长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析

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分类号:S435.121.5学校代码：10712UDC：579研究生学号：2011060049密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析学科专业：植物病理学研究方向：植物病毒学研究生李艳指导教师：吴云锋教授完成时间：2015年5月中国陕西杨凌 Classificationcode:S435.121.5Universitycode:10712UDC:579Postgraduatenumber:2011060049Confidentialitylevel:PublicDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015ISOLATIONANDANALYSISOFRESISTENCE-RELATEDGENESDURINGPERIWINKLEANDWHEATBLUEDWARFPHYTOPLASMAINTERACTIONMajor:PlantPathologyResearchfield:PlantviruologyNameofPostgraduate:LiYanAdviser:Prof.WUYunfengDateofsubmission:2015-05YanglingShaanxiChina 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的博士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研咒生签名：时间：年5月•^日导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的博士研究生所呈交的博士学位（毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名:时间：年f月•^曰 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。(保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：时间：年J月y日 长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析摘要目前已报道的植原体病害已有1000多种，其中多种病害尤其木本植物上的都是致死性的。小麦蓝矮病是目前仅在我国有报道的一种小麦上的植原体病害，主要分布在陕西、宁夏、甘肃和内蒙古等西北干旱和半干旱的冬麦区，由介体条沙叶蝉（PsammotettixstriatusL.）传播。小麦蓝矮病影响小麦植株的生长，影响小麦的抽穗和结实，造成小麦的大幅度减产，严重威胁小麦生产。目前，已开展了小麦蓝矮植原体基因组学及致病性等方面的研究，但是对寄主与小麦蓝矮植原体之间的互作机理还知之甚少。从转录水平了解寄主与小麦蓝矮植原体互作的基因表达特征，揭示寄主在感染小麦蓝矮植原体后在代谢、病害防御等方面的作用机制，将为研究小麦蓝矮植原体的致病性及其抗病品种的选育提供理论依据。因此，本研究以植原体的模式植物长春花为材料，采用cDNA-AFLP技术对感染小麦蓝矮植原体的长春花进行差异基因表达谱分析，并通过荧光定量PCR技术验证了cDNA-AFLP表达谱的准确性；利用RACE方法克隆病程相关蛋白基因及防御相关的基因全长，并通过生物信息学分析编码蛋白的基本特征；在转录水平分析这些基因在长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的表达模式。主要研究结果如下：1.以长春花为材料，采用cDNA-AFLP技术对感病植株中表现花绿变的花组织与健康对照的花组织进行差异基因表达谱分析，共分离到258条TDFs，其中201条TDFs的表达受到小麦蓝矮植原体侵染的诱导，而57条TDFs的表达受到抑制。通过与GenBank的nr数据库进行相似性比对，125条TDFs有明确的基因功能，参与了代谢、能量、信号转导、致病和防御等多条生物代谢途径。因此，这些基因的分离对深入了解寄主与植原体之间的互作机理有重要作用。2.从得到的TDFs中选择了8个TDFs，对其进行荧光定量PCR分析，除了一个基因的表达量变化与cDNA-AFLP的结果相悖外，其他基因的表达量变化与cDNA-AFLP得到的结果一致，说明cDNA-AFLP结果准确可靠。3.通过cDNA-AFLP分离到的TDFs的功能注释，找到两个基因W_8-35和W_1-23可能与花瓣的绿变相关。通过荧光定量PCR分析两个基因在花褪色、花绿变、花变叶及健康花组织中的表达量变化，结果显示W_1-23在花变态的各个阶段表达量均高于健康长春花；而W_8-35在花褪色样品中的表达量上升，在花绿变和花变叶中表达量低于健康花组织，说明两个基因在花变态的过程中发挥了作用。4.对长春花的10个内参基因在小麦蓝矮植原体侵染过程中的表达稳定性进行评价，通过软件geNorm和NormFinder得到的结果显示，CrL23在整个小麦蓝矮植原体侵染的过程中表达相对最稳定；在长春花表现不同程度的花变态样品中，CrTUB和CrTUA是最稳定的内参基因；在长春花的不同组织样品中，CrACT在两个软件得到结果中表现 最稳定。5.通过RACE方法，以cDNA-AFLP得到的基因片段为基础，克隆到两个长春花的PR蛋白基因全长，分别为CrPR5和CrPR6基因。CrPR5基因全长1049bp，ORF为750bp，编码249个氨基酸。CrPR6基因全长1682bp，ORF长1170bp，编码389个氨基酸。生物信息学分析结果显示CrPR5蛋白序列N端有信号肽，无跨膜区；CrPR6没有信号肽也没有跨膜区，可能定位在过氧化物酶体上。6.对长春花的PR蛋白基因CrPR1a,CrPR2,CrPR4,CrPR10a,CrPR5,CrPR6,CrPR13和CrPR14在感染小麦蓝矮和枣疯植原体的长春花中的表达量进行qRT-PCR分析，结果显示同一PR基因在两种植原体侵染的长春花中表达模式不同。大部分基因在嫁接后5天即受到WBD的诱导表达，而受到JWB诱导表达的时间点则相对滞后。同时以上结果也表明不同的PR蛋白在两种植原体与长春花的互作体系中发挥的作用不同。7.通过RACE方法，克隆到长春花的CBSX3基因，该基因全长1051bp，ORF为618bp，编码205个氨基酸。对CrCBSX3基因在小麦蓝矮植原体的侵染过程中及不同组织中的表达量进行分析，结果显示该基因在长春花花中的表达量最高，在根中的表达量最低；在嫁接小麦蓝矮植原体10天后即受到强烈诱导表达。在本氏烟叶片中的亚细胞定位结果显示该基因编码的蛋白定位在细胞质；瞬时表达结果显示CrCBSX3在本氏烟叶片中能够抑制BAX诱导的细胞坏死。以上实验结果说明该基因在侵染早期参与了长春花与小麦蓝矮植原体之间的互作。关键词：小麦蓝矮植原体；长春花；cDNA-AFLP；表达谱；病程相关蛋白；防御相关基因 ISOLATIONANDANALYSISOFRESISTENCE-RELATEDGENESDURINGPERIWINKLEANDWHEATBLUEDWARFPHYTOPLASMAINTERACTIONABSTRACTPhytoplasmasareassociatedwithdiseasesinoveronethousandofplantspecies,especiallyarelethalinsomewoodyplants.Todate,Wheatbluedwarf(WBD)disease,causedbywheatbluedwarfphytoplasma,hasonlybeenreportedinChina.ItistransmittedbyleafhopperPsammotettixstriatusL.,andmostlydistributesinaridandsemiaridareasofnorthwesternChina,includingShaanxi,Ningxia,GansuandInnerMongolia.Thegrowthofinfectedwheatwasdepressed,andthewheatheadsproutingandfructificationwereinfluenced.Thediseasecouldreducethewheatyield,andthreatwheatproduction.Recently,theresearchesinvolvedinWBDphytoplasmagenomesandpathogenicityhavebeencarriedout.However,themechanismsoftheinteractionbetweenhostplantandphytoplasmawereobscure.Consequently,understandingtheexpressionprofilingofplant-phytoplasmainteractionatthetranscriptomelevel,soastoelucidatethemechanismsinvolvedinmetabolismanddefenseafterhostplantinfectedbyWBDphytoplasma,willbegreatlyimportantforWBDpathogencityresearchandresistantbreeding.Inthepresentstudy,cDNA-AFLPtechniquewasusedtoanalyzethedifferentialexpressionprofileofWBDphytoplasma-infectedperiwinkle(Catharanthusroseus).Quantitativereal-timePCRwerecarriedouttoverifytheexpressionpatternsofTDFsderivedfromcDNA-AFLPanalysis.Pathogenesis-relatedprotein(PRs)genesandsomegenesrelatedwithdefensewerefull-lengthclonedusingRACEmethod,followingbybioinformaticscharacterization.Finally,theexpressionpatternsofthesegeneswereanalyzedduringtheinteractionbetweenperiwinkleandWBDphytoplasma.Themainresultsareasfollows:1.Usingperiwinkleasthematerial,thedifferentialexpressionprofileofWBDphytoplasma-infectedflowerswithvirescencewereanalyzedbycDNA-AFLPtechnique.Twohundredandfifty-eightreliableTDFswereobtainedafterselectiveamplificationandsequencing.Ofthe258transcripts,201TDFswereup-regulatedduringphytoplasmainfection,while57wererepressed.Meantime,125hadrelativelyclearfunctionsinvariouscategories(eg.metabolism,energy,signaltranslocationanddisease/defenseandsoon)whensearchingthenon-redundantproteindatabase.Therefore,thesegenescanbevaluableresourcesforunderstandingmolecularchangesintheplant-phytoplasmainteraction. 2.EightTDFswereselectedforqRT-PCRassays.ThesameexpressionpatternsofallTDFswerefoundasobservedinthecDNA-AFLPanalysis,exceptforoneTDFwhichwasappeareddown-regulatedonthegel,turnedouttobeup-regulatedinqRT-PCRassays.TheresultsrevealedthatthecDNA-AFLPtechniquewasefficientandreliableinidentifyingexpressedgenesinhostplantinducedbyphytoplasmainfection.3.AmongtheisolatedTDFs,twogenes(W_1-23andW_8-35)werespeculatedtobeinvolvedinflowervirescence.Theexpressionpatternsofthesetwogenesweredetectedintheflowerswithdiscorloration,virescence,phyllodyandhealthyones.TheresultsshowedthattheexpressionlevelsofW_1-23indifferentstagesofflowermalformationwerehigherthanthatinhealthycontrol,whiletheexpressionofW_8-35wasup-regulatedinflowerswithdiscorloration,anddown-regulatedinflowerswithvirescenceandphyllody.TheseindicatedthatW_1-23andW_8-35havearoleduringflowermalformation.4.Tencandidatedreferencegeneswereselected,andtheirexpressionstabilityduringWBDphytoplasmainfectionwereevaluatedusingthealgorithmsgeNormandNormFinderprogram.TheresultsshowedthatCrL23performedwellwhenallsampleswereconsidered.CrTUBandCrTUAwerethemoststablereferencegenesforflowermalformationduringWBDphytoplasmainfection.Inaddition,CrACTwasthemoststablereferencegeneforsamplesfromdifferenttissuesofperiwinkle.5.AccordingtothesequencesderivedfromcDNA-AFLPanalysis,twoPRgeneswereclonedwithRACEmethod.ThefulllengthofCrPR5was1049bp，andtheORFwas750bpwhichencoded249aa.WhileCrPR6was1682bpinlength,andtheORFwas1170bp,whichencoded389aa.CrPR5waspredictedtohaveasignalpeptidewithinitsNterminalresiduesandlackthetransmembrane.However,CrPR6hadnosignalpeptideortransmemberaneregion,andwaspredictedtobelocalizedonperoxisome.6.qRT-PCRanalysiswascarriedoutfortheexpressionofCrPR1a,CrPR2,CrPR4,CrPR10a,CrPR5,CrPR6,CrPR13andCrPR14duringWBDandJujubeWitches’Broom(JWB)phytoplasmainfection,respectively.Theexpressionpatternsweredifferentforthesamegeneintwophytoplasma-infectedperiwinkles.MostofthegeneswereinducedbyWBDphytoplasmaaftergrafted5days,whilethetimepointofbeinginducedbyJWBphytoplasmawaslater.TheresultsindicatedthatPRshavedifferentrolesinthesetwoperiwinkle-phytoplasmasystems.7.ThefulllengthofCrCBSX3wasclonedusingtheRACEmethod.TheORFofCrCBSX3(1051bp)was618bp,andencoded205aa.ExpressionprofilesanalysisshowedthatCrCBSX3expressedwiththehighestlevelintheflower,andthelowestoneintheroot.Inaddition,CrCBSX3wasstronglyinducedafterWBDphytoplasmagrafted10daysduringthe periwinkle-WBDinteractions.SubcellularlocalizationinNicotianabenthamianaleavesshowedthatCrCBSX3localizedinthecytoplasm.TransientexpressionanalysisindicatedthatCrCBSX3couldsuppressthecelldeathcausedbyBAXintobaccocells,whichindicatedthatCrCBSX3hadavitalroleintheearlystageofthisinteractionsystem.KEYWORDS:WheatBlueDwarfphytoplasma,perieinkle,cDNA-AFLP,expressionpattern,pathogenesis-relatedprotein,defense-realtedgene 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1植原体病害.................................................................................................................11.1.1植原体的危害......................................................................................................11.1.2植原体引起的植物的症状..................................................................................11.1.3植原体的检测......................................................................................................21.1.4植原体的分类......................................................................................................31.1.5植原体在寄主体内的运动..................................................................................41.1.6植原体的基因组及对寄主的致病性..................................................................61.2小麦蓝矮病.................................................................................................................91.2.1小麦蓝矮病的症状及危害..................................................................................91.2.2小麦蓝矮病的病原及其寄主范围....................................................................101.2.3小麦蓝矮植原体的基因组................................................................................111.3植物与植原体的互作研究.......................................................................................121.3.1长春花为植原体的实验寄主.............................................................................121.3.2植物产生的生理生化变化................................................................................121.4cDNA-AFLP技术分离差异表达基因.....................................................................141.4.1cDNA-AFLP技术的原理与方法......................................................................151.4.2cDNA-AFLP技术特点......................................................................................151.4.3差异表达基因的分离技术在植物与植原体互作中的应用............................161.5植物PR蛋白研究进展............................................................................................171.5.1PR蛋白的分类和功能.......................................................................................181.5.2PR蛋白的分布...................................................................................................191.6本研究的目的和意义...............................................................................................20第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析..........................212.0引言...........................................................................................................................212.1材料、仪器和试剂...................................................................................................212.1.1材料....................................................................................................................212.1.2仪器和试剂........................................................................................................212.2实验方法...................................................................................................................222.2.1小麦蓝矮植原体的接种与样品采集................................................................222.2.2总RNA的提取与纯化.....................................................................................22 2.2.3cDNA-AFLP表达谱分析..................................................................................232.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳.........................................................................................282.2.5差异条带的回收和纯化..................................................................................302.2.6差异条带的连接和转化....................................................................................312.2.7cDNA回收片段的测序及功能分析.................................................................312.2.8cDNA回收片段的功能分析.............................................................................322.2.9qRT-PCR验证cDNA-AFLP的差异表达基因.................................................322.3结果与分析...............................................................................................................342.3.1长春花的症状表现............................................................................................342.3.2长春花花的总RNA提取.................................................................................352.3.3cDNA-AFLP表达谱分析..................................................................................362.3.4部分差异表达基因的qRT-PCR分析...............................................................412.4讨论...........................................................................................................................422.4.1WBD植原体引起的花绿变...............................................................................432.4.2植原体侵染后寄主植物的代谢........................................................................442.4.3植原体侵染后防御相关基因的表达................................................................44第三章长春花感染WBD植原体后体内内参基因的筛选.................................................473.0引言...........................................................................................................................473.1材料和仪器...............................................................................................................473.2实验方法...................................................................................................................483.2.1长春花样品采集................................................................................................483.2.2总RNA的提取.................................................................................................483.2.3长春花cDNA的合成.......................................................................................483.2.4内参基因的筛选................................................................................................483.2.5qRT-PCR引物设计与检验................................................................................493.2.6定量引物的扩增................................................................................................503.2.7候选内参基因表达稳定性的评价....................................................................503.2.8感病长春花中CrDEF表达谱分析..................................................................503.3结果与分析...............................................................................................................513.3.1定量引物的特异性检测与PCR扩增效率......................................................513.3.2内参基因的表达量............................................................................................513.3.3geNorm结果分析...............................................................................................533.3.4NormFinder结果分析........................................................................................553.3.5内参基因的验证................................................................................................553.4讨论...........................................................................................................................56 第四章长春花CrPR5和CrPR6基因全长的克隆与表达分析..........................................584.0引言...........................................................................................................................584.1材料、仪器和试剂....................................................................................................594.2实验方法................................................................................................................594.2.2总RNA的提取及cDNA的合成.....................................................................594.2.3CrPR5和CrPR6基因全长的克隆与分析........................................................594.2.4PR基因的表达谱分析.......................................................................................624.3结果与分析...............................................................................................................634.3.1长春花感染JWB植原体后的症状表现..........................................................634.3.2CrPR5和CrPR6基因的克隆............................................................................644.3.3CrPR5和CrPR6基因序列分析........................................................................664.3.4PR蛋白基因的表达谱分析...............................................................................714.4结论与讨论...............................................................................................................73第五章长春花CrCBSX3基因的克隆与分析......................................................................755.0引言...........................................................................................................................755.1材料、仪器和试剂....................................................................................................765.2实验方法....................................................................................................................765.2.1长春花样品采集.................................................................................................765.2.2总RNA的提取及cDNA的合成.....................................................................765.2.3CrCBSX3基因全长的克隆与分析....................................................................765.2.4SouthernBlot.......................................................................................................775.2.5qRT-PCR分析表达量的变化............................................................................805.2.6CrCBSX3的亚细胞定位分析...........................................................................805.2.7CrCBSX3基因在本氏烟中超表达....................................................................825.3结果与分析...............................................................................................................825.3.1CrCBSX3基因的全长克隆................................................................................825.3.2CrCBSX3蛋白的序列分析...............................................................................835.3.3CrCBSX3基因在长春花基因组中的拷贝数分析............................................855.3.4CrCBSX3基因的表达谱分析............................................................................865.3.5CrCBSX3的亚细胞定位分析...........................................................................865.3.6CrCBSX3基因超表达抑制BAX诱导的细胞坏死..........................................885.4结论与讨论................................................................................................................89第六章结论和创新点............................................................................................................906.1结论...........................................................................................................................906.2创新点.......................................................................................................................91 6.3进一步研究设想.......................................................................................................91参考文献..................................................................................................................................92附件................................................................................................................................107致谢................................................................................................................................121作者简介................................................................................................................................123 第一章文献综述1第一章文献综述1.1植原体病害1.1.1植原体的危害植原体是一种专性寄生于植物韧皮部和昆虫的病原性细菌。与其他革兰氏阳性菌相比，它的基因组非常小，和其他柔膜菌纲成员一样，没有细胞壁，只有单层细胞膜包被（Doietal.1967）。用电子显微镜能够在感病材料中观察到植原体的存在，其形态多样，有圆形，珠状，丝状，球状，直径在200-800nm（Leeetal.2000）。植原体在世界范围内能够引起千余种病害，侵染多个属的植物，对重要的经济作物（如葡萄、甘蔗和椰子等）及自然生态系统造成严重的损害（Leeetal.2000）。目前，植原体引起的病害还在逐年增加。植原体的侵染已经成为世界上许多重要作物生产上的最主要的限制因素（LeeandDavis1992；McCoyetal.1989）。植原体在适宜条件下如种植感病品种及合适温度下活跃的介体昆虫，能够对农业造成严重的损失，尤其在农村经济比较落后的国家和地区，损失更加严重。仅2001年，植原体在苹果树上大爆发，导致德国损失2500万欧元，而意大利损失了1亿欧元（Strauss2009）。椰子致死黄化病的大流行导致非洲和加勒比海地区很多以椰子为经济来源及食物来源的人民流离失所。世界上由植原体引起的重要经济作物病害还包括：翠菊黄化，引起该病害的植原体寄主范围非常广泛，包括马铃薯、胡萝卜、玉米、番茄、洋葱和鲜花等；美国地区桃上的植原体病害；欧洲和美国的苹果增殖和梨衰退病；欧洲和澳大利亚葡萄上的病害；发生在非洲东部和亚洲的甘蔗白叶病和水稻黄矮病；美洲中部及南部发生的马铃薯丛枝及玉米丛矮病；亚洲花生、芝麻、大豆上的病害等（Dickinson2013）。由于这些病害的发生，国际上对很多感病的植物种类实行了检疫性管理（Maustetal.2003）。1.1.2植原体引起的植物的症状植原体能够侵染世界上1000多种植物，引起的很多种病害尤其在木本植物上都是致死性的（McCoyetal.1989）。植物表现的症状随着寄主植物种类、植原体侵染时寄主植物的老嫩程度、植原体株系、病害的发展阶段及环境条件的不同而有差异（McCoy1979；Seemülleretal.2002）。由植原体引起的特异性的典型症状包括花的变色和畸形（例如花绿变、花变叶、巨芽，花的增殖和花的其他异常症状，所有的这些症状都导致花的不育）、腋芽和辅助芽的增殖导致产生的丛枝（枝条纤细）、叶片莲座形、节间缩短、托叶变大、韧皮部组织变褐等（图1-1）。植原体引起的非典型的症状大多数出现在木本植物上，包括叶片的黄化和红化、小叶、叶子卷曲、叶脉增大、坏死、过早成熟、过早落叶、果实变小、叶片稀疏、顶端枯死、植物矮化、树势衰退等。还有极少数植原体侵染的植物在整个生命周期中均不表现症状；还有些症状会出现暂时性或者永久性的缓解， 2长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析被称为“恢复”。植原体侵染植物的一个特例是一品红，这种侵染对植物的影响是有益的。侵染后的一品红看起来浓密，矮化，使其成为选择盆栽的理想性状，在节日庆祝中更受青睐。（引自BertacciniAetal.2009，2014）图1-1植物感染植原体后的典型症状A.紫松果菊表现花绿变；B.枣疯树丛枝症状；C.长春花表现花绿变；D.葡萄感染FD植原体；E.草莓花绿变症状。(ByBertacciniAetal.2009，2014)Fig.1-1Typicalsymptomsofplantsinfectedwithphytoplasmas.A.Purpleconeflowerinfectedwith16SrIX-Cphytoplasmas;B.Witches’broomsymptomsonZiziphusjujubainducedbyinfectionwith‘Ca.Pziziphi’;C.Periwinkleshowingflowervirescenceinfectedwith16SrIX-Cphytoplasmas;D.Grapevineflavescencedoréesymptoms;E.Strawberrygreenpetalsinwhichvirescentandmalformedfruitsarepresentinafield.1.1.3植原体的检测由于不能获得植原体的任何纯培养物，在过去的几十年，植原体的检测和鉴定进展缓慢。观察感病植物的症状，然后通过电镜观察超薄切片中植原体的形态成为诊断植原体病害的主要手段。此外，抗生素（如四环素）喷施后症状消失更能辅助支持这种诊断结果。通过植原体的生物学特性如感病植物的症状是否相同，植物寄主和昆虫寄主等是区分和鉴定植原体的株系的主要途径。然而确定这些生物学特性耗费时间精力，而且重复性较差。 第一章文献综述3在二十世纪80年代，多克隆和单克隆抗体制备及植原体特异性DNA的分离有效地推动了植原体病害诊断的发展（Bonnetetal.1990；Chenetal.1992；Harrisonetal.1992；Maixneretal.1994；Sinha1988）。利用特异性高的单克隆抗体进行血清学检测例如酶联免疫分析，免疫荧光显微观察等，能够相对简便、灵敏、可靠的检测和鉴定植原体的株系。以植原体DNA为探针进行点杂交和Southern杂交，能够了解植原体间的遗传关系，区分植原体不同的组和亚组。在已知株系群中通过Southern杂交和RFLP分析植原体的基因组DNA，能够很容易地区分植原体的不同株系。在二十世纪80年代末和90年代初发展起来的PCR技术进一步推动了植原体病害的诊断及检测的发展（LeeandDavis1992）。PCR技术相对于血清学检测和DNA杂交技术，灵敏度更高。起初，基于已克隆的植原体DNA片段的序列设计PCR引物，能够特异性的检测不同株系的植原体。而且PCR技术能够检测到较低浓度的植原体，这是血清学和DNA杂交不能达到的。随后，有些实验团队根据高度保守的16SrRNA基因序列设计了植原体的通用引物和组间特异性寡核苷酸引物（AhrensandSeemuller1992；DavisandLee1993；DengandHiruki1991；GundersenandLee1996；Leeetal.1993；Lorenzetal.1995；Nakashimaetal.1993；Schneideretal.1993；Smartetal.1996）。采用这些引物，扩增到了大量的植原体株系以及特定植原体组的16SrDNA序列。此举在植原体研究领域是一项重要的突破性进展，研究者首次能够将植原体与寄主植物和介体昆虫三者联系起来，并在这个大病害范围内进行检测和研究。随后，人们又根据16S-23S区间的序列和保守的rp基因及延伸因子EF-Tu(tuf)基因序列对通用引物和植原体组间特异性引物进行了改进和完善（Schneideretal.1995）。随着分子生物学技术的发展，从2004年起，植原体的检测与鉴定方面逐渐引入了实时荧光定量PCR技术。传统的PCR扩增需要将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后才能分析结果，比较耗时。然而荧光定量PCR完全能够克服这个问题，每个扩增循环监测到的荧光值与目的基因的含量的log值成比例，利用特异性引物就能在荧光定量PCR的过程中对植原体进行检测和鉴定，因此荧光定量PCR更灵敏、简便、快速，同时降低了扩增过程中污染的危险。1.1.4植原体的分类植原体首次发现于1967年，之前半个世纪人们都认为黄化病是由病毒引起的，日本学者Doi等（1967）在感染黄化病的植物韧皮部的超薄切片中首次观察到了植原体。由于植原体的形态与动物病原支原体相似，因此被命名为类菌原体（Mycoplasma-likeorganisms，MLO）。随后通过电子显微镜观察，陆续发现了其他由MLO引起的病害。在20世纪90年代初，通过DNA序列的系统进化分析，人们认识到MLO在柔膜菌纲中是一个大的单源群，从此，MLO有了新的命名-植原体（phytoplasma）。柔膜菌纲的其他成员包括支原体、无胆甾原体、螺原体等，他们与芽孢杆菌、梭菌和链球菌的进化 4长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析关系非常近。植原体的基因组很小，大约为530kb-1600kb，基因组G+C含量很低，大约在23.0-29.5%。目前植原体被划分为一个新的属即“植原体暂定属”（‘CandidatusPhytoplasma’）（Firraoetal.2005）。通常分类学家将类似植原体这种不能人工培养的微生物命名为“暂定”（Candidatus）。在这个体系中，16SrRNA基因的序列相似性在97.5%以上即认为是同一个种。根据这个标准已经鉴定了超过28个的暂定种。在植原体分类中，与暂定种分类系统地位相当的同时也被广泛应用的是16Sr组的分类体系，这种分类是基于16SrDNA的限制性酶切片段多态性的结果。首先采用通用引物，以感病植物或者昆虫的DNA为模板，扩增病原的16SrDNA片段，PCR产物经过特异的限制性内切酶酶切后，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能够非常清晰的观察酶切后的谱系，根据这种限制性酶切条带多态性（RFLP）将植原体划分到各个16Sr组及亚组（Leeetal.1998）。尽管目前植原体还不能纯培养，但是可以在温室内采用多年生的植物（例如长春花）或者组培技术来保存和繁殖植原体。然而还有很多株系不能得到有效保存，目前人们只知道其引起的症状及提交到GenBank数据库中的16SrDNA序列。传统的RFLP技术不能对它们进行分析，造成许多新的株系不能在16Sr组及‘CandidatusPhytoplasma’中归类。因此，Wei等人（2007，2008）开发了一款基于NCBI核酸数据库的在线分析软件，模拟RFLP技术，采用电子酶切的方法对酶切条带进行分析，采用特定的公式计算酶切片段的相似性系数（NeiandLi1979），并与已知的株系进行比较。根据这种方法，目前将植原体划分到30个16Sr组（Dickinsonetal.2013）。1.1.5植原体在寄主体内的运动植原体在植物韧皮部专性寄生，主要通过韧皮部取食的介体昆虫如叶蝉（Cicadellidae）、飞虱（Fulgoromorpha）和木虱（Psyllidae）进行传播（WeintraubandBeanland2006）。植原体还可以通过嫁接繁殖及菟丝子（Cuscutaspp.）进行传播。一旦植原体进入到植物体内，会通过韧皮部的筛孔运动到整个植物，偶尔在韧皮部与筛管相邻的伴胞细胞也能观察到植原体的存在。了解植原体在寄主植物体内如何运动以及在不同组织中的分布对于研究寄主植物与植原体间的互作关系非常重要。1.1.5.1植原体在植物体内的运动在草本植物体内，Kuske和Kirkpatrick（1992）通过嫁接方法将翠菊黄化（AsterYellow，AY）植原体的两个株系SAY（severe）和DAY（dwarf）嫁接到实验寄主长春花上，连续10周观测植原体的运动模式，发现两个株系的运动模式相似。在嫁接伤口愈合后大约一周，两个株系的植原体从接穗运动到主茎嫁接点的下方嫩枝，然后系统运动到整个植物。SAY株系比DAY株系运动更快，能够比DAY早一周检测到。同时，感染SAY的长春花表现的症状比感染DAY的早一周。嫁接4周后，在植物的不同组织 第一章文献综述5中SAY的含量比DAY的高，而且SAY引起的症状更明显。然而，接种4周后，SAY的含量开始下降，而DAY的含量仍然增加，到观察的后期，DAY的含量高于SAY的含量，但是在症状表现上，DAY的还是不如SAY的症状明显。两种株系在活跃生长的分生组织中含量最高，这类分生组织包括主茎嫁接点下方的嫩枝以及接穗滋生出来的侧枝，在根中的含量最低。地上部分植原体的分布及含量与植物产生的症状轻重一致。三叶草绿变植原体在自然条件下侵染草莓后，在其体内的定殖方式与AY的相似。植原体的含量在显症的肉茎和花托中含量最高，其次是萼片、花瓣和叶片，然而在草莓的根中没有检测到三叶草绿变植原体（Clarketal.1983）。将X植原体通过介体叶蝉Colladonusmontanus在实验条件下接种到芹菜上，植原体首先能够在根部检测到（Kirkpatrick1991）。待芹菜完全表症后，植原体在茎尖中的含量最高，其次是受到严重侵染的新叶。在完全退绿的老叶中虽然还能检测到X植原体，但是含量极低。Wei等人（2004）通过定点接种技术、巢式PCR、定量PCR及免疫组化方法分析了洋葱黄化（OnionYellow，OY）植原体在茼蒿体内的运动模式。利用介体叶蝉Macrostelesstriifrons接种植原体到茼蒿的一个固定的叶片，OY植原体从接种叶逐渐运动到主茎、根、顶部叶片，然后到达下部叶片。接种21天后OY植原体就能够在植物体内系统分布，而且在接种后14-28天，它的含量每周大约增加6倍，根中的含量高于接种叶片。在地上的组织中，OY植原体在接种叶和茎尖中含量最高，然后是新叶和接种点下部的叶片。接种28天后，茼蒿表现出典型的内部症状如根的韧皮部坏死、茎韧皮部增生，以及外部症状如长势变弱等。Saracco等人（2006）分析菊花黄化（CY）植原体在三色菊体内的定殖方式，也得到了相似的结果。利用介体叶蝉Macrostelesquadripunctulatus定点接种植原体到基部或者顶部的叶片，CY在根部和新生的顶部叶片中的含量高于成熟的基部叶片，且在根中的含量通常高于地上组织。在木本植物中，植原体在发病植物地上部分的定殖表现出季节性波动。Schaper和Seemüller等人（1982；1984；1984a；1984b）通过几年的连续嫁接和DAPI染色方法监测了感染苹果增殖（AppleProliferation，AP）病的苹果树中植原体以及感染梨衰退（PearDecline，PD）病的梨树中的植原体的运动与定殖。由于植原体依赖于有活力的筛管，而且木本植物苹果和梨树的地上组织的筛管在深秋和早春会出现退化现象，因此冬天AP和PD植原体几乎在地上部分检测不到。然而，由于根部的完整筛管一直存在，这两种植原体常年定殖在根部。在春天万物萌生的季节，地上部分形成新的韧皮组织，AP和PD植原体再从根部重新扩散到地上部分。每年的3月份，新的分化型筛管一出现，植原体就开始重新定殖。AP和PD植原体向上运动的很慢，以大约平均每天7.5-30mm的速度。苹果树和梨树上症状的表现依赖于重新定殖的植原体的数量，因此，每年的感病症状表现也随着植原体含量的多少而有差异。1.1.5.2植原体在介体昆虫体内的运动植原体与植物病原螺原体相似，既能在植物体内生长，又能在昆虫体内繁殖以实现 6长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析自然状态下病害的传播。介体昆虫取食感染植原体的植物而受到植原体侵染的过程称为获毒取食期（acquisitionfeeding）。昆虫在营养丰富的筛管细胞（含有植原体）中取食，使植原体进入到昆虫体内（Hogenhoutetal.2008）。然而植原体需要粘附在中肠表皮细胞膜上，才能进入中肠，在中肠的表皮细胞中复制，然后穿过中肠细胞进入到肠内腔，在肠刷毛的表皮细胞和附近的肌肉细胞增殖，然后释放到血淋巴。通过血淋巴侵染昆虫其他的器官和组织，其中包括唾液腺。唾液腺细胞中有大的液泡，内含唾液蛋白，能够在昆虫取食植物时分泌到植物中。植原体在这种大液泡中进行复制和累积，随着昆虫取食植物分泌的唾液进入到植物筛管细胞。从获毒期到接种期之间的时间被称为潜伏期，这段时间大约为10天，但也有可能很长（长达12周）。潜伏期时间的长短与植原体的种类、昆虫的种类以及温度有关。1.1.6植原体的基因组及对寄主的致病性1.1.6.1植原体的基因组目前世界上已报道了5个植原体的全长基因组，分别是翠菊黄化（‘CandidatusPhytoplasmaasteris’）的两个株系，澳大利亚植原体（‘Ca.P.australiense’）的两个株系以及苹果植原体（‘Ca.P.mali’）的一个株系（Andersenetal.2013；Baietal.2006；Kubeetal.2008；Oshimaetal.2004；Tran-Nguyenetal.2008）。已知的全基因组序列为探究植原体与寄主互作的分子机制及为植原体毒性的研究提供了强大的平台。植原体拥有植物病原细菌中最小的基因组，但是很多重要的保守基因在基因组中都有多个拷贝。植原体基因组中含有大量的转座子基因和插入序列，在相似的地方分布着相似的基因，这种被称为潜在的移动单元PMU（potentialmobileunits），为植原体所特有（Baietal.2006）。植原体内还含有染色体外DNA或者质粒。目前在16SrI和16SrXII的所有成员及其他组16SrIII和16SrVI的部分成员中均发现有质粒的存在（Kuboyamaetal.1998；Nishigawaetal.2001；Nishigawaetal.2002；Oshimaetal.2001；Rekabetal.1999）。植原体基因组中包含很多编码转运系统如苹果酸盐、金属离子和氨基酸转运子的基因，其中很多基因以多拷贝形式存在。这表明植原体能够摄取寄主细胞的很多代谢产物，因此造成了寄主植物体内的代谢紊乱，从而导致症状的产生。通过分析OY-M植原体的基因组，发现其体内缺少ATP合成酶基因。OY-W基因组中有一个约30kb的区域，以两个拷贝的形式存在。在这个区域内的基因编码了2套糖酵解的酶类，这种现象在其他细菌的基因组中目前还没有被发现（Oshimaetal.2007）。然而糖酵解并不对每个植原体来说都重要，因为在‘Ca.P.mali’植原体中完全缺失与这些相关的酶类（Kubeetal.2008）。1.1.6.2植原体对寄主的致病性由于植原体体内缺少了很多常见的代谢途径，必须从寄主细胞中摄取大量的代谢物质，因此对寄主造成了一定的影响，而寄主表现出不同的症状可能与侵染植物的植原体 第一章文献综述7基因组大小有关。OY植原体温和株系（OY-M）侵染植物后，植物表现出温和的增殖和黄化现象，而被严重株系（OY-W）感染后，植物会产生黄化、矮化、增殖和丛枝的现象。这两个植原体株系的基因组大小不同，OY-W为1000kb，而OY-M大小为860kb。随后的研究显示，OY-W基因组中的5个糖酵解基因为双拷贝，同时，OY-W在植物体内的含量也高于OY-M。这些现象说明植原体对植物体内碳源的利用可能促进OY-W的繁殖，直接或者间接导致植物产生更严重的症状（Oshimaetal.2007）。目前已报到OY的一个毒性因子TENGU在转基因烟草和拟南芥中能够产生丛枝和矮化的症状。尽管植原体只在韧皮部生存，但是免疫组化分析结果显示TENGU存在于顶芽组织中，说明该蛋白从韧皮部运输到了其他细胞。该研究中基因芯片的结果显示生长素响应基因在转TENGU基因的植物中表达受到抑制（Hoshietal.2009）。由于植原体没有细胞壁，在植物细胞内生存，它们的膜蛋白和分泌蛋白暴露于植物细胞或者动物细胞的细胞质中，这些蛋白可能在寄主与植原体互作及植原体对寄主的毒性方面有重要的作用，是候选的效应蛋白。因此，鉴定植原体基因组中组成分泌系统的基因对探究植原体的生物学习性非常重要。植原体有两个已知的分泌系统，YidC系统用于膜蛋白的整合，而Sec系统用于整合分泌蛋白，并将其分泌到寄主细胞质中。OY-M植原体中含有编码SecA，SecY和SecE的基因，在植原体侵染的植物中能够检测到SecY和SecA基因的表达（Kadizawaetal.2001；Kadizawaetal.2004；Weietal.2004）。在植原体其他三个基因组中也鉴定到了这些基因（Baietal.2006；Kubeetal.2008；Tran-Nguyenetal.2008），而且很多植原体的株系中都能克隆到secY基因（Leeetal.2006；Leeetal.2010；Baietal.2009）。这些结果说明Sec分泌系统在大多数甚至所有的植原体中发挥了作用。有报道表示抗原膜蛋白通过Sec分泌系统分泌到寄主细胞中。OY-M株系的Amp蛋白在N端含有Sec系统的信号肽序列，成熟后该序列被切掉（Kadizawaetal.2001），说明植原体的Sec系统与其他细菌的Sec分泌系统一样，能够识别和切割信号肽序列。采用SignalP和TMHMM软件预测植原体已知基因组中的分泌蛋白，结果显示AY-WB基因组中，有56个基因编码分泌蛋白，其中基因组编码49个，其他7个由质粒上的基因编码；OY植原体中编码45个分泌蛋白，AUSGY植原体中编码41个，而AP植原体中只有13个分泌蛋白基因，玉米丛缩植原体（MBSP）中含有25个编码分泌蛋白的基因。植原体将效应因子分泌到筛管细胞的细胞质中，这些效应因子可能与筛管内的成分互作或者经由筛管进入到伴胞细胞、叶肉或者其他植物细胞中。AY-WB的效应蛋白SAP11（9kDa）和OY的TENGU（<5kDa）都能够在韧皮部之外的组织中被检测到（Baietal.2009；Hoshietal.2009）。此外，SAP11含有一段核定位信号序列，然而韧皮部筛管中没有细胞核，更加说明SAP11定位在韧皮部外的其他组织细胞中。OY的TENGU在茎尖、分枝处的腋芽以及茎的顶端分生组织中有分布，定位于在植物细胞质。转SAP11的拟南芥叶片皱缩，且能产生与AY-WB侵染拟南芥造成的丛枝相似的症 8长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析状。酵母双杂筛选及免疫共沉淀分析结果表明SAP11与植物的TCP（TEOSINTEBRANCHED1,CYCLOIDEA,PROLIFERATINGCELLFACTORS1and2）转录因子互作。该类TCP转录因子分为两类，ClassI和II，而ClassII的TCP又划分为CIN(CINCINNATA)-TCPs和TB/CYC(TEOSINTEBRANCHED1/CYCLOIDEA)-TCPs。ClassI的TCP有报道能够控制细胞增殖，而classII的CIN-TCP调控细胞成熟，通过两类TCP家族之间的平衡来控制植物的生长（MartinandCubas2010）。免疫共沉淀结果表明SAP11能够与CIN-TCP互作，但是不能与classI家族的TCP互作。同时转SAP11的植株与敲除CIN-TCP的植株在叶子的表型上相似。因此，SAP11是CIN-TCP的负调控因子（Sugioetal.2010）。敲除CIN-TCP的植株会产生很多不成熟的细胞导致叶子变大褶皱（Efroniletal.2008），而TB/CYC-TCP突变的植株会表现出茎的增加（MacLeanetal.2011）。因此，SAP11导致的茎的增加表明SAP11也能与classII的TB/CYC-TCP互作。转SAP11的拟南芥中JA合成量下降，而JA参与了拟南芥对AY-WB的传播介体Macrosteles(M.)quadrilineatus的防御反应。健康的M.quadrilineatus在AY-WB侵染的拟南芥上的产卵量比在健康拟南芥上的产卵量高约60%（Sugioetal.2010）。而感染AY-WB的M.quadrilineatus在取食拟南芥10天后（AY-WB运动到叶蝉的唾液腺的时间，此时植物感染AY-WB，叶蝉的产卵率才开始上升。因此，叶蝉产卵率的增加是因为植物受到AY-WB的侵染所致，而不是由于叶蝉受到了AY-WB的侵染。同样作者观察到在转SAP11的拟南芥上叶蝉的产卵率也有所增加。Hoshi等人通过在本氏烟上瞬时表达筛选到OY中有一个能够使本氏烟产生形态变化的效应蛋白TENGU（Hoshietal.2009），能够导致本氏烟产生丛枝和矮化现象。TENGU大约为4.5kDa，而成熟的蛋白质只有38个氨基酸。转tengu基因的拟南芥表现出一系列的症状包括丛枝、矮化、叶序缺失及花不育等。基因芯片分析转tengu基因的拟南芥基因的表达量变化，结果显示一些与生长素响应相关的基因表达下调。因此推测TENGU可能直接影响生长素的合成和信号转导途径，也可能通过影响其他的分子途径，间接地影响生长素的生理学变化，从而导致植物形态的变化。AY-WB的另一个效应蛋白SAP54基因转到拟南芥中，能够对花的发育产生影响（MacLeanetal.2014）。转基因的拟南芥心皮又发育成新的花，一些花产生绿色叶片状的有表皮毛的花瓣，而且萼片肥大。AY-WB侵染的拟南芥产生的绿色花瓣也有表皮毛，有时也会产生与转SAP54的拟南芥表现相似的花，偶尔在花序的顶端还会产生一朵顶生花。然而，转SAP54的拟南芥不会产生顶生花，但会继续产生花序。通过酵母双杂及免疫共沉淀分析，MacLean等人得到SAP54能与MADS转录因子（MTF）家族中的成员互作，其中关键调节因子SEPALLATA3和APETALA1在调节花器官发育上占据中心位置。SAP54与RAD23家族的蛋白互作来降解MTFs。拟南芥rad23缺失突变体在转SAP54后或者直接接种植原体，都没有使花转变成叶状的组织，说明RAD23对SAP54活性的发挥有重要作用。转SAP54基因的拟南芥更能够吸引叶蝉，而且这种吸引依赖 第一章文献综述9于RAD23。然而目前RAD23家族的蛋白在花的生长发育或者植物对昆虫的防御方面的功能并没有相关报道。因此，在植物中SAP54能将两种重要途径联系起来，改变植物的生长，导致植物不育，而且使植物吸引更多的介体叶蝉取食产卵，以帮助植原体的繁殖与传播。1.2小麦蓝矮病1.2.1小麦蓝矮病的症状及危害小麦蓝矮（WheatBlueDarf，WBD）病目前仅在我国有报道，是一种小麦上的植原体病害，主要分布在西北干旱和半干旱的冬麦区包括陕西、宁夏、甘肃和内蒙古等地，由介体条沙叶蝉（PsammotettixstriatusL.）专化性传播（安德荣等1991；张秦风等1993）。该病害在小麦返青后即开始表现症状，感染WBD植原体的小麦初期叶片发黄；发病严重的小麦分蘖减少，甚至不分蘖。随后小麦叶片增宽加厚直立，叶鞘松弛，叶片上会出现一些深绿色的条形区域，植株矮化，节间缩短，越到顶部节间越短，导致叶片类似轮生（柳树斌等2005；吴云锋等2005）。感病后期小麦严重矮化，高度仅为健康小麦的约三分之一，植株表现黄化，抽穗减少，甚至不抽穗，即使能够正常抽穗，但不能正常开花，绝大部分麦穗不会含有籽粒，即使有籽粒也发育不良，比健康的籽粒小且不饱满。小麦蓝矮病的症状因侵染时期、小麦品种及气候条件等因素的不同而表现出差异。朱象三等人（1984）在温室条件下通过介体条沙叶蝉对不同时期的小麦进行接种，系统阐明了WBD对小麦的影响。在小麦真叶期接种WBD植原体，小麦植株叶片颜色变浅，生长缓慢，边缘卷曲，植株不分蘖，感病严重的生长停滞，植株枯死；在小麦分蘖期接种植原体，植株停止分蘖，拔节受阻，后期枯死；在小麦拔节期接种植原体，植株节间缩短，导致叶片丛生，能够抽穗的植株穗茎变短，小穗发育不良，同时根部的发育也受到影响，根毛减少，根部坏死。小麦蓝矮病影响小麦植株的生长，导致小麦的抽穗和结实受到影响，造成小麦的大量减产。一般发病较轻的田块减产20%-40%，发病较重的田块减产60%-80%，甚至绝收。小麦蓝矮病与其他病害混合发生，对我国陕西、甘肃和山西等地的小麦产量造成严重损失。自20世纪80年代以来，随着套作耕作制度的发展及麦草覆盖还田的推广，小麦蓝矮病在陕西发生了10余次，在甘肃也流行过若干次。该病每次流行大约会危害90,000公顷的小麦，造成50,000吨的小麦损失（刘汉文1990）。1996年春，陕西韩城市约20%的小麦田块爆发该病，发病田块中10%（333hm2）的田块颗粒无收。之后十年小麦蓝矮病在该市有着不同程度的危害。2005年，小麦蓝矮病危害的小麦田块面积占该市小麦种植面积的40%，其中约六分之一的田块发病严重，重病田块中五分之一（200hm2）的田块绝收（柳树斌等2005）。 10长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析1.2.2小麦蓝矮病的病原及其寄主范围小麦蓝矮病是一种植原体病害。朱象三等（1984）调查了小麦蓝矮病发生分布的生态环境，并开展了小麦蓝矮病与冻害和水肥关系的实验，证实小麦蓝矮病不是由冰冻和水肥等条件直接引起的生理性病害。同时研究了介体昆虫对小麦蓝矮病的影响，证实小麦蓝矮病能够通过介体昆虫进行传播。安德荣等人（1991）收集小麦蓝矮病株，使用大麦黄矮病毒、小麦黄花叶病毒、雀麦花叶病毒、玉米矮花叶病毒和高粱红条纹病毒五种病毒的抗血清对其进行检测，均无阳性的结果，因此认定小麦蓝矮病不是由以上5种病毒引发的病害，此外，他们对病株进行超薄切片电镜观察，结果发现病株韧皮部细胞中存在类菌原体（即植原体），直径在50-1000nm，能够以芽生或二均分裂的方式增殖，因此确定小麦蓝矮病是由类菌原体引起的。此外，采用四环素处理感病小麦，发现感病小麦的发病程度受到明显抑制，进一步证实小麦蓝矮病由类菌原体引起。随着PCR及RFLP技术在植原体检测及鉴定方面的应用，顾沛雯等（2005）和张荣等（2005）根据WBD植原体的16srDNA片段序列对其进行系统进化分析，结果表明WBD植原体为16SrI组即翠菊黄化组成员，与三叶草绿变植原体亲缘关系最近，同时被细划到16Sr-C亚组。张春平（2010）对陕西韩城、合阳和甘肃定西的小麦蓝矮病样品进行分析，分别克隆其16SrDNA片段和rp基因片段，并对克隆片段进行RFLP分析，结果显示WBD植原体可分为3类，分别为16SrI-B、16SrI-C和16SrI-S亚组植原体，表明WBD植原体存在多样性。WBD植原体由条沙叶蝉持久专化性传播，但不经卵传播（朱象三等1984）。相建业（1994）和顾沛雯等人（2007a）对条沙叶蝉的传播机制进行了系统研究，阐明条沙叶蝉的获毒取食期为7天；WBD植原体在叶蝉体内存在潜育期，大约为15-17天；成功接种WBD植原体的时间为2-3天。条沙叶蝉一旦获得WBD植原体，可终身携带并传播。WBD植原体的寄主范围很广，除能够侵染小麦外，还可以侵染其他多种植物。顾沛雯等人（2005，2007b）通过田间发病田块附近作物及杂草的样品16SrDNA的PCR扩增检测，及室内条沙叶蝉的接种鉴定，得出WBD植原体能够侵染多种田间杂草及蔬菜花卉，总共9个科的植物（表1-1）。表1-1小麦蓝矮植原体的寄主范围Table1-1HostsofWheatbluedwarfphytoplasma植物Plants分类地位Classification小麦（TriticumaestivumL.）禾本科（Gramineae）冬牧（Secalecereale）禾本科（Gramineae）野燕麦（AvenafatuaL.）禾本科（Gramineae）节节麦（Aegilopssquarrosa）禾本科（Gramineae）大画眉草（Eragrostiscilianensis(AII)L.）禾本科（Gramineae） 第一章文献综述11翠菊（CallistephuschinensisNees）菊科（Compositae）米米蒿（DescurainiasophiaL.）菊科（Compositae）白菜（Brassicaoleraceavar.capitata）十字花科（Cruciferaceae）小花唐芥（ErysimumcheiranthoidesL.）十字花科（Cruciferaceae）紫花苜蓿（Medicagosativa）豆科（Leguminosae）三叶草（TrifoliumrepensL.）豆科（Leguminosae）长春花（CatharanthusroseusG.Don）夹竹桃科（Apocynaceae）番茄（Lycopersiconesculentum）茄科（Solanaceae）婆婆纳（VeronicadidymaTenore）玄参科（Scrophulariaceae）反枝苋（AmaranthusretroflexusL.）苋科（Amaranthacae）麦加公（Lithospermumarvense）紫草科（Boraginaceae）1.2.3小麦蓝矮植原体的基因组小麦蓝矮植原体属于16SrI组成员，该组的OY及AY植原体中均含有染色体外DNA即质粒，根据已公布的质粒序列，陈旺等人（2014）通过反向PCR技术，克隆到了小麦蓝矮植原体的3个质粒。三个质粒的大小分别为3449bp，3601bp和3844bp，共编码15个蛋白，其中5个为分泌蛋白，5个为膜蛋白。此外质粒中含有编码复制相关蛋白（RepA），拷贝数调控蛋白（Cop）及单链DNA绑定蛋白（SSB）的基因。对目前NCBI网站公布的36个植原体质粒的rep蛋白序列进行系统进化分析，结果表明WBD植原体的两个质粒pWBD1和pWBD2与泡桐丛枝（PaWB）植原体南阳株系的质粒pPaWBNy-1关系最近；pWBD3与苦楝丛枝（CWB）植原体的质粒pCWBFq亲缘关系最近。此外，采用荧光定量PCR的方法对WBD植原体的三个质粒的拷贝数在实验寄主长春花上的组织特异性及时间变化进行分析，结果显示质粒在嫁接点以下组织中的含量较高，尤其在根中最高；在整个侵染过程中质粒pWBD1的数量变化不大，然而其他两个质粒在显症后三个月时拷贝数最高。以上结果说明植原体的质粒在植原体侵染寄主的过程中及植原体对不同环境的适应方面发挥了一定的作用，但是具体的分子机理还需要进一步的探究。陈旺等人（2013）通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）分离到了WBD植原体的基因组DNA，大小约为650kb。随后通过基因组扩增（MDA）技术对WBD基因组的DNA进行扩增，经过测序组装，得到了WBD植原体的基因组草图（Chenetal.2014）。该草图含有6条拼接后的序列，共计611,462bp，覆盖率达94%。通过目前已知序列分析，序列中含有525个编码蛋白的基因，2个rRNA操纵子和32个tRNA基因。比较基因组学分析显示大部分WBD植原体编码蛋白的基因与其他植原体的基因同源，有22个WBD特异性基因。WBD植原体基因组中含有46个转运子，涉及到二肽/寡肽、亚精胺/腐胺、Mn/Zn的转运等。基因组中共预测到32个分泌蛋白，其中有三个分别与已报道的效应 12长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析因子TENGU，SAP11和SAP54有同源性。WBD植原体基因组序列的获得为研究植原体的自身代谢、与寄主之间的互作提供了非常重要的信息。1.3植物与植原体的互作研究1.3.1长春花为植原体的实验寄主长春花（Catharanthusroseus(L.)G.Don）极易受到植原体的侵染，因此被用作植原体的实验寄主，用于植原体的保存繁殖及研究，以便深入的了解植原体及其引起的病害（Seemulleretal.1998；CHoietal.2004；Favalietal.2004）。长春花是一种多年生的热带植物，属于世界上广泛分布和种植的夹竹桃科（Patietal.2011）。长春花是一种常绿植物，因其叶片墨绿色，有光泽，花瓣颜色鲜艳，在温度适宜的条件下可常年开花，被广泛用于庭院栽培及观赏（Aslametal.2010）。在20世纪60年代，人们发现长春花的叶片提取物有抗肿瘤的功效，因此，长春花还是一种重要的药用植物。其体内含有大量的类单萜吲哚生物碱类物质，其中长春花碱和长春新碱是目前商业上重要的抗癌药物（Abduletal.2007；Guptaetal.2007）。研究表明，长春花感染植原体后根部长春花碱的含量显著高于健康的长春花中的含量（Favalietal.2004）。长春花在感染植原体后表现出的症状包括：花绿变（花瓣颜色变绿）、花变叶（花的各个结构变成叶片状）、不育、花瓣条纹状或畸形、叶片黄化直立、腋芽大量萌发、增殖、丛枝、衰退、叶片褶皱或者卷曲、花瓣颜色变淡、花瓣变小等，但这些症状因植原体的种类、侵染时间等条件的不同而有差异。大多数的植原体都能通过嫁接、菟丝子或者介体昆虫传播到长春花上。植原体在植物体内的含量差异很大，在木本植物例如树木和葡萄体内的植原体含量很低，而植原体在长春花体内的含量非常高（Bergesetal.2000）。1.3.2植物产生的生理生化变化植原体专性寄生在植物的韧皮部筛管，能够影响植物体内物质的运输，从而导致成熟叶片中碳水化合物的非正常积累。在新生的叶片和根中，重要的能量储存物质急剧下降（Catlinetal.1975；BraunandSinclair1978；KisonandSeemuller2001；Lepkaetal.1999；Guthrieetal.2001；Maustetal.2003）。光合作用产物转运的变化以及生理功能受影响如光合作用、气孔电导率、根的呼吸作用下降，次级代谢产物的改变，植物激素平衡的扰乱，很可能由韧皮部功能紊乱引起，从而导致症状的产生（Choietal.2004；Maustetal.2003；McCoy1979；Leónetal.1996；Lepkaetal.1999；TanandWhitlow2001）。1.3.2.1植物激素的变化由植原体引起的植物症状被归为植物生长素类病害。植原体病害大部分的典型症状例如巨芽、花变叶、增殖等其他症状表明植物体内的激素平衡被打乱。Pertot等人（1998）报道植原体侵染的长春花嫩枝中吲哚乙酸（IAA）的含量比对照增加了10倍。然而，对 第一章文献综述13健康植物喷施IAA或者其他生长素类似物质，都没有产生与植原体侵染表现类似的症状，这种情况支持了感染植原体的组织中IAA水平的升高是植物响应胁迫的一种非特异性反应或者次级响应机制的假设。Perica（2008）通过持续地外施生长素或者IBA能够使感染植原体的长春花症状减轻，说明生长素可能对植原体有一定抗性作用。Kesumawati等人（2006）报道了细胞分裂素在绣球花花变叶的症状发展中的作用。植原体侵染导致的花绿变症状的发展与花组织中高含量细胞分裂素的积累有关（Daveyetal.1981）。然而，这些症状与细胞分裂素之间的关系最终是因为细胞分裂素在叶绿体的形成及防止叶绿素降解方面发挥了作用。Nicolaisen和Horvath（2008）通过DD-RTPCR技术分析了感染植原体后一品红体内的基因表达变化。他们分离到三个与植物激素和其他生长调节因子例如细胞分裂素、扩展蛋白和赤霉素合成相关的基因，并且这三个基因的表达量呈现不同程度的上调。由于在植物的顶端分生组织中从没有检测到植原体的存在，因此传递诱导花发育基因表达变化的信号可能为长距离信号。有研究表明植原体能够影响植物韧皮部的功能，损害碳水化合物的运输，从而导致源叶中可溶性糖的积累（Lepkaetal.1999）。糖类的积累在长春花感染螺原体后的叶片中也能观察到（Andréetal.2005）。1.3.2.2胼胝质的产生胼胝质积累是植物抵抗病原侵染的一种非特异性反应。对植原体侵染的多种植物进行组织学观察，结果显示，侵染后首先被检测到的解剖学症状是筛板出现胼胝质的不正常沉积，随后这些筛板和伴胞细胞崩溃瓦解。由于植物对植原体的敏感程度不同，韧皮部会出现或大或小的坏死区域。韧皮部内胼胝质的合成以及P蛋白微丝聚合成栓塞是由钙离子进入韧皮部调节的依赖钙离子的现象，这些物质是植物早期形成，用于阻止植原体运动的物理屏障的关键物质（Musettietal.2008）。在苹果树体内，受到苹果增殖植原体的侵染后，韧皮部的胞浆Ca2+浓度下降（Musettietal.2008）。1.3.2.3植原体对植物体内碳水化合物及光合作用的影响Lepka等人（2004）分析了长春花和烟草在受到植原体的侵染后体内碳水化合物的含量及转运的变化。在感病植物的源叶中还原糖和蔗糖的含量比健康叶片中高；根中糖的含量较低，而且几乎不受植原体侵染的影响。植原体侵染导致源叶中淀粉含量显著上升，而库叶和根中的淀粉含量下降。这些数据与果树和木本植物的结果相似，植原体的侵染导致成熟叶片中碳水化合物的积累，根部的淀粉含量下降。采用超薄切片也观察到相同的结果，叶绿体中淀粉含量的增加与类囊体的严重解体以及叶绿素含量的下降有关（Musetti2006）。碳水化合物的积累在感染椰子致死黄化病的椰子体内及感染玉米簇缩植原体的玉米中也能观察到，被认为是侵染的负效应，可能由于韧皮部运输受到抑制引起的（MusettiandFavali2003；Junqueiraetal.2004）。因此，叶绿体内光合产物累积会抑制光合作用，降低源叶到根部的糖类运输。Jagoueix-Eveillard等人（2001）报道一些柔膜菌纲的病原能够抑制糖类转运相关的基因，例如转酮醇酶。这些基因受到抑制可能 14长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析导致光合作用相关的基因也被抑制。这种基因的变化能够解释由螺原体、植原体和其他韧皮部专性寄生病原引起的植物的黄化症状。植物受到植原体的侵染后，影响了碳水化合物的代谢，从而导致叶片中叶绿素总含量（包括叶绿素a和b）的显著下降。在感染植原体的玉米、苹果和葡萄中可以观察到光和色素的下降。这种情况可能是由于感病叶片中叶绿素酶活性的增强导致的（Bertaminietal.2002b）。叶绿素含量的降低通常伴随着与光合作用相关的基因受到由糖类介导的抑制（Krappetal.1993）。因此，植原体可能参与了抑制寄主植物叶片中叶绿素的合成（Bertaminietal.2002a）。光合作用的下降是植原体侵染对光和电子传递及酶活性产生影响所致。由于一些类囊体膜蛋白的损失以及叶片中可溶性蛋白（主要为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶，RuBPC）的减少，植原体病害导致光合作用整条链的活性显著下降。这种变化与叶片老化诱导产生的变化相似，因此，我们可以推断植原体的侵染导致调控叶片衰老过程的植物激素的平衡受到影响。1.3.2.4植原体对寄主植物蛋白及酚含量的影响植物在受到病原侵染后，由于寄主启动防卫反应，导致植物体内蛋白增加。这些蛋白主要为病程相关蛋白（PR蛋白），其中包括氧化物酶，几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶。玉米在受到玉米簇缩植原体的侵染后，体内蛋白的总量增加（Junqueiraetal.2004）。抗病植株中蛋白的含量高于感病品种，可能由于侵染部位PR蛋白的积累造成。Zhong和Shen（2004）在感染植原体的菊花中分离到6个表达量升高的可溶性蛋白，这些蛋白序列与PR-5家族的奇异果甜蛋白或者渗透蛋白的N端氨基酸序列有高度同源性。在植物受到病原的侵染后，体内积累大量的对病原有毒性的酚类物质，尤其在抗病品种中积累的更多（Afrios1997）。在同一发病组织同时出现不同的酚类化合物，对病原的抗性有协同作用。Musetti等人（2000）对感染植原体的苹果和李树进行了总的酚类物质的测定，在春季开花后首次取样，夏天重复取样，结果发现感病组织中的酚类物质的含量比健康对照高3倍。1.4cDNA-AFLP技术分离差异表达基因目前使用比较广泛的分离差异表达基因的技术主要有mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）、抑制性消减杂交（SSH）、cDNA扩增片断长度多态性技术（cDNA-AFLP）和cDNA微阵列技术（cDNAmicroarray）。DDRT-PCR原理简单，操作简便，但是假阳性高，重复性差，基因冗余发生率高（李子银等1999；Diatchenkoetal.1996）。SSH技术采用了两步杂交和PCR，极大的降低了结果的假阳性，灵敏度高，但是需要的样品量大，在差减杂交过程中，会漏掉很多表达差异较小或者低拷贝的基因，而且不能对多个材料或者不同处理同时进行比较（刘正军2000；Gurskayaetal.1996；Vonsteinetal.1997）。cDNA微阵列技术基于Northern杂交来检测目的基因的差异表达，方法简单， 第一章文献综述15准确性高，但是此技术依赖物种的基因组序列信息，因此使用范围受到限制（邹宗亮2000；Shoemakeretal.2001）。cDNA-AFLP技术是Bachem等人于1996年将限制性片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）技术应用于mRNA的差异分析，从而发展起来的一种mRNA指纹图谱技术，因此称为cDNA-AFLP技术（Bachemetal.1996）。该技术继承了AFLP技术的稳定性和多态性等优点，通过限制性内切酶对反转录后的cDNA酶切，能够集中显示转录组中含有相应酶切位点的基因的表达差异，重复性好，效率高，而且cDNA-AFLP技术无需了解物种的基因组序列信息。因此，cDNA-AFLP技术成为研究基因表达差异及克隆新基因的有效而广泛使用的重要工具。1.4.1cDNA-AFLP技术的原理与方法cDNA-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术，原理如图1-2所示（Bachemetal.1998），首先以mRNA为模板反转录合成cDNA双链；采用能够分别识别6bp和4bp的两个限制性内切酶同时对合成的cDNA双链进行酶切；酶切产物两端连接合适的接头；采用与接头序列互补的引物进行预扩增；之后在预扩增引物的3’端添加2-3个选择性碱基对预扩增产物进行选择性扩增；将选择性扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，通过染色可以观察到大小为100-1000bp之间的清晰条带，平均每对引物扩增出50条左右的条带（Bachemetal.1998）。对凝胶中显示有表达差异的条带进行回收，克隆，能够得到该物种的差异表达基因，以此分析物种在生长过程中或者在胁迫条件下的基因表达变化及生理变化。1.4.2cDNA-AFLP技术特点与其他差异表达基因筛选方法相比，cDNA-AFLP技术具有以下特点：(1)cDNA-AFLP技术重复性好，假阳性率低。该技术以连接接头的双链cDNA的酶切片段为模板进行预扩增及选择性扩增，退火温度较高，而且cDNA中没有内含子，因此，能够切实的反应基因转录状况，可靠性高。Money等人（1996）通过重新合成cDNA并进行选择性扩增，结果表明不同批次合成的cDNA表现结果完全一致，证明cDNA-AFLP的重复性好。cDNA-AFLP技术采用引物3’端添加选择性碱基的方法对模板进行选择性扩增，能够有效减少PCR中被扩增的非目标条带的产生。与其他差异表达分析技术比较，cDNA-AFLP技术对模板及反应条件不会很敏感，要求没有那么苛刻，因此cDNA-AFLP技术能够用于较大范围的基因表达分析（Bachemetal.1998；Baldwinetal.1999）。 16长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析（引自Bachemetal.1998）图1-2cDNA-AFLP技术原理及操作流程示意图Fig.1-2DiagramofcDNA-AFLPmethod(ByBachemetal.1998)(2)能够准确反应基因间表达量的差异并且需要样品量少cDNA-AFLP技术的扩增产物的量取决于该模板的浓度，因此，在凝胶中通过扩增条带的亮度可以判断基因表达量的高低。Bachem等人（1996）利用cDNA-AFLP技术分析马铃薯块茎形成过程中的差异表达基因，结果显示特异表达基因片段TDF531（LOX同源基因）的表达量的变化与Northern分析的结果完全一致。由于cDNA-AFLP技术采用以酶切后的cDNA为模板，通过预扩增及选择性扩增程序扩增到大量的产物，大大放大了模板的量，因此，该技术中对样品量的要求较低，只需少量样品即可完成。1.4.3差异表达基因的分离技术在植物与植原体互作中的应用通过对植原体侵染后植物体内基因表达量的变化，能够了解植物如何应对植原体的侵染，帮助人们更深入的探究植物与植原体间的互作机理。Jagoueix-Eveillard等人（2001）利用DDRT-PCR技术，研究长春花感染植原体后的差异表达基因，经过northernblot分析之后，共分离到24个差异片段（TDFs），其中只有8个TDFs与GenBank数据库中的基因有同源性，涉及到光合作用，糖运输，对刺激的响应及植物甾醇类的合成 第一章文献综述17等。Vincenzo等人（2004）采用同样的方法，检测杏树感染植原体后的差异表达基因，结果得到4个差异表达片段，其中包括编码热激蛋白和金属硫因的基因。Mogens和Nynne（2007）研究观赏植物一品红感染植原体后的差异表达基因，分离到的差异基因中包括在磷酸化信号转导途径中起关键作用的磷酸信号传递因子。V.DeLuca等人（2010）对长春花感染‘CandidatusPhytoplasmapyri’后的差异表达基因进行分析，共分离到16个TDFs，其中7个基因上调，3个基因下调，6个没有变化，这些差异基因涉及的功能包括植物防御反应、蛋白代谢和运输、转录调控和碳水化合物代谢等方面。Chen等人（2011）同样采用DDRT-PCR的方法，对长春花感染花生丛枝（PnWB）植原体后的基因表达差异进行分析，共得到64条TDFs。经过反向Northern杂交验证，仅有10个为阳性，可见DDRT-PCR技术虽然方法简单，但是假阳性率太高。随着研究差异表达基因的技术的发展，Giorgia等人（2009）利用基因芯片研究葡萄感染BoisNoir（BN）植原体后的基因表达差异，检测到有数百个基因的表达量发生变化，涉及到代谢、防御和能量等多个方面。但是采用基因芯片方法的前提是已知植物的基因组序列，迄今关于植物的基因组信息仍然限定在主要的粮食作物、蔬菜和果树上，并没有广泛的物种序列被测定。而基于凝胶显示的cDNA-AFLP技术则不需要待测物种的序列信息，并且相对于基因芯片价格低，操作简单。Maryam等（2011）采用cDNA-AFLP方法研究柠檬树感染’CandidatusPhytoplasmaaurantifolia’产生丛枝后的差异表达谱，应用43对选择性物引组合特异性扩增，得到55个TDFs，其中有36个与柠檬树基因有同源性，有70.5%的基因下调，涉及到柠檬树病害防御、代谢、转录、转运等方面，此外分离到的编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、富含脯氨酸蛋白等的基因表现上调。Aldaghi等（2012）利用cDNA-AFLP技术研究苹果感染植原体后的差异表达基因，采用20对选择性引物组合分离到45个TDFs，其中27个与GenBank数据库中的基因有同源性，主要与光合作用、症状表现、植物防御等方面相关。1.5植物PR蛋白研究进展在植物与病原的非亲和互作中，植物的防御反应对病原的侵染起到限制作用。最有效的是过敏反应（hypersensitiveresponse，HR），导致植物在病原的侵染点附近的细胞迅速坏死形成枯斑。HR涉及到一系列植物代谢产物的变化，而这种变化能够阻止病原的进一步入侵，同时增强寄主对后来入侵的其他病原的防御能力。这些代谢产物变化的同时，植物还受诱导产生各种新的蛋白，这些蛋白总称为病程相关蛋白（Pathogenesis-relatedprotein，PRs）。病程相关蛋白是指植物在病理或者病理相关的环境下诱导产生的由植物编码的蛋白（vanLoonetal.1994）。病理环境涉及到所有的侵染状态，不仅指病原细菌、真菌、卵菌和病毒的侵染，而且还包括线虫、昆虫和食草动物对植物的寄生与取食。病理相关 18长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析的环境包括喷施类似病原物效果的化合物和能诱导相似胁迫条件的化合物。同时自然老化时合成的相关酶类也属于病程相关蛋白。PRs不仅在受侵染的叶片中积累，同时能够系统性诱导表达，参与具有广谱抗性的系统获得抗性（systemicacquiredresistance，SAR）的发展。PRs首次发现于1970年，vanLoon和vanKammen（1970）用烟草花叶病毒侵染烟草叶片，在产生HR的烟草叶片中分离到PRs。植物至少13个科的植物在受到卵菌、真菌、细菌、病毒和类病毒侵染，此外还有线虫和昆虫的攻击后，能够诱导产生PRs。1.5.1PR蛋白的分类和功能目前，根据血清学关系、氨基酸序列及酶活性等，将PR蛋白划分为17个家族（vanLoon1999；Görlachetal.1996；Okushimaetal.2000；Christensenetal.2002）。PRs的每个家族按照被发现的顺序进行编号（表1-2）。每个家族中最典型的成员通常是第一个被发现或者是最重要的一个。表1-2PR蛋白基因家族Table1-2Recognizedfamiliesofpathogenesis-relatedproteinsFamilyTypememberPropertiesPR-1TobaccoPR-1aUnknownPR-2TobaccoPR-2β-1,3-glucanasePR-3TobaccoP,QChitinasetypeI,II,IV,V,VI,VIIPR-4Tobacco‘R’ChitinasetypeI,IIPR-5TobaccoSThaumatin-likePR-6TomatoInhibitorIProteinase-inhibitorPR-7TomatoP69EndoproteinasePR-8CucumberchitinaseChitinasetypeIIIPR-9Tobacco“lignin-formingperoxidase”PeroxidasePR-10Parsley“PR1”Ribonuclease-likePR-11Tobacco“classV”chitinaseChitinase,typeIPR-12RadishRs-AFP3DefensinPR-13ArabidopsisTHI2.1ThioninPR-14BarleyLTP4Lipid-transferproteinPR-15BarleyOxOa(germin)OxalateoxidasePR-16BarleyOxOLPOxalate-oxidase-likePR-17TobaccoPRp27UnknownPR-2具有β-1,3-葡聚糖酶的活性，能够限制病原的活动、生长和扩展；PR-3、4、8和PR11具有几丁质酶活性，可能对真菌的入侵发挥作用；几丁质酶和蛋白酶抑制剂 第一章文献综述19（PR-6）也可能作用于线虫和食草性昆虫。PR-8家族的成员也有溶菌酶的活性，可能直接与细菌互作；然而防御素（PR-12）（LayandAnderson2005；Thommaetal.2002）和硫素（PR-13）均有广谱的抗细菌和抗真菌活性（Bohlmann1994；Eppleetal.1997）。PR-14为脂转移蛋白，有些也有抗真菌和抗细菌的作用；PR-1家族的成员和类甜蛋白PR-5家族的成员能够作用于卵菌，尤其PR-1蛋白通常用来作为由病原诱导的SAR产生的标志，但是它们的生物学活性还不清楚（vanLoonandvanStrien1999）。PR-7为内源蛋白酶，是番茄中含量最丰富的PR蛋白（Jord´aetal.2000），该家族的蛋白可能对微生物的细胞壁裂解有作用。PR-9是一类特异性的过氧化物酶，能够通过催化木质化参与细胞壁的加固（Passardietal.2004），同时能够增强对多种病原的抗性。PR-10与核糖核酸酶同源，而且该家族的一些成员确实有较弱的核糖核酸酶活性（Bufeetal.1996；Parketal.2004）。所有的PR蛋白中没有一种PR蛋白能够直接与病毒特异性互作，但是推断PR-10的核糖核酸酶活性在防御病毒的过程中可能发挥作用（Parketal.2004）。此外，最近有报道显示小麦体内抗真菌的PR-4蛋白也具有核糖核酸酶的活性（Caporaleetal.2004）。PR-15、16、17是新发现的PR蛋白，PR-15和PR-16只在单子叶植物中被发现，前者具有类萌发素草酸氧化酶活性，后者是有超氧化物歧化酶活性的类草酸氧化酶（BernierandBerna2001）。这些蛋白能够产生过氧化氢，对不同类型的病原菌有毒害作用，或直接或间接的激发植物的防卫反应（Donaldsonetal.2001；Huetal.2003）。PR-17蛋白在感病的烟草、小麦和大麦中发现，包含有类似金属蛋白酶的活性位点（Christensenetal.2002），但是目前还没有具体的功能报道。此外，PR-18是一类新的PR蛋白家族，包括由真菌和SA诱导的糖类氧化酶类，该类蛋白只在向日葵中发现，能够产生过氧化氢，并且有抗菌活性（Custeretal.2004）。综上所述，所有的PR蛋白并不是都能在同一植物中发现，而且同一家族的不同成员的含量和功能也可能有很大差异。1.5.2PR蛋白的分布PRs在叶片的表皮和叶肉细胞中都有分布，同时也存在于维管束中。很多与防御相关的蛋白质N端都有信号肽，能够运输到内质网，随后分泌到质外体中，这些蛋白在细胞外积累，能够在细胞间的物质流中很快聚集。有实验结果显示，在番茄、西兰花、油菜、南瓜和黄瓜的木质部渗出液及大麦叶片的吐水液中收集到PR蛋白（Buhtzetal.2004；Kehretal.2005；Repetal.2002；2003；Grunwaldetal.2003），说明PR蛋白分泌到叶脉并能够随着蒸腾作用进行运输。其他的PR蛋白只在液泡中特异的聚集，只有PR-10家族的蛋白定位在细胞质中。很多PR蛋白基因在健康植物中的表达有时空特异性（Broekaertetal.2000；Veroneseetal.2003）。例如，烟草中病原诱导的PR-2葡聚糖酶和PR-3几丁质酶在未受到侵染的新叶中检测不到，但是会随着叶片的成熟而积累，尤其在根部的含量非常丰富。这些PR蛋白和其他的PRs也存在于不同植物的花组织中。绿豆的PR-10家族的蛋白能够特 20长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析异性的绑定细胞分裂素（Fujimotoetal.1998），而唐松草和金丝桃中的类似蛋白在植物的次级代谢中是一种重要的代谢酶类（Samananietal.2004）。此外，PR-10蛋白还能够作为植物类固醇的载体，例如能够绑定油菜素类固醇（Markovicetal.2003）。在烟草和水稻中，PR-2蛋白在正常的花粉形成过程中发挥作用（Worralletal.1992）。另外，在烟草、番茄和豌豆的种子中，PR-2和PR-3家族的蛋白能够降解种皮的细胞壁，帮助胚根生长，并能够保护种子的内部组织不被微生物的入侵（Leubner2005；MorohashiandMatsushima2000；Wuetal.2001）。胡萝卜在胚胎形成到球形期胚胎需要PR-3和PR-4的几丁质酶的参与（Kraghetal.1996）。几丁质酶在胚胎组织中经常出现的原因可能是该酶对阿拉伯半乳糖蛋白有活性（Domonetal.2000；Petruzzellietal.1999）。以上这些结果表明PRs对植物的生长发育有一定的作用，此外，PRs可能通过自身酶的活性，能够产生类似内源激发子的信号分子，这些信号分子可能也在激发其他类型的防卫反应中发挥了作用。一些PRs，例如PR-1，PR-2，PR-3和PR-4类的蛋白和蛋白酶抑制剂，在离带层中有分布（Robertsetal.2000），这种现象说明它们可能参与了细胞壁的松弛或者对细菌和真菌的入侵的防御。叶片中很多病原诱导的蛋白存在于储存组织（果实、种子和块茎）中（Broekaertetal.1997；ShewryandLucas1997）。这些蛋白主要是蛋白酶和淀粉酶抑制剂，凝集素，防卫素，硫素和一些脂转移蛋白（Broekaertetal.2000）。除了保护组织不被捕食或者受到病原侵染（Lozovayaetal.1998），这些蛋白还能形成氮源的储存库（Peumansetal.2002），以供组织度过环境恶劣时期。1.6本研究的目的和意义小麦蓝矮植原体是我国西北干旱和半干旱地区冬小麦上的一种危险性病害，由介体条沙叶蝉传播，寄主范围广。小麦蓝矮病在陕西发生了10余次，在甘肃也流行过若干次。田间流行时，对小麦产量造成严重损失，有些田块甚至颗粒无收，严重威胁小麦生产。虽然已经对小麦蓝矮植原体展开了基因组学的系统研究，但是目前对于小麦蓝矮植原体与寄主间的互作机理还知之甚少。因此，本研究将小麦蓝矮植原体传播到实验寄主长春花上，以感病植株表现出典型症状花绿变的花为材料，采用cDNA-AFLP技术对感染小麦蓝矮植原体的长春花进行差异表达谱分析，并分离和克隆差异表达基因片段，通过荧光定量PCR技术验证cDNA-AFLP表达谱并分析花色相关基因的表达量变化；利用RACE方法克隆病程相关蛋白及防御相关的基因全长，并通过生物信息学分析基因的基本特征；在转录水平分析这些基因在长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的表达模式。初步阐明了寄主在感染小麦蓝矮植原体后在代谢、病害防御等方面的作用机制，对以后研究小麦蓝矮植原体的致病性及其对抗病品种的选育提供理论依据。 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析21第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析2.0引言小麦蓝矮病是中国西北部干旱和半干旱地区冬小麦上的一种重要病害。感病小麦植株严重矮化，基部分蘖增多，发病严重的小麦，麦穗畸形、不育，造成小麦的严重减产甚至绝收（刘汉文1990；张秦风等1993）。该病的病原为小麦蓝矮植原体，前人的研究确定了WBD植原体的分类地位（顾沛雯等2005；张荣等2005），为植原体暂定种16SrI组成员。目前，已经获得WBD植原体的基因组草图（Chenetal.2014），但是关于小麦蓝矮植原体与寄主互作方面的研究还非常少。通过寄主植物与病原互作的表达谱分析二者间的互作机理是一种切实、有效的途径。cDNA-AFLP技术基于凝胶电泳的方法观察基因转录表达情况，能够在基因组水平分离差异表达的基因。该技术被认为是基于片段的检测挖掘基因的最有效、最灵敏的方法之一（Gabrieletal.2006）。长春花是植原体广泛的实验寄主，在感染植原体后能够表现出多种典型症状，主要有花绿变、花变叶、丛枝、节间缩短等症状。本实验以长春花为材料，利用cDNA-AFLP技术对长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的基因表达进行分析，从转录水平了解长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中基因表达的变化，以揭示寄主植物与植原体互作的分子机理，为控制植原体病害提供理论依据。2.1材料、仪器和试剂2.1.1材料2.1.1.1感病长春花的获得与繁殖2011年3月到5月在陕西省韩城小麦感病地块采集带有小麦蓝矮植原体的小麦植株。无植原体的条沙叶蝉（PsammotettixstriatusL.）在感染小麦蓝矮植原体的小麦上取食7d，放入有健康长春花的防虫罩内，迫使叶蝉取食长春花7d左右，取出长春花植株，在防虫玻璃温室中培养。通过芽接方式将感病的长春花枝芽嫁接到10叶期左右的健康长春花上，以后通过定期的连续嫁接的方式来保存和扩繁带毒植株，以备实验所需。2.1.2仪器和试剂2.1.2.1主要仪器Bio-RadPCR扩增仪；北京六一公司水平电泳槽和垂直电泳槽；Eppendorf移液器；EppendorfCentrifuge5415D型台式常温高速离心机；EppendorfCentrifuge冷冻离心机；Milli-Q型超纯水仪；HIRAYAMAHV-50型全自动高压灭菌锅；伯乐-80℃冰箱；赛多 22长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析利斯万分之一电子天平；BIOIMAGINGSystemGeneGENIUS凝胶成像系统；Eppendorf核酸蛋白检测仪ND-2000；震荡培养箱；恒温培养箱；2.1.2.2主要试剂RNA抽提液；M-MLVReverseTranscriptase，Taqpolymerase购自Fermentas公司；克隆载体pMD19-TSimplevector，T4DNALigase，RNaseH购自大连宝生物公司；DNA琼脂糖胶回收试剂盒（离心柱型）购自北京天根生物技术公司；DNApolymeraseI，DNaseI，EcoRI和MseI购自NEB（北京）公司；剥离硅烷和亲和硅烷购自Sigma；丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺（19:1）购自上海生工；酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，pH<5.9）购自索来宝生物技术公司；SYBRGreenPCRMasterMix购自韩国柏业公司；其他化学试剂均为分析纯。2.2实验方法2.2.1小麦蓝矮植原体的接种与样品采集播种长春花种子，待幼苗生长2个月后，将带有WBD植原体的长春花通过芽接方式嫁接到健康长春花的主茎上，用保鲜膜封住伤口，暗处放置24h，然后置于温室正常光照下培养。同时将健康的长春花嫁接到相同生长程度的健康长春花上，作为健康对照。实验设置4个重复。待感病长春花表现出花绿变的症状后，采集有花绿变的整朵花放入采样袋内，立即置于液氮中，-80℃保存。同时采集健康长春花的整朵花作为健康对照。2.2.2总RNA的提取与纯化2.2.2.1植物总RNA的提取参照本实验室的方法提取长春花的总RNA，具体方法如下：RNA抽提液的配置：1MTris-HClpH8.020mLNaCl11.7gSDS10gEDTA18.61g用DEPC处理水溶解，定容至1L，高压湿热灭菌25min。(1)将0.5g的长春花花组织放在研钵中用液氮充分研磨，将粉末装在无RNase的1.5mL离心管中，加入600μLRNA抽提液，600μL酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，pH<5.9）混合液，充分涡旋混匀，室温静置5min；(2)将离心管置于冷冻离心机内，4℃，12,000r/min，离心10min；(3)小心收集上清到新的无RNase的1.5mL离心管中，加入600μL酚：氯仿：异戊醇混合液，充分混匀，室温静置5min； 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析23(4)重复离心，同(2)；(5)小心收集上清至新的无RNase的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，温柔混匀，-20℃放置2h；(6)4℃，12,000r/min，离心15min；(7)弃上清，留沉淀，用1mL无RNase的75%乙醇洗涤；(8)4℃，12,000r/min，离心5min；(9)弃上清，留沉淀，用移液器吸出管底多余液体，室温放置5min，去除乙醇；(10)用50μL无RNase的DEPC处理水溶解沉淀。2.2.2.2总RNA中基因组DNA的去除(1)在200μL离心管中加入以下反应液：RNA1μg10×DNaseIReactionBuffer10μLDNaseI1μL（轻轻抽打混匀）加入DEPC处理水至终体积100μL，37℃温浴30min0.5MEDTA(终浓度5mM)1μL75℃温浴10min（终止反应）(2)加入100μLDEPC水，转入1.5mL离心管，轻轻吸打混匀；(3)加入等体积酚：氯仿（1:1）溶液并充分涡旋，4℃，12,000r/min，离心10min，取上清于新1.5mL离心管中；(4)加入等体积氯仿并充分混匀，4℃，12,000r/min，离心10min，取上清于新1.5mL离心管中；(5)加入0.1倍体积的3MNaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20℃沉淀20-30min；(6)4℃，12,000r/min，离心10min，弃上清，加1mL75%乙醇，4℃，12,000r/min，离心5min，尽量去掉上清；(7)超净工作台中吹干，溶于30μLDEPC水中；(8)利用核酸蛋白检测仪ND-2000测定OD260/OD280，检测RNA的纯度和浓度；(9)吸出RNA溶液2μL，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，电泳条件为10V/cm，20min。观察RNA是否降解，无降解后保存于-80℃备用。2.2.3cDNA-AFLP表达谱分析2.2.3.1cDNA第一链的合成(1)在200μL离心管中加入以下反应液： 24长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析RNA4μLOligo(dT)18primer4.25μLDEPCH2O3.75μLTotalVolume12.5μL70℃水浴5min,迅速冰置5min,取出后，加入以下试剂：M-MLVRT5×Reactionbuffer5μLRNaseInhibitor0.625μLdNTPs(10mmol/L)5μLM-MLVReverseTranscriptase1μLDEPCH2O0.625μLTotalVolume25μL(2)轻弹混匀，瞬时离心；(3)42℃水浴1h，95℃5min，立即置于冰上；(4)取出4μLcDNA第一链产物存放在4℃，以备用于琼脂糖凝胶电泳，其余用于第二链的合成，-20℃保存。2.2.3.2cDNA第二链的合成(1)在200μL离心管中加入以下反应液：cDNA第一链产物10μLNEBuffer2(10×)3μLT4DNAligasebuffer3μLT4ligase(350U/μL)0.5μLRNaseH(60U/μL)0.5μLDNApolymeraseI(4U/μL)2μLdNTPs(2.5mmol/L)6μLddH2O5μLTotalVolume30μL(2)轻轻混匀，瞬时离心，16℃反应2.5小时，70℃灭活10分钟，冰上放置；(3)取4μLcDNA第二链产物，同保存的cDNA一链产物一起在1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，同时上1kbLadder用作分子量标记，确定双链的大小范围。2.2.3.3双链cDNA(dscDNA)的纯化(1)取75μLdscDNA于1.5mL离心管中，加水稀释至300μL，加入等体积苯酚，轻轻充分混匀，室温2,000r/min离心5min；(2)小心吸取上清液（约250μL）于新离心管中（切勿取中间层），加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻充分混匀，室温2,000r/min离心5min；(3)吸取上清液（约200μL）于新离心管中，加入0.1倍体积3mol/LNaAc（pH5.5） 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析25和2倍体积无水乙醇，轻轻混匀，-20℃沉淀过夜或者-80℃沉淀20-30min；(4)室温12,000r/min离心10min，弃上清；(5)加入600μL75%乙醇，充分悬浮沉淀，室温12,000r/min离心10min；(6)弃上清，沉淀置于超净工作台中吹干；(7)加入25μLddH2O溶解，经核酸蛋白检测仪ND-2000测定双链cDNA的浓度，用ddH2O稀释成200ng/μL的相同浓度，-20℃保存备用。2.2.3.4接头和引物的合成本实验所需的接头和引物均由北京奥科生物科技公司合成，引物序列如下：表2-1cDNA-AFLP引物序列Table2-1PrimersequencesforcDNA-AFLPanalysis引物名称(Primername)引物序列(Sequencesofprimer)接头：EcoRI接头Ead15’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’EcoRI接头Ead25'-AATTGGTACGCAGTC-3'MseI接头Mad15’-GACGATGAGTCCTGAG-3’MseI接头Mad25'-TACTCAGGACTCAT-3'预扩增引物：E005’-GACTGCGTACCAATTC-3’M005’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’选择性扩增引物：E-AG5’-GACTGCGTACCAATTCAG-3’E-AC5’-GACTGCGTACCAATTCAC-3’E-AT5’-GACTGCGTACCAATTCAT-3’E-AA5’-GACTGCGTACCAATTCAA-3’E-CC5’-GACTGCGTACCAATTCCC-3’E-CT5’-GACTGCGTACCAATTCCT-3’E-CA5’-GACTGCGTACCAATTCCA-3’E-CG5’-GACTGCGTACCAATTCCG-3’E-TA5’-GACTGCGTACCAATTCTA-3’E-TT5’-GACTGCGTACCAATTCTT-3’E-TC5’-GACTGCGTACCAATTCTC-3’E-TG5’-GACTGCGTACCAATTCTG-3’E-GC5’-GACTGCGTACCAATTCGC-3’E-GA5’-GACTGCGTACCAATTCGA-3’ 26长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析E-GG5’-GACTGCGTACCAATTCGG-3’E-GT5’-GACTGCGTACCAATTCGT-3’M-AC5’-GATGAGTCCTGAGTAAAC-3’M-AT5’-GATGAGTCCTGAGTAAAT-3’M-AG5’-GATGAGTCCTGAGTAAAG-3’M-AA5’-GATGAGTCCTGAGTAAAA-3’M-CG5’-GATGAGTCCTGAGTAACG-3’M-CT5’-GATGAGTCCTGAGTAACT-3’M-CC5’-GATGAGTCCTGAGTAACC-3’M-CA5’-GATGAGTCCTGAGTAACA-3’M-GA5’-GATGAGTCCTGAGTAAGA-3’M-GT5’-GATGAGTCCTGAGTAAGT-3’M-GC5’-GATGAGTCCTGAGTAAGC-3’M-GG5’-GATGAGTCCTGAGTAAGG-3’M-TA5’-GATGAGTCCTGAGTAATA-3’M-TT5’-GATGAGTCCTGAGTAATT-3’M-TC5’-GATGAGTCCTGAGTAATC-3’M-TG5’-GATGAGTCCTGAGTAATG-3’2.2.3.4cDNA-AFLP酶切本实验中采用MseI和EcoRI对上面得到的双链cDNA进行双酶切。MseI的识别位点为：EcoRI的识别位点为：5'...T^TAA...3'5'...G^AATTC...3'3'...AAT^T...5'3'...CTTAA^G...5'MseI/EcoRI双酶切体系如下：dscDNA10μL（2µg按实验计算）NEBufferEcoRI2μLBSA2μLEcoRI2μLMseI2μLddH2O2μLTotalVolume20μL轻轻混匀，瞬时离心，37℃孵育5h，65℃孵育45min；取4μL酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，其余放于冰上备用。2.2.3.5接头的连接 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析27(1)接头的制备准备2个200μL微量离心管，各加入以下反应体系：Ead1(10μmol/L)10μLMad1(100μmol/L)10μLEad2(10μmol/L)10μLMad2(100μmol/L)10μLEcoRIadapter(5μmol/L)20μLMseIadapter(50μmol/L)20μL将混合好的接头EcoRIadapter(5μmol/L)和MseIadapter(50μmol/L)于95℃变性5min，65℃反应10min，然后室温冷却。(2)1×TE(pH8.0)配制：1.211gTris，0.372gEDTA-Na2，先用800mLddH2O溶解，用浓盐酸调节pH到8.0，再用蒸馏水定容至1000mL，高压灭菌20min。接头连接体系：酶切产物10μLEcoRIadapter(5μmol/L)0.5μLMseIadapter(50μmol/L)0.5μL10×Ligasebuffer2.5μLT4DNAligase(1U/μL)1.0μLddH2O10.5μLTotalVolume25.0μL混匀，瞬时离心，16℃连接过夜，然后用1×TEbuffer（pH8.0）将产物稀释10倍，作为预扩增的模板，储存在-20℃。2.2.3.6cDNA-AFLP预扩增预扩增反应体系：在200μL离心管中加入以下反应液：Dilutedtemplate4.0μL10×PCRbuffer2.5μLMgCl2(2.5mmol/L)2.5μLdNTPs(2.5mmol/L)2.0μLE00(10μmol/L)1.0μLM00(10μmol/L)1.0μLTaq-Polymerase(5U/μL)0.2μLddH2O11.8μLTotalVolume25.0μL混匀，瞬时离心，后放在PCR仪中进行预扩增。预扩增反应程序为：94℃3min;94℃30s,56℃1min,72℃1min,30个循环；72℃7min；8℃forever。取2μL预扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩余产物用1×TEbuffer稀释50倍， 28长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析作为选择性扩增的模板，保存在-20℃冰箱。2.2.3.7cDNA-AFLP选择性扩增在200μL离心管中加入以下反应液：Dilutedtemplate4.0μL10×PCRbuffer2.5μLMgCl2(25mmol/L)2.5μLdNTPs(25mmol/L)2.0μLE-NN(10μmol/L)1.0μLM-NN(10μmol/L)1.0μLTaq-Polymerase(5U/μL)0.2μLddH2O11.8μLTotalVolume25.0μL混匀，瞬时离心，然后放在PCR仪中进行选择性扩增。选择性扩增反应程序为：94℃3min94℃30s65℃(-0.7℃/cycle)30s13cycles72℃1min94℃30s56℃30s25cycles72℃1min72℃5min8℃forever取部分选择性扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行检测，以验证PCR体系及程序的有效性。确认有效后，选择性扩增产物可直接用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。2.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳2.2.4.1玻璃板的处理(1)玻璃板的清洗：先用洗涤剂清洗，然后用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗干净，晾干；(2)晾干的玻璃板用无屑纸巾蘸取无水乙醇快速擦拭2次，涂抹均匀，晾干；(3)用优质无屑纸巾蘸取0.5%亲和硅烷（5μL亲和硅烷，5μL冰醋酸，990μL无水乙醇）快速均匀涂布于长玻璃板上，涂亲和硅烷的目的是使凝胶充分与玻璃板粘贴；(4)用优质无屑纸巾蘸取2%剥离硅烷快速均匀涂布于短玻璃板上，目的在于跑完胶后使短玻璃板容易与长玻璃板分离，使凝胶完全贴合在长玻璃板上； 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析29(5)洗净梳子和压条，用纸巾擦干；(6)组装长玻璃板和短玻璃板，保证长玻璃板涂亲和硅烷的一面与短玻璃板涂剥离硅烷的一面相对，用塑料胶带将两侧和底部封口固定，防止漏胶。2.2.4.2制胶(1)溶液配制：A.10×TBE配制：Tris108g硼酸55gNa2EDTA7.44g加蒸馏水溶解，定容至1L。B.6%聚丙烯酰胺储存液的配置丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺（19:1）120mL尿素420g10×TBE100mL用磁力搅拌器搅拌至完全溶解后，加ddH2O定容至1L，过滤后避光保存在4℃冰箱。(2)灌胶在100mL烧杯中加入5%聚丙烯酰胺储存液60mL，10%过硫酸铵（AP）300μL和TEMED50μL，轻轻搅拌30s，避免产生气泡，混匀后通过进胶口将胶注入倾斜的玻璃板内，待玻璃板内注满胶后，将干净的鲨鱼齿梳子背插入两板之间，避免气泡产生，水平放置胶板，两侧和底部用夹子夹紧固定，室温放置至少30min。(3)预电泳待胶凝固后，去掉胶板周围的夹子、塑料胶带和梳子，将灌胶口清理干净，把胶板安装到垂直电泳槽中，上下电泳槽内各加入适量1×TBE电泳缓冲液，1600V恒压预电泳30-45min，使胶表面的温度达到50℃左右。用注射器吸取1×TBE溶液冲洗凝胶上界面，冲去残胶和析出的尿素，小心插入鲨鱼齿梳子，梳齿刚插入到凝胶面即可。(4)点样25μL扩增产物中加入10μL上样缓冲液（98%去离子甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青），95℃变性5min后，立即转移至冰水混合物中冷却。取6μL样品进行点样。(5)电泳1400V恒压电泳2h左右，至溴酚蓝到达凝胶最底部。2.2.4.3凝胶银染显色(1)固定电泳结束后，小心分开两块玻璃板将有凝胶的长玻璃板置于2L10%冰醋酸溶液（1.8L蒸馏水，200mL冰醋酸）中，在摇床上轻摇20min。(2)冲洗用重蒸水冲洗胶板2次，每次2min。(3)染色在2L蒸馏水中加入2gAgNO3，混匀后，放入有胶的玻璃板进行染色，水平摇床上轻摇30min。 30长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析(4)冲洗将染色后的胶板放入蒸馏水中快速漂洗10s，立即拿出，竖直控水。(5)显色2L蒸馏水中加入20gNaOH，使之充分溶解，放至室温，使用前加入3mL甲醛，将胶板快速放入显影液中，轻摇7-8min，直至可以看到清晰的条带。(6)再固定将有条带的胶板再次放入10%冰醋酸溶液中，轻摇5min，终止反应。(7)水洗用蒸馏水水洗4min。取出后室温自然晾干，照相并统计结果。2.2.5差异条带的回收和纯化2.2.5.1差异条带的回收(1)用移液器吸取10μLddH2O，将目的条带周围润湿，然后用10微升移液器吸头将条带挑出放入200μL离心管中，加入100μLddH2O漂洗2次，扔掉漂洗液。(2)离心管中加入50μLddH2O，室温下浸泡凝胶24h。(3)将离心管在沸水浴中煮沸10min，立即置于冰上，-20℃保存。2.2.5.2差异条带的纯化(1)取适量煮沸过的上清液为模板进行差异表达条带的二次PCR，PCR的体系和程序同2.2.3.7。(2)将PCR产物再次通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，步骤同2.2.4。(3)在凝胶上挑取与上一次条带大小相同的条带进行回收和处理；(4)以第二次回收的胶条为模板进行大体积的PCR，PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，在紫外光下用手术刀片割取目标条带，装入1.5mL离心管中，按照天根普通琼脂糖凝胶回收试剂盒的操作说明回收目的条带DNA。具体方法如下：A.柱平衡：向吸附柱CA2（吸附柱放入收集管）中加入500μL平衡液BL，室温12,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。B.向胶块中加入3倍体积的溶胶液PN（凝胶重0.1g，其体积可视为100μL）。50℃水浴10min，每隔几分钟轻轻上下颠倒离心管，使胶块充分溶解。室温放置2min，待溶胶液温度降至室温。C.将步骤B中的溶液加入到吸附柱CA2中，室温放置2min。室温12,000r/min离心1min，弃废液，吸附柱重新放回收集管中。D.向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，室温静置5min。12,000r/min离心1min，弃废液。E.重复步骤D。F.室温12,000r/min离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于放入一个干净的离心管中，室温放置或者超净台吹干5min，彻底晾干，防止残留的无水乙醇影响后续试验。G.向吸附柱中央悬空加入40μLddH2O，室温放置2min。室温12,000r/min离心1 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析31min。H.为了提高DNA片段的回收量，将离心得到的溶液重新加到离心吸附柱中，重复步骤G。将所得溶液直接进行连接或-20℃保存。2.2.6差异条带的连接和转化2.2.6.1差异条带的连接将回收的差异条带连接到pMD19-TSimple载体上，体系如下：回收产物4μLSolutionI5μLpMD19-TSimpleVector1μLTotalVolume10μL轻弹混匀，瞬时离心，16℃连接30min以上。2.2.6.2差异条带的转化(1)大肠杆菌DH5α感受态由本实验采用CaCl2法制备，具体制备方法如下：A.原始菌种在2mLLB液体培养基中活化24h；B.以1:100比例接种于100mLLB培养基中，37℃200r/min培养2-3h，至OD值达到0.5-0.6；C.将培养的大肠杆菌菌液冰浴10min，平均分到3个50mL离心管中，4℃3,000r/min离心10min；D.倒掉上清，每管用20mL0.1mol/LCaCl2悬浮沉淀，用移液器吸打混匀；E.冰上放置10min，4℃3,000r/min离心10min；F.倒掉上清，每管加入2mL含15%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液，重悬菌体；G.等量分装到1.5mL离心管中，每管100μL，迅速冰置，-80℃保存备用。(2)连接产物转化A.从-80℃冰箱取出感受态细胞，冰上放置融化；B.加入10μL连接产物，轻轻吸打混匀，冰置30min；C.在42℃金属浴中热激60-90s，立即放于冰上5min；D.每管加入200μLLB液体培养基，在37℃摇床上180r/min缓慢震荡培养20min，然后调整转速到220r/min，继续培养至少40min；E.用移液器吸取全部的转化产物至含Amp（60mg/mL）LB固体培养基平板上，用涂布器均匀涂抹，37℃倒置培养过夜。F.挑取单克隆至含有1mLLB液体培养基的2mL离心管中，37℃220r/min震荡培养5h。2.2.7cDNA回收片段的测序及功能分析2.2.7.1回收片段的测序 32长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析(1)菌液PCR：取1μL菌液作为模板进行PCR，PCR体系和程序同2.2.3.7。(2)测序：将上一步得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择有条带的阳性菌液进行测序。1mL的菌液平均分装在两个1.5mL离心管中，室温5,000r/min离心1min，用移液器完全吸掉上清液后，每管中加入400μL已灭菌的20%甘油。其中一管送去测序，另一管保存在-80℃冰箱备用。本实验所有的测序均由北京奥科生物科技公司测序完成。(3)得到的测序序列去除载体及两端引物后，在NCBI网站上，利用NCBI的BLAST在线分析工具对所获得差异片段序列在GenBank数据库中进行同源序列比对及分析。2.2.8cDNA回收片段的功能分析(1)将所有得到的差异表达片段（differentiallyexpressed-transcriptderivedfragments，DE-TDFs）序列整理成一个.fasta格式的文件；(2)利用CAP3软件（HuangandMadan1999）（http://doua.prabi.fr/software/cap3）在线对序列进行拼接，去除冗余序列和序列长度不足100bp的序列；(3)将所得到的非冗余序列采用Blast2GO软件进行注释和功能分析，方法参照Götz等（2008）的文章。大体方法如下：A.将自己的序列文件以.fasta格式导入到Blast2GO软件；B.点击“Blast”菜单中的“MakeBlast”，将序列进行Blastx相似性比对分析，数据库选择GenBank中的非冗余蛋白质数据库nr（non-redundantproteindatabase），E值<10-6；C.待比对完成后，点击“Mapping”菜单中的“RunGO-MappingStep”获得序列的GO分类数据，参数为缺省值；D.Mapping结束后，点击“Annotation”菜单中的“RunAnnotationStep”，参数为缺省值，以完成序列的注释。E.对有些有Blastx比对结果但是没有得到注释的TDF序列，通过“InterProScan”将序列在InterPro数据库中进行蛋白质结构域或结构原件的预测；F.最后将步骤D和E得到的结果进行整合，导出注释信息。G.根据得到的序列注释，参照Bevan等（1998）的方法对序列进行功能划分归类。2.2.9qRT-PCR验证cDNA-AFLP的差异表达基因根据得到的差异表达基因功能的分类，挑选可能与植物抗病、信号转导途径以及未分类相关的候选基因，对其在健康长春花与感染WBD植原体表现花绿变的花中的表达量进行分析，验证利用cDNA-AFLP技术分析差异基因表达谱的准确性和可靠性。2.2.9.1感病长春花上表现花绿变的花朵的获得感病长春花的嫁接方法同2.2.1，待发病长春花表现出花绿变的症状后，采集有花绿 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析33变的整朵花，样品采集方式同2.2.1，同时采集健康对照。2.2.9.2长春花样品总RNA的提取样品总RNA的提取与纯化同2.2.2。2.2.9.3cDNA第一链的合成样品中cDNA第一链的合成方法同2.2.3.1。将得到的反转录产物用ddH2O稀释10倍，储存在-20℃冰箱。2.2.9.4部分差异表达基因的qRT-PCR分析本研究选择了8个TDFs，这些基因功能涉及能量和病害防御等方面。同时选择了两个可能与花色变化相关的TDFs，分析其在花变态过程中的表达量变化。差异表达基因的荧光定量PCR引物由Primer5.0软件设计。本实验中选择长春花的18SrRNA基因作为内参基因，荧光定量引物序列参考Christensen等（2004）的文章。所有的定量引物序列见表2-2。表2-2荧光定量PCR分析用引物序列Table2-2PrimerssequencesusedinqRT-PCRanalysisPrimernameForwardprimersequence(5’-3’)Reverseprimersequence(5’-3’)＊18SGACTACGTCCCTGCCCTTTGAACACTTCACCGGACCATTCAW_29-1-6-1CGGCAATGATTTTACAACGCACATGAGAACCAAACTGGGGW_463TTTTCGCCTATGTGGATGATTGGTAAGACAGTTTTGAGTTH_29-1-25-2TCCCAATTCCTTTTGCCAACGTCCCTCTTCAAGCCTTTCW_62CAAGACACTCATCATTTGGTAGTAGTATTTGACCCGCTW_448ACTGCACATTGGATGCTTTGTTGCTGCTTGATGGGAGAGAW_404GCGATCATCCAAATCAACAAACCATACCTATCATCCCACTW_12-1-1-2AAGCATTTAGCAAAGGTCCTTGAGAAACAATTCAACTH_349GTTCCTACCACCAACCAAAATCAGCCCCCATCATCAAAGTW_8-35TGTTTTGGGAGTTATGGGTCATCTTGCCTTCAGGTGGTGW_1-23AACCTCCACTATTCCCCCCTTACTTCCCCAAGCGACAC＊18SrRNA基因的定量引物参考Christensenetal.2004.(1)引物特异性检测在进行基因表达分析前，首先利用普通PCR技术检测各定量引物扩增的特异性，若琼脂糖凝胶电泳结果显示为单一条带，说明该引物特异性较好，可以用荧光定量PCR做进一步验证；若琼脂糖凝胶电泳结果显示为非单一条带，则该差异片段的定量引物需要重新设计。(2)qRT-PCR分析荧光定量PCR反应使用iQ5仪器。以稀释10倍的反转录产物为模板进行荧光定量PCR。反应体系如下： 34长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析2×SYBRGreenPCRMasterMix12.5μLDilutedtemplates2μLPrimer1(10μmol/L)1μLPrimer2(10μmol/L)1μLddH2O8.5μLTotalVolume25μL荧光定量PCR程序为：95℃10min，95℃5s，55℃30s，40个循环。反应结束后立即进行熔解曲线分析：95℃15s，55℃15s，每个循环上升0.5℃，直至升到95℃。每个反应重复3次，生物学重复3次。利用iQ5软件分析各个基因的扩增曲线和熔解曲线，确定各基因在感病长春花与健康对照样品中的Ct值。以长春花的18SrRNA基因为内参，采用2-ΔΔCT方法（LivakandSchmittgen2001）计算各个基因的相对表达水平。2-ΔΔCT表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。其中ᇞᇞCT＝ᇞCT，Gene－ᇞCT，Control，ᇞCT，Gene为样品目的基因的CT值与同一样品的内参基因CT值的差值，ᇞCT，Control为对照组中目的基因的CT值与内参基因CT值之间的差值。2.3结果与分析2.3.1长春花的症状表现通过芽接的方法将WBD植原体嫁接到健康长春花上，嫁接后8天左右，接穗成活；25天左右，感病长春花即可表现出花褪色（图2-1A）或者花绿变（图2-1B）的症状；嫁接后40天左右，能够观察到花变叶的情况（图2-1C），嫁接后大约70天，长春花表现出系统感病症状（图2-2A），包括腋芽萌发（图2-2B）、节间缩短（图2-2C）、叶片发黄（图2-2D）、植株矮化等症状。图2-1长春花感染WBD植原体后的花的变化A.花褪色；B.花绿变；C.花变叶Fig.2-1PeriwinkleflowermalformationafterWBDphytoplasmainfected.A.flowerdiscoloration;B.flowerwithvirescence;C.flowerwithphyllody. 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析35图2-2长春花感染WBD植原体后的症状A.嫁接WBD植原体70天后长春花系统显症；B.腋芽萌发；C.节间缩短；D.感病植株叶片发黄Fig.2-2SymptomsofperiwinkleinfectedwithWBDphytoplasma.A.Systematicsymptomsofinfectedperiwinkle(left)andhealthycontrol(right);B.sproutingofaxillarybuds;C.shortenedinternodes(left)andhealthycontrol(right);D.leafyellowing.2.3.2长春花花的总RNA提取将感染WBD植原体样品的总RNA和健康对照的总RNA去除基因组DNA后，进行琼脂糖凝胶电泳（图2-3）。结果显示RNA的条带清晰，28SrRNA与18SrRNA的条带宽度基本呈2:1关系，说明总RNA中没有DNA的污染和蛋白质的混杂，RNA几乎没有降解。图2-3长春花总RNA琼脂糖凝胶电泳1-2：感病长春花总RNA；3-4：健康长春花总RNA 36长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析Fig.2-3AgarosegelelectrophoresisofperiwinkletotalRNA.1-2:TotalRNAofinfectedperiwinkle;3-4:TotalRNAofhealthyperiwinkle.利用核酸检测仪ND-2000测得的样品中总RNA的OD值，不仅能得到RNA的浓度，同时也可以反映出RNA的完整性及是否有其他杂质的污染。A260/280表示样品中是否有蛋白质的污染及程度，A260/280值在1.9-2.1表示RNA的质量较高，值太小说明可能有蛋白质或其他有机溶剂的污染，值大于这个区间有RNA降解的可能性。A260/230的值能够反映样品中小分子盐类的量，通常质量高的RNA的A260/230值要大于2.0。表2-3列出的是实验样品的总RNA的OD值（数据未全部列出），说明提取的总RNA纯度较好，完整性高。表2-3样品中总RNA的浓度及纯度检测Table2-3DetectionofTotalRNAfromperiwinklesinfectedwithWBDphytoplasmaandhealthycontrol样品（Sample）浓度（ng/μL）A260/280A260/230感病1734.22.062.35感病2808.62.032.25对照1436.72.012.23对照2677.32.042.282.3.3cDNA-AFLP表达谱分析2.3.3.1选择性扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测双链cDNA经过MseI/EcoRI双酶切、接头连接后，用本实验的预扩增引物E00和M00进行PCR扩增。将得到的预扩增产物稀释50倍后做为模板，通过选择性扩增引物组合进行选择性PCR扩增。取少量选择性扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以检验选择性扩增产物的质量及验证PCR反应体系和程序的有效性。图2-4为部分选择性扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。图片显示，泳道的条带明亮，说明扩增产物的量较大；条带大小集中在50bp-600bp，这样的大小的条带能够用聚丙烯酰胺凝胶分离，表明本研究中的酶切组合及选择性扩增引物对的选择符合分子标记中多态性的要求。综合以上分析，前期的双酶切、预扩增及选择性扩增的PCR体系和程序切实有效，可以进行下一步cDNA-AFLP实验。图2-4选择性扩增产物的琼脂糖凝胶电泳1-14：选择性扩增产物；M：MarkerI(100-600bp) 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析37Fig.2-4Agarosegelelectrophoresisofselectiveamplifiedproducts.1-14:Selectiveamplifiedproducts;M:MarkerI(100-600bp)2.3.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为了尽可能多的分离到差异表达片段，以代表整个长春花基因组mRNA的表达水平，本实验共采用了256（16×16）对选择性扩增引物组合对感病长春花的模板进行扩增。根据引物组合的不同，每对引物大约能够产生40-70条长度在50bp-1500bp的可见条带。为了能够精准地分离到差异表达条带，减少假阳性的产生，本实验中将选择性扩增引物后面加了2个选择性碱基，同时样品设置了4个重复，只有条带在4个重复中同时出现并且与健康对照中的条带谱表现出差异，才认为这种条带为差异表达条带。经统计，256对引物组合共产生约54120条TDFs，其中表达量出现差异的TDFs约为2880条，平均差异率为5.3%。图2-5展示了选择性扩增引物组合M-GG/E-CG的扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图中泳道1-4为健康对照的4个重复，5-8为感染WBD植原体的长春花样品的4个重复，箭头指示的为差异表达条带。图2-5选择性扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果1-4：健康对照；5-8：感病样品；箭头指示的为差异表达条带Fig.2-5ExpressionofWBDphytoplasma-infectedperiwinkletranscriptsbycDNA-AFLPanalysis.AnexampleoftheresultobtainedfromtheselectiveprimersM-GG/E-CG.Lanes1to4:healthycontrol;5to8:periwinkleinfectedwithWBDphytoplasma.Thebandsatthe 38长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析arrowheadaredifferentlyexpressedtranscriptderivedfragments.2.3.3.3差异表达片段的回收、克隆及测序本实验中选取了400条表达差异明显的TDFs进行回收。经过聚丙烯酰胺凝胶中二次筛选后，得到376条TDFs。以处理过的胶条溶液为模板，再次PCR后，PCR产物在2%琼脂糖凝胶中分离并回收，最终得到364条TDFs，回收率为96.8%。图2-6展示了部分差异表达条带在琼脂糖凝胶中的电泳结果。图2-6差异表达条带的二次PCR产物琼脂糖凝胶电泳1-12：差异表达条带的PCR产物；M：DM2000Fig.2-6Agarosegelelectrophoresisofre-amplifiedTDFs1-12:Re-amplifiedproductsofdifferentiallyexpressedTDFs;M:DM2000经琼脂糖凝胶回收的差异表达片段通过T-A连接到pMD19-TSimple载体上，转化到大肠杆菌DH5a菌株，经过单克隆的筛选与PCR检测获得阳性克隆，菌液直接用于测序，每个差异表达片段平行选择三个阳性克隆送去测序。2.3.3.4差异表达片段的功能分析将测序得到的序列通过CAP3软件进行拼接，去除小于100bp的TDFs，得到258条非冗余TDFs（见附表1），其中201条TDFs为上调表达，57条为下调表达。将所有的TDFs用Blast2GO软件进行Blastx相似性比对后，总结出与本实验得到的长春花的序列有相似性的其他物种的分布（图2-7）。通过该图可以看出本实验分离到的TDFs中与葡萄（Vitisvinifera）、大豆（Glycinemax）序列有同源性的TDFs最多，说明长春花与葡萄、大豆的同源关系相对较近。 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析39图2-7在Blast结果中与长春花的TDFs有相似性的物种分布Fig.2-7SpeciesdistributionofTDFsBlastresultswithBlastHits通过Blast2GO软件将比对后的序列进行功能注释及蛋白质结构域或结构原件的预测，能够得到TDFs在生物途径（biologicalprocess）（图2-8）,分子功能（molecularfunction）（图2-9）以及细胞成分（Cellularcomponent）（图2-10）3个方面的功能分布信息。根据软件中得到的序列注释信息，按照Bevan的方法将序列统一进行功能分类，如图2-11。在所有的TDFs中，没有功能的有133条TDFs，占总数的51.5%，这种情况可能是因为目前长春花的基因组还是未知。这些TDFs包括在与GenBank的nr数据库的相似性分析中没有匹配序列（nohitfound，36.8%）或者序列相似性很低（unclassified，14.7%）的TDFs；与代谢和能量相关的基因有43条，占据了16.7%，为第二大类；16条TDFs（6.2%）与信号转导相关，占据第三大类，其中蛋白激酶占大部分；参与致病和防御相关的基因有14条，占总数的5.4%，PR蛋白和热激蛋白都有出现；参与转录的TDFs占总数的6.2%；剩余的TDFs被归类到细胞结构、细胞生长与分裂、蛋白质代谢等方面。本实验中得到的TDFs序列已全部提交至NCBIEST数据库，登录号为JZ078211-JZ078468。图2-8Blast2GO结果中差异表达基因在生物途径方面的基因分布Fig.2-8ThedistributionofDE-TDFsinbiologyprocessfromBlast2GOresults 40长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析图2-9Blast2GO结果中差异表达基因在分子功能方面的基因分布Fig.2-9ThedistributionofDE-TDFsinmolecularfunctionfromBlast2GOresults图2-10Blast2GO结果中差异表达基因在细胞成分方面的基因分布Fig.2-10ThedistributionofDE-TDFsincellularcomponentfromBlast2GOresults 第二章长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中的差异基因表达谱分析41图2-11长春花与WBD植原体互作过程中差异表达基因的功能分类Fig.2-11ClassificationofDE-TDFsduringtheinteractionbetweenperiwinkleandWBDphytoplasma综合上述分析，由于目前没有长春花基因组的测序信息，并且与已知基因组的植物如拟南芥、水稻、玉米的亲缘关系较远，出现了很多未知功能基因及序列相似性很低的基因。长春花在感染WBD植原体后，很多与代谢和能量有关的基因在转录水平上发生了变化，并且大部分都为上调表达。2.3.4部分差异表达基因的qRT-PCR分析为了检测cDNA-AFLP技术的准确性，验证差异表达基因的表达模式，本实验根据基因功能分类选择了8个TDFs用于荧光定量分析。候选TDFs的表达情况如图2-12所示，与能量、代谢和病害防御相关的TDFs在感病长春花花中的表达量显著高于健康对照，另外两个与致病/抗病相关的TDFs的表达量也高于对照中的表达量，说明这些基因在寄主植物长春花受到植原体的侵染后被诱导表达，参与了寄主植物与植原体之间的互作。基因H_29-1-25-2为假定蛋白基因，在健康对照中的表达量非常丰富，而在感病长春花中的表达量下降，说明该基因可能在长春花与植原体的互作中有重要作用，同时也可以推断本实验中分离到的其他未知功能蛋白很可能在二者的互作中也发挥了比较重要的作用。在qRT-PCR分析中，H_349的表达受到WBD植原体侵染的诱导，与健康对照相比呈现极显著差异，而在cDNA-AFLP分析中，该基因呈现下调表达。出现这种情况的原因可能是由于每一个泳道中片段之间的距离太近而回收了错误片段所致。上述结 42长春花与小麦蓝矮植原体互作过程中抗病相关基因的分离与分析果证明cDNA-AFLP技术能够有效而准确地分离到差异表达基因。图2-128个差异表达基因的qRT-PCR分析Fig.2-12Relativeexpressionof8selectedgenesusing2-ΔΔCTmethodinqRT-PCRanalysis.Statisticallysignificantdifferencesoftranscriptlevelsbetweeninfectedplantsandmock-graftedplantsweredeterminedbySNKtest(*0.01