尿KIM-1和NGAL与慢性肾脏病肾小管间质损伤的相关性分析

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分类号：R692单位代码：10159密级：公开学号：201520387硕士学位论文（临床医学硕士专业学位）中文题目：尿KIM-1和NGAL与慢性肾脏病肾小管间质损伤的相关性分析英文题目：CorrelationanalysisofurinaryKIM-1andNGALwithpatientsofchronickidneydiseasewithtubulointerstitiallesion.论文作者：李晨晨指导教师：张蓓茹教授学科专业：肾脏内科学完成时间：2018年3月 中国医科大学硕士学位论文尿KIM-1和NGAL与慢性肾脏病肾小管间质损伤的相关性分析CorrelationanalysisofurinaryKIM-1andNGALwithpatientsofchronickidneydiseasewithtubulointerstitiallesion.论文作者李晨晨指导教师张蓓茹教授申请学位医学硕士培养单位第二临床学院一级学科内科学二级学科肾脏内科学研究方向肾小管间质损伤论文起止时间2017年1月—2018年2月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月 中国医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：本论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果，论文中除加以标注的内容外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得其他学位而使用过的成果。对本研究提供贡献的其他个人和集体均已在文中进行了明确的说明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：日期：年月日中国医科大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密（），在年后解密适用本授权书。（保密：请在括号内划“√”）论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日 中国医科大学博（硕）士学位论文摘要目的：测定慢性肾脏病肾小管间质损伤患者尿液中的KIM-1及NGAL的浓度，分析其二者与慢性小管间质损伤的差异性，明确KIM-1与NGAL在慢性肾脏病肾小管间质损伤患者中的临床意义。方法：收集2017年2月至2017年9月于中国医科大学附属盛京医院行肾脏病理活检患者尿标本，共162例，按照入组条件剔除59例，选择103例经肾组织病理活检存在肾小管间质损伤，且经临床诊断为慢性肾脏病的患者作为实验组，其中男性56例，女性47例，平均年龄45.15±13.58岁。依据Banff病理评分标准对肾小管间质进行半定量分级,将实验组分为轻度损伤组、轻-中度损伤组、重度损伤组3个实验组。依据选取我院同时期体检中心体检的相匹配健康体检者17例，其中男性8例，女性9例，平均年龄39.18±12.76岁，作为健康对照组。应用酶联免疫吸附法（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）测定尿KIM-1以及NGAL的浓度。实验组研究对象采集的临床指标包括：年龄、性别、血红蛋白、血肌酐、血尿素、血尿酸、血胱抑素C、血浆白蛋白、血糖、甘油三脂、胆固醇、24小时尿蛋白定量。所有数据采用SPSS22.0统计软件进行数据处理和分析。结果：1、实验组和健康对照组之间年龄、性别构成比差异不具有统计学意义。实验组之间除白蛋白、甘油三酯与血糖三组之间的差异无统计学意义，在其他临床指标的差异有统计学意义。2、肾间质损伤越严重，尿KIM-1及尿NGAL浓度越高。尿KIM-1在对照组与轻度组两组间比较（p=0.32）、轻度组与轻-中度组间比较（p=0.21）、轻-中度组与重度组比较（p=0.89）差异无统计学意义；余两两组间比较均有统计学差异（p＜0.01）。尿NGAL在轻度组与轻-中度损伤组比较（p=0.08）差异无统计学意义，其他两两组间比较差异具有统计学意义（p＜0.01）。3、在慢性肾脏病肾小管间质损伤患者中，尿KIM-1与尿蛋白定量呈正相关（r=0.22，p＜0.05），与肌酐(r=0.26，p＜0.01)、胱抑素C(r=0.26，p＜0.01)、肾小管间质损伤程度（r=0.60,p＜0.01）呈正相关关系，与eGFR（r=﹣0.33，p＜0.01）、血红蛋白呈负相关（r=-0.25,p＜0.01）；尿NGAL与肌酐（r=0.63，p＜0.01）、尿素氮（r=0.62，p＜0.01）、胱抑素C（r=0.37，p＜0.01）、肾小管I 中国医科大学博（硕）士学位论文间质损伤程度（r=0.76，p＜0.01）呈正相关关系，与eGFR（r=﹣0.64，p＜0.01）、血红蛋白（r=﹣0.43，p＜0.01）呈负相关关系。4、尿KIM-1的ROC曲线下面积为0.88，最佳临界点为2.13ng/ml,灵敏度为80%，特异度为88%,95%置信区间为（0.78,0.97)。尿NGAL曲线下面积为0.97，最佳临界点为4.62ng/ml，灵敏度为96%，特异度为88%,95%置信区间（0.93,1）。联合诊断曲线下面积为0.98，灵敏度为94%，特异度均为94%，95%置信区间（0.96，1）。5、轻度损伤组尿KIM-1的曲线下面积为0.68，最佳临界点为2.13ng/ml,灵敏度68%，特异度为88%,95%可信区间为（0.68,0.94)。尿NGAL曲线下面积为0.94，最佳临界点为4.62ng/ml，灵敏度为95%，特异度为88%,95%可信区间（0.88,1）。二者联合诊断曲线下面积为0.96，灵敏度为98%，特异度为82%，95%可信区间（0.92，1)。结论：在慢性肾脏病小管间质损伤患者中，尿KIM-1与尿NGAL随着小管间质损伤严重程度升高而浓度升高，且与损伤程度呈具有正相关关系，可成为评估CKD患者肾小管间质损伤程度有价值的生物学指标。对慢性肾脏病小管间质损伤的诊断，尿NGAL的诊断明显优于尿KIM-1，而联合诊断对于发现早期肾小管间质损伤更具有意义。关键词：慢性肾脏病肾小管间质损伤肾损伤分子-1，人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。II 中国医科大学博（硕）士学位论文AbstractObjective:UrinaryKIM-1andurinaryNGALweredetectedinpatientswithchronickidneydisease(CKD)tubulointerstitialinjuryandhealthycontrolgroup.ToinvestigatethedifferenceandcorrelationbetweenKIM-1andNGALinpatientswithtubulointerstitialinjury.ToclarifytheclinicalsignificanceandvalueofKIM-1andNGALinpatientswithtubulointerstitialinjuryofchronickidneydisease.Methods:Atotalof103patientswithchronickidneydiseasediagnosedbyrenalbiopsyattheDepartmentofNephrology,ShengjingHospital,duringFebruary2017toSeptember2017,wasenrolledinthestudy.Therewere56malesand47femaleswithanaverageageof45.15±13.58yearsinthetestgroup.Theexperimentalgroupwasdividedintomildinjury,mildtomoderateinjury,severeinjurygroupaccordingtothecriteriaofBanffpathologicalclassificationcriteria.Atthesameperiodwechoose17normalphysicalpersonashealthycontrolsgroup,including8malesand9females,aged25to58years,averageageis39.18±12.76yearsold.UsedEnzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)todetecttheexpressionofurinaryKIM-1andNGALrespectively.Clinicalindicatorscollectedintheexperimentalgroupincluded:age,gender,serumcreatinine,bloodurea,serumuricacid,serumcystatinC,plasmaalbumin,bloodglucose,triglycerides,cholesterol,hemoglobin,and24-hoururinaryprotein.AlldatausingSPSS22.0softwareforstatisticalanalysis.Results:1.Therewasnosignificantdifferenceinageandsexbetweentheexperimentalgroupsandthecontrolgroup;Therewasnodifferencebetweenthethreeexperimentalgroupsinalbumin,triglycerideandbloodglucose.Thedifferencesinotherclinicalindicatorswerestatisticallysignificant.2.Themoreseriousrenalinterstitialinjury,thehighlevelsofUrinaryKIM-1andurinaryNGAL.UrinaryKIM-1wascomparedwiththecontrolgroupandthemildgroup(p=0.32),themildgroupandthemild-moderategroup(p=0.21),themild-moderategroupandseveregroup(p=0.89)，thesedifferencewasnotstatisticallysignificant.Theremainingtwogroupswerestatisticallysignificantdifferences(p<0.01).TherewasnosignificantdifferenceinurinaryNGALbetweenmildgroupandmild-moderategroup(PIII 中国医科大学博（硕）士学位论文=0.08).Theremainingtwogroupswerestatisticallysignificantdifferences(p<0.01).3.UrinarylevelsofKIM-1inpatientswithtubulointerstitiallesionsofchronickidneydiseasewaspositivelycorrelatedwithurinaryprotein(r=0.22,p<0.05),andserumcreatinine(r=0.26,p<0.01)，andCystatinC(r=0.26,p<0.01)andthedegreeoftubulointerstitiallesions(r=0.6,p<0.01),andnegativelycorrelatedwitheGFR(r=-0.33,p<0.01)andhemoglobin(r=-0.25,p<0.01);UrinarylevelsofNGALinpatientswithtubulointerstitiallesionsofchronickidneydiseasewaspositivelycorrelatedwithbloodureanitrogen（r=0.62，p<0.01）,andserumcreatinine(r=0.63,p<0.01),andCystatinC(r=0.37,p<0.01)andthedegreeoftubulointerstitiallesions(r=0.76p<0.01),andnegativelycorrelatedwitheGFR(r=-0.64,p<0.01)andhemoglobin(r=-0.43,p<0.01);4.DrawROCcurveanalysisshowedthaturinaryKIM-1andNGALassesstherenaltubularinterstitiallesion.TheKIM-1ofareaundertheROCcurvetodiagnosistherenaltubularinterstitialinjuryofprimarychronickidneydisease(CKD)was0.88，theoptimalthresholdvaluewas2.13ng/ml,thesensitivitywas80%,andthespecificitywas88%．TheNGALofareaundertheROCcurvewas0.97,theoptimalthresholdvaluewas4.62ng/ml,thesensitivitywas96%,andthespecificitywas88%.ThetwocombineddiagnosisofareaundertheROCcurvewas0.98,thesensitivitywas94%,andthespecificitywas94%．5.DrawROCcurveanalysisshowedthaturinaryKIM-1andNGALassesstherenaltubularinterstitiallesioninthemildgroup.TheKIM-1ofareaundertheROCcurvetodiagnosistherenaltubularinterstitialinjuryofprimarychronickidneydisease(CKD)was0.8,theoptimalthresholdvaluewas2.13ng/ml,thesensitivitywas68%,andthespecificitywas88%.TheNGALofareaundertheROCcurvewas0.94,theoptimalthresholdvaluewas4.62ng/ml,thesensitivitywas95%,andthespecificitywas88%．ThetwocombineddiagnosisofareaundertheROCcurvewas0.96,thesensitivitywas98%,andthespecificitywas82%．Conclusions:UrinaryKIM-1andNGALincreasedwiththeseverityoftubulointerstitialinjuryinpatientswhowerediagnosedchronickidneydisease,whichwerepositivelycorrelatedwiththedegreeofinterstitialinjuryandcouldbeusedasvaluablemarkersofCKDoftubulointerstitialinjury.UrinaryNGALwassignificantlybetterthanurinaryIV 中国医科大学博（硕）士学位论文KIM-1todiagnosisofchronictubulointerstitialinjury.Combineddiagnosisismoremeaningfulfordetectingearlytubulointerstitialinjury.Keywords:ChronickidneydiseaseTubulointertitialinjuryKidneyInjuryMolecule-1NeutrophilGelatinaseAssociatedLipocalinV 中国医科大学博（硕）士学位论文英文缩略语英文缩写英文全称中文全称KIM-1KidneyInjuryMolecule-1肾损伤分子-1NGALneutrophilgelatinase-associatedlipocalin中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白CKDchronickidneydisease慢性肾脏病ELISAEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附实验AKIAcuteKidneyInjury急性肾损伤eGFRglomerularfiltrationrate肾小球滤过率ESRDendstagerenaldisease终末期肾脏病ECMextracellularmatrix细胞外基质TGF-βtransforminggrowthfactor-β转化生长因子-βScrSerumcreatinine血肌酐BUNBloodureanitrogen血尿素氮VI 中国医科大学博（硕）士学位论文目录摘要……………………………………………………………………………………IAbstract………………………………………………………………………………III英文缩略词……………………………………………………………………………VI目录…………………………………………………………………………………VII尿KIM-1和NGAL与慢性肾脏病肾小管间质损伤的相关性分析1前言…………………………………………………………………………………12材料与方法…………………………………………………………………………22.1研究对象………………………………………………………………………22.2研究方法………………………………………………………………………22.3仪器与试剂……………………………………………………………………32.4实验方法………………………………………………………………………42.5统计学分析……………………………………………………………………63结果…………………………………………………………………………………84讨论…………………………………………………………………………………135结论…………………………………………………………………………………16本研究创新性的自我评价……………………………………………………………17参考文献………………………………………………………………………………18综述……………………………………………………………………………………20致谢……………………………………………………………………………………27个人简历………………………………………………………………………………28VII 中国医科大学博（硕）士学位论文尿KIM-1和NGAL与慢性肾脏病肾小管间质损伤的相关性分析1前言近年来，肾小管间质病变在慢性肾脏疾病（chronickidneydisease,CKD）进展中的所发挥的作用得到更多的重视，相关研究也随之增多。慢性肾小管间质损伤主[1]要包括炎细胞浸润，小管变性与肾间质纤维化，其中肾间质纤维化已被认为是所有慢性肾脏病发展至肾衰竭期的必要途径。肾间质纤维化病因复杂，目前认为主要由细胞因子、肾小管上皮细胞、肌成纤维细胞等共同作用，参与形成细胞外基质与[2][3]间质瘢痕。更有研究表明，对慢性肾脏病发展的影响程度，肾间质损伤超过了肾小球的作用。因此，如何能早期诊断肾小管间质损伤，以便干预其向纤维化进展，成为人们关注的重点。临床上，常需要对患者进行肾脏病理活检明确肾小管间质损伤，但其作为一种有创检查，受肾穿后并发症、经济、可行性等多方面条件限制，所以寻找出可评估慢性肾脏病肾小管间质损伤的无创检测手段尤为重要。肾损伤分子-1（KidneyInjuryMolecule-1)是一种属于免疫球超蛋白家族的糖蛋白，在健康人肾组织或尿液中浓度较低，检测到肾小管上皮细胞可在肾脏受到损伤时KIM-1的浓度升高，有大量实验证明其对肾小管间质损伤的诊断与预后评估[4]具有重要意义。中性粒细胞明胶酶相关性载脂蛋白（neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL）是一种可结合并运输疏水性小分子脂质运载蛋白，在人类多种组织中呈低表达，当肾脏组织受到缺血、炎症、毒性等损伤后，NAGL高表达于近端小[5]管上皮细胞。研究显示，尿NGAL可反应肾小管间质损害的严重程度，其有望成为反应肾小管损伤的可靠指标。然而，目前，关于KIM-1及NGAL在肾脏病方面研究主要围绕在各种病因引起的急性肾损伤或糖尿病肾病、IgA肾病等单个病种展开，针对慢性肾脏病的报道与研究相对偏少。本实验采用ELISA方法检测原发与继发慢性肾脏病患者的尿液中KIM-1及NGAL浓度，对其二者与肾小管间质病理改变进行差异性分析及相关性分析，探讨二者在诊断肾小管间质损伤中的临床意义，旨在明确尿KIM-1及NGAL检测临床意义。1 中国医科大学博（硕）士学位论文2材料与方法2.1研究对象(1)收集2017年2月至2017年9月于中国医科大学附属盛京医院行肾脏病理活检患者尿标本，共162例，按照入组条件剔除59例，选择103例经肾组织病理活检存在肾小管间质损伤，且经临床诊断为慢性肾脏病的患者作为实验组，其中男性56例，女性47例，平均年龄45.15±13.58岁。纳入研究对象肾脏病理类型分别为膜性肾病患者41例，IgA肾病患者29例，微小病变肾小球肾炎患者6例，局灶节段硬化患者4例，系膜增生性肾小球肾炎患者6例，狼疮性肾炎患者5例，糖尿病肾病患者5例，紫癜肾炎患者2例，ANCA相关性血管炎患者3例，乙型病毒肝炎相关性肾小球肾炎患者1例，高血压肾损害患者1例，所有研究对象均签署知情告知书。实验组入选标准：经临床及病理诊断为慢性肾脏病（包括原发性慢性肾脏病与继发性慢性肾脏病）。排除标准：除外行肾脏组织病理活检前应用过糖皮质激素、免疫抑制剂等药物。除外各种急、慢性感染，急性肾损伤、恶性肿瘤、心功能不全的患者。除外治疗后二次肾穿的患者。(2)健康对照组：选取我院体检中心体检的相匹配健康体检者尿检正常者17例，其中男性8例，女性9例，平均年龄39.18±12.76岁作为健康对照组。均无自身免疫疾病病史，近3个月无感染史，除外心脑血管疾病、恶性肿瘤和其他全身系统疾病。2.2研究方法：2.2.1临床观察指标：包括性别、年龄、血红蛋白、血肌酐、血尿素、血尿酸、血胱抑素C、血浆白蛋白、血糖、甘油三脂、胆固醇、24小时尿蛋白定量，临床观察化验指标由我院检验科医[6]师完成测定。根据CKD-EPI公式估算肾小球滤过率（eGFR）。2.2.2肾小管间质损伤病理分级及评分：2 中国医科大学博（硕）士学位论文CKD患者行常规肾脏组织病理活检，所有患者肾活检前签定知情告知书，于我院肾内科在B超引导下，使用自动枪负压吸收法行肾活检穿刺术。肾穿刺活检标本送至金域医学检验中心检测。肾小管间质病变包括：急性病变:可表现为上皮细胞萎缩变性，灶性坏死及再生、刷状缘脱落、间质水肿、裸摸、小管炎等，慢性病变包括：[7]肾间质多灶或大片状纤维化、炎细胞浸润、小管萎缩变性等。采用Banff病理评分标准对肾小管间质进行半定量分级，分级评分标准如下表，由于本实验组评分为3分12例，4分14例，故将中度损伤组与中-重度损伤组合并为1组为重度损伤组。2.3仪器和试剂2.3.1仪器：1、一80℃冰箱美国Thermo公司2、台式低速自动平衡离心机日本Kubota公司3、标准规格酶标仪瑞士Tecan酶标仪4、微量移液器及一次性移液枪头GenexBeta5、37℃恒温箱上海精宏实验设公司有限备6、4℃冰箱中国海尔2.3.2试剂：(1)人肾损伤分子一1（KIM-1）ELISA试剂盒：购自博士德生物技术公司，检测范围：31.2pg/ml→2000pg/ml。预包被抗人KIM-1抗体的96孔板96T重组人KIM-1冻干标准品10ng/管*23 中国医科大学博（硕）士学位论文生物素标记抗人KIM-1(100X)130μl亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）（100X）130μl样品稀释液30ml抗体稀释液12mlABC稀释液12mlTMB显色液10mlTMB终止液10ml洗涤缓冲液(25X)20ml封板膜4张(2)人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)ELISA试剂盒，购自博士德生物技术公司，检测范围：156pg/ml→10,000pg/ml。预包被抗人NGAL抗体的96孔板96T重组人NGAL冻干标准品10ng/管*2管生物素标记抗人NGAL(100X)130μl亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）（100X）130μl样品稀释液30ml抗体稀释液12mlABC稀释液12mlTMB显色液10mlTMB终止液10ml洗涤缓冲液(25X)20ml封板膜4张(3)标本的采集与保存：实验组尿液标本在行肾穿刺活检前一日早晨留取中段尿10ml，健康对照组于体检当日清晨留取中段尿10ml；所有尿标本均无菌管收集，收集当日在室温下以1000G／min离心20分钟，弃去沉淀，取上清于无菌管，一80℃冰箱保存，进行统一检测，避免反复冻融。2.4实验方法：ELISA法检测尿液KIM-1以及NGAL严格按照说明书执行2.4.1尿KIM-1的ELISA法检测：4 中国医科大学博（硕）士学位论文原理：KIM-1，肾脏损伤分子，本试剂盒所采用的标准品为重组人的KIM-1，分子量为29.6KD。人KIM-1ELISAKit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（EnzymeLinked-ImmunosorbentAssay,ELISA）。用纯化的KIM-1包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入KIM-1，再与过氧化物酶标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后用底物显色。催化作用下显色为蓝色，并酸的作用下最终显色为黄色。颜色的深浅程度和样品中的KIM-1浓度呈正相关。准备工作：A.KIM-1A.KIM-1标准品的稀释：配制标准品：1000pg/ml,500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml。B．生物素标记抗体工作液C．C.亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液D.样本稀释10倍。ABC工作液和TMB显色液都先在37℃中至少平衡30分钟。实判步骤1.标准品的加样：将配置好不同浓度的标准品各100ul依次加入一排7孔中，1孔作为空白对照。稀释后样品依次加样，37℃反应90分钟。2.弃去酶标板内液体，拍干。不洗。3.加入生物素抗人KIM-1抗体工作液100ul，37℃反应60分钟。4．洗涤3次，每次浸泡约1分钟。5．每空加入ABC工作液100ul，37℃反应30分钟。6.洗板5次，每次泡1-2分钟。7.每空加入90μιTMB显色液，37℃避光反应20分钟。8．每孔加入TMB终止液100ul，此时显色为黄色。结果判断：（1）使用酶标仪在450nm处读数。（2）根据OD值找出对应的浓度。实际浓度=原始浓度*稀释倍数2.4.2尿NGAL的ELISA法检测：原理：Lipocalin-2/NGAL,在细胞增殖、肿瘤发生和细胞凋亡过程中都有作用。本试剂盒所用的标准品是重组人的NGAL，从Q21-N198，有178个氨基酸，分子量5 中国医科大学博（硕）士学位论文22KDa。采用夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）。用纯化的NGAL包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入NGAL，再与过氧化物酶标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后用底物显色。催化作用下显色为蓝色，并酸的作用下最终显色为黄色。颜色的深浅程度和样品中的NGAL浓度呈正相关。准备工作：A.NGAL配制标准品：10000pg/ml，5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312pg/ml，156pg/ml。B．生物素标记抗体工作液C.亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液D.实验组样本稀释20倍，对照组样本稀释2倍。ABC工作液和TMB显色液都先在37℃中至少平衡30分钟。实判步骤：1.标准品的加样：将配置好不同浓度的标准品各100ul依次加入一排7孔中，1孔作为空白对照。稀释后样品依次加样，37℃反应90分钟。2.弃去酶标板内液体，拍干。不洗。3.加入生物素抗体工作液100ul，37℃反应60分钟。4．洗涤3次，每次浸泡约1分钟。5．每空加入ABC工作液100ul，37℃反应30分钟。6.洗板5次，每次泡1-2分钟。7.每空加入90μιTMB显色液，37℃避光反应20分钟。8．每孔加入TMB终止液100ul，此时显色为黄色。结果判断：（1）使用酶标仪在450nm处读数。（2）根据OD值找出对应的浓度。实际浓度=原始浓度*稀释倍数2.5统计分析采用SPSS22.0软件进行数据处理和统计分析。（1）一般描述：计量资料用均数±标准差表示；计数资料用个数表示。（2）假设检验：正态分类变量计数资料组之6 中国医科大学博（硕）士学位论文间的差异性比较采用χ2检验；正态连续变量采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t方法；非正态连续资料采用多个独立样本的非参数H检验。肾小管损伤程度与KIM-1、NGAL的相关分析采用非参数相关分析；与其他指标选择Pearson相关性分析。对KIM-1、NGAL及其联合预测进行评测采用ROC分析，计算灵敏度、特异度、曲线下面积（AUC）值及其95%置信区间（95%CI）。所有检验均为双侧检验，检验水平α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。7 中国医科大学博（硕）士学位论文3结果3.1CKD实验组与正常对照组一般临床资料的比较（1）对健康对照、轻度、轻-中度与重度四组进行差异性分析，发现在年龄与性别无统计学意义，如表1。表1临床资料组间比较（ｘ±ｓ或ｎ／ｎ）组别n年龄（岁）性别（男/女）健康对照1739.18±12.768/9轻度4145.59±13.4919/22轻-中度3645.39±12.7220/16重度2644.12±15.2917/9实验组共纳入103例，健康对照组17例，各组差异无统计学意义（P均＞0.05，其中P1=0.11，P2=0.12，P3=0.25，P4=0.95，P5=0.67，P6=0.72；性别构成比（男/女）,各组差异无统计学意义（P均＞0.05),其中P1=0.96，P2=0.56，P3=0.24，P4=0.42，P5=0.13，P6=0.45。注：P1表示健康对照与轻度进行比较；P2表示健康对照与中度进行比较；P3表示健康对照与重度进行比较；P4表示轻度与与中度进行比较；P5表示轻度与重度进行比较；P6表示中度与重度进行比较。（2）对表中轻、轻-中、重三组的年各临床指标进行差异性比较及两两比较（LSD）分析，发现除在白蛋白、甘油三酯与血糖三组之间的差异无统计学意义，在血肌酐、尿蛋白定量、肾小球滤过率、血红蛋白等指标间的差异具有统计学意义，详见表2。表2轻中重组间的临床指标比较组别轻度轻中度组重度PP1P2P324小时尿蛋白定量5.87±4.443.86±3.675.51±4.140.040.040.720.12（g/24h）eGFRml/(min.106.0±24.9481.37±23.5243.98±35.01<0.01<0.01<0.01<0.011.73m28 中国医科大学博（硕）士学位论文肌酐75.00±63.2794.39±30.73239.±179.61<0.010.40<0.01<0.01umol/L尿素氮4.92±1.816.63±3.0610.79±5.79<0.010.04<0.01<0.01mmol/L尿酸365.24±131392.4±115.51454.9±159.740.030.38<0.010.07mg/L胱抑素1.11±0.631.76±2.072.65±1.34<0.010.05<0.010.02umol/L血红蛋135.7±15.44132.28±21.66115.69±25.120.010.55<0.01<0.01白g/L白蛋白27.91±8.8731.84±9.4631.84±7.570.90.530.771.00g/L胆固醇6.66±2.245.60±2.055.75±1.960.040.030.090.79mmol/L甘油三酯2.30±1.722.24±1.402.37±1.340.950.860.860.75mmol/L血糖5.00±0.924.85±0.704.87±0.880.730.440.530.93mmol/L注：P为单因素方差分析三组间比较；P1表示轻度与轻-中度进行比较；P2表示轻度与重度进行比较；P3表示轻-中度与重度进行比较；其中，轻度损伤、轻-中度损伤、重度损伤三组间分别两两比较肾小球滤过率差异均具有统计学意义（P＜0.01）。轻度损伤组与轻-中度损伤组比较，24小时尿蛋白定量、尿素氮、胱抑素C、胆固醇均有统计学差异；轻度组与重度组比较，肌酐、尿素氮、尿酸、胱抑素C、血红蛋白均有统计学差异（p＜0.01）；轻-中度组与重度组比较，肌酐、尿素氮、胱抑素C、血红蛋白均有统计学差异；3.2尿KIM-1和尿NGAL与肾小管间质损伤(1)尿KIM-1和尿NGAL水平组间比较,对健康对照组、轻度组、轻-中度组、重度9 中国医科大学博（硕）士学位论文分别进行组间比较，见表3；表3尿KIM-1和尿NGAL水平组间比较（ｘ±ｓ，ｎｇ／ｍＬ）组别nKIM-1（ng/ml）NGAL（ng/ml）健康对照171.44±1.281.25±0.92轻度412.85±1.5019.88±14.35轻-中度364.53±2.4137.96±29.96重度269.44±9.38104.96±64.06其中，尿KIM-1的总体及组间比较：P＜0.01，P1=0.32，P2＜0.01，P3＜0.01，P4=0.21，P5=＜0.01，P6=0.89；即尿KIM-1在对照组与轻度组两组间比较、轻度组与轻-中度组间比较、轻-中度组与重度组比较差异无统计学意义；余两两组间比较均具有统计学意义。尿NGAL的总体及组间比较:P＜0.01，P1=0.001，P2＜0.01，P3＜0.01，P4=0.08，P5=＜0.01，P6=0.004；即尿NGAL在轻度组与轻-中度两组间比较，无统计学差异；余两两组间比较均有统计学差异（p＜0.01）。注：P表示四组间整体比较；P1表示健康对照与轻度进行比较；P2表示健康对照与中度进行比较；P3表示健康对照与重度进行比较；P4表示轻度与与中度进行比较；P5表示轻度与重度进行比较；P6表示中度与重度进行比较。（2）尿KIM-1和尿NGAL与肾小管间质损伤病理的相关性分析对肾小管损伤程度与尿KIM-1、NGAL的相关性进行非参数(Spearman)相关分析，发现肾小管损伤程度与尿KIM-1、尿NGAL存在正相关关系（P＜0.01），有统计学意义。见表4表4RsP肾小管损伤程度与ＫＩＭ－１0.60<0.01(P=0.0012)肾小管损伤程度与ＮＧＡＬ0.76<0.01(P=0.0012)3.3KIM-1、NGAL与其他临床指标进行Pearson相关性分析。10 中国医科大学博（硕）士学位论文表5尿ＫＩＭ－１和尿ＮＧＡＬ与其他临床指标的相关性分析组别尿KIM-1尿NGALr值p值r值p值尿蛋白定量（g/24h）0.22*0.020.130.21eGFRml/(min.1.73m2）-0.33**0.01-0.64**＜0.01肌酐umol/L0.26**0.010.63**＜0.01尿素氮mmol/L0.180.090.62**＜0.01尿酸mg/L0.120.240.150.13胱抑素umol/L0.26**0.010.37**＜0.01血红蛋白g/L-0.25**0.01-0.43**＜0.01白蛋白g/L-0.130.190.080,43胆固醇mmol/L0.130.20-0.040.68甘油三酯mmol/L0.170.090.110.26血糖mmol/L-0.100.330.020.82**.在0.01级别（双尾），相关性显著。*.在0.05级别（双尾），相关性显著。尿KIM-1与尿蛋白定量呈正相关（r=0.22，p＜0.05），与肌酐、胱抑素C呈正相关关系，且相关性显著（p＜0.01），与eGFR(肾小球滤过率)、血红蛋白呈负相关（p＜0.01）；尿NGAL与肌酐、尿素氮、胱抑素C呈正相关关系，且相关性显著（p＜0.01），与eGFR、血红蛋白呈负相关关系（p＜0.01）。3.5尿KIM-1与尿NGAL对诊断慢性肾脏病肾小管间质损伤的ROC曲线分析。11 中国医科大学博（硕）士学位论文表6roc曲线结果Cut-off灵敏度特异度ROC95%置信区间KIM-12.130.800.880.880.780.97NGAL4.620.960.880.970.931.00联合预测0.940.940.980.961.00尿KIM-1的ROC曲线下面积为0.88，最佳临界点为2.13ng/ml,灵敏度为80%，特异度为88%,95%可信区间为（0.78,0.97)。尿NGAL曲线下面积0.97，最佳临界点为4.62ng/ml，灵敏度为96%，特异度为88%,95%可信区间（0.93,1）。二者联合诊断曲线下面积为0.98，灵敏度为94%，特异度均为94%，95%可信区间（0.96，1）。3.6尿KIM-1与尿NGAL对轻度损伤组ROC曲线分析。表7Roc曲线结果Cut-off灵敏度特异度ROC95%置信区间Kim-12.130.680.880.800.680.94NGAL4.620.950.880.940.881.00联合预测0.980.820.960.921.00轻度损伤组尿KIM-1曲线下面积为0.68，最佳临界点为2.13ng/ml,灵敏度68%，特异度为88%,95%可信区间为（0.68,0.94)。尿NGAL曲线下面积0.94，最佳临界点为4.62ng/ml，灵敏度为95%，特异度为88%,95%可信区间（0.88,1）。二者联合诊断曲线下面积为0.96，灵敏度为98%，特异度均为82%，95%可信区间（0.92，1）。12 中国医科大学博（硕）士学位论文4讨论慢性肾脏疾病(CKD)是指各种原因引起的肾脏损害或肾小球滤过率低于60mL/（min*1.73m^2）持续至少3个月。慢性肾脏病已逐渐成为影响人类健康的不可忽略的主要病因。近年来，多项研究表明，肾小管间质损伤是各种原因所致慢性肾脏病走向终末期的必经之路。肾小管间质损伤的最终结局是肾间质纤维化，在慢性肾脏病进展中的作用逐渐被认识，探究其分子机制成为近年来研究的热点。肾间质纤维化的形成由多细胞、多通路共同参与。当肾脏遭遇缺血，毒性等病因攻击时，细胞因子如转化生长因子-β（TGF-β）等被刺激活化后，诱导肾间质固有的成纤维细胞增殖为具有效应作用的肌成纤维细胞，同时促进肾小管上皮细胞转分化为效[8]应细胞，而肌成纤维细胞则充分发挥分泌和收缩功能，通过促进细胞外基质堆积、[9]炎细胞浸润、生成大量瘢痕中基质蛋白促进肾脏纤维化。肾损伤分子-1（KIM-1）是由Ichimura等人发现在肾脏和肝脏中表达的I型[10]跨膜蛋白，包含14kD膜结合片段和90kD可溶部分。分为两种剪接变体KIM-1a和KIM-1b。KIM-1a剪接变体由于缺少酪氨酸激酶磷酸化基序，主要在肝脏中表达。KIM-1b变体含有两个保守的酪氨酸残基和1个酪氨酸激酶磷酸化基序;它主要在肾[11]脏中表达。肾损伤后，近端小管上皮再生，这包括受损伤的活细胞去分化和增殖重建一个完整的功能上皮层。一项研究表明，当正常上皮细胞到去分化细胞的这种[10]转变发生时，KIM-1的表达急剧上调。vanTimmeren等发现KIM-1阳性肾小管细胞具有去分化表型并与参与趋化和修复的小管衍生蛋白α-平滑肌相关肌动蛋白[12]（α-SMA）相关，因此推断KIM-1可能在肾小管上皮细胞再生过程中发挥作用。KIM-1不仅已被充分证实是急性肾损伤的敏感生物指标，它在预测慢性肾脏病转归方面也有潜在的作用。本实验发现，健康对照的尿KIM-1平均浓度为1.44±1.28（ng/ml）,轻度损伤组为2.85±1.50（ng/ml），轻-中度损伤组为4.53±2.41（ng/ml）,重度损伤组为9.44±9.38（ng/ml）。实验组中轻-中度损伤组与重度组KIM-1水平均明显高于健康对照组，且实验组与肾小管间质损伤进行性非参数相关性分析，发现尿KIM-1与肾小管间质损伤相关性明显，随着肾小管间质损伤越来越严重，尿KIM-1[13][14]浓度也逐步升高。这一结论得到其他实验结果的证实。Humphreys等等研究认为KIM-1的表达可通过单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平升高和MCP-1依赖性[15]巨噬细胞趋化性增加，从而引起炎症以及间质纤维化的形成。Xu等通过对202例13 中国医科大学博（硕）士学位论文IgA肾病患者尿KIM-1的研究，得出结论IgA肾病患者中KIM-1的水平与血肌酐及尿蛋白呈正相关,与肾小球滤过率呈负相关，且肾小管间质损伤程度越高，尿KIM-1水平越高。本实验研究结果与上述研究结果一致。另外，本研究通过对尿KIM-1与其他临床资料进行相关性分析，发现，尿KIM-1与血胱抑素C成正相关，考虑血胱[15]抑素C反应肾小球滤过功能，推测尿KIM-1与肾小球功能改变密切相关。同时，尿KIM-1与血红蛋白成负相关，这可能与慢性肾脏病不断进展，患者肾性贫血加重，血红蛋白下降有关。中性粒细胞明胶酶相关性载脂蛋白（NGAL）是最初在激活的中性粒细胞中发[5]现的属于脂质运载蛋白超家族的蛋白质。分子量为25kd的小分子蛋白。在肾小管中，NGAL信使RNA在各种类型的有害刺激后几小时内表达上调，表明NGAL在急[16]性肾损伤的病理生理过程中发挥作用。曾有研究在腹膜内注射高剂量顺铂之后，发现NGAL在小鼠中被快速诱导并从肾小管中释放，并且早于肾衰竭的典型生物标[17-18]志物血肌酐及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。近年来，不断有研究证实，尿NGAL是严重肾损伤的的敏感可靠的预测因子。最近的证据还表明，NGAL可能以某种方式在慢性肾病的病理生理过程中发挥作用。本研究中尿NGAL在对照组中平均浓度为1.25±0.92（ng/ml）,轻度损伤组为19.88±14.35（ng/ml），轻-中度损伤组为37.96±29.96（ng/ml）,重度损伤组为104.96±64.06ng/ml）。经非参数H检验，不同肾间质损伤程度的实验组与健康对照相比较，差异均具有统计学意义（p＜0.01）。尿NGAL浓度随肾间质损伤的严重程度逐步递增，且本实验经相关性分析，得出尿NGAL与肾间质损伤成正相关，且相关性强（r=0.76，p＜0.01）。这一结果说明了，尿NGAL可作为反应慢[19]性肾脏病患者中肾小管间质的损伤程度的指标。这与Bolignano等研究结果一致。进一步分析显示，尿NGAL与血肌酐、尿素氮、胱抑素C等传统反应肾功能的指标呈正相关性，与eGFR、血红蛋白呈负相关。这表明NGAL水平可与能肾功能的下[20][21]降严重程度相关，可能预测慢性病脏病肾功能进展。Vasilkova等通过对125名慢性肾脏病糖尿病患者测定尿NGAL发现，CKD患者的尿NGAL水平显著高于健康对照组（69.82±63.20ng/mL比2.69±1.74ng/mL,p＜0.01），且尿NGAL水平与eGFR呈显著负相关（r=-0.305，p＜0.05）,认为NGAL可以是糖尿病[22]CKD患者肾功能的可靠标指标。另有研究纳入了125名经肾穿刺活检证实不同病因的慢性肾脏病患者的尿NGAL，同样证实了尿NGAL可成为反应CKD肾小管间质损伤的生物学指标。14 中国医科大学博（硕）士学位论文本实验还进一步分析尿KIM-1、尿NGAL,以及二者联合诊断的ROC曲线。尿KIM-1、NGAL对肾小管间质损伤的诊断，联合检测的曲线下面积优于单独检测，且NGAL在最佳临界点的灵敏度明显优于KIM-1在最佳临界点的灵敏度。这或许有望为临床辅助检验提供帮助。本实验发现，在早期慢性肾小管间质损伤时尿KIM-1浓度虽然较健康对照组轻度升高，但不具备统计学差异，通过ROC曲线比较，尿NGAL对肾小管间质损伤的[23]诊断优于尿KIM-1，尤其在肾小管损伤的早期。曾有研究分析KIM-1以及NGAL对IgA肾病预后的影响，发现虽然二者浓度均较对照组升高，但通过多变量回归分析得出结论，尿KIM-1才是影响终末期肾脏病（ESRD）的独立预测因子。而另[24]有研究表明，在糖尿病肾病的的早期诊断中，尿NGAL的曲线下面积大于尿KIM-1的曲线下面积，即诊断价值更大，且尿NGAL与肾小球滤过率的相关性更为显著。该实验结果与本实验结果相似。可见，在不同疾病中，尿KIM-1与NGAL的诊断优势不同。而本研究涵盖不同的病理类型，得出以上结论，这可能为临床上早期诊断慢性肾小管间质损伤提供依据。本研究的不足之处：其一，健康对照组未行肾活检，是否存在早期肾小管间质损伤尚无明确病理依据，且由于入组患者数量有限，将肾间质损伤评分为3分及4分实验组合并为一组，无法精确分析不同病理损伤程度下KIM-1与NGAL的变化情况。其二，此次实验虽纳入慢性肾脏病的不同病理类型，但各病理类型数量不均衡，尚不能充分对各病理类型进行详尽的分析；其三，本研究为横断面研究，尚未对尿KIM-1及NGAL进行动态检测，观察其浓度变化对疾病病程及预后的影响。基于以上三点，未来仍需要大量样本、多中心的前瞻性研究进行进一步探讨。综上所述，本研究发现尿KIM-1、NGAL对慢性肾脏病患者肾小管间质损伤的评估与诊断提供依据，二者联和检测更具优势,尤其是在肾小管间质损伤的早期，更具有临床价值。二者很可能成为无创性、可操作性强的灵敏检测手段，应用于临床实践来分析肾小管间质损伤。15 中国医科大学博（硕）士学位论文5结论1、在CKD肾小管间质损伤的患者中，尿KIM-1与NGAL随着小管间质损伤严重程度升高而表达水平升高。2、尿KIM-1与NGAL与肾小管间质损伤程度呈正相关。3、对慢性肾脏病小管间质损伤的诊断，尿NGAL的诊断明显优于尿KIM-1，而联合诊断对于发现早期肾小管间质损伤更具有意义。16 中国医科大学博（硕）士学位论文本研究创新性的自我评价目前，关于KIM-1及NGAL在肾脏病方面研究主要围绕在各种病因引起的急性肾损伤或糖尿病肾病、IgA肾病等单个病种展开，针对慢性肾脏病的报道与研究相对偏少。本实验采用ELISA方法检测原发与继发慢性肾脏病患者的尿液中KIM-1及NGAL浓度，对其二者与肾小管间质病理改变进行差异性分析及相关性分析，探讨二者在诊断肾小管间质损伤中的临床意义，旨在明确尿KIM-1及NGAL检测临床意义，也是本研究立题的创新之处。17 中国医科大学博（硕）士学位论文参考文献[1]陈香美.临床诊疗指南[M].人民卫生出版社,2010,6(1):164-166.[2]肖程程,张杰.肾纤维化的细胞和分子基础[J].中国医药导报,2017,14(7):45-48.[3]CattranDC,CoppoR,CookHT,etal.TheOxfordclassificationofIgAnephropathy:rationale,clinicopathologicalcorrelations,andclassification[J].KidneyInternational,2009,76(5):534-545.[4]LimAI,TangSC,LaiKN,etal.Kidneyinjurymolecule-1:morethanjustaninjurymarkeroftubularepithelialcells?[J].JournalofCellularPhysiology,2013,228(5):917.[5]CowlandJB,BorregaardN.Molecularcharacterizationandpatternoftissueexpressionofthegeneforneutrophilgelatinase-associatedlipocalinfromhumans.[J].Genomics,1997,45(1):17-23.[6]苏超,张桂霞,王瑞峰,等.CKD—EPI方程估算中国慢性肾脏病患者肾小球滤过率的适用性评价[J].中华疾病控制杂志,2013,17(7):621-624.[7]IkezumiY,SuzukiT,HayafujiS,etal.Thesialoadhesin(CD169)expressingamacrophagesubsetinhumanproliferativeglomerulonephritis[J].NephrolDialTransplant,2005,20(12):2704-2713.[8]FalkeLL,GholizadehS,GoldschmedingR,etal.Diverseoriginsofthemyofibroblast—implicationsforkidneyfibrosis[J].NatureReviewsNephrology,2015,11(4):233.[9]LiuY.Renalfibrosis:newinsightsintothepathogenesisandtherapeutics[J].KidneyInternational,2006,69(2):213-217.[10]IchimuraT,BonventreJV,BaillyV,etal.Kidneyinjurymolecule-1(KIM-1),aputativeepithelialcelladhesionmoleculecontaininganovelimmunoglobulindomain,isup-regulatedinrenalcellsafterinjury.[J].JournalofBiologicalChemistry,1998,273(7):4135-42.[11]ZhangZ,HumphreysBD,BonventreJV.SheddingoftheUrinaryBiomarkerKidneyInjuryMolecule-1(KIM-1)IsRegulatedbyMAPKinasesandJuxtamembraneRegion[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrologyJasn,2007,18(10):2704-14.[12]vanTimmerenMM,McVDH,BaillyV,etal.Tubularkidneyinjurymolecule-1(KIM-1)inhumanrenaldisease[J].JournalofPathology,2007,212(2):209-217.[13]KramerAB,TimmerenMMV,SchuursTA,etal.Reductionofproteinuriainadriamycin-inducednephropathyisassociatedwithreductionofrenalkidneyinjurymolecule(Kim-1)overtime[J].AmericanJournalofPhysiologyRenalPhysiology,2009,296(5):F1136-45.[14]HumphreysBD,XuF,SabbisettiV,etal.Chronicepithelialkidneyinjurymolecule-1expressioncausesmurinekidneyfibrosis.[J].JournalofClinicalInvestigation,2013,123(9):4023.18 中国医科大学博（硕）士学位论文[15]XuPC,ZhangJJ,ChenM,etal.Urinarykidneyinjurymolecule-1inpatientswithIgAnephropathyiscloselyassociatedwithdiseaseseverity.[J].NephrolDialTransplant,2011,26(10):3229-36.[16]MishraJ,MoriK,MaQ,etal.Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin:anovelearlyurinarybiomarkerforcisplatinnephrotoxicity.[J].AmericanJournalofNephrology,2004,24(3):307-315.[17]MishraJ,DentC,TarabishiR,etal.Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)asabiomarkerforacuterenalinjuryaftercardiacsurgery[J].Lancet(London,England),2005,365(9466):1231.[18]HirschR,DentC,PfriemH,etal.NGALisanearlypredictivebiomarkerofcontrast-inducednephropathyinchildren.[J].PediatricNephrology,2007,22(12):2089-2095.[19]BolignanoD,LacquanitiA,CoppolinoG,etal.NeutrophilGelatinase-AssociatedLipocalin(NGAL)andProgressionofChronicKidneyDisease[J].ClinJAmSocNephrol,2009,4(2):337.[20]BolignanoD,DonatoV,CoppolinoG,etal.Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)asamarkerofkidneydamage.[J].AmericanJournalofKidneyDiseasestheOfficialJournaloftheNationalKidneyFoundation,2008,52(3):595.[21]VasilkovaV,MokhortT,GroshevaV.Urinaryneutrophilgelatinase-associatedlipocalinlevelsindiabeticpatientswithchronickidneydisease[J].Atherosclerosis,2015,241(1):e183-e183.[22]张科，张科,刘彧崟,张春,等.尿NGAL与CKD肾小管间质损伤的相关性研究[J].检验医学,2015,30(4):327-330.[23]PetersHP,WaandersF,MeijerE,etal.Highurinaryexcretionofkidneyinjurymolecule-1isanindependentpredictorofend-stagerenaldiseaseinpatientswithIgAnephropathy[J].Nephrology,dialysis,transplantation:officialpublicationoftheEuropeanDialysisandTransplantAssociation-EuropeanRenalAssociation,2011,26(11):3581.[24]孙建敏，吕肖峰，姚璐等.尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和肾损伤分子-1在糖尿病肾病早期诊断中作用的研究[J].中国糖尿病杂志.2015,21(2),129-130.19 中国医科大学博（硕）士学位论文综述肾小管间质损伤与其生物学标志物的相关研究目前慢性肾脏疾病（chronickidneydisease，CKD）已经成为全世界范围内的公共卫生问题，尤其在发展中国家，其发病率及患病率逐年上升。近年来，人们通过[1]大量研究认识到肾间质病变与CKD进展速度以及预后存在着密切的相关。肾小管间质损伤的肾脏病理特点包括：肾间质多灶或大片状纤维化、炎细胞浸润、小管萎[2]缩变性等。而其中肾小管-间质纤维化则在慢性肾脏病向终末期发展的过程中起重要作用，表现为间质炎细胞浸润、肾小管萎缩以及纤维基质沉积。本文就肾小管间质纤维化的发病机制以及肾小管间质损伤的生物学标志的研究进展进行综述。1、肾小管间质纤维化的发病机制（1）细胞因子与肾间质纤维化：肾间质纤维化的形成过程复杂，由巨噬细胞合成并分泌的多种细胞因子参与其中，如生长因子类：转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、结缔组织生长因子（CTGF）、血小板源性生长因子等，血管活性肽类包括：血管紧张素II、内皮素-1；以及其他如肿瘤坏死因子、单核细胞趋化蛋白-1、白细胞介素类等通过发挥其促进炎症作用、激发免疫反应、促进基质聚集参与肾小管间质损伤。其中转化生长因子-β在肾间质纤维化中发挥着重要的作用，与其他细胞因子共同发挥作用，几乎在肾间质纤维化的各个环节起着决定性作用。TGF-β在肾脏病变时主要表达在肾小球系膜细胞、肾间质细胞以及肾小管上皮细胞。TGF-β可促进细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）的形成、抑制［4］细胞外基质（ECM）的降解，并诱导间充质细胞基因表达为肌成纤维细胞。有［5］研究证明，TGF-β通过破坏细胞外基质代谢平衡促进肾间质纤维化的进展。TGF-β还可通过在信号转导途径中发挥作用，促进肾间质纤维化。有研究指出，抑制TGF-β下游的Smad基因可使介导小管上皮细胞间充质转分化的整合素β1表达减弱，［6］减缓间质纤维化。因此，近年来，关于通过TGF-β信号抑制因子的研究给防治［7］肾间质纤维化提供了新的临床思路。结缔组织生长因子存在于正常人肾组织中，在IgA肾病、糖尿病肾病等慢性肾脏病中高表达。有研究表明，CTGF可通过诱导［8］整合素β1的表达，与TGF-β同样调控肾小管上皮细胞间充质转分化。这也进一步证实了结缔组生长因子是TGF-β下游的作用因子。另外，CTGF还可通过活化巨［9］噬细胞产生细胞外基质，促进成纤维细胞有丝分裂，造成肾间质纤维化。血管紧20 中国医科大学博（硕）士学位论文张素II可通过调控信号转导促进ECM的聚集，内皮素-1则通过扩大肾间质炎症［10］协同TGF-β的表达促进肾间质纤维化。（2）肾小管上皮细胞与肾间质纤维化:肾小管上皮细胞的活化、表型转化为主要的效应细胞以及肾小管上皮细胞的凋亡，都在肾小管间质纤维化的形成过程中扮演着［11］重要的角色。当肾脏发生病理改变时，肾小管上皮细胞受到肾毒性分子及炎症分子、活性氧以及炎症因子的刺激而活化，活化后的上皮细胞可通过释放细胞因子如TGF-β促进成纤维细胞形成、增加细胞外基质的堆积在肾间质纤维化的诱导阶段发挥作用。上皮间质转化（EMT）是指在特定的生理、病理条件下上皮到间质细胞的转化，在生长发育、组织器官修复以及纤维化、和肿瘤转移中发挥重要作用，是使复杂组织中细胞多样化的中心机制。EMT分为3种类型，其中II型EMT与组织纤维化关系密切。肾小管上皮细胞EMT即肾小管上皮细胞转化为成纤维细胞的重要病理过程。成纤维细胞在正常的肾组织中并不特别丰富，但当肾纤维化发生时，约36％的新成纤维细胞来自局部EMT，约14-15％来自骨髓，其余来自局部增殖，［12］这一发现强化了EMT在纤维化形成中占重要地位的观点。目前已知TGF-β、整［13］合素链接激酶、Wnt/β3条细胞内信号转导通路协同作用，调控EMT的形成。另外，体内多种起着正、负调节作用的细胞因子同样参与调节EMT的形成，经典的促EMT因子包括TGF-β、血管紧张素II、内皮素-等，经典的抑EMT因子包括肝细胞［14］生长因子（HGF）、血管内皮生长因子、骨形成蛋白—7（BMP-7）等。肾小管上皮细胞microRNA水平同样与EMT关系密切。miRNAs是一类具有调控功能的非编码RNA。Yang等在多个单侧输尿管闭塞（UUO）经典动物模型肾组织活检中可检［15］测到表达增加的miRNA-21。这也进一步印证了，microRNA可能参与EMT的形成。肾小管上皮细胞是肾间质结构的主要组成细胞，当肾脏经历缺血、中毒等损伤时，均可造成小管上皮细胞的过度凋亡及坏死。而过度凋亡则被认为是肾小管萎缩的病理基础。由于在多个动物模型以及人体肾脏病理标本中发现，间质纤维化的严重程度与上皮细胞凋亡数呈正相关，推测肾小管上皮细胞的过度凋亡被动参与了［11］间质纤维化的发展。有研究表明，凋亡后的肾小管上皮细胞，可合成并分泌成纤维细胞，共同参与间质纤维化。（3）肌成纤维细胞与肾间质纤维化:肌成纤维细胞是肾间质纤维化中形成基质蛋白最主要的效应细胞，只有在病理状态才存在在肾组织中。但是，肌成纤维细胞的具体来源现仍未达成共识，目前认为除固有的成纤维细胞外，如前所述的肾小管上皮转分化为其主要来源。而作为肾间质固有细胞的成纤维细胞，在正常肾组织中占细21 中国医科大学博（硕）士学位论文［16］胞总数的6%，在缺血、毒素等病理状态下被细胞因子激活后，自身增殖成为肌成纤维细胞，活化后的成纤维细胞具有更强大的收缩和分泌功能，通过促进ECM细胞外基质堆积，分泌蛋白水解酶促进炎细胞浸润参与间质纤维化。肌成纤维细胞表现为既具有合成胶原间质的成纤维细胞的生物学特性，又如血管平滑肌细胞一样，可表达a-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。［17-18］经多方验证，随着间质纤维化越来越严重，α-SMA表达也越来越多，且临床治疗的效果越差，得出结论：α-SMA既可评估肾间质纤维化的严重程度，又具有反应慢性肾脏病预后的价值。肌成纤维细胞则主要通过大量生成瘢痕中基质蛋白促进肾脏纤维化。ECM是维持间质正常构造的细胞支持，执行重要的生理作用，[19]是细胞间信息传递的重要通路。当肾间质纤维化时，ECM异常聚积的基质蛋白主要包括胶原(尤其是I型和Ⅲ型)、糖蛋白及蛋白聚糖、纤维连接蛋白等。肌成纤维细胞通过分泌基质金属蛋白酶抑制剂，使ECM合成加剧，降解减低，致使ECM异常堆积，从而引起肾间质纤维化的形成。2、NGAL与肾小管间质损伤(1)NGAL的分子特点与生物学功能中性粒细胞明胶酶相关性载脂蛋白（neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin，NGAL）是一种相对分子质量为25KD的小分子蛋白，由197个氨基酸组成，是一种[20]脂质运载蛋白，属于载脂蛋白家族成员。NGAL蛋白具有花萼形状的桶形结构，即8个β-折叠，可结合并运输疏水性小分子，且β-折叠封闭端的游离疏基具有结［21］合MMP-9的功能，形成NGAL的异源二聚体。NGAL正常情况下，NGAL在人类多种组织（成人、骨髓、前列腺、消化道、肺、子宫等）中呈低表达，当人体受到如炎症反应、肿瘤环境等病理刺激时，上述组织中NGAL表达增强。NGAL在肾小管上皮形成与损伤后修复中起重要作用。当肾脏组织受灌注不足、炎症、毒性等刺激后，其表达升高，且研究发现NAGL高表达部位主要集中于近端小管上皮细胞，肾脏其他部位其他部位低表达。因此NGAL常常作为肾小管损伤的生物学标志物。（2）近年来，大量研究发现，NGAL可作为急性肾损伤（AcuteKidneyInjury，AKI）的早期生物学标志物，其敏感性及特异性优于传统肾脏损伤的标志物如肌酐、尿素氮等。尤其尿液NGAL与肾间质损伤水平密切相关。无论建立的急性肾损伤动物模型还是针对AKI患者的大量临床试验研究，都得相似的结论：血液或尿液中的［22]NGAL是预测AKI的早期可靠检测手段。更有研究发现其不仅在急性肾小管间22 中国医科大学博（硕）士学位论文［23］质损伤中可作为生物学标志物，在慢性肾脏病中同具有临床意义。有研究显示，慢性肾脏病患者血尿NGAL可与肾小球滤过率成负相关,证明其可作为CKD疾病严［24］重程度的。Siddiq等对180名2型糖尿病患者的前瞻性研究结果显示，与正常白蛋白尿对照组相比，微量白蛋白尿患者的尿NGAL和血NGAL水平显著升高。且尿白蛋白排泄与血NGAL和尿NGAL呈正相关。且通过绘制ROC曲线，发现尿NGAL和血NGAL曲线下面积分别为1和0.8，表明它们是糖尿病肾病肾损伤的敏感检测手段。同样有研究指出，NGAL在肾病综合征中也可作为反应早期肾损害的指标。[25]吴杰等探讨了在IgA肾病中NGAL对肾小管间质损伤的应用评价，得出尿NGAL水平能够反映IgA肾病患者疾病严重程度，与反应肾功能指标相关，且与肾小管间［25］质损伤密切相关。目前研究推测，NGAL可能通过与可降解ECM的金属蛋白酶[26]-9（MMP-9）结合成异源二聚体，调节其活性，参与肾脏纤维化。刘刚等通过对48只大鼠单侧输尿管梗阻（UUO）模型肾组织中NGAL的观测，得出大鼠肾小管间质损伤指数以及肾间质纤维化程度与肾组织中NGAL阳性程度呈负相关，推测NGAL可能参与间质纤维化的形成过程。但由于肾间质纤维化成因复杂，且影响因素多样，故NGAL在其中发挥的作用的还需进一步深入探究。3、KIM-1与肾小管间质损伤（1）KIM-1的分子特点及生物功能肾损伤分子-1（KidneyInjuryMolecule-1）是近年来发现的一种新型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。其相对分子量为104KD,由334个氨基酸片段组成，具有免疫球蛋白和黏蛋白结构功能，KIM-1具有a、b两个亚型，其中a亚型主要［27］表达于人类肝脏，b亚型表达于人类肾脏。KIM-1有助于去除凋亡细胞并促进受[28]损小管的再生，对损伤后小管结构和功能的愈合和恢复起调节作用。在正常人肾组织或尿液中表达微弱，当肾脏灌注不足或中毒性损伤时在近曲小管上皮细胞中表[29]达增强。因此KIM-1被视为可反应肾小管间质损伤的可靠指标。（2）由于传统的肾损伤标志血肌酐（Serumcreatinine,Scr）、尿素氮(Bloodureanitrogen,BUN)敏感性和特异性差,KIM-1成为近年来研究较多的新兴AKI的标志[30]物。Vaidya等通过建立顺铂，庆大霉素和万古霉素等8种药物致肾毒性损伤动物模型，比较尿KIM-1与BUN，SCr和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）的诊断药物所致急性肾损伤（AKI）的灵敏度及特异度，得出结论：在多种大鼠肾损伤模型中，KIM-1优于Scr，BUN和尿NAG，尿KIM-1可作为诊断AKI早期损伤的生物学标志物。AKI和CKD都可能发展为终末期肾病（endstagerenaldisease，23 中国医科大学博（硕）士学位论文[31]ESRD），需要肾脏替代治疗，多项研究表明，在急性肾小管坏死患者中，肾脏活检标本与尿液中KIM-1表达显著增加，同时发现KIM-1的表达也与肾小管间质纤维化有关，表明KIM-1在慢性肾脏病中有着重要的位置。糖尿病是造成造成终末[32]期肾脏病的重要原因，Aslan等通过对2型糖尿病患者根据尿白蛋白/肌酐比值进行分组，观察到对照组与正常白蛋白尿，微量白蛋白尿和蛋白尿组之间的差异对于KIM-1是非常显著的，并且KIM-1与尿微量白蛋白/肌酐呈正相关，由此推断尿KIM-1水平可以是糖尿病肾病患者的AKI早期标志物。Kramer等在阿霉素诱导的大鼠肾脏疾病中发现，KIM-1可随着尿蛋白的下降而减少，由此推测KIM-1可作[33][34]为反应肾小管间质损伤和预测预后的指标。有研究纳入了102名经病理学家诊断CKD的患者的肾活检标本,包括局灶性肾小球硬化症,IgA肾病,糖尿病肾病、紫癜肾炎等各种病因的肾病脏疾病，发现KIM-1与肾损伤呈正相关，与肾功能呈负相关，与蛋白尿无关。免疫组化法标记KIM-1，其在肾小管间质的表达与α-SMA的表达、单核细胞趋化因子-1呈正相关。α-SMA可活化肌成纤维细胞促进细胞外基质形成间质纤维化，而单核细胞趋化因子-1可介导巨噬细胞聚集，促进肾脏炎性反[35]应及纤维化。综上所述，KIM-1不仅可作为预测AKI指标，因其参与肾间质纤维化形成，也可作为预测慢性肾脏病进展及预后评价的标志物。参考文献[1]HealyE,BradyHR.Roleoftubuleepithlialcellsinpathogenesisoftubulointerstitialfibrosisinducedbyglomerulardisease-curropin.[J].NephrolHypertens,1998,7:525-530.[2]陈香美.临床诊疗指南[M].人民卫生出版社,2010,6(1):164-166.[3]马春艳,王海燕.转化生长因子β1在肾小管上皮细胞的信号介导分子[J].中国细胞生物学学报,2002,24(1):41-45.[4]FalkeLL,GholizadehS,GoldschmedingR,etal.Diverseoriginsofthemyofibroblast—implicationsforkidneyfibrosis[J].NatureReviewsNephrology,2015,11(4):233.[5]BrantonMH,KoppJB.TGF-betaandfibrosis[J].Microbes&Infection,1999,1(15):1349.[6]YehYC,WeiWC,WangYK,etal.Transforminggrowthfactor-{beta1inducesSmad3-dependent{beta1integringeneexpressioninepithelial-to-mesenchymaltransitionduringchronictubulointerstitialfibrosis[J].AmericanJournalofPathology,2010,177(4):1743.[7]BaghyK，DezsoK，LaszloV，etal．Ablationofthedecorigeneenhancesexperimentalhepaticfibrosisandimpairshepatichealinginmice[J].LabInvest，2011，91(3)：439．24 中国医科大学博（硕）士学位论文[8]BumsWC，TwiggsM，ForbesJM，etal．Connectivetissuegrowthfactorplaysanimportantroleinadvancedglycationendproduct-inducedTubularepithelial-to-mesenchymaltransition：jmplicationsfordiabetjcrenaldjsease[J]．JAmsocNephrol，2006，17(9)：2484—2494．[9]KarihalooA，KoraishyF.HuenSC，etal．MacrophagespromoteC．VSIgrowthinpolyeystickidne．disease[J]JAmSocNephrol，2011，22(10)：1809—1814．[10]宋新文.细胞因子与肾小管间质纤维化[J].国际泌尿系统杂志,2005,25(3):374-377.[11]李彪,李晓玫.肾小管上皮细胞在肾间质纤维化中的作用[J].临床与病理杂志,2004,24(1):65-67.[12]Iwano,M.,IwanoM,PliethD,DanoffTM,etal.Evidencethatfibroblastsderivefromepitheliumduringtissuefibrosis[J].JournalofClinicalInvestigation,2002,110(3):341-350.[13]刘珊,王惠明,丁国华.上皮间质转化在肾脏纤维化中的分子机制研究进展[J].临床内科杂志,2016,33(6):428-430.[14]于方.肾小管上皮间质转化的研究进展[J].国际儿科学杂志,2017,44(4).[15]ZarjouA,YangS,AbrahamE,etal.IdentificationofamicroRNAsignatureinrenalfibrosis:roleofmiR-21[J].AmericanJournalofPhysiology-RenalPhysiology,2011,301(4):F793.[16]MüllerGA,StrutzFM.Renalfibroblastheterogeneity.[J].KidneyInternationalSupplement,1995,50:S33.[17]YangJ,DaiC.UuY.Anovelmechanismbywhichhepatocytegrewthfactorblockstubularepithelialtomesenchymaltnmsition[J]．JAmSocNephrol，2005，16(1)：68-78．[18]BadidC,VinccmM,FouqueD，etal.Myoflbreblast：aprognosticmarkerandtargetcellinprogressiverenaldiseasese[J]．BenFail，2001．23(3-4)：543-549．[19]王锁刚,张翥.肌成纤维细胞与肾小管间质纤维化[J].医学综述,2008,14(7):982-984.[20]CoCowlandJB,BorregaardN.Molecularcharacterizationandpatternoftissueexpressionofthegeneforneutrophilgelatinase-associatedlipocalinfromhumans.[J].Genomics,1997,45(1):17-23.[21]DavidBolignanoD,DonatoV,CoppolinoG,etal.Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)asamarkerofkidneydamage.[J].AmericanJournalofKidneyDiseasestheOfficialJournaloftheNationalKidneyFoundation,2008,52(3):595.[22]何莹,陈安,胡川闽.NGAL测定在急性肾损伤诊断中应用的研究进展[J].医学综述,2014,20(22):4044-4046.[23]BolignanoD,CoppolinoG,CampoS,etal.Urinaryneutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)isassociatedwithseverityofrenaldiseaseinproteinuricpatients[J].Nephrology,dialysis,25 中国医科大学博（硕）士学位论文transplantation:officialpublicationoftheEuropeanDialysisandTransplantAssociation-EuropeanRenalAssociation,2008,23(1):414-6.[24]SiddiqiZ,KaroliR,KaulA,etal.EvaluationofNeutrophilGelatinase-associatedLipocalinandCystatinCasEarlyMarkersofDiabeticNephropathy[J].AnnalsofAfricanMedicine,2017,16(3):101.[25]MishraJ,DentC,TarabishiR,etal.Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)asabiomarkerforacuterenalinjuryaftercardiacsurgery[J].Lancet(London,England),2005,365(9466):1231.[26]刘刚,于永刚,梁毅文,等.NGAL在肾间质纤维化不质阶段的表达及意义[J].浙江临床医学,2010,12(5):458-461.[27]IchimuraT,BonventreJV,BaillyV,etal.Kidneyinjurymolecule-1(KIM-1),aputativeepithelialcelladhesionmoleculecontaininganovelimmunoglobulindomain,isup-regulatedinrenalcellsafterinjury.[J].JournalofBiologicalChemistry,1998,273(7):4135-42.[28]BaillyV，ZhangZ，MeierW，etal．Sheddingofkidneyinjurymole-eule-1．Aputativeedhesionproteininvolvedinrenalregeneration[J].．JBiolChem，2002，277：39739-39748．[29]CruzDN,GohCY,Haase-FielitzA,etal.Earlybiomarkersofrenalinjury[J].CongestiveHeartFailure,2010,16(s1):S25-S31.[30]VaidyaVS,OzerJS,DieterleF,etal.Kidneyinjurymolecule-1outperformstraditionalbiomarkersofkidneyinjuryinpreclinicalbiomarkerqualificationstudies[J].NatureBiotechnology,2010,28(5):478-85.[31]LimAI,TangSC,LaiKN,etal.Kidneyinjurymolecule-1:morethanjustaninjurymarkeroftubularepithelialcells?[J].JournalofCellularPhysiology,2013,228(5):917.[32]AslanAslanO,DemirM,KoseogluM.KidneyInjuryMoleculeLevelsinType2DiabetesMellitus[J].JournalofClinicalLaboratoryAnalysis,2016,30(6):1031-1036.[33]KramerAB,TimmerenMMV,SchuursTA,etal.Reductionofproteinuriainadriamycin-inducednephropathyisassociatedwithreductionofrenalkidneyinjurymolecule(Kim-1)overtime[J].AmericanJournalofPhysiologyRenalPhysiology,2009,296(5):F1136-45.[34]vanTimmerenMM,McVDH,BaillyV,etal.Tubularkidneyinjurymolecule-1(KIM-1)inhumanrenaldisease[J].JournalofPathology,2007,212(2):209-217.[35]尹彩霞,王宁宁.肾损伤因子-1与慢性肾脏病[J].中国临床医学,2016,23(1):118-123.26 中国医科大学博（硕）士学位论文致谢感谢我的导师张蓓茹教授三年来对我临床工作及学术方面的指导与培养。老师的教诲与教导让我终身受益，老师的医术医德是我奋斗的目标！三年的临床实践让我学习到了很多临床知识，也让我迈出了成为一名合格医生的第一步！感谢第二临床学院各科室带教老师在规培轮转过程中的照顾与指导！特别感谢检验科实验室的老师以及同学在本次实验中为我提供的帮助！感谢一致以来支持我的家人与朋友！感谢母校对我的培养！李晨晨2017年3月27 中国医科大学博（硕）士学位论文个人简历姓名：李晨晨年龄：26岁性别：女民族：汉族学习经历：2010.8--2015.7大连医科大学临床医学本科2015.7—2018.7中国医科大学第二临床学院硕士研究生所获奖励：2016.5研究生学业奖学金三等2018.5研究生学业奖学金三等28