中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）与Tamm-Horsfall蛋白在慢性肾脏病（CKD）肾小管损伤中的诊断意义

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中图分类号密级＾论文题目ＬＴａｍｍ－Ｈｏｒｓｆａ中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（ＮＧＡｌｌ蛋）与白在慢性督脏病（ＣＫＤ）臂小管损伤中的诊断意义Ｄ－ｉａｇｎｏｓｔｉｃｖａｌｕｅｏｆＴａｍｍＨｏｒｓｆａｌｌｒｏｔｅｉ打ａｎｄｎｅｕｔｒｏｈｉｌｐｐｅ－ｌａｔｉｎａｓｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｉｏｃａｌｉｎｉｎｃｈｒｏｎｉｃｋｉｄｎｅｄｉｓｅａｓｅｗｉｔｈｒｅｎａｌｇｐｙＵｉｂ山ａｒｄａｍａｇｅ．孙立美３４汁：学位论文：页表格：口个４插图；幅指导教师；朱美财教授马红雨教授申请学位级别：硕女学位学科（专业）：临床检验诊断学培养单位—：大连医科大学完成时间：二〇六年二月（北巧空军总医院）答辩委员会主席ｆ：，右 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中将别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医一科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。如冰学位论文作者签名；篇字日期一年ｒ月日 关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权影大连医科大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位＂论文。本学位论文属于（请在レッ下相应方框内打Ｖ＂）：１．保密□，在＿＿年解密后运用本授权书。２．不保密ａ。作者签名；言曰期：谷年ｒ月Ｕ曰导师签名：冰細４日期年巧■＾日 大连医科大学硕士毕业论文目录一、摘要.................................................................................................................1（一）中文摘要.................................................................................................1（二）英文摘要.................................................................................................4二、正文.................................................................................................................9（一）前言.........................................................................................................9（二）实验材料和方法.....................................................................................91.实验材料........................................................................................101.1主要试剂耗材..........................................................................101.2主要仪器..................................................................................101.3研究对象..................................................................................102.实验方法........................................................................................112.1细胞复苏培养..........................................................................112.1.1杂交瘤细胞复苏.....................................................................112.1.2细胞日常维护.........................................................................112.2腹水制备..................................................................................112.3腹水纯化..................................................................................112.4抗体标记..................................................................................122.5试剂盒制备................................................................................132.6检测临床标本............................................................................142.7统计学方法................................................................................14 大连医科大学硕士毕业论文（三）结果.........................................................................................................141.腹水效价检测................................................................................142.纯化抗体效价检测........................................................................153.标记抗体4E4-HRP效价检测结果...............................................154.自制ELISA试剂盒.......................................................................154.1ELISA试剂盒检测样本曲线.......................................................154.2标准品浓度及其对应的OD值...................................................164.3检测临床标本................................................................................165.数据统计........................................................................................165.1CKD不同分期中各生物学指标的变化......................................165.2相关性分析..................................................................................175.3ROC曲线......................................................................................185.4联合检测诊断CKD界值分析....................................................19（四）讨论.....................................................................................................21（五）结论.....................................................................................................23（六）参考文献.............................................................................................24三、综述...........................................................................................................26（一）综述...................................................................................................26（二）参考文献………………………………………………………….….............................31四、攻读学位期间发表文章情况.....................................................................34五、致谢...........................................................................................................35 大连医科大学硕士毕业论文中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)与Tamm-Horsfall蛋白在慢性肾脏病(CKD)肾小管损伤中的诊断意义中文摘要随着人口老龄化的不断增加及人们生活环境的日益变化，慢性肾脏病(Chronickidneydisease,CKD)包括糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮肾病等继发性肾病和原发性肾病的发病率逐渐升高。慢性肾脏病的病理进展比较缓慢而且具有不可逆性，早期肾脏损害的临床症状不明显。研究发现THP(Tamm-HorsfallProtein,THP)和其他新型肾功能指标如：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)、血清胱抑素C(CystatinC,CysC)、血清β2微球蛋白、血清及尿液视黄醇结合蛋白等在肾脏损伤早期即可发生变化，而且尿液NGAL和THP的水平变化可反映慢性肾脏病早期肾小管损伤。但是，目前检测尿液THP的方法大多为放射免疫法，具有一定的危险性和污染性。本研究通过THP单克隆抗体的制备、纯化、鉴定，最终建立了THP的酶联免疫试验(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检验方法。收集在北京空军总医院风湿肾病科住院的慢性肾脏病患者，检测其尿液THP的含量，并采用日立7600全自动生化分析仪检测患者尿液NGAL、尿液NAG、血清CysC、血清β2-MG、血清及尿液视黄醇结合蛋白等肾功能指标含量。根据2009年改善全球肾脏疾病结局组织(KidneyDisease:ImprovingGlobalOutcomes,KDIGO)新公布的临床实践指南，结合eGFR值将慢性肾病患者进行分期，利用统计学方法分析CKD患者在不同分期中THP及各指标的含量变化。分析新型肾脏指标如，尿液NGAL、THP与传统肾功能指标如Scr、Urea等的相关性，绘制受试者特征性工作曲线判断各指标在CKD早期诊断中的准确性，并联合检测尿液NGAL和THP，观察联合预测因子在CKD肾小管损伤诊断中的准确性，为CKD的早期诊断及临床分期提供实验室依据。研究目的首先，ELISA检测方法便于操作，成本较低，没有污染。通过THP单克隆抗体的制备了解单克隆抗体制备的实验原理、主要步骤和实验方法。掌握细胞的1 大连医科大学硕士毕业论文复苏、培养、腹水纯化、抗体效价鉴定等实验室基本技术。其次，尿液THP蛋白在CKD早期肾小管损伤中变化具有临床诊断意义，通过纯化重组THP片段蛋白作为免疫原制备THP单克隆抗体，建立其ELISA检测方法。最后，研究证明，尿液NGAL是反映急性肾损伤的敏感指标，本文将研究尿液NGAL在慢性肾脏病肾小管损伤中的诊断价值，并分析联合检测尿NGAL与尿THP在早期CKD诊断中的敏感度及特异性。用统计学分析反映肾脏损伤的新型生物学指标在CKD患者不同分期中的变化并判断在慢性肾脏病早期诊断中的临床价值。检测各指标与肾小球滤过率(Glomendarfiltrationrate,GFR)、血肌酐(Scr)、血清尿素(Urea)等传统肾功能指标的相关性，为早期诊断CKD，给予早期干预治疗延缓CKD患者的病理进展提供可靠的实验室依据。研究方法实验之前已经利用基因工程技术制备好了抗原，并以纯化的重组THP片段蛋白作为免疫原免疫小鼠，待小鼠血液抗体效价达到要求后，取脾脏。采用常规方法，使脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得具有分泌THP抗体的杂交瘤细胞放入液氮中保存。我将能够分泌3B9和4E4抗体的两株杂交瘤细胞复苏、培养、注入小鼠腹腔制备腹水，并将腹水用ProteinG方法进行纯化、检测抗体效价、用辣根过氧化物酶标记抗体并检测偶联后的效价、建立检测患者尿液THP含量的双抗体夹心的ELISA检测方法。用自制的ELISA试剂盒检测慢性肾脏病患者的尿液THP含量。同时采用日立7600全自动生化分析仪检测CKD患者的尿NGAL、尿NAG、血清CysC、血清β2-MG等肾功能指标，并收集49名健康体检人员(尿常规正常，尿蛋白阴性)作为对照组。最后对数据进行统计学分析处理。研究结果利用两株能够稳定分泌THP单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水后，腹水效价均高于1:720000，经ProteinG方法纯化得到THP单克隆抗体纯度大于90%，其抗体效价为4.1ng/ml左右。偶联后用ELISA方法检测4E4-HRP的效价也较高，可用于检测临床标本。统计数据结果显示，尿液THP从CKD2期即与对照组和1期出现明显差异，以后各期间比较也有统计学意义，尿液NGAL从CKD3a期开始于对照组比较有统计学差异。说明尿液NGAL与尿液THP在CKD早期就出现变化，比传统指标Scr、Urea等指标更为敏感。其他生物学指标如尿液2 大连医科大学硕士毕业论文NAG、血清CysC、β2-MG等在CKD早期中的诊断价值也较高，是反映慢性肾病早期病变的良好指标。在绘制的ROC曲线中显示尿液NGAL的准确性大于尿液THP，两者的联合预测因子敏感度及特异性更高，ROC曲线下的面积为0.953。尿液THP与Scr、Urea呈负相关，随着肾小球滤过率的降低而降低。其他指标如：尿液NGAL、尿液NAG、血清CysC等与Scr、Urea呈正相关，随着肾小球滤过率的降低而增高。研究结论杂交瘤细胞复苏培养后能稳定分泌THP单克隆抗体，在体外传代后分泌抗体的能力没有改变，说明具有很好地稳定性。制备的THP蛋白单克隆抗体能够很好的识别天然THP，表明单克隆抗体的特异性较好。用两个效价较高的单抗制备双抗体夹心法检测临床标本的稳定性也较好。采用ELISA方法检测尿液THP比传统的放射免疫法更加方便、简洁。尿液THP、NGAL、血清CysC与β2-MG可作为CKD患者早期评价GFR的敏感指标，联合NGAL、THP作联合预测因子可提高早期诊断肾损害的灵敏度及特异性，对于早期发现CKD患者肾小管损伤并评估其损害程度有重要的临床意义。关键词：单克隆抗体慢性肾脏病ELISA方法尿THP尿NGAL3 大连医科大学硕士毕业论文DiagnosticvalueofTamm-Horsfallproteinandneutrophilgelatinase-associatedlipocalininchronickidneydiseasewithrenaltubulardamageAbstractWiththeincreasingaswellaschangingofagingpopulationandlivingenvironment,theincidenceofchronickidneydisease(CKD)includingdiabeticnephropathy,hypertensivenephropathyandprimarynephroticweregraduallyincreased.Thepathologicaldevelopmentofchronickidneydiseaseisslowlyandearlysymptomsofkidneydamageisnotobvious.AlotofresearchfoundthatTamm-HorsfallProtein(THP)andothernewindicatorsofrenalfunctionhadchangesintheearlykidneydamagesuchas:neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL),cystatinC(CysC),etc.Currently,theradioimmunoassayisusedtodetectTHP,butitcouldcausemedicalpollution.Inthisstudy,ELISAwasdevelopedtodetectTHP.CollectingthepatientswithChronicKidneydiseaseinourhospitalanddetectingurineTHP.TheurinaryNGAL,RBPandNAG,serumCysC,β2-MGandRBPofthesepatientsweredetectedbyusingHitachi7600automaticbiochemicalanalyzer.AccordingtotheOrganizationtoImproveGlobalOutcomesofKidneyDisease(KDIGO)in2009,thepatientswerestagedaccordingtoeGFRvalues.TheTHPandvariousindicatorsinCKDpatientsatdifferentstagesweredetected.ThecorrelationofnewindicatorsofkidneyfunctionasurinaryNGAL,urinaryTHPwithtraditionalindicatorssuchasScrandUreawasanalyzed.ThecurveofreceiveroperatingcharacteristicofeachindicatorwasdrawntojudgetheaccuracyofearlydiagnosisofCKD.Finally,theurinaryNGALandTHPwerejointdetectedtoobservetheaccuracyofjointpredictorsindiagnoseofrenaltubulardamage,whichprovidesthebasisforearlydiagnosisandstagingofCKD.ResearchObjectiveFirstly,themethodofELISAissimpleaswellaslow-cost.Weshouldunderstand4 大连医科大学硕士毕业论文theprinciplesofpreparationofmonoclonalantibodies,themainstepsandmethods.Secondly,thechangesofurineTHPinrenaltubularinjuryofCKDhaveclinicaldiagnosticsignificance.ThemonoclonalantibodieswerepreparedbyusingtheTHPfragmentafterpurifiedandreorganized,andthentheELISAtodetectTHPwasconstructed.Finally,urineNGALisasensitiveindicatorofacutekidneyinjury.ThisstudywillanalyzethediagnosticvalueofurineNGALinpatientswithrenaltubularinjuryofCKD.ThesensitivityandspecificityofcombineddetectionofurinaryNGALandTHPinthediagnosisofearlystageCKDwasanalyzed.Meanwhile,theothernewbiologicalindicatorsofchangesindifferentstagesofCKDpatientswasanalyzed.Toobservetherelevanceoftheseindicatorswithglomerularfiltrationrate,serumcreatinineandserumurea.Alloftheseindicatorscouldprovideclinicalevidenceforearlydiagnosis,earlytreatmentanddelaythepathologicalprogressionofCKD.ResearchmethodsBeforetheseexperiments,geneticengineeringtechnologywasusedtopreparetheTHPantigen,andthentheTHPwasimmunedtomice.Splenocyteswereharvestedwhenthebloodantibodytitersmeettherequirements.ThesplenocyteswerefusedwithmyelomacellsbyusingconventionalmethodtoobtainhybridomacellssecretingTHPantibodiesandstoredinliquidnitrogen.Afterbeingrecoveriedandcultured,thecellswereinjectedintomice.ThemethodofProteinG.Labeledantibodyhorseradishperoxidasewasusedtopurifyasciticfluid,andthemethodofELISAdetectingtheTHPintheurineofthepatientswasconstructed.ThelevelsofurineNGALandNAG,serumCysCandβ2-MGweredetectedbyusingHitachi7600automaticbiochemicalanalyzer.Atthesametime,49healthyvolunteerswerecollectedasacontrolgroup.ResearchresultTheascitestiterwashigherthan1:720000afterthepreparationofasciteswiththehybridtumorcells.ThemonoclonalantibodyofTHPwerepurifiedwithProteinG.Theantibodytiterwas4.1ng/ml.AfterconjugatedwithHRP,the4E4-HRPantibodytiterwashighenoughanditcouldbeusedtodetectclinicalspecimens.Statistics5 大连医科大学硕士毕业论文resultsshowedthatthelevelofurineTHPappearssignificantincreasingfromtheCKD2.ThelevelofurineNGALwassignificantlydifferentfromthecontrolgroupfromtheperiodofCKD3a.TheresultsindicatesthatthelevelsofurineNGALandTHPwerechangedintheearlyperiodofCKD.TheseindicatorsweremoresensitivethantraditionalindicatorslikeserumScrandUrea.TheotherbiologicalindicatorssuchasurinaryNAG,serumCysCandβ2-MGalsohavediagnosticvalueintheearlyperiodofCKD,whichwerebetterindicatorsinreflectingtheearlydamageofchronickidneydisease.ROCcurvesshowedthattheaccuracyofurineNGALwashigherthanthatofurineTHP.Thejointpredictorshadhighersensitivityandspecificity,andtheareaundertheROCcurvewas0.953.ThelevelofurineTHPwasnegativelycorrelatedwithserumScrandUrea.Whilethelevelofotherindicatorssuchas:UrineNGAL,urineNAGandserumCysCwerepositivelycorrelatedwithserumScrandUrea.ConclusionAfterbeingrecoveriedandcultured,thecellofhybridomacouldstablysecretemonoclonalantibodyofTHP.Theresultsshowsthatthehybridomahadgoodstability.ThemonoclonalantibodyofTHPcouldspeciallyrecognizethenativeTHP.Comparedwiththetraditionalmethodofradioimmunoassay,ELISAismoreconvenientandconcise.TheurineTHPandNGAL,serumCysCandβ2-MGcouldbeusedasthesensitiveindicatorofearlyevaluationofGFRinpatientswithCKD.TheurineNGALandTHPasjointpredictorscouldimprovethesensitivityandspecificityinearlydiagnosisofrenaldamage,whichcouldhaveimportantclinicalsignificanceforearlydetectionofCKDpatientswithtubulardamageandevaluatingthedamagedegree.Keywords:MonoclonalantibodiesChronicKidneyDiseaseMethodofELISAUrineTHPUrineNGAL6 大连医科大学硕士毕业论文（一）前言慢性肾脏病(Chronickidneydisease,CKD)是指肾脏结构慢性损伤及肾脏功能发生障碍3个月以上，导致肾小球滤过率下降，各种体液成分发生病理改变、影像学检查出现异常[1]。2009年改善全球肾脏病结局组织(KDIGO)对慢性肾脏病重新分期，将3期分为3a和3b期，因为CKD3期占患者的50%以上，而且患者在eGFR45-60及30-45ml/min/1.73m2的预后不同，因此将3期进一步分为3a和3b期。3a期是轻-中度，3b期是中-重度。1、2期为肾脏损伤早期阶段，3a期往后为肾脏损伤的中晚期阶段[2-3]。目前，估计GFR的金标准是菊粉清除率，但是操作复杂。放射性核素法也可较准确的估计GFR，但涉及排泄物污染的问题不宜用于常规检测。而慢性肾脏病的病程进展比较缓慢，早期损伤的临床症状比较隐匿。寻找具有高灵敏度及特异性的肾脏损伤标志物可实现对肾脏疾病的早期诊断并给予早期的临床干预和治疗，延缓病情进展，从而降低慢性肾脏病的病死率。这些生物学指标如尿液THP、NGAL，血清CysC、β2-MG和视黄醇结合蛋白等既可以诊断早期肾脏损伤又能够帮助慢性肾脏病的临床分期。T-H糖蛋白又名Tamm-Horsfall蛋白，因Tamm及Horsfall利用盐析法分离纯化到而得名。T-H是由远曲小管上皮细胞和肾髓袢厚壁段升支合成、分泌的一种糖蛋白，在尿中的含量极为丰富同时也是尿管型的重要组成成分[4]。肾脏疾病患者的T-H糖蛋白合成量减少，血和尿中T-H糖蛋白含量也相应减少而且与Urea及Scr的增高成正相关。在一些尿路梗阻、肾炎等疾病中可使T-H糖蛋白从梗阻或肾小管损伤导致的裂隙中漏出并沉积在肾间质中[5]，由此可见尿中T-H糖蛋白的减少能反映肾小管的损伤。目前，检测THP的方法大多为放射免疫法，具有一定的危险及污染性，我们用制备的THP单克隆抗体建立ELISA的检测方法，尿液中THP含量的多少与慢性肾脏病的病程进展息息相关。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)是一种与中性粒细胞明胶酶以共价键结合的脂质运载蛋白，在受损的肾小管中高表达，是反映急性肾损伤的有效指标[6]。本实验将探讨尿NGAL在慢性肾脏病不同时期的含量变化，并联合检测多种反应肾脏损伤的生物学指标，为慢性肾脏病的早期诊断提供临床依据。传统的肾功能指标血清尿素、肌酐在肾损伤早期升高不明显，且易受饮食、运动等多种因素影响[7]。但是血清7 大连医科大学硕士毕业论文胱抑素C(CystatinC,CysC)浓度不受患者炎症程度、是否患有肿瘤及患者年龄等因素的影响，灵敏度较高，是反应肾小球滤过功能的新型标志物[8-9]。β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)在循环血中不易与血浆蛋白形成复合物而且不受患者年龄、性别、肾功能状态的影响，是反应慢性肾脏病患者肾功能早期损伤的敏感特异的指标之一[10]。视黄醇结合蛋白(Retinol-bindingprotein,RBP)是肝细胞释放的低分子量蛋白，存在于人体的血清、尿液和其他体液中[11]。在肝细胞的高尔基体复合体表面先与视黄醇按1:1的比例行成视黄醇-视黄醇结合蛋白(retinol/RBP)复合物，再与前白蛋白形成三位复合物以防RBP通过肾小球滤过膜。只有复合物与靶细胞结合后，RBP才与前白蛋白分离通过肾小球滤过膜。滤过的RBP在近端小管重吸收并代谢分解，仅有极少量的RBP从尿中排出。当慢性肾脏病患者肾近端小管损伤时，尿RBP明显增多是反映近端小管损伤的敏感指标[12]。本文将检测慢性肾脏病患者的肾功能指标，尿液THP、NGAL、RBP、NAG、尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)、血清CysC、β2-MG和传统指标Scr及Urea。通过统计学分析各指标与eGFR及各分期的相关性，各指标在早期肾脏损伤中的诊断准确性及联合检测因子的敏感度及特异性。8 大连医科大学硕士毕业论文正文（二）实验材料与方法1.实验材料1.1主要试剂耗材，如表1所示。表1所用试剂耗材及生产厂家所用试剂耗材生产厂家RPMI1640培养基Gibco公司Cat.No31800105胎牛血清上海洛神20100205山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRPCWbio.Co.LtdCat.NoCW01022ml冻存管Corning公司酶标条CWbio.Co.Ltd辣根过氧化物酶(HRP)ThermoNGAL检测试剂盒宁波美康生物科技有限公司NAG检测试剂盒北京九强生物科技有限公司RBP检测试剂盒北京世纪沃德生物科技有限公司β2-MG测定试剂盒北京莱帮生物技术有限公司1.2主要仪器，如表2所示。表2所用主要仪器及生产厂家所用仪器生产厂家DEM-3型自动洗板机北京拓普分析仪器有限责任公司酶标仪BIO-RAD680HD-4层析工作站上海沪西仪器厂层析柱Phamacia蛋白电泳装置BioRadⅡ蛋白定量检测仪AmershamBiosciences生化分析仪全自动日立76001.3研究对象：选取2014年5月到2015年10月期间在北京空军总医院风湿肾病科住院的慢性肾脏病患者211例，其中男136例，女75例，平均年龄55.3818.76岁。均符合KDIGO分期的诊断标准。实验分组：根据KDIGO的分组标准将211例患者分为6组，如表3所示。收集49例健康体检的正常人作为对照组，其中9 大连医科大学硕士毕业论文男28例，女21例，平均年龄为48.579.17岁。表3慢性肾脏病的eGFR新分期标准分期eGFR[ml/(min·1.73m2)]描述1期≥90肾损伤；GFR正常或升高2期60～89肾损伤伴轻度GFR下降3a期45～59GFR轻中度下降3b期30～44GFR中重度下降4期15～29GFR重度下降5期<15肾功能衰竭2.实验方法前面的实验已经利用基因工程技术制备好了抗原，并以纯化的重组THP片段蛋白为免疫原免疫小鼠，待小鼠血液抗体效价达到要求后，取脾脏。采用常规方法，与骨髓瘤细胞融合，获得具有分泌THP抗体的杂交瘤细胞放入液氮中保存。将杂交瘤细胞复苏培养、制备腹水、腹水纯化、抗体效价鉴定、建立ELISA检测方法、检测临床标本，并分析检测结果。2.1细胞复苏培养2.1.1杂交瘤细胞复苏从液氮灌中取出装有细胞的安瓶立即放入42℃水浴在1min内快速溶解冻存杂交瘤细胞，无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液转入T-25培养瓶培养。2.1.2细胞的日常维护2.1.2.1细胞复苏后24h更换新鲜生长培养基；2.1.2.2待细胞密度增加至80%以上时，用无菌移液管重新悬浮细胞；2.1.2.3用离心机以1000rpm的速度离心5min；2.1.2.4用冻存液(50%生长培养基+40%FBS+10%DMSO)或生长培养基(90%培养基+10%胎牛血清(FBS))重悬细胞，进行冻存或传代细胞；2.2腹水的制备2.2.1取2只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蜡油作为提前免疫刺激，有利于腹水的形成和降低实体瘤的产生；2.2.2一周以后将杂交瘤细胞在无血清培养基中重新悬浮，每一只以提前免疫好的石蜡小鼠注射1×106个杂交瘤细胞每0.5ml；10 大连医科大学硕士毕业论文2.2.3注射完细胞一周左右会长腹水，一般第六天就需要观察，防止胀死，约7-14天后收集腹水，首次抽取应该轻柔，不能抽取过度；2.2.4包被：每孔加入100µl浓度为2µg/ml的抗原,在4℃中过夜，然后用洗液洗涤3次；2.2.5封闭：每孔加入封闭液150µl，在37℃温箱中孵育2小时，最后洗液洗涤3次后拍干；2.2.6加入待测样品：对于腹水效价的检测从第一个孔1:1000稀释，第二个空1:3000稀释，以此类推以1:3的梯度倍比稀释，在37℃温箱中孵育半个小时，最后反复洗液洗板4次后拍干；对于细胞上清的检测，在酶标板中加入细胞上清100µl每孔，在37℃温箱中孵育半个小时，洗板4次后拍干；2.2.7加二抗：每孔加入100µl以1:5000稀释后的辣根酶标记的羊抗鼠IgG,100µl在37℃温箱中孵育大约半个小时,反复洗涤4次后拍干；2.2.8显色：每孔加入从20×到1×的四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine,TMB)每100µl,在37℃温箱中显色15-30min后取出；2.2.9终止：在已经变为蓝色的板上每孔加入终止液(2MH2SO4）50ul，破坏HRP酶的活性，降低反应的PH值来阻止化学反应；2.2.10读数：用实验室的酶标仪在450nm单波长下进行测定各孔的光密度值(Opticaldensity,OD)，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。筛选阳性细胞时，P/N>2.1的判别为阳性细胞；1

2.1的仍判为阳性。2.3腹水纯化（采用ProteinG法纯化单抗）2.3.1预处理：买来的ProteinG先要泡在20%的乙醇中将保护剂去掉，把填料装进洗净的纯化柱，再用约10倍体积的PBS洗涤1-3次。2.3.2平衡：用BindingBuffer平衡proteinG亲和柱至基线平稳。2.3.3上腹水：从小鼠腹腔中采到的腹水含有油脂、体细胞和杂交瘤细胞，上注前需要先将腹水离心，离心后，油脂等杂质在上面，细胞在下面，取中间的清澈腹水加到装好的柱子里，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳；11 大连医科大学硕士毕业论文2.3.4洗涤和洗脱：将腹水从亲和柱内流出，再用10倍体积的PBS洗柱3次，最后加入ElutingBuffer洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE检测纯度洗脱液将抗体脱下；2.3.5抗体的保存：将纯化后的抗体保存在0.01M,pH7.2PBS环境中再加上0.5ml甘油；2.3.6抗体浓度和效价的检测：采用蛋白定量检测仪测定纯化后单克隆抗体的浓度及抗体效价，采用方法“2.2.4-2.2.10”的步骤进行检测；2.4抗体标记2.4.1透析抗体：将抗体碳酸盐缓冲液透析过夜；2.4.2辣根过氧化物酶（HRP）活化2.4.2.1将HRP溶解于蒸馏水中；2.4.2.2于上液中加入新配的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；2.4.2.3将上述溶液装入透析袋中，对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；2.4.3HRP标记2.4.3.1用碳酸盐缓冲液将以上活化后的HRP缓冲体系pH升高到9.0～9.5，然后立即加入透析好的抗体，在0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；2.4.3.2加入新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时；2.4.3.3将上述液装入透析袋中，对PH7.2PBS透析，4℃过夜；2.4.3.4分子筛分离标记产物，收集标记产物；2.5试剂盒制备（双抗体夹心法）2.5.1包被：5µg/ml3B9抗体浓度，100µl/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次；2.5.2封闭：含0.5%BSA的PBS，37度封闭2h，洗涤3次，拍干；2.5.3上样：100µl/孔。2.5.3.1标准品（抗原）浓度选择为250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.2ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、0ng/ml；2.5.3.2待测样品：对照组是50倍稀释，病例组5倍稀释。37度水浴反应1h；2.5.4加二抗（酶标抗体）：加入二抗4E4-HRP，1:6000,100ul/孔，37度水浴反12 大连医科大学硕士毕业论文应30min，洗涤4次，拍干；2.5.5显色：将四甲基联苯胺从20×稀释到1×，在反应板上每孔加入100µl，在37℃温箱中显色15-30min；2.5.6终止：每孔加入反应的终止液(2MH2SO4)50µl，阻止反应的进行，有利于实验结果的分析。2.5.7读数：用酶标仪在450nm单波长下测定各孔的OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。筛选阳性细胞时，P/N>2.1的判别为阳性细胞；1

2.1的仍判为阳性。2.6检测临床标本抽取受检者空腹静脉血凝固离心后取上清采用日立7600全自动生化分析仪检测空腹尿素(Urea)、血肌酐(Scr)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、LP(a)；采用免疫比浊法检测血清CysC、β2-MG、URBP和SRBP；计算尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)；以MDRD简化方程计算eGFR[ml/(min·1.73m2)]=186×血肌酐(µmol/L)-1.154×年龄-0.203×0.742(女性)[13]。用自制的ELISA试剂盒检测患者尿液THP含量。2.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学处理分析，数据Xs表示。多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD检验，利用Pearson作相关性分析，P<0.05具有统计学意义。先进行logistic回归，求出logistic回归方程再绘制受试者工作特征性曲线(Receiveroperatingcharacteristic,ROC),同时计算曲线下面积(Areaunderthecurve,AUC)、敏感度、特异性等统计学指标。（三）实验结果1.腹水效价检测结果对复苏的THP3B9和THP4E4细胞株，每株制备腹水小鼠各2只；10-14天后分别收集腹水，并以2µg/ml的包被浓度包被THP蛋白，对获得的腹水进行效价检测，检测结果见如表4所示。13 大连医科大学硕士毕业论文表4腹水效价检测结果克隆号稀释度1:10001:30001:90001:270001:810001:2400001:720000PBS3B9腹水4.0004.0003.6712.1060.7400.2340.1260.0594E4腹水4.0004.0003.4922.5650.8710.2760.1450.056腹水效价均高于1:720000，可进行纯化操作。2.纯化抗体效价检测结果对获得的3B9和4E4腹水应用ProteinG纯化方法纯化获得对应的单克隆抗体，并采用ELISA检测纯化抗体的效价，检测结果如表5所示。表5抗体效价检测结果克隆稀释度号1000ng/ml333ng/ml111ng/ml37ng/ml12.3ng/ml4.1ng/ml1.37ng/ml0ng/ml3B93.9934.0003.0081.9450.7390.2120.1080.0684E43.8423.9682.9581.8700.6630.2160.1140.0673B9和4E4抗体效价均为4.1ng/ml左右。3.标记抗体4E4-HRP效价检测结果将4E4抗体偶联HRP后，通过ELISA法检测4E4-HRP效价，检测结果如表6所示，抗体效价为1:720000。表64E4-HRP效价检测结果克隆号稀释度1:10001:30001:90001:270001:810001:2400001:720000PBS4E4-HRP4.0004.0003.5842.5501.1430.5360.2000.0684.自制ELISA试剂盒4.1自制ELISA试剂盒检测样本曲线,见图1。图1ELISA试剂盒检测样本的曲线图纵坐标为OD值（光密度），横坐标为样本浓度。在特定情况下样本的浓度与吸光度成正比。14 大连医科大学硕士毕业论文4.2标准品浓度及其对应的OD值如表7所示。表7标准品浓度及其OD值浓度(ng/ml)25012562.531.515.67.83.90OD值2.2872.1781.5190.8590.4980.2530.1920.132.2992.1231.4110.7690.5140.4260.2210.159平均值2.2932.15051.4650.8140.5060.33950.20650.14454.3检测临床标本，样本稀释5倍。（摘选病例组一部分标本THP的检测结果）见表8。表8样本的THP含量及其对应的CKD分期OD值尿THP含量(ng/mL)CKD分期尿NGAL含量(ng/mL)0.715149.275期1023.312.364640.512期109.781.613416.783b期578.432.594799.021期58.492.087557.993a期217.582.473672.982期154.781.397352.434期503.235.数据统计5.1.CKD不同分期中各生物学指标的变化对照组的年龄与性别比与病例组相比较没有统计学差异，具有可比性。各组间一般生化指标如TC、HDL、LDL、LP(a)之间的比较没有明显差异。肾功能指标比例组与对照组比较有明显差异，以血清CysC最为敏感，在1期即与对照组有差异，CKD各组间比较也有统计学意义。血UA在各分期比较中变化不明显，在CKD4期后才与对照组有差异。如表9所示，尿液RBP比血液RBP在CKD各分期间的变化明显，在3a期后与正常组比较差异明显，以后CKD各组间比较也有统计学差异。尿THP、NAG及尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)在2期后就与正常对照组有明显差异，CKD各组间比较也有统计学意义。尿NGAL、血Scr、Urea在3a期后与对照组出现差异。想了解各肾功能指标反映肾脏损伤的敏感度及特异性，需要绘制受试者工作特征曲线(Receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)。15 大连医科大学硕士毕业论文表9病例组各分期组与对照组生化指标比较，Xs分组尿NGAL尿NAG尿THP血CysC血β2-MG对照组19.1416.415.062.57869.6689.810.510.171.610.591期55.1846.198.965.61837.8957.120.750.25*2.260.67①①①2期91.6374.1715.4112.71*720.0170.91*1.150.32*3.641.02*①②①②①②①②3a期185.29174.49*26.7322.57*511.45129.74*1.670.58*5.432.30*3b期372.37309.44*①②3a30.9720.26*①②459.21164.40*①②2.050.63*①②3a6.712.08*①②4期385.92338.68*①②3a39.9327.29*①②3a404.47133.71*①②3a2.310.72*①②3a8.525.48*①②3a5期950.68836.00*①②3a3b④41.2027.43*①②3a3b224.73115.63*①②3a3b④3.450.38*①②3a3b④15.527.83*①②3a3b④分组UreaScrUA尿RBP血RBP对照组4.531.1864.912.69324.598.540.470.1935.019.321期4.991.8155.6012.98315.9187.510.520.4434.8815.63①2期6.772.14*82.2419.92363.90125.370.940.8340.5613.35①①①②①3a期8.411.94*102.0431.48*371.07116.522.261.77*45.2219.71*3b期11.644.48*①②3a138.5539.16*①②373.41107.024.942.03*①②3a50.8420.37*①4期16.908.08*①②3a3b225.0777.82*①②3a3b422.63154.71*①7.353.44*①②3a3b59.5429.35*①②3a5期23.676.98*①②3a3b④496.60130.10*①②3a3b④397.03175.63*①11.291.91*①②3a3b④95.7431.50*①②3a3b④分组UACR年龄TCHDLLDLLP(a)对照组14.3412.7948.579.174.630.821.320.282.810.60145.49110.921期45.7323.6947.9316.934.912.151.260.423.021.74174.29150.04①2期193.92186.61*55.9219.074.531.371.260.352.691.11181.18143.23①3a期216.88221.31*59.0719.864.151.611.230.782.581.79250.07189.43①②3a3b期427.92271.48*62.6415.814.661.751.230.562.570.76183.77136.36①②3a3b4期550.27365.93*56.5920.864.331.741.110.382.310.84178.30125.52①②3a3b④①②5期1198.50211.47*58.4017.484.531.581.160.322.721.01258.40203.00*①②注：与对照组比较*P<0.05，与1期组比较P<0.05，与2期组比较P<0.05，与3a期组比较3a3b④P<0.05,与3b期组比较P<0.05，与4期组比较P<0.05。5.2相关性分析除尿THP水平与Scr呈负相关外(相关系数R=-0.71)，其他指标均与Scr呈正相关，其中以尿RBP、尿UACR、血β2-MG的相关程度较大。尿RBP与Urea呈正相关，相关程度最高R=0.79。尿THP与eGFR呈正相关，相关程度最大16 大连医科大学硕士毕业论文R=0.79，其他指标与eGFR呈负相关。众所周知，Scr、Urea及eGFR是反映肾脏功能的指标，eGFR是CKD分期的重要标准，以上相关系数说明新型肾功能指标在一定程度上能够较好的反应肾脏损伤程度，有助于CKD的分期判断。见表10。表10新型肾功能指标与Scr、Urea及eGFR的相关性，R值相关指标ScrUreaeGFR尿NGAL0.560.43-0.46尿THP-0.71-0.670.79尿NAG0.350.40-0.50尿RBP0.830.79-0.71尿UACR0.850.75-0.65血CysC0.770.76-0.73血β2-MG0.830.68-0.60血RBP0.750.60-0.51注:均在0.01水平上显著相关5.3.以CKD早期(1、2期)为分界点绘制ROC曲线，见图2、图3、图4、表11。各肾功能指标对CKD早期诊断的敏感度及特异性的排序为：血清CysC>尿UACR>尿NGAL>血清β2-MG>尿THP>尿NAG>尿RBP>血清Urea。其中以血清CysC对CKD早期病变的诊断准确性最高，其下面积为0.944。在尿液指标中UACR的其下面积较大，但UACR是尿微量白蛋白/肌酐比值，受多种因素的影响。尿NGAL的准确性也较高，其下面积为0.91。如表4显示，肌酐和血清RBP在诊断早期CKD中没有统计学意义，Urea有明显差异但其敏感度及特异性较低，不利于早期CKD的诊断。用尿NGAL和尿THP作联合预测因子检测早期CKD的准确性更高，其下面积为0.953，大于敏感度和特异性最高的血清CysC。17 大连医科大学硕士毕业论文图2CKD早期各尿液指标的ROC曲线图3CKD早期各血液指标的ROC曲线图4联合预测因子(尿NGAL+尿THP)与血清CysC的比较18 大连医科大学硕士毕业论文表11诊断CKD早期肾损伤生化指标及联合预测因子的敏感度及特异性比较检测指标面积P值95%置信区间尿NGAL0.9100.0000.855-0.965尿NAG0.8150.0000.727-0.904尿THP0.8770.0000.808-0.946尿RBP0.6850.0020.580-0.791尿UACR0.9420.0000.895-0.988血CysC0.9440.0000.895-0.994血β2-MG0.9010.0000.842-0.960Urea0.7630.0480.669-0.858Scr0.6730.0560.564-0.783血RBP0.5910.0580.477-0.705联合预测因子0.9530.0000.911-0.9965.4.尿NGAL和尿THP两项指标联合检测诊断慢性肾脏病cut-off值分析依据联合检测因子诊断早期慢性肾脏病的ROC曲线进行统计学分析，各点cut-off值如表12所示。结果显示随着cut-off值得逐渐升高，敏感度逐渐降低，特异性逐渐增高。以Youden指数最高(0.857)对应的0.358作为临界值，对早期慢性肾脏病的诊断综合能力最强，敏感度为95.9%，特异性为89.8%。见表5。表12联合检测因子不同cut-off值诊断早期慢性肾脏病的统计分析Cut-off值敏感度(%)特异性(%)Youden指数0.04310038.80.3880.06998.051.00.4900.09795.959.20.3670.21195.981.60.7750.35895.989.80.8570.52291.889.80.8160.66683.791.80.7550.74177.698.00.7560.99826.51000.26519 大连医科大学硕士毕业论文讨论THP在泌尿系统病变如：尿路结石、肾小球肾炎、尿路感染炎和肾脏衰竭的病理进展中发挥非常重要的作用。现代精准医学与基因工程学的迅速发展，使人们对THP的研究更加推进了一步，从分子基因水平上研究THP的生物学功能。现已有研究结果显示THP储积病是由于其16号染色体上某些区域发生突变导致的，THP储积可引起一系列的肾脏病变如家族性高尿酸血症、肾性囊肿等[14]；某研究发现，慢性肾脏病的发生发展与THP基因的单核苷酸的多态性密切相关[15]。此外，THP的免疫反应包括B细胞介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫在肾脏疾病中病程进展中起到非常重要的作用[16]。本实验将在液氮中冻存的杂交瘤细胞复苏培养后打入石蜡小鼠的腹腔制备腹水，腹水的效价较高，经过腹水后续的纯化得到效价较高的THP单克隆抗体，分泌抗体的能力较强，说明抗体具有很好地稳定性。我们用得到的THP蛋白单克隆抗体与标准THP抗原进行ELISA方法检测得到很好的结果，表明制备的单克隆抗体能准确识别标准THP蛋白，具有很好的特异性，并用于检测临床慢性肾脏患者的尿液THP含量，随着肾小球滤过率的降低而不断降低，从CKD2期开始就与正常对照组和CKD1期有明显差异，在CKD早期的诊断中具有较高的敏感度和特异性。相关性分析表明尿液THP与eGFR的相关程度较高，而且呈正相关，通过尿液THP的含量及变化可以判断CKD患者的不同分期及病情进展。文章中检测了慢性肾脏病患者的新型肾功能指标与传统的Scr、Urea等，并通过eGFR对CKD患者进行分期。ROC曲线下的面积显示：血清CysC在CKD早期诊断的准确性最高，这一结果同AkbariA研究结论一致[17]。血清CysC是低分子量的非糖基化碱性蛋白质，通过肾小球滤过膜后在肾近曲小管全部重吸收并完全代谢分解。不易和其他蛋白质形成复合物，肾小管也不分泌CysC，血循环中的CysC只能通过肾脏来清除[18]。是反映CKD早期肾小球滤过率的敏感血清指标。血清标本我们还检测了患者的β2-MG、RBP、Scr、Urea和一些基本的生化指标。血清HDL、UA、LDL等水平在CKD不同分期中的变化没有明显差异，可能与受患者的饮食、肾脏病的不同类型有关，在CKD中的肾病综合症中，患者的血脂变化是有临床意义的。实验结果显示，Scr、Urea在诊断CKD早期病变中敏感度及特异性较差。这与BradyHR[19]的研究结果一致。血清RBP从CKD3a20 大连医科大学硕士毕业论文期起与对照组出现明显差异，但在绘制的ROC曲线中显示对于诊断早期CKD没有统计学意义。RBP主要在肝脏中合成，是反映机体营养状态的一个灵敏指标，在肝病、肝硬化急慢性肝炎中RBP的水平出现变化。血清β2-MG因电泳在β2区带而得名，是人体所有有核细胞尤其是淋巴细胞和肿瘤细胞产生的低分子量球蛋白[20]。统计结果显示，血清β2-MG从CKD2期起就与对照组及CKD1期患者出现统计学差异，以后各期间比较也有明显差异，是反映CKD早期肾小球损伤的良好指标。尿液标本通常用于检测CKD患者肾小管功能的变化，本实验中检测的CKD患者的尿NGAL、NAG、UACR、THP、RBP。结果显示，尿液UACR从CKD2期即与对照组和CKD1期有明显差异，在诊断敏感度及特异性上也较高，但是，UACR是尿微量白蛋白/肌酐比值，易受患者饮食、用药等多种因素的影响。尿液NGAL是低分子量的脂质运载蛋白，与中性粒细胞明胶酶以共价键结合[21]。NGAL在受损的肾小管中高表达，当肾损伤时尿NGAL水平显著升高，这时浸润在肾小管间质的中性粒细胞发生凋亡以减轻炎细胞的侵害。NGAL还能诱导肾间质细胞向肾小管上皮细胞的转化并促进肾小管上皮细胞的修复和再生[22]。尿NGAL有抗蛋白酶的水解的能力，易在尿中检出。实验结果显示，尿液NGAL从3a期与对照组出现明显差异，在ROC曲线下的面积为0.91，是反映CKD早期肾小管病变的良好尿液指标。联合尿液NGAL、THP，作为联合预测因子以0.358位临界值诊断CKD早期肾小管病变的敏感度为91.8%，特异性为89.8%。诊断慢性肾脏病肾小管损伤的临床价值较高，可为临床上的诊断、用药、预后判断提供数据资料。尿NAG是存在于近端小管的高分子量溶酶体酶，不能自由通过肾小球滤过膜。尿液中的NAG主要来自肾近端小管上皮细胞，NAG在尿液中不受其他因素影响浓度比较稳定，能够反映肾小管实质细胞的受损情况。有研究在几百例受试者的尿液指标中比较NAG、mAlb、α1-MG、β2-MG的水平发现NAG和β2-MG在反应早期肾损伤上较其他指标更为敏感，在观察治疗效果和判断预后情况上也有重要的临床意义[23]。本实验的结果表明，尿NAG从CKD2期起与对照组出现差异，在ROC曲线下的面积为0.815，与上述结论一致，是反映CKD早期肾小管损伤的敏感特异指标。尿液RBP比血液RBP更能反映CKD患者的病情变化，21 大连医科大学硕士毕业论文虽然达不到NGAL、THP等指标的敏感度及特异性，但在CKD肾小管损伤的诊断中也有一定的临床价值，如果尿液指标一起联合检测可更好地反映早期CKD的肾小管损伤。结论两株杂交瘤细胞经过复苏培养后得到的抗体效价较高，经ProteinG方法纯化后的稳定性较好。我们以3B9抗体包被酶联反应板，以4E4-HRP作为二抗建立ELISA双抗体夹心法检测标准品得到的THP标准曲线效果可证明自制的ELISA试剂盒可用于检测临床标本，稳定性较好。血清CysC、β2-MG在慢性肾脏病早期肾小球损伤的诊断中的准确性较好，敏感度及特异性较高。血清CysC和β2-MG等指标的变化可帮助临床上慢性肾脏病的分期及观察患者病情进展。尿液NGAL、THP和NAG在慢性肾脏病早期肾小管损伤的诊断中具有较高的敏感度及特异性，为临床上诊断早期CKD提供可靠的实验室数据。22 大连医科大学硕士毕业论文参考文献[1]葛均波，徐永健.内科学.8版,北京:人民卫生出版社,2013:1815.[2]KidneyDisease;ImprovingGlobalOutcomes.(KDIGO)CKDworkgroup,KDIGOclinicalpracticeguidelinefortheevaluationandmanagementofchronickidneydisease[J].KidneyIntSuppl,2013,13(3):147-150.[3]StevensPE,LevinA.Evaluationandmanagementofchronickidneydisease:synopsisoftheKidneyDisease:ImprovingGlobalOutcomes202ClinicalPracticeGuideline[J].AnnInternMed,2013,158(11):825-830.[4]ParsonsCL,SteinP,ZupkasP,etal.DefectiveTamm-Horsfallproteininpatientswithinterstitialcystitis[J].Urol,2007,178(6):2665-2670.[5]KarlL.Uromodulinandchronickidneydisease[J].KidneyBloodpressRes,2010,33(11):393-398.[6]SombatTreeprasertsuk,AmornpunWongkarnjana,etal.UrineNeutrophilGglatinase-AssociatedLipocalin(UNGAL)level:AValidDiagnosticandPrognosticMarkerforAcuteKidneyInjuryinCirrhoticPatients[J].Gastroenterology,2015,148(4):988-988.[7]许苏琴，张萍.胱抑素C、β2-微球蛋白及尿微量清蛋白在早期肾损害诊断中的应用价值分析.中国现代医生，2014,52(23):158-160.[8]高文.慢性非糖尿病肾病患者血清胱抑素C的检测及临床分析[J].北京医学,2014,36(9):760-761.[9]胡志斌.血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在早期肾损害诊断中的应用[J].临床血液学杂志:输血与检验版,2011,24(5):602-604.[10]JovanovicD,Kpstivojevicp,ObradovicI,etal.SerumcystatinCandβ2-microglobulinasmarkersofglonerularfiltrationrate[J].RenalFailure,2003,25(1):123-133.[11]何萍,何艳佩,陈艳华等.血视黄醇结合蛋白测定在2型糖尿病肾病中的临床意义[J].检验医学,2009,24(6):461-462.[12]NaylorHM,NewcomerME.Thestructureofhumanretinol-bindingprotein(RBP)withitscarrierproteintransthyretinrevealsaninteractionwiththecarboxyterminusofRBP[J].Biochemistry,1999,38(9):2647-2653.23 大连医科大学硕士毕业论文[13]徐风芹,杨友琴,刘津.血清胱抑素C的检测研究及临床应用进展.医学综述,2013,19(16),2907-2910.[14]HartTC,GorryMC,HartPS,WoodardAS,ShihabiZ,SandhuJ,ShirtsB,XuL,ZhuH,BarmadaMM,BleyerAJ:MutationsoftheUMODgeneareresponsibleformedullarycystickidneydisease2andfamilialjuvenilehyperuricaemicnephropathy[J].MedGenet，2002,39(12):882-892.[15]ScolariF,CaridiG,RampoldiL,TardanicoR,IzziC,PirulliD,AmorosoA,CasariG,GhiggeriGM:Uromodulinstoragediseases:clinicalaspectsandmechanisms[J].AmJKidneyDis2004,44(6):987-999.[16]ChambersR,GroufskyA,HuntJS,LynnKL,McGivenAR:RelationshipofabnormalTamm-Horsfallglycoproteinlocalizationtorenalmorphologyandfunction[J].ClinNephrol，1986,26(1):21–26.[17]AkbariA,LepageN,KeelyE,etal.CystatinCandbetatraceproteinasmarkersofrenalfunctioninpregnancy[J].BJOG,2005,112(5):575-578.[18]RuleAD,BerqstralhEJ,SlezakJM,etal.GlomerularfiltrationrateestimatedbycystatinCamongdifferentclinicalpresentations[J].KidneyInt,2006,69(2):399-405.[19]BradyHR,ClarksonMR,LieberthalW,etal.AcuteRenalFailure.InBrennerBM.TheKidney[M].7thed.Philadelphia:Saunders,2004:1215-1292.[20]王鸿利主编.实验诊断学[M].人民卫生出版社,2005.[21]MalyszkoJ.Biomarkersofacutekidneyinjuryindifferentclinicalsettings:atimetochangetheparadigm[J].kidneyBloodPressRes,2010,33:368-382.[22]SombatTreeprasertsuk,AmornpunWongkarnjana,etal.UrineNeutrophilGglatinase-AssociatedLipocalin(UNGAL)level:AValidDiagnosticandPrognosticMarkerforAcuteKidneyInjuryinCirrhoticPatients[J].Gastroenterology,2015,148(4):988-988.[23]赵红娟,刘红德.尿mALB、NAG、β2-MG检测对肾脏疾病的临床意义[J].西部医学,2011,23:234-235.24 大连医科大学硕士毕业论文文献综述肾脏疾病与损伤标志物[摘要]：肾脏疾病的临床表现比较隐匿，目前有较多的生物学指标可用于诊断肾脏损伤，并能对其疾病进程进行监控。寻找具有高灵敏度及特异度的肾脏损伤标志物可实现对肾脏疾病的早期诊断，降低肾脏损伤的病死率。本文就目前现有的肾脏损伤传统及新型的生物学标志物综述，并分析其优缺点，为临床肾脏疾病的早期诊断提供借鉴依据。[关键词]：肾脏疾病早期诊断生物学标志物Kidneydiseaseandinjurybio-markers[Abstract]：Owingtotheclinicalmanifestationofkidneydiseaseisnotobvious,therearemanybio-markerscouldbeusedtodiagnosekidneyinjuryaswellasmonitortheirdiseaseprogression.Markerswithhighsensitivityandspecificitycouldearlydiagnosekidneydiseaseandreducetheirmortality.Thearticlemainlydescribesthetraditionalandnovelbio-markersaswellasanalyzestheiradvantagesanddisadvantages,providingareferencebasisforearlydiagnosisofkidneyinjury.[Keywords]:kidneydiseaseearlydiagnosisbio-markers1.前言肾脏疾病是世界范围内的公共健康问题，发病原因较多，有免疫复合物沉积在肾小球引起的肾小球肾炎和细菌逆行感染导致的肾盂肾炎，此外高血压、糖尿病以及系统性红斑狼疮等也常引起继发性肾脏病变，并且糖尿病、高血压、慢性肾脏病的发病率会随着年龄的增加而逐渐增高。我国的老龄化人口正逐渐增多，早期发现并监测肾脏疾病的进展对降低终末期肾衰竭病人的数量及肾脏损伤的病死率具有重要意义。按损伤部位可将肾脏损伤分为肾小管损伤和肾小球损伤，目前可通过尿中各种小分子蛋白和酶类管型判断肾小管损伤，血中小分子蛋白滤过率的减少和大分子蛋白滤过率的增加反映肾小球损伤。2.肾小球损伤标志物肾小球病分为原发性、继发性和遗传性的，病变部位主要累及双肾肾小球，具有相似的临床表现但其发病原因、病理改变和预后各有不同。原发性肾小球病25 大连医科大学硕士毕业论文大多是特发的（即病因不明），继发性肾小球病是由系统性红斑狼疮、糖尿病等全身性疾病导致的肾小球损害，遗传性肾小球病是基因变异引起的肾小球病(如Alport综合征又称眼-耳-肾综合征等)[1]。反映肾小球损伤的标志物有传统型的也有最近年来进行了大量的临床试验验证的新型标志物。2.1传统肾小球损伤标志物：2.1.1血清肌酐(Creatinine,Cr)和血清尿素(serumurea,Urea):Cr和Urea分别是体内肌肉肌酸和蛋白质的低分子量代谢产物，可通过肾小球滤过膜并且在近端小管重吸收很少，因此，肾小球率过滤的高低可决定血中Cr和Urea的浓度[2]。通过血中两者的浓度变化可判断肾实质受损情况，但灵敏度较低，当Cr和Urea浓度开始升高时肾小球率过滤已经下降到正常的50%[3]。2.1.2尿微量白蛋白(microalbumin,mAlb)和尿转铁蛋白(transferring,Tf)：由于mAlb（66.46KD）和Tf（77KD）都是高分子量蛋白，绝大部分不能通过肾小球滤过膜，正常人尿液中只有极少量的Tf和mAlb。糖尿病病人的长期高血糖可引起肾脏微血管的病变，肾小球滤过膜的选择性屏障受损，基底膜内外疏松层的硫酸肝素糖蛋白含量降低导致负电荷电位明显减少，带负电荷的mAlb和Tf排出过量[4]。从开始出现尿mAlb到最终转变成终末期肾衰竭大概需要10-20年的病情进展，因此尿mAlb可作为反映肾脏早期损伤的一个重要标志物[5]。尿Tf也是肾小球早期损伤的指标之一，主要反映肾小球滤过膜电荷选择屏障的损伤。2.1.3α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG)：α1-MG在血液中以游离和结合两种形式存在，游离型α1-MG可以通过肾小球滤过膜，滤过的α1-MG中有95%—99%在肾近曲小管重吸收和代谢；结合型的α1-MG不能通过肾小球滤过膜，所以正常人的尿液中只有少量的α1-MG。肾小球滤过功能受损时，滤过的α1-MG过多超过肾小管的重吸收能力，尿液中的α1-MG升高，因此可通过尿中α1-MG浓度的变化评价肾功能的损伤[6]。2.2新型肾小球损伤标志物血胱抑素C(cystatinC,CysC)：CysC是低分子量(13KD)非糖基化碱性蛋白质，通过肾小球滤过膜后在肾近曲小管全部重吸收并完全代谢分解。此外，CysC不易和其他蛋白质形成复合物，肾小管也不分泌CysC，血循环中的CysC只能通过肾脏来清除[7]。血清中CysC的浓度既不受机体感染、炎症程度、肿瘤大小和部26 大连医科大学硕士毕业论文位的影响也患者不受年龄的大小、饮食的变化、性别、体表面积等因素的影响。CysC的灵敏度较高，不仅能够很好的反应肾小球滤过功能的改变[8-10]，对于判断肾功能进行性恶化的程度也有重要的临床意义[11-12]。在糖尿病、高血压、儿童过敏性紫癜等引起的继发性肾脏疾病的早期检测中CysC具有较高的临床价值，目前已被各临床实验室广泛应用[13]。3.肾小管损伤相关标志物肾小管疾病是指肾小管功能发生障碍，临床上表现为肾浓缩功能减低如多尿、低渗尿；肾脏排酸保碱功能障碍，表现为高氯性代谢性酸中毒；肾小管重吸收功能受损，表现为低钾、钠、钙和镁。与此同时，反映肾小管损害的生物学分子也会随着其损害程度及部位发生相应的变化。3.1传统肾小管损伤标志物3.1.1β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)：β2-MG因电泳在β2区带而得名，是人体所有有核细胞尤其是淋巴细胞和肿瘤细胞产生的低分子量(1.18KD)球蛋白[14]。健康人体每天生成β2-MG的速率比较稳定昼夜变化较小，大约150-200mg/d。血循环中的β2-MG不易与血浆蛋白形成复合物而且不受患者年龄、性别、肾功能状态的影响。因此，血β[15]2-MG浓度的变化能够很好的反应肾小球滤过功能。GRF及肾血流量降低时，血β2-MG的升高较Cr浓度升高更早更显著。肾小管是处理β2-MG的唯一场所，通过肾小球率过的β2-MG几乎全部在肾近端肾小管重吸收。尿β2-MG浓度的升高与肾小管的损伤程度有密切关系。在肾小球滤过率降低或某种情况使有核细胞产生β2-MG过高且超过肾小管重吸收的阈值(5mg/L)时，尿β2-MG会出现非肾小管重吸收功能损伤的升高。因此要结合血β2-MG的浓度及临床诊断来分析尿β2-MG的变化。3.1.2尿N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG)：NAG是存在于近端小管的高分子量溶酶体酶，不能自由通过肾小球滤过膜。尿液中的NAG主要来自肾近端小管上皮细胞，NAG在尿液中不受其他因素影响浓度比较稳定，能够反映肾小管实质细胞的受损情况。有研究在几百例受试者的尿液指标中比较NAG、mAlb、α1-MG、β2-MG的水平发现NAG和β2-MG在反应早期肾损伤上较其他指标更为敏感，在观察治疗效果和判断预后情况上也有重要的临床意义[16]。27 大连医科大学硕士毕业论文3.2新型肾小管损伤标志物3.2.1肝型脂肪酸结合蛋白(liverfattyacid-bindingprotein,L-FABP)：L-FABP是一种低分子量（14KD-15KD）的游离脂肪酸携带蛋白，存在于肝细胞内并且在肾近端小管中高表达[17]。目前尿中的生物学标志物如尿蛋白是在细胞结构损伤出现后才升高而L-FABP及分泌的尿L-FABP可在细胞结构受损出现之前就开始升高，有研究显示尿L-FABP在预测危重患者急性肾损伤比UNGAL及KIM-1更为敏感[18]，因此尿L-FABP能够反应肾脏疾病未来发展的进程[19]。3.2.2视黄醇结合蛋白(retinol-bindingprotein,RBP)：RBP是肝细胞释放的低分子量蛋白，在肝细胞的高尔基体复合体表面先与视黄醇按1:1的比例行成视黄醇-视黄醇结合蛋白（retinol/RBP）复合物，再与前白蛋白形成三位复合物以防RBP通过肾小球滤过膜。只有复合物与靶细胞结合后，RBP才与前白蛋白分离通过肾小球滤过膜。滤过的RBP在近端小管重吸收并代谢分解，仅有极少量的RBP从尿中排出。肾近端小管受损时，尿RBP明显增多是反映近端小管损伤的敏感指标[20]。3.2.3中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)NGAL是低分子量(2.5KD)的脂质运载蛋白，与中性粒细胞明胶酶以共价键结合[21]。NGAL在受损的肾小管中高表达，当急性肾损伤时尿NGAL水平显著升高，这时浸润在肾小管间质的中性粒细胞发生凋亡以减轻炎细胞的侵害。NGAL还能诱导肾间质细胞向肾小管上皮细胞的转化并促进肾小管上皮细胞的修复和再生[22]。尿NGAL有抗蛋白酶的水解的能力，易在尿中检出。有研究显示，在急性肾损伤患者中尿NGAL水平明显高于对照组，其敏感度及特异度分别是77.1%和73.3%，是反映急性肾损伤的有效指标[23]。3.2.4T-H糖蛋白(Tamm-Horsfallglycoprotein,THP)：T-H糖蛋白又名Tamm-Horsfall蛋白，因Tamm及Horsfall利用盐析法分离纯化到而得名。T-H是由远曲小管上皮细胞和肾髓袢厚壁段升支合成、分泌的一种糖蛋白，在尿中的含量较为丰富也是尿管型的重要成分[24]。肾脏疾病患者的T-H糖蛋白合成量减少，血和尿中T-H糖蛋白含量也相应减少而且与Urea及Cr的增高成正相关。在一些尿路梗阻、肾炎等疾病可使T-H糖蛋白从梗阻或肾小管损伤导致的裂隙中漏出并沉积在肾间质中[25]，由此可见尿中T-H糖蛋白的减少能反映肾小管的损伤。28 大连医科大学硕士毕业论文3.2.5肾损伤分子-1(Kidneyinjurymolecule-1,Kim-1)：Kim-1是一种主要表达于损伤的近端小管上皮细胞的新型跨膜蛋白。在缺血-再灌注的动物模型的实验中发现，双侧肾缺血10min再灌注24h尿中Kim-1水平比基础水平增长了10倍，而且Kim-1的表达会随着时间的延长持续增高，45min组可高达基础水平的50倍左右[26]。肌酐、尿素、尿蛋白水平在缺血30、45min组才会出现明显增高，可见Kim-1对于早期肾损伤的敏感性高于肌酐、尿素、微量蛋白尿等传统生物学指标，有用于早期诊断急性肾损伤[26]。Han等教授[26]在实验中发现Kim-1在尿中以可溶性片段的形式存而且在肾缺血12h后即可检测到，由此可见尿Kim-1能够较早的监测肾近端小管的损伤。3.2.6白细胞介素-18(interleukin-18,IL-8)：IL-18是一种炎性细胞因子高表达于健康人的肾近端小管，国外有研究者的实验显示尿IL-18在急性肾小管坏死的诊断中具有较高的敏感度和特异度[27]。此外，在急性呼吸窘迫综合症(acuterespiratorydistresssyndrom,ARDS)并发急性肾损伤的患者中研究表明，尿IL-18能够有效的预测机械通气时的死亡率[28]。由于IL-18是炎性细胞因子在促炎症反应性和在炎性疾病起到增量调节作用，其测量结果受到很多其他因素的影响可干扰其敏感度和特异度。4.结语传统型的肾损伤标志物不能在早期诊断肾脏损伤，无法满足临床诊断和治疗需求。文中描述的新型标志物均已证明在肾损伤中的变化都早于血Cr和Urea的升高，且具有较高敏感度和特异度。每种指标都有优缺点，全面认识和了解各种标志物的特点应用联合指标监测早期肾损伤是一种趋势。例如，CysC联合β2-MG在糖尿病肾病中早期诊断，将糖尿病患者分为尿蛋白阴性组和尿微量白蛋白组，结果显示在尿蛋白阴性组CysC阳性率为31%，β2-MG阳性率为42%，具有较高的敏感性。两性指标联合在尿蛋白阴性组中的阳性率提高到62%，其敏感度更高[29]。此外，每种器官都有其特异的基因序列及调控程序，积极寻找高器官特异性分子是最终目的。29 大连医科大学硕士毕业论文参考文献[1]陆再英,钟南山主编.内科学[M].第七版.人民卫生出版社,2008.[2]PalevskyPM.AcuteRentalFailure[J].NephSAP.2004,3:245-247.[3]BradyHR,ClarksonMR,LieberthalW,etal.AcuteRenalFailure.InBrennerBM.TheKidney[M].7thed.Philadelphia:Saunders,2004:1215-1292.[4]蒋云峰.尿微量清蛋白检验在糖尿病肾病早期诊断中的意义[J].医学检验,2011,18(25):66-67.[5]陈燕,赵敏.尿微量蛋白检查对糖尿病早期肾损伤的诊断价值[J].中华医学检验杂志,2003,26(9):562-564.[6]黄琼莲.尿α1-MG检测对肾损伤早期诊断的应用价值[J].临床误诊误治,2014,27(7):87.[7]RuleAD,BerqstralhEJ,SlezakJM,etal.GlomerularfiltrationrateestimatedbycystatinCamongdifferentclinicalpresentations[J].KidneyInt,2006,69(2):399-405.[8]高文.慢性非糖尿病肾病患者血清胱抑素C的检测及临床分析[J].北京医学,2014,36(9):760-761.[9]胡志斌.血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在早期肾损害诊断中的应用[J].临床血液学杂志:输血与检验版,2011,24(5):602-604.[10]杨芳.胱抑素C在糖尿病肾病早期诊断中的作用[J].医学信息：下旬刊,2009,1(12):232-232.[11]刘丽琴,王捷.胱抑素C与早期肾功能损害的关系[J].广东医学,2010,31(24):3256-325.[12]刘硕,徐东强.胱抑素C、尿素、肌酐在肾脏疾病检测和诊断中的应用研究[J].临床合理用药杂志,2010,3(24):11-12.[13]郭茂盛.紫癜性肾炎患儿血清胱抑素C水平分析[J].检验医学与临床,2013,10（17）:2236-2239.[14]王鸿利主编.实验诊断学[M].人民卫生出版社,2005.[15]JovanovicD,Kpstivojevicp,ObradovicI,etal.SerumcystatinCandβ2-microglobulinasmarkersofglonerularfiltrationrate[J].RenalFailure,2003,25(1):123-133.30 大连医科大学硕士毕业论文[16]赵红娟,刘红德.尿mALB、NAG、β2-MG检测对肾脏疾病的临床意义[J].西部医学,2011,23:234-235.[17]SchroederF,JollyCA,ChoTH,etal.Fattyacidbindingproteinisoforms:structureandfunction[J].ChenPhysLipids,1998,92(1):1-25.[18]SharidanK,Parr,AmandaJ,etal.UrinaryL-FABPpredictspooroutcomesincriticallyillpatientswithearlyacutekidneyinjury[J].KidneyInternational,2014,87(2015):640-648.[19]左楠,王力宁.肝脂肪酸结合蛋白：一个新型肾脏疾病标志物[J].中国中西医结合肾病杂志，2012,13（7）:646-648.[20]NaylorHM,NewcomerME.Thestructureofhumanretinol-bindingprotein(RBP)withitscarrierproteintransthyretinrevealsaninteractionwiththecarboxyterminusofRBP[J].Biochemistry,1999,38(9):2647-2653.[21]MalyszkoJ.Biomarkersofacutekidneyinjuryindifferentclinicalsettings:atimetochangetheparadigm[J].kidneyBloodPressRes,2010,33:368-382.[22]SombatTreeprasertsuk,AmornpunWongkarnjana,etal.UrineNeutrophilGglatinase-AssociatedLipocalin(UNGAL)level:AValidDiagnosticandPrognosticMarkerforAcuteKidneyInjuryinCirrhoticPatients[J].Gastroenterology,2015,148(4):988-988.[23]曹长春,万辛,肖丽龙,等.心脏术后尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和白介素18与急性肾损伤的关系[J].中华肾脏病杂志,2008,24(7):471-475.[24]ParsonsCL,SteinP,ZupkasP,etal.DefectiveTamm-Horsfallproteininpatientswithinterstitialcystitis[J].JUrol,2007,178(6):2665-2670.[25]KarlL.Uromodulinandchronickidneydisease[J].KidneyBloodpressRes,2010,33(11):393-398.[26]HanWK,BailyV,AbichandaniR,etal.Kidneyinjurymolecule-1(Kim-1):anovelbiomarkerforhumanrenalproximaltubuleinjury[J].KidneyInt,2002,62:237-244.[27]ParikhCR,JaniA,MelnikovVY,etal.Urinaryinterleukin-18isamarkerofhumanacutetubularnecrosis[J].AmJKidneyDis,2004,43:405-414.31 大连医科大学硕士毕业论文[28]ParikhCR,AbrahamE,AncukiewiczM,etal.UrineIL-18isanearlydiagnosticmarkerforacutekidneyinjuryandpredictsmortalityintheintensivecareunit[J].JAmSocNephrol,2005,16:3046-3052.[29]王艳春,张俊峰,魏殿军.胱抑素C和β2-微球蛋白对糖尿病肾病早期诊断的价值及相关性[J].广东医学,2014,35(17):2715-2717.32 大连医科大学硕士毕业论文攻读学位期间发表论文情况1.孙立美,马红雨,董磊,朱美财.肾脏疾病与损伤标志物.空军医学杂志.已发表.2.孙立美,马红雨,朱美财,董磊,刘成刚.2型糖尿病肾病患者血清25-OH-VD水平与相关因素分析.标记免疫分析与临床.已发表.3.孙立美,马红雨,朱美财,董磊,全首祯.血清胱抑素C、β2-MG和尿NGAL联合检测对糖尿病肾病早期诊断价值.武警医学.已接收待发表.33 大连医科大学硕士毕业论文致谢时光荏苒，三年的研究生生涯一晃而过。在这短暂而又意义非凡的三年中我不但学习到了很多专业知识，还结识了良师益友，留下了许多难忘美好的回忆。三年的求学生涯就要结束了，真的特别感谢我的母校大连医科大学给我深造的机会，感谢咱们学校如画般的风景还有那浩瀚的书海，虽然只有短短的半年时间，我在图书馆的书海中找到了精神寄托。让我的生活过的充实且丰富。感谢我的导师朱美财教授，带教老师马红雨教授、董磊老师。在空军总医院实习的两年多时间里我感觉到了家的温暖，妈妈般的关怀。感谢三位老师在学习，临床工作中的谆谆教诲。三位老师正直的人格，积极向上的工作作风是我们一生学习的榜样。同时我要感谢我的同门晏雪婷、宋永在课题讨论、数据收集工作中给予的帮助。在生活各个方面给予的关心与照顾。感谢科室的每一个老师，谢谢老师们三年来在工作中给予的教导与帮助。同时我要感谢感谢我的父母和家人，谢谢你们多年的支持，你们是我人生坚强的后盾，是我一生前进的动力。最后，再次衷心的感谢三年来在学习工作中帮助过我的每一位同学老师，谢谢你们！34 ．－、？、、■？？＇．－？？－，＇＇？Ｌ，，〇＜＞、。Ｖ－、：：／？…，Ｖ心／，向■’、，＇’知Ｖ．Ｖ－？＊．．、、．，Ｖ．？＇Ｊ＇－．占‘Ｖ‘＇．、心．、ｒ．４、；Ｓ．＊？．、？；－、．’＇￣：沪，，Ｖ．叫忘＇貫‘冷…；普祥心爭Ｊ＇．．，省Ｖ．记：；：慕薦钱读资；招釋灰、代占‘诘献，，黃游．护中‘巧－礎終総运巧暇心勢巧，骇或枯；盖雜說＇＇－－．４子、＇‘化八、；Ｖ＇井皆－岳泌如巧＼、：刊Ｋ．亡苗Ｖ－■；．’．．、－心记．＾：、‘古心．＾－；‘、苗：二，…巧｝；Ｖ＇，貧Ｖ，ｒ．．．．、？＇、、＇．山－＇■．，＇－．？、、、＇－．，：？，．－■？、？心‘？＇＇。？语、．■Ｊ，？心＇－．．：一＇’？＾、＜、：＇Ｖ一＾＊＇．’．．＇．＇．．－：：…：心：＾Ｖ：？。ｒ－．省扭Ｃ巧苦．公：一＾－－：＾ｖＶ；．ｖ．：；，：，：Ｋ：：．＾，．、？’＾：．谜壬，；：＇；巧驻；＾立；礎＾；念？背＇？节邱婷＇１’‘＇、＇－、‘＇‘’Ｉ、‘－’；．、－．＾文？：：Ｖ敏：；．成货茹；Ｘ：林，ｙ？Ｖ折货ｖ馬７、．＆．．’、、＇’＇＇’：＜別＾＞、＇：：苗：如私＼：六＾皆、．＞、换賊Ａ护皆．’、、．．．．：‘■的．＇＇、ｓ。八片Ｖ－，心：ｖ在户进１：；甘知分？．ＶＵ、乂记Ｙ批、＇巧．．．丫；八－心乂下；妓．Ｖ紙＼．＇诚‘，ｒ＼：黃．掉擊蹲為梦ｖＡ，、斗．，＇．領．Ｖｖ銷；皆Ｖ巧於疑格’ｔ．奇．＇’‘．碱托：．：＞：、，，、＞／；；、、雜ｆ＾‘．；．；；私、讀黯每讀巧：脚酿趣矿‘；．‘苟－＾哨＾．．诚：：裝巧／；姥知瑞紋＃公；带：斬應，搪３八篇朽产点；：扣Ｖ迫群邸斬＇：、：Ｖ－．：：ｖｖ＜；；：：Ｘ，：：ｊｐ＇，＇’－．．、一、．：Ｉ：＇．？？－林心…．｜、．托＊：，：０二、ｆ，．餐於＾、．勺Ｔ＞＼朽穿韻．公；．片＇．蘇＇Ｖ、：：々．八：＾．＾軒．卢子苗：：心繞Ｉ，麾巧．．＊护巧寒贼心心循霉罷壤編輕觀茲論记郷献Ｉ‘＇＇‘＇．＾＾早、＾、＾、？－、，．诗ｒ；权请连医大有ｙ．版大裸学所＆：苗芯皆＾咬．．．＇与．，．兴取．．；、：：；；，记：：４？紙施式踞議、猶巧如祭、、？－一．、｜、Ａ？＇、．？＊■１、．．一？－．－、＾，．．．Ｉ、、、、Ｖ；、＇一ｖＩ：？、Ｓ，二＾ｉ二