WilhelmssonU,PeknaM.Thedualroleofastrocyteactivationandreactivegliosis.[J].NeuroscienceLetters,2014,565:30-38.[63]ZhaoJ,O'ConnorT,VassarR.ThecontributionofactivatedastrocytestoAβproduction:ImplicationsforAlzheimer'sdiseasepathogenesis[J].JournalofNeuroinflammation,2011,8(1)::150.[64]GarwoodCJ,PoolerAM,AthertonJ,etal.AstrocytesareimportantmediatorsofAβ-inducedneurotoxicityandtauphosphorylationinprimaryculture[J].CellDeath&Disease,2011,2(6):e167.[65]YehCY,OlabarriaM,NoristaniHN,etal.EarlyastrocyticatrophyintheentorhinalcortexofatripletransgenicanimalmodelofAlzheimer'sdisease.[J].AsnNeuro,2011,3(5):e00071.35 [66]LiuL,MartinR,ChanC.Palmitate-activatedastrocytesviaserinepalmitoyltransferaseincreaseBACE1inprimaryneuronsbysphingomyelinases[J].Neurobiologyofaging,2013,34(2):540-550.[67]BlaskoI,VeerhuisR,Stampfer-KountchevM,etal.Costimulatoryeffectsofinterferon-γandinterleukin-1βortumornecrosisfactorαonthesynthesisofAβ1-40andAβ1-42byhumanastrocytes[J].Neurobiologyofdisease,2000,7(6):682-689.[68]SharmaR,FischerMT,BauerJ,etal.Inflammationinducedbyinnateimmunityinthecentralnervoussystemleadstoprimaryastrocytedysfunctionfollowedbydemyelination[J].Actaneuropathologica,2010,120(2):223-236.[69]VillacampaN,AlmoldaB,VilellaA,etal.Astrocyte-targetedproductionofIL-10induceschangesinmicroglialreactivityandreducesmotorneurondeathafterfacialnerveaxotomy[J].Glia,2015,63(7):1166–1184.[70]HenekaMT,CarsonMJ,JosephEK,etal.NeuroinflammationinAlzheimer'sdisease[J].LancetNeurology,2015,14(4):388-405.[71]WuC,LeongSY,MooreCS,etal.DualeffectsofdailyFTY720onhumanastrocytesinvitro:relevanceforneuroinflammation.[J].JournalofNeuroinflammation,2013,10(6):1174-1186.[72]洪涛.传染性与非传染性痴呆症[M].科学出版社,2011:336-337.36 综述神经炎性因子与阿尔茨海默病：从平衡阴阳的视角[摘要]阿尔茨海默病是一种神经退行性病变，确切的发病机制目前不明。目前大量研究表明，由Aβ沉积激活的小胶质细胞和星形胶质细胞分泌的细胞因子所引起的慢性神经炎症被认为是阿尔茨海默病的主要神经病理学机制之一。本文拟从炎症细胞因子的角度探讨阿尔茨海默病的炎症机制。[关键词]阿尔茨海默病；炎性细胞因子；平衡；阴阳阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD），是一种目前最常见的中枢神经系统退行性功能紊乱，又叫老年性痴呆。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状。其主要神经病理学标志物是神经元外的淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）聚集形成老年斑（senileplaques,SP）、神经元内Tau蛋白异常磷酸化形成神经原纤维缠结（neurofibrillarytangles,NFTs）。目前，大多数学者认为Aβ沉积激活胶质细胞（主要是星形胶质细胞、小胶质细胞）引起的炎症反应和神经毒性作用是AD的核心机制。慢性激活状态的胶质细胞所产生的细胞因子在AD的不同环节起放大炎症过程和细胞毒性作用，激活的胶质细胞所产生的炎症不仅仅是Aβ沉积的继发反应，它所分泌的一系列促炎因子协同作用，增加了Aβ的神经[1]毒性，通过多种途径介导了神经元死亡。本文就主要的炎症细胞因子同AD的关系作一综述。1主要促炎细胞因子与AD1.1IL-1β白介素-1(IL-1)是炎症免疫反应初始调控因子，可以诱发炎性反应及机体防御反应。IL-1家族细胞因子包括两个激动剂蛋白IL-1α和IL-1β，在与特定的膜受体结合时启动细胞活化。IL-1β在AD患者脑组织中过度表达，与AD的病理过程密切相关。37 AD患者大脑中Aβ沉积在皮质和海马神经细胞外形成老年斑，周围环绕激活的小胶质细胞。研究发现，β淀粉样前体蛋白(β-APP)转基因小鼠脑组织中形成的Aβ可以持续反复激活小胶质细胞，小胶质细胞慢性过度表达IL-1β，这个持续激活的炎症修复机制，造成脑神经慢性炎[2]症损伤。IL-1β的过度表达发生于Aβ斑块早期，其通过蛋白激酶C(PKC)途径促进β-APP的合成和分泌裂解，从而进一步促进Aβ的产[3]生和沉积。因此，IL-1β的过度表达在Aβ斑块早期形成过程中起决定作用。在AD患者脑内IL-1β分布与Aβ斑块分布一致，并与不同类[4]型的Aβ斑块具有相关性;首先在早期斑块中，弥散型APP沉积内存在活化的小胶质细胞，并且过度表达IL-1β;其次具有AD病理诊断意义的成熟斑块(神经炎性斑)中，相关性小胶质细胞的数量及大小均增加，IL-1β反应活性亦相应提高;最后形成燃尽斑块(致密斑)，神经炎性减轻、小胶质细胞减少、IL-1β亦不再与斑块具有相关性。在AD患者脑中，IL-1β受体存在于星形胶质细胞(Ac)表面，IL-1β可诱导Ac活化增生，大量表达S100β，促进营养不良的神经轴突过度[5]生长，最终形成神经炎斑块。IL-1β过度表达造成营养障碍型轴突的无意义生长，促进了Aβ斑块形成，同时促进神经元表达APP、乙酰胆碱酯酶及其他斑块相关蛋白;此外，IL-1β还诱导星形胶质细胞表达其他斑块相关分泌型急性期蛋白及Aβ结合蛋白，如IL-6，α1-抗凝乳蛋白酶(α1-ACT)、ApoE和一些补体蛋白，这些蛋白在Aβ斑块中浓度大大增[6]高，与斑块的进展关系密切。因此活化的小胶质细胞和IL-1β在Aβ斑块的形成、发展中起着十分重要的病理作用。1.2TNF-αTNF-α是具有广泛生物学效应的细胞因子，对肿瘤具有特异性杀伤作用，参与炎症反应和免疫调节，可以诱导其他前炎性细胞因子及炎性相关蛋白表达，形成炎性反应的放大级联反应。生理条件下，TNF-α在健康的脑中低水平表达。在炎症或疾病状态下，TNF-α以及其他一些炎症介质和神经毒性物质，则主要由激活的小胶质细胞产生。TNF-α在AD患38 者脑内过度表达，与AD病理变化密切相关。Aβ可持续激活小胶质细胞，并过量表达炎症因子TNF-α、IL-1β，[7]在AD患者脑中形成慢性炎症反应。TNF-α刺激小胶质细胞和Ac表达炎症因子，如TNF-α、IL-6、γ-干扰素(IFN-γ)。研究发现，单独的TNF-α不影响APP的产生和代谢，但IFN-γ可诱导APP的转录和翻译，使APP释放增多;TNF-α也可使小胶质细胞Aβ1-42趋化受体[8]表达水平上调，增强对Aβ的趋化效应，导致Aβ生成增加，形成Aβ斑块。可见TNF-α的过度表达在Aβ斑块形成中具有重要作用。1.3IFN-γIFN-γ在脑中是一个多效的细胞因子。它能够通过确保病毒感染潜伏期内的组织修复发挥保护作用，通过在脑损伤病灶招募激活的小胶质细胞分泌潜在的炎症因子而又对大脑有害。在中枢神经系统中，IFN-γ可由激活的胶质细胞、神经元产生，主要具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。通过与相应受体结合发挥生物学活性。此外IFN-γ能够增加血管通透性，使得T细胞和NK细胞通过血脑屏障，促使小胶质细胞分泌TNF-α和IL-1β。[9]研究表明，IFN-γ和TNF-α在脑内共同过度表达，存在AD病理性加重的协同效应，导致AD模型大鼠加剧Aβ的产生和减少致病肽的清除。然而，在三重转基因AD模型大鼠，慢性IFN-γ的表达导致小胶质细胞的明显激活，但是对于星形胶质细胞影响不大；IFN-γ的过度表达最终表现[10]出神经保护作用，同时促进神经的再生。提示作为脑内的促炎性细胞因子之一，IFN-γ究竟是加重神经炎症反应促使神经细胞的老化和死亡，还是发挥对神经炎症的保护作用、促进神经再生，根据目前的实验研究尚不能够得出肯定的结论，可能和AD所处于的病理阶段、产生IFN-γ的细胞环境以及各细胞因子之间的协同作用有关。2主要抗炎细胞因子与AD2.1TGF-1转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)是一个多态性细胞39 因子，在哺乳动物中它有三种亚型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。研究显示TGF-β1基因多态性在AD发病中发挥一定作用。TGF-β1是一种重要的炎症因子，TGF-β1可能通过影响细胞的增殖分化、神经元转移及轴[11]突形成、抗原表达及细胞毒等作用，参与AD的发生。转基因动物实验表明，TGF-β1能够诱导形成血管淀粉样沉积和神经纤维缠结。转基因小鼠星形胶质细胞表达具有活性结构的TGF-β1，使脑[12]血管内血液淀粉样沉积和内皮细胞变性，另外，过度表达TGF-β1能够使人APP蛋白和Aβ蛋白表达增加，从而加速神经元Aβ沉积。TGF-β1还可使星形胶质细胞产生神经黏附因子L1，降低幼稚星形胶质细胞黏附分子的表达，后者可介导胶质细胞与神经元之间的相互作用，影响神经元[13]转移及轴突形成，参与神经系统发育及组织修复过程。另外，TGF-β1还有免疫抑制作用，抑制T、B淋巴细胞的增殖和活性，明显抑制了巨噬细胞的吞噬能力，机体不能及时清除损伤或衰老的自身细胞，AD患者脑皮层及皮层下的神经元不能正常的生长和凋亡而出现退行[14]性变，可能与TGF-β1的免疫抑制作用有关。[15]研究发现，预先脑室内注射外源性TGF-β1,能够预防海马注射Aβ1-42诱导的AD认知功能损害；另外，通过滴鼻途径给予TGF-β1，也有治疗效果，虽然治疗效果没有预先给药强，但对于临床AD病人是一个易被接受的治疗途径。上述研究结果提示，TGF-β1是一个既有预防又有治疗AD相关病理损害的细胞因子，同时预防效果大于治疗效果。2.2IL-4IL-4是由成熟的Th2细胞和来自肥大细胞或嗜碱性粒细胞谱系细胞产生的能够影响Th细胞分化的20-kDa的糖蛋白。IL-4驱动Th2应答，介导聚集和激活肥大细胞，并刺激IgE抗体的产生通过B细胞分化成IgE[16]的分泌细胞。另外，IL-4在表达和释放炎性细胞因子时表现出明显的抑制效果，这是能够阻断或抑制单核细胞衍生的细胞因子，包括IL-1，TNF-α，IL-6，IL-8，并MIP-1α，和刺激IL-1ra的合成。其他机制，其中IL-4的发挥其神经保护作用可能与抑制IFN-γ和随之减少TNF-α40 [17]和NO的浓度有关。IL-4能够增强VIP（海马齿状回中间神经元分泌的神经肽）促进神经[18]元的增殖和再生，从而有利于神经炎症的修复。然而，鼠IL-4（murineInterleukin-4，mIL-4）在病灶短期的表达却会使Aβ沉积加重，可能的机制是在急性期抑制了胶质细胞对Aβ的清除。所以我们应当重新审视抗[19]炎治疗的副作用。可见IL-4的神经保护作用和神经组织特定的微环境、AD病理阶段等相关，有待进一步阐明。2.3IL-10IL-10是主要的抗炎性细胞因子之一，在神经元的稳态和细胞的存活方面扮演重要的角色。IL-10介导的细胞通过与特定细胞表面受体（IL-10Rs）（存在于大脑中的所有神经胶质细胞）群体相互作用，它通过减少促炎细胞因子如IL-1和TNF-α的合成限制炎症，通过在大脑中抑[20]制细胞因子受体的表达和抑制受体激活。Aβ似乎并没有在体外刺激由神经胶质细胞产生IL-10，而预先暴露IL-10的神经胶质细胞抑制了Aβ或脂多糖LPS诱导的促炎细胞因子，提示IL-10受体存在于培养的神经胶[21]质细胞中。IL-10能抑制单核细胞/巨噬细胞源性的TNF-α，IL-1，IL-6，[22]IL-8，IL-12，G-MSF，MIP-1α和MIP-2α。除此之外，IL-10减少表面TNF受体的表达，促进肿瘤坏死因子受体的脱落进入体循环。研究发现：与对照组相比，AD患者的脑脊液IL-10水平升高，而血[23]清IL-10水平没有显著差异。另一项研究表明，AD患者血清IL-10水平和病情严重程度相关，即血清IL-10水平可以作为判断病情的生物标志[24]物之一。由于有血脑屏障的存在，使得外周炎症和中枢炎症是相分离的，但是，已有研究表明，特定情况下，外周淋巴细胞能够渗入血脑屏障，使得外周炎症和神经炎症相互关联。IL-10的水平在中枢神经系统和外周血的不同意义和联系有待进一步研究。3讨论AD病因不清，发病机制复杂，目前有较多试图解释AD的学说，如Aβ学说、胆碱能缺陷学说、tau蛋白异常磷酸化学说及神经炎症学说等。41 其中神经炎症在AD发病的病理生理学过程中发挥着较为重要的作用。关于神经炎症假说,还有很多问题需要进一步明确：神经炎症究竟是AD发生发展的原动力、是保护脑组织免受伤害的有利因素、还是没有关系的旁观者？抗炎治疗对AD的疗效尚有争议。目前仅仅知道炎症确实发生了,却并不知道其发生的意义。从当前的研究现状来看：一方面，临床研究试图从炎症细胞因子的角度找出AD的早期生物标记物，从而早期诊断AD。另一方面，实验研究试图弄清每一种炎症细胞因子在AD病理过程中的作用，从而找到临床干预神经炎症的切入点。但是，现有的研究结果有时是模棱两可的。这些研究结果表明，各炎症细胞因子在AD的病理过程中是一个复杂的网络关系。“细胞因子循环”在AD的发病机制中占有重要作用，细胞因子和神经病理又有反馈调节。即，促炎细胞因子能够促进炎症的进展，但同某种细胞因子（如IFN-γ）共存又具有一定的神经保护作用；抗炎细胞因子能够抑制炎症的进展，但某种细胞因子（如IL-4）在炎症初期反而对神经细胞有害。另外，由于AD隐匿发病，病程发展缓慢，AD模型复制的神经病理代表临床AD的哪一个阶段，对早期AD的指导意义又有多少等诸多问题都有待进一步研究。AD的病理机制是复杂的，临床上根据单一靶点干预神经炎症的治疗效果（如非甾体抗炎药，NSAIDs）并不明显是对这一观点的佐证。也许从复杂的西医微观病理机制中暂时“跳出来”，转而从中医的整体观念出发，来探讨AD的发病机制与治疗是一个有借鉴意义的视角。中医认为：肾藏精，主骨生髓，脑为髓海。人的灵机记性职司在脑，但和肾精充足密切相关。人的神志等精神活动，又和肾阳对于肾精的气化有关。各种外因（诸如外伤、感染、应激状态等）引起的急性炎症和慢性炎症，犹如人体阳气对有害因素的积极抵抗。抗炎因子对神经组织有利，犹如正气充足，邪气被排出体外（正胜邪退）；促炎因子对神经组织有害，犹如正气不足，邪气亢盛（正虚邪进）。意即，炎症是向有利还是有害于神经组织的方向发展，取决于：和邪气相比，人体正气是否充足。那么，42 决定炎症平衡的关键是什么？神经系统的“阴精”是否有可以检测的物质基础？能否用较简易客观的指标衡量“肾阳”？是否有某种或几种细胞因子水平能够决定人体的正气强弱？反之，某种或几种促炎细胞因子水平是否能够衡量邪气亢盛程度？如果能，也许将现有研究资料运用中医理论解读更有利于指导中医临床的辩证施治。如果不能，我们当前是否应当反省研究思路是否进入了“思维的死胡同”，从而启示我们进一步改善研究思路。也许这是一个有趣而又有意义的问题，有待将来进一步研究。参考文献[1]吴映曼,蔡毅.阿尔茨海默病患者血清和脑脊液中肿瘤坏死因子‐α及IL‐6和IL‐8水平研究[J].中国全科医学,2010,33:3738‐3740.[2]CotmanCW,TennerAJ,CummingsBJ.beta‐Amyloidconvertsanacutephaseinjuryresponsetochronicinjuryresponses.[J].Neurobiologyofaging,1996,175.[3]ShaftelSolomonS,KyrkanidesStephanos,OlschowkaJohnA,MillerJen‐nieH,JohnsonReneeE,O'BanionMKerry.SustainedhippocampalIL‐1betaoverexpressionmediateschronicneuroinflammationandamelioratesAlzheimerplaquepathology.[J].JournalofClinicalInvestigation,2007,1176.[4]MizunoT.TheBiphasicRoleofMicrogliainAlzheimer’sDisease.InternationalJournalofAlzheimer’sDisease.2012;2012:737846.[5]ShengJG,MrakRE,RovnaghiCR,KozlowskaE,VanEldikLJ,GriffinWS.HumanbrainS100betaandS100betamRNAexpressionincreaseswithage:pathogenicimplicationsforAlzheimer'sdisease.[J].Neurobiologyofaging,1996,173:.[6]ShaftelSolomonS,GriffinWSueT,O'BanionMKerry.Theroleofinterleukin‐1inneuroinflammationandAlzheimerdisease:anevolvingperspective.[J].JournalofNeuroinflammation,2008,5.[7]PS.A.TheinflammatoryhypothesisofAlzheimerdisease:deadoralive?[J].AlzheimerDisAssocDisord,2008,22(1):4‐5.[8]IDP.Emergingconceptsofhowβ‐amyloidproteinsandpro‐inflammatorycytokinesmightcollaboratetoproducean'Alzheimerbrain'(Review).[J].MolecularMedicineReports,2008,volume1(2):173‐178(6).[9]YamamotoM,KiyotaT,HoribaM,etal.Interferon‐γandtumornecrosisfactor‐αregulateamyloid‐βplaquedepositionandβ‐secretaseexpressioninSwedishmutantAPPtransgenicmice[J].TheAmericanjournalofpathology,2007,170(2):680‐692.[10]MastrangeloMA,SudolKL,NarrowWC,etal.Interferon‐γdifferentiallyaffectsAlzheimer’sdiseasepathologiesandinducesneurogenesisintripletransgenic‐ADmice[J].TheAmericanjournalofpathology,2009,175(5):2076‐2088.[11]ArosioB,BergamaschiniL,GalimbertiL,etal.+10T/Cpolymorphismsinthegeneoftransforminggrowthfactor‐β1areassociatedwithneurodegenerationanditsclinicalevolution[J].Mechanismsof43 ageinganddevelopment,2007,128(10):553‐557.[12]RosenbergRN.TranslationalresearchonthewaytoeffectivetherapyforAlzheimerdisease[J].Archivesofgeneralpsychiatry,2005,62(11):1186‐1192.[13]吴学玲,曾孟兰,周志明,等.TGF‐β1在神经精神疾病患者血清中的含量变化及分析[J].实用预防医学,2004(4):685‐686.[14]吴学玲,王先酉,周志明,等.阿尔茨海默病患者血清TGF‐β1含量观察与分析[J].实用心脑肺血管病杂志,2003,11(3):139‐140.[15]Chen,Jia‐Huietal.“ProtectionofTGF‐β1againstNeuroinflammationandNeurodegenerationinAβ1–42‐InducedAlzheimer’sDiseaseModelRats.”Ed.MichelleL.Block.PLoSONE10.2(2015).[16]BrownMA,HuralJ.FunctionsofIL‐4andcontrolofitsexpression[J].CriticalReviews™inImmunology,1997,17(1).[17]ChaoCC,MolitorTW,HuS.NeuroprotectiveroleofIL‐4againstactivatedmicroglia[J].TheJournalofImmunology,1993,151(3):1473‐1481.[18]RN,HS,DK,etal.MicroglialVPAC1Rmediatesanovelmechanismofneuroimmune‐modulationofhippocampalprecursorcellsviaIL‐4release.[J].Glia,2014,62(8):1313–1327.[19]ChakrabartyP,TianbaiL,HerringA,etal.HippocampalexpressionofmurineIL‐4resultsinexacerbationofamyloiddeposition.[J].MolecularNeurodegeneration,2012,7(1)::36.[20]StrleK,ZhouJH,ShenWH,etal.lnterleukin‐10inthebrain[J].CriticalReviews™inImmunology,2001,21(5).[21]LedeboerA,BreveJJP,WierinckxA,etal.Expressionandregulationofinterleukin‐10andinterleukin‐10receptorinratastroglialandmicroglialcells[J].EuropeanJournalofNeuroscience,2002,16(7):1175‐1185.[22]ClarkeCJP,HalesA,HuntA,etal.IL‐10‐mediatedsuppressionofTNF‐aproductionisindependentofitsabilitytoinhibitNFkBactivity[J].Europeanjournalofimmunology,1998,28(5):1719‐1726.[23]ER.IncreasedintrathecalTGF‐beta1,butnotIL‐12,IFN‐gammaandIL‐10levelsinAlzheimer'sdiseasepatients.[J].NeurologicalSciencesOfficialJournaloftheItalianNeurologicalSociety&oftheItalianSocietyofClinicalNeurophysiology,2006,(1):33‐39.[24]LeungR,ProitsiP,SimmonsA,etal.InflammatoryProteinsinPlasmaAreAssociatedwithSeverityofAlzheimer’sDisease[J].PlosOne,2013.44 致谢首先，衷心感谢恩师杜艳军教授三年来对我孜孜不倦的教诲，悉心的指导，以及在学习、生活等各个方面对我的帮助和支持!感谢您对本课题设计、实施与论文撰写所倾注的心血！导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力使我获益终生！衷心感谢针灸实验室刘建民副教授；王亚文、魏玉玲高级实验师在课题实验过程中给予的热情支持和无私帮助！衷心感谢师兄（罗磊、何勋）、师妹（肖佳欢、王芸）等在整个实验中所给予的指导与帮助。尤其要特别感谢室友（尹小强）、师弟（王中明）在取材过程中提供的及时帮助！衷心感谢在实验过程当中为医学实验研究牺牲的大鼠！衷心感谢实验过程中和论文撰写时引用文献的所有作者！他们的辛勤劳动为我的课题实验和论文撰写顺利完成提供了相关的技术支持和论据。衷心感谢湖北中医药大学研究生处和针灸骨伤学院领导和老师们三年来对我的教育和培养!衷心感谢我的家人，感谢他们在我的求学过程中的默默无闻的奉献和全力支持！最后，再次感谢三年来所有关心、帮助过我的老师、同学和亲友们!45
