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密级硕士学位论文２型糖尿病兔脑早期脑损伤ＳＷＩ、ＤＫＩ与病理对照性研究王梦辰作者姓名：指导教师：苗延巍教授学科专业：影像医学与核医学大连医科大学 中图分类号Ｒ８１密级不保密２型糖尿病兔脑早期脑损伤ＳＷＩ、ＤＫＩ与病理对照性研究ＡＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＳｔｕｄｙｏｆＳＷＩＤＫＩａｎｄＰａｔｈｏｌｏｉｃａｌＣｈａｎｅｓｏｆ，ｇｇＥａｒｌｙＢｒａｉｎＩｎｊｕｒｙｉｎＲａｂｂｉｔｓｗｉｔｈＴｙｐｅ２Ｄｉａｂｅｔｅｓ：计：学位论文４２页表格：９个插图：１３幅指导教师苗延巍教授：（专业：申请学位级别硕士学位学科）影像医学与核医学一培养单位：大连医科大学附属第医院完成时间一二月：二？八年答辩委员会主席：￥ 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研宂工作及所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过一的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。？学位论文作者签名．签字日期：ｙ／Ｊ年上月／＾曰 关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留，同意学校、使用学位论文的规定保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和。借阅本人授医可以论或分内容编入有关数权大连科大学将本学位文的全部部进检索，采影、描等复保存和汇编本学位论据库行可以用印缩印或扫制手段。文“”Ｖ（）：本学位论文属于请在以下相应方框内打１．□，。密后适保密在＿年解用本授权书２．０。不保密签：曰作者名年如这ｉｌｋ’／（厂：＾日签名年月导师 目录一、摘要........................................................................................................1（一）中文摘要............................................................................................1（二）英文摘要............................................................................................3二、正文........................................................................................................5（一）前言....................................................................................................5第一部分T2DM兔模型的建立（二）材料和方法........................................................................................61.实验动物及分组...................................................................................62.实验兔饲料及饲养...............................................................................73.主要实验仪器及试剂...........................................................................74.重要试剂配制与应用...........................................................................75.T2DM实验兔模型的建立方法...........................................................86.NC组与T2DM组实验兔生理生化指标检测...................................87.口服糖耐量试验（Oralglucosetolerancetest，OGTT）、胰岛素释试验及胰岛素抵抗评估......................................................................98.统计学分析..........................................................................................9（三）结果....................................................................................................91.实验兔成模率及死亡情况..................................................................92.两组实验兔生理指标........................................................................103.造模前OGTT试验、同步胰岛素释放试验结果.............................11 4.造模后第2周生化指标检测结果....................................................13（四）讨论..................................................................................................14（五）结论..................................................................................................15第二部分T2DM兔脑SWI、DKI与病理分析（二）材料和方法......................................................................................161.T2DM模型建立.................................................................................162.MRI扫描及后处理............................................................................163.病理检测.............................................................................................184.统计学分析.........................................................................................20（三）结果..................................................................................................211.T2DM组与NC组实验兔海马相位值.............................................212.T2DM组与NC组实验兔海马DKI的MK值...............................213.第10周NC组与T2DM组海马区Aβ1-42蛋白、凋亡细胞染色结果............................................................................................................214.相位值、MK值与Aβ1-42、细胞凋亡相关性分析..........................23（四）讨论..................................................................................................23（五）结论..................................................................................................27（六）参考文献..........................................................................................27三、综述....................................................................................................32（一）综述................................................................................................32（二）参考文献..........................................................................................38 四、致谢....................................................................................................43 大连医科大学硕士学位论文2型糖尿病兔脑早期脑损伤SWI、DKI与病理对照性研究一、摘要（一）中文摘要目的：本研究通过高脂高糖饲料喂养8周联合两次低剂量链脲佐菌素（streptozocin，STZ）（65mg/kg）注射建立2型糖尿病（type2diabetesmellitus，T2DM）兔模型，评估所制备的模型是否具有人类T2DM的典型特征；对T2DM组及正常对照（normalcontrol，NC）组兔脑进行多时间点磁敏感成像(susceptibilityweightedimaging,SWI）及弥散峰度成像（diffusionkurtosisimaging，DKI），测量海马区的相位值及MK值，并对两组实验兔进行海马区的Aβ1-42及细胞凋亡检测，将SWI、DKI与病理结果进行相关性分析，评估SWI及DKI能否反映T2DM早期脑损伤的病理变化。材料与方法：1.随机选取日系大耳白15只并分为两组，NC组=5只，T2DM组=10只。对T2DM组实验兔进行8周的高脂高糖饲料喂养，之后采用口服糖耐量试验（Oralglucosetolerancetest，OGTT）及胰岛素释放试验评估T2DM组是否存在胰岛素抵抗，在T2DM组实验兔出现胰岛素抵抗时，进行连续两次低剂量STZ（65mg/kg）注射，之后进行血糖检测，以连续两次空腹血糖大于7.0mmol/L认为造模成功，计算造模成功率。对造模成功的T2DM组及NC组进行体重、血糖、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（totalcholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（High-densitylipoproteincholesterol，HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-densitylipoproteincholesterol，HDL-c）的检测。2.取上述造模成功的T2DM组（7只）与NC组（5只），使用GESignaHDxt3.0T磁共振扫描仪在2周、6周、10周进行SWI及DKI扫描。每次扫描结束后，使用GEADW4.6后处理工作站，选择Functool2后处理软件对图像进行后处理，使用手绘ROI的方法，测量并分析右侧海马的相位值与MK值。3.取右侧海马进行Aβ1-42染色并进行凋亡细胞检测，使用Image-ProPlus测量1 大连医科大学硕士学位论文T2DM组与NC组实验兔右侧海马Aβ1-42的平均光密度值，通过TUNEL法检测、高倍镜计数凋亡细胞计算海马区凋亡指数。4.4.观察T2DM组与NC组之间是否存在Aβ1-42的蓄积及细胞凋亡的差异，并将结果与SWI的相位值与DKI的MK值之间做相关性分析；使用SPSS20.0对血糖、体重、TG、TC、HDL-c、LDL-c等计量数据进行后处理。结果：1.使用高脂高糖饲料喂养8周联合两次低剂量STZ（65mg/kg）注射可以成功诱导T2DM兔模型。造模前T2DM组较NC组OGTT及胰岛素释放实验显示血糖及胰岛素峰值后移，血糖及胰岛素曲线下面积存在显著性差异（P<0.05）。造模后第2周生理生化指标检测结果显示所建立的T2DM组较NC组血糖显著性增高（p<0.05）；TG、LDL-c含量增高（P<0.05）；HDL-c含量明显降低（P<0.05）；而TC含量无显著性差异（P>0.05）。本课题对10只日系大耳白进行造模，最后成功建立7只T2DM模型（成功率70%）。2.两组SWI及DKI结果显示，T2DM组海马区较NC组相位值逐次降低，MK值也逐次升高，但于第10周出现显著差异（p＜0.05）。此时进行海马区Aβ1-42及细胞凋亡检测，病理结果显示，T2DM组较NC组出现显著的Aβ1-42的沉积（p＜0.05），而细胞凋亡检测结果之间无显著差异（p＞0.05）；3.相位值、MK值与病理结果相关性分析显示，相位值与Aβ1-42之间存在明显负相关性（r=-0.838，p＜0.05），与细胞凋亡之间不存在相关性（p＞0.05）；而MK值与Aβ1-42与细胞凋亡之间不存在相关性（p＞0.05）。结论：1.使用高脂高糖喂养8周联合连续两次低剂量STZ（65mg/kg）注射可以成功诱导T2DM兔模型，与人类T2DM的生理生化具有很高的相似度，且成模率较高；2.T2DM会加重兔脑组织的β淀粉样蛋白的蓄积，SWI及DKI可以在一定程度上反映T2DM兔脑损伤。关键词：2型糖尿病脑MRIβ淀粉样蛋白细胞凋亡2 大连医科大学硕士学位论文(二)英文摘要AComparativeStudyofSWI,DKIandPathologicalChangesofEarlyBrainInjuryinRabbitswithType2DiabetesAbstract：Objective:Inthisstudy,type2diabetesmellitus(T2DM)weredevelopedinrabbitmodelsbyprovidingthemwith8weeksofhighfatdietandtwodosesofstreptozotocin(STZ)(65mg/kg).Wemeasuredthesomebiochemicalindicesintheserabbits.AfterwhichtheywereassessedtofindoutiftheyhadthecharacteristicsofhumanT2DM.Followingthis,theT2DMgroupandnormalcontrol(NC)groupunderwentSWIandDKIscanseveraltimes.WemeasuredthephaseandMKvalueofthehippocampus.Then,withachangeinthephasevalueandMKvalue,wedetectedtheAβ1-42andapoptosisinT2DMgroupandNCgroupinhippocampus.AnalysisofthepathologicaldifferenceinT2DMgroupandNCgroupwasconductedbyevaluatingthecorrelationbetweenpathologicalfindingsandsensitivityindicesofSWIandDKIThereby,SWIandDKIresultscouldreflectearlybraininjuryinT2DMgroupornot.Materialsandmethods:1.15rabbitswererandomizedintotwogroups(NCgroup=5,T2DMgroup=10).TheT2DMgroupwasfedbyhigh-fatandhighglucosedietfor8weeks.Then,T2DMgroupandNCgroupunderwenttheOGTTandinsulinreleasetesttochecktheinsulinresistance.WheninsulinresistanceoccurredingroupT2DM,twolowdosesofSTZ(65mg/kg)wereinjected.Ifconsecutivefastingbloodglucosewasgreaterthan7.0mmol/Ltwice,itwouldbeconsideredassuccessful.TheT2DMmodelthatfailedwouldberemoved..ThenthefollowingbiochemicalparametersofT2DMgroupandNCgroupnamelyweight,glucose,TG,TC,HDL-c,LDL-cwerecollected.2.UsingGESignaHDxt3.0TMRIscanwasconductedsuccessfullyforT2DMgroup(7rabbits)andtheNCgroup(5rabbits)in2weeks,6weeks,10weeks.Everytimeafterthescan,imagingswereprocessedusingGEADW4.6workstationFunctool2software.ThenthephaseandMKvaluesweremeasuredUsinghand-paintedregionofinterestoftherighthippocampus.AfterchangingthephasevalueandMKvalues,theAβ1-42and3 大连医科大学硕士学位论文apoptosisinT2DMgroupandNCgroupinrighthippocampusweredetected.3.TheaverageopticaldensityofT2DMgroupandNCgroupAβ1-42weremeasuredbyImage-ProPlus.Theapoptosisindexinhippocampusbycountingapoptosiscellsatanyhighmagnificationwerecalculated.WeobservedwhethertherewasdifferenceinapoptosiswhencomparisonbetweenT2DMgroupandNCgroupwasdone.ThenweanalyzedthecorrelationofpathologyfindingswithphasevalueandMKvalue.4.WeusedSPSS20.0toanalyzequantitativedata,suchasbloodglucose,bodyweight,TG,TC,HDL-candLDL-c.Pearsoncorrelationanalysiswasdonetofindthecorrelationbetweenpathologicalfindingsandimagingdata.Result：Through8weeks,highfat-sugardietwithtwolowdosesofSTZ(65mg/kg)injectioncaninduceT2DMinrabbit.After8weeksofhighfat-sugardiet,OGTTandinsulinreleasetestshowedthepeakofbloodglucoseandinsulinofT2DMgroupwasdelayed.Thereisasignificantdifferenceintheareaofbloodglucoseandinsulincurve.ItshowsthatthereisinsulinresistanceingroupT2DM.After2weeksofinduction,thebloodglucoseintheT2DMgroupwassignificantlyhigherthanthatintheNCgroup(p<0.05).TherewasasignificantdifferenceinthecontentofTG,(LDL-cisincreased,HDL-cisdecreased)(P<0.05).TherewasnosignificantdifferenceinthecontentofTC(P>0.05).Aboveall,theT2DMgroupshowedtypicalsymptomsofT2DM,similartohuman,suchashyperlipidemia,hyperglycemia,insulinresistance.Inthisstudy,7rabbitsweresuccessfullyinducedtodevelopT2DMmodels(thesuceessrateis70%).2.ThetwogroupsofSWIandDKIresultsshowedthatthephasevaluedecreasedgraduallyinthehippocampusareainT2DMgroup.MKvalueincreasedgradually.Therewasamajordifferenceat10weeks(P<0.05).PathologicalresultsshowedthatT2DMgrouphadsignificantdepositionofAβ1-42comparedwithNCgroup(P<0.05).Therewasnosignificantdifferenceintheresultsofapoptosisdetection(P>0.05).3.CorrelationwasseenbetweenpathologicalresultsandphasevalueandMKvalue.TheresultsshowthatthephasevaluehassignificantvalueswithAβ1-42(P<0.05),apoptosisvaluesarenotsignificant(P>0.05).Therewasnotanycorrelationbetween4 大连医科大学硕士学位论文DKIvalueandAβ1-42andMKapoptosis(P>0.05).Conclusion：1.Using8weekshighfat-sugardietwithtwolowdosesofSTZ(65mg/kg)injectioncouldinduceT2DMinrabbitssuccessfully.Themodelshowsimilarphysiologyandbiochemistrysymptomlikethatofhumans.Thereisahighsuccessrate.2.WhentherewasasignificantdifferenceinSWIandDKIsensitivityindex,T2DMgrouphadsignificantdepositionofAβ1-42(p<0.05).ItindicatesthatT2DMwouldaggravatetheaccumulationofbetaamyloidproteininbraintissue,andalsoshowedSWIandDKIcouldreflectT2DMbraindamagetoacertainextent.Thereisnosignificantdifferencesinapoptosisdetectionat10weeks.PerhapsbecauseT2DMbraindamageisstillintheearlystageandfurtherexplorationisstillneeded.Keywords:T2DMBrainMRIAmyloidβ-proteinApoptosis正文（一）前言近年来，随着我国社会经济的快速发展、生活方式的改变，T2DM患者人数迅猛增加[1]。研究表明，DM是认知功能下降的重要危险因素之一，并且常表现出与阿尔兹海默症（Alzheimerdisease，AD）类似的认知及痴呆症状[2]。有MRI研究发现，T2DM患者与健康对照组相比，海马体积减少，认知能力下降[3]。此外，在一项对SAMP8小鼠进行T2DM模型诱导的基础性研究发现T2DM小鼠较正常组小鼠出现记忆障碍，T2DM小鼠脑内β淀粉样蛋白的沉积和海马区tau蛋白过度磷酸化，该研究表明T2DM脑损伤具有与AD脑损伤类似的机制[4]。另外，T2DM患者脑脊液分析也发现T2DM患者具有与AD患者类似的高水平β淀粉样蛋白[5]。目前对于脑内β淀粉样蛋白定量检测方法较少，仅有正电子发射型计算机断层显像（PositronEmissionComputedTomography，PET-CT）[6]，但是PET成像价格昂贵，而且存在辐射，不适用于广泛的临床应用。磁共振（MagneticResonanceImaging，MRI）是临床上也是评估脑退行性疾病重要的方法之一，广泛应用于脑疾病的筛查与病情随访。然而，常规MRI序列如T1WI、T2WI难以5 大连医科大学硕士学位论文发现脑微细结构及功能的早期改变。有研究[7][8]使用多模态MRI技术，如DKI及SWI等技术检测T2DM患者脑组织，发现T2DM患者出现DKI及SWI参数的改变，表明这两种序列对T2DM脑组织损伤具有一定的诊断意义，但是这些参数与病理结果之间是否存在相关性呢，目前尚缺乏深入的研究。为了进一步明确T2DM是否会存在β淀粉样蛋白的沉积，利用SWI、DKI能否较早的检测脑微观结构变化，本课题拟通过建立T2DM兔模型并进行MRI（SWI、DKI）与病理学对照研究，进一步探索T2DM脑损伤机制，并寻求定量早期T2DM脑损伤的MRI指标。第一部分T2DM兔模型的建立目前，常用且较为成熟的T2DM动物模型主要是鼠类，但是鼠类脑组织较小，经MRI扫描难以获取合适的图像，因此本实验选择日系大耳白兔作为实验动物，并对所建立的T2DM实验兔模型进行生理生化指标检测，评价其与人类T2DM是否具有相似的病理生理改变。本课题通过使用高脂高糖饲养8周联合两次低剂量STZ（65mg/kg）进行T2DM实验兔模型的制备。（二）材料与方法1实验动物及分组实验动物：日系大耳白兔雄性15只（由大连医科大学动物实验中心提供），兔龄8周，体重（3.02±0.27）kg。按照实验兔饲养标准进行饲养：独笼（兔笼大小40cm×60cm×80cm）；室温（20±5）°C；湿度55(±10)%；12小时昼/夜光照循环；饲料及饮水不限；兔舍于每日上午9时清扫。将实验兔随机分为两组，NC组=5只，T2DM组=10只。本动物实验通过大连医科大学医学伦理委员会批准并严格遵守国际医学科学组织理事会颁布的国际生物医学研究动物实验指导原则。2实验兔饲料及饲养实验兔普通饲料组成：小麦粉、玉米粉、麸皮、豆粉、骨粉、鱼粉等按一定比例进行充分混匀、搅拌、烘干、成型、储存（饲料由大连医科大学动物实验中心提供）。6 大连医科大学硕士学位论文T2DM组高脂高糖饲料组成：按照王宗保[9]等人的研究进行高脂高糖饲料的配制，即在基础饲料(53%)中加入猪油(10%)和蔗糖(37%)进行混匀、搅拌、烘干、成型、储存（饲料由大连医科大学动物实验中心制作提供）。NC组全程使用普通饲料喂养。T2DM组使用高脂高糖饲料喂养8周，进行STZ注射造模，造模成功的T2DM组更换为普通饲料饲养直至实验结束。实验周期内，各组实验兔充足供应饲料，不限饮水。3主要实验仪器及试剂罗氏卓越精采型血糖仪及试纸德国，Roche公司电子天平中国，上海第二天平仪器厂恒温水浴箱中国，北京医疗器械公司高速离心机日本，Hitachi公司全自动生化分析仪日本，Hitachi公司链脲佐菌素（STZ）美国，SIGMA公司戊巴比妥钠中国，天津化学试剂三厂柠檬酸、柠檬酸钠中国，天津化学试剂三厂ELISA试剂盒中国，北京科盈美科技有限公司4重要试剂配制与应用4.1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液称取柠檬酸2.1g，加双蒸水100ml，配成0.1mol/L的柠檬酸溶液；取柠檬酸钠2.94g，加双蒸水100ml，配成0.1mol/L的柠檬酸钠溶液，按1：1混匀，调节PH值为4.0-4.5，灭菌。4.22%STZ溶液称取2gSTZ粉末，按2：100的比例溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，置于冰水浴中，在30min内注射，每次需现配现用。4.33%戊巴比妥钠溶液称取3g戊巴比妥钠粉末，溶于100ml生理盐水，混匀，低温干燥保存。5T2DM实验兔模型的建立方法7 大连医科大学硕士学位论文选取日系大耳白兔10只，编组为T2DM组，在通过高脂高糖饲料喂养8周后，进行口服糖耐量试验（Oralglucosetolerancetest，OGTT）及胰岛素释放试验，评估T2DM组实验兔是否存在胰岛素抵抗（Insulinresistence，IR）。造模前对出现IR的T2DM组实验兔禁食12小时以上，使用3%的戊巴比妥钠(30mg/kg)经耳缘静脉麻醉，再经耳缘静脉注射新配制的2%STZ溶液(65mg/kg)，72小时再次注射同等剂量新配制的STZ溶液，之后每2周检测血糖一次，连续2次空腹血糖高于7.0mmol/L视为造模成功，对血糖低于7.0mmol/L的实验兔剔除实验。NC组注射两次同等剂量的生理盐水。6NC组与T2DM组实验兔生理生化指标检测6.1NC组与T2DM组体重每一周检测一次，测空腹体重。对NC组与T2DM组禁食一晚，于次日上午8点测量体重，禁食时间约为10-12小时，用电子天平称量并计数（单位：kg，保留小数点后2位）。6.2NC组与T2DM组血糖每两周检测一次，对NC组与T2DM组禁食一晚，于次日上午8点测量血糖，禁食时间约为10-12小时，用罗氏血糖仪测量并计数（单位：mmol/L，保留小数点后1位）。6.3NC组与T2DM组血清TG、TC、HDL-c、LDL-c于造模成功后第2周对NC组与T2DM组禁食一晚，于次日上午8点使用黄色促凝真空采血管经耳缘静脉抽取静脉血，经离心机离心(2100r/min，10min)，离心完成后，使用移液枪移至EP管内保存，待全部实验兔血清分离完成后，使用全自动分析仪对血清TG、TC、HDL-c、LDL-c进行检测。7.口服糖耐量试验（Oralglucosetolerancetest，OGTT）、胰岛素释放试验及胰岛素抵抗评估对T2DM组及NC组实验兔禁食12小时，给予葡萄糖(3g)溶于少量生理盐水灌胃，按0h、0.5h、1h、2h、3h分别使用黄色促凝真空采血管及采血针经耳缘静脉采血3ml，并测定血糖和胰岛素含量。血糖使用罗氏血糖仪检测；血清胰岛素8 大连医科大学硕士学位论文采用ELISA法检测。7.1静脉血血清胰岛素浓度的测定(ELISA法)a.使用离心机(2100r/min,10min)对采集的静脉血离心，取上清；b.设置标准孔，取离心所得的上清液100μl加入含有抗胰岛素抗体的微孔中；c.加入酶标液50ul，充分混匀，37°C孵育60min，洗板机清洗微孔5次；d.向微孔内加入底物I和底物II各50μl，充分混匀，室温避光反应20min，加终止液终止反应；e.使用全自动酶标仪测量并记录每个微孔450nm波长下光密度(opticaldensity，OD)值，根据标准孔和待测上清胰岛素样品的OD450值之间的相关性，绘制标准曲线并计算胰岛素浓度。7.2NC组与T2DM组实验兔IR的评估通过OGTT及胰岛素释放试验绘制各时间点血糖与胰岛素曲线，使用GraphpadPrism软件计算NC组与T2DM组血糖曲线下面积（areaunderthecurveofglucose，AUCG）与胰岛素曲线下面积（areaunderthecurveofinsulin，AUCI），使用SPSS20.0分析比较NC组与T2DM组AUCG和AUCI是否存在统计学差异，由此评价两组实验兔是否存在IR。8统计学分析体重、血糖、生化指标等计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS20.0软件，对同时间点两组数据比较使用独立样本t检验。所有结果以P<0.05表明存在显著性差异，视为具有统计学意义。（三）结果1实验兔成模率及死亡情况T2DM组实验兔共10只，于第8周注射STZ进行造模，造模结果显示连续两次空腹血糖高于7.0mmol/L的实验兔共有7只，余3只因血糖不满足DM诊断标准而剔除，成模率为70%。实验周期内NC组及T2DM组实验兔未出现死亡。2两组实验兔生理指标（注：下述结果基于造模成功并长期存活的实验兔进行统计学分析：NC组=59 大连医科大学硕士学位论文只，T2DM组=7只）2.1实验周期内NC组与T2DM组体重变化实验周期内对NC组与T2DM组每周检测1次空腹体重，计数并绘制体重变化曲线（图1）。曲线显示NC组体重呈平稳缓升趋势，T2DM组在高脂高糖饲料喂养期间体重增长较NC组快，第8周体重显著高于NC组实验兔（P<0.05），于第8周造模成功后随实验周期延长，体重稍减轻。图1：T2DM组与NC组体重变化曲线2.2实验周期内NC组与T2DM组血糖变化实验周期内对NC组及T2DM组每2周检测1次空腹血糖，计数并绘制血糖曲线图（图2）。曲线显示NC组血糖低于7.0mmol/L，略有波动；T2DM组在高脂高糖饲料喂养期间血糖稍有增高，但未达DM诊断标准，于第8周造模成功后，空腹血糖值高于7.0mmol/L，之后血糖略有波动，但均符合DM诊断标准。图2：NC组与T2DM组血糖变化曲线10 大连医科大学硕士学位论文3造模前OGTT试验、同步胰岛素释放试验结果3.1OGTT试验血糖结果显示造模前T2DM组与NC组空腹血糖无明显差异，均未达DM诊断标准。T2DM在0.5h、1h、2h、3h血糖显著高于NC组（P<0.05）（表1）。血糖曲线显示T2DM组血糖在2h出现峰值，NC组血糖峰值在0.5h，表现出峰值后移(图3)。表1：OGTT试验T2DM组与NC组血糖变化分组0h0.5h1h2h3hT2DM6.13±0.578.40±0.439.70±0.6110.37±0.656.61±0.53NC5.36±0.679.70±0.677.82±0.366.24±0.715.34±0.49t2.145-3.8226.14710.4644.219p0.0710.0080.0000.0000.002图3：OGTT试验T2DM组与NC组血糖变化3.2OGTT试验同步胰岛素释放结果OGTT试验同步胰岛素释放结果显示：T2DM组较NC组各个时间点均高（P<0.05）（表2），0h显示T2DM组空腹胰岛素较NC组高。胰岛素曲线亦呈峰值后移（图4）。11 大连医科大学硕士学位论文表2：OGTT试验T2DM组与NC组胰岛素变化μU/mL分组0h0.5h1h2h3hT2DM11.85±2.1922.47±4.6133.25±4.5526.77±3.7514.09±2.08NC6.98±1.8319.47±2.2524.45±1.7514.28±2.579.30±1.86t4.0461.3334.0666.4074.093p0.0020.2120.0020.0000.002图4：OGTT试验同步胰岛素变化3.3IR评估计算两组T2DM组与NC组AUCI、AUCG、AUCI/AUCG，结果显示均存在显著性差异（P<0.05）（表3），表明T2DM组存在IR。12 大连医科大学硕士学位论文表3：OGTT试验、同步胰岛素释放试验曲线下面积分组AUCIAUCGAUCI/AUCGT2DM72.95±7.3226.69±1.082.74±0.31NC48.75±4.9920.97±1.062.33±0.30t6.3669.0752.282p0.0000.0000.0464造模后第2周生化指标检测结果造模后第2周末采血检测T2DM组和NC组实验兔生化指标，包括TC、LDL-c、HDL-c、TG。结果显示造模成功的T2DM组较NC组TG、LDL-c含量增高，存在显著差异（P<0.05），HDL-c含量降低，存在显著差异（P<0.05），而TC含量无显著性差异（P>0.05）(表4，图5）。图5：T2DM组与NC组生化指标（TC、LDL-c、HDL-c、TG）表4：NC组与T2DM组生化指标比较（mmol/L）分组TCLDL-cHDL-cTGT2DM2.06±0.251.26±0.070.63±0.113.23±0.21NC1.84±0.141.11±0.100.87±0.090.98±0.12t1.7372.892-4.21621.967P0.1130.0160.0020.00013 大连医科大学硕士学位论文（四）讨论T2DM动物模型主要是鼠类，亦存在其它的动物，如兔、猫、狗、猪等。根据研究需要，本课题组选择日系大耳白兔作为研究对象。首先，本实验在对动物造成T2DM模型后，需要进行脑MRI检查。鼠类体型相对兔类较小，鼠模型脑组织MRI成像时难以显示良好的解剖结构，不利于影像资料的后处理，而兔模型则有效的避免了这一问题，使用MRI可以获取具有更高分辨率的脑组织影像。第二，鼠模型的饲养环境要求高（通常在SPF环境中），无菌的生存环境与人类T2DM生存环境存在差异，而兔模型所暴露的环境与人类相仿，可以更好的与人类T2DM患者空间环境相吻合。第三，兔模型性格温柔，体型适中，易于控制，对环境耐受能力强，长期生存率高，常被用于DM研究中[10][11]。制备T2DM动物模型主要有三种方法：1、通过近亲杂交筛选、繁育出符合T2DM的动物模型，即自发型T2DM动物模型；2、使用STZ及ALX等化学药物，损伤胰岛细胞，形成诱导型T2DM动物模型；3、通过基因敲除等获取转基因型T2DM动物模型。其中自发型和转基因T2DM动物模型价格昂贵，难以在大多数实验室中应用[12]。化学药物诱导T2DM动物模型的方法相对简单，而且价格便宜，适用于多种动物[13]。作为诱导DM动物模型的常用化学试剂，STZ与四氧嘧啶（alloxan，ALX），两种药物之间有相似性，亦存在差异。相同点在于STZ与ALX的分子结构与葡萄糖相似，因此，STZ与ALX可以通过葡萄糖转运蛋白2（Glucosetransporter2，GLUT2）进入胰腺β细胞，从而导致胰腺β细胞的损伤和破坏，引起高血糖等DM症状。不同点在于STZ生物半衰期较ALX长，约15min；造模稳定、快速；组织毒性较四氧嘧啶小，致死率相对较低等，但是STZ价格较ALX稍昂贵。目前有很多使用高脂高糖喂养联合STZ注射诱导T2DM的动物模型[14][15][16]。Reed[16]等人认为在高脂饲养一段时间后注射STZ，会导致胰腺β细胞功能减低，形成轻度的糖耐量降低，而不会完全损伤胰岛素分泌功能，更加符合人类T2DM的慢性进展。目前近年来这种高脂高糖加STZ注射的T2DM动物模型的建立方法无论是在研究T2DM机制研究，还是并发症的研究或治疗中都越来越受欢迎[17][18]。本研究亦采用上述方法进行T2DM兔模型的制备。结果显示喂养高脂高糖8周，再进行连续两次低剂量STZ注射，可以成功诱导T2DM模型。本14 大连医科大学硕士学位论文研究对10只实验兔进行建模，所成功建立T2DM组模型共有7只，成模率为70%。本研究发现，在高脂高糖饲养8周后，T2DM组实验兔较NC组体重增加（p<0.05），这与人类T2DM多表现为肥胖具有相似性。目前T2DM的患病人数迅速增加，与久坐不动，营养过剩等当代生活方式的改变密切相关，这些变化导致了超重和肥胖人群的增加[19]。研究显示，超重与肥胖人群T2DM患病率显著高于体重正常的人，是T2DM的独立危险因素[20]。T2DM患者的另一个主要特征是机体存在IR[21]，引起机体出现IR的因素很多，包括体型肥胖、基因突变、运动减少等[22]。在出现IR的早期阶段，机体可通过增加分泌胰岛素进行代偿，以维持正常的血糖，随着IR持续进展，会引起胰岛素分泌的失代偿，出现糖耐量受损，血糖升高，从而形成T2DM并促进其发展[23]。目前对于IR检测的方法很多，其中作为IR"金标准"的检测方法就是高胰岛素葡萄糖钳夹试验[24]，由于该方法的步骤繁琐，难以广泛应用。目前有许多关于IR评估的模型被提出，如评估的胰岛素抵抗稳态模型(HOMA-IR）、胰岛素敏感性定量检查指数（QUICKI）和基于OGTT的检测方法，用于简化测量、评估机体是否存在IR。本研究采用OGTT联合胰岛素同步释放试验，绘制各时间点血糖和胰岛素曲线，计算AUCG、AUCI、AUCI/AUCG从而对机体是否存在IR进行评估。OGTT联合胰岛素同步释放试验结果显示，T2DM组实验兔较NC组葡萄糖、胰岛素曲线峰值后移，AUCG、AUCI、AUCI/AUCG均存在显著增高（p<0.05），表明在喂养8周高脂高糖后T2DM组实验兔体内存在胰岛素抵抗。本研究在造模成功后第2周对T2DM组及NC组实验兔进行生化指标（TC、LDL-c、HDL-c、TG）的分析，结果显示T2DM组实验兔LDL-c、HDL-c、TG的紊乱，血脂较NC组显著增高（p<0.05）。综上，本研究使用高脂高糖喂养8周联合两次低剂量STZ（65mg/kg）注射可以成功建立DM模型。该模型具有体重增加、高血糖、高血脂等T2DM典型症状，并存在IR，与人类T2DM模型具有相似的生理生化特征。（五）结论本课题建立了具有人类T2DM生理生化特征的兔模型，表明利用高脂高糖喂养8周，联合两次低剂量STZ（65mg/kg）可以成功建立T2DM模型，该模型具15 大连医科大学硕士学位论文有体重增加、高血糖、高血脂等T2DM典型症状，并存在IR，与人类T2DM模型具有相似的生理生化特征。第二部分T2DM兔脑SWI、DKI与病理分析（一）材料与方法1T2DM模型建立详见第一部分。取造模成功的T2DM组实验兔（7只）和NC组实验兔（5只），于第2周、第6周、第10周每间隔4周进行MRI扫描（包括SWI、DKI）。2MRI扫描及后处理2.1MR设备MR设备：GESignaHDxt3.0TMR扫描仪；线圈：8通道膝关节线圈。2.2MRI扫描准备扫描前，麻醉实验兔，3%戊巴比妥钠溶液（1ml/kg），耳缘静脉注射，麻醉同时给予声音刺激（拍掌），以无显著反应为宜；扫描时，俯卧位扫描，头部稍抬高，兔前脚位于头部两侧，使得颈部暴露，严禁气管压迫，防止窒息，给予耳塞，进行保护并限制运动。2.3MRI序列及参数MRI序列包括轴位T2Flair、轴位DKI及轴位SWI序列。T2Flair扫描垂直颅底，覆盖全脑；DKI采用3个b值：0s/mm2，600s/mm2，1200s/mm2，共15个方向。总扫描时间约15分钟，详细参数如下（表1）：16 大连医科大学硕士学位论文表1MRI序列详细参数T2FlairDKISWITR(ms)9000300079.1TE(ms)16892.5/TI(ms)2250//层厚(mm)3.03.02.0层间距(mm)0.50.50矩阵256×160128×128320×288FOV(mm×mm)120×120120×120120×120NEX110.69FA(°)9090202.4MRI数据后处理2.41SWI数据后处理将SWI原始数据传至GEADW4.6后处理工作站，选择Functool2后处理软件，经处理的SWI图像形成幅度图（magnitudeimaging，MI）和相位图(phaseimaging，PI)。使用画ROI的方法测量双侧海马的相位值，ROI大小为4mm2，相位值取右侧海马平均值为海马区的相位值。对照解剖图[25]，准确画取海马的ROI（图1、图2），采用测3次取均值的方法，测量时尽可能避免脑脊液、血管、颅骨，以减少伪影干扰及人为误差。图1.SWI原始图（俯卧位）图2.PI图2.42DKI数据后处理17 大连医科大学硕士学位论文将DKI原始数据传至GEADW4.6后处理工作站，选择Functool2后处理软件，重建获得MK图。在MK图采用手绘画ROI的方法测量双侧海马的MK值。(图3，图4)图3.DKI原始图图4.MK图3病理检测3.1病理检测试剂、仪器多聚甲醛中国，天津化学试剂三厂中性树胶中国，北京中杉金桥生物公司显微镜盖玻片中国，北京中杉金桥生物公司磷酸盐缓冲液粉剂（PBS）中国，北京中杉金桥生物公司切片机德国，Leika公司恒温干燥箱中国，新腾公司普通冰箱中国，海尔有限公司双蒸水制备系统美国，Millipore公司显微镜日本，Nikon公司β淀粉样肽（1-42）抗体中国，北京博奥森生物技术有限公司TUNEL凋亡检测试剂盒中国，上海博谷生物科技有限公司石蜡中国，上海博谷生物科技有限公司3.2实验中溶液配制3.21PBS液18 大连医科大学硕士学位论文取PBS粉剂，溶于双蒸水，搅拌溶解，调节液体体积至2000ml，调节PH值至弱碱（7.4），4°C贮藏。3.224%多聚甲醛溶液避光取40g多聚甲醛，溶于配制好的PBS液中，定容1000ml，加热至80°C，搅拌溶解，4°C贮藏。3.233%戊巴比妥钠溶液取3g戊巴比妥钠粉末，溶于100ml生理盐水，混匀，低温干燥保存。3.24兔脑取材在两组实验兔MRI检查完成后，对两组所存活的实验兔进行取脑，并进行病理检测分析。固定好实验兔，剃毛备皮，经耳缘静脉注射麻醉药（3%戊巴比妥钠1ml/kg）进行深度麻醉，打开右心房，在左心室插入导管，先经导管灌流常温生理盐水约2000ml，待右心房流出液变清，灌入4%多聚甲醛，约1000ml，进行固定。断头、取脑、浸泡于组织固定液中，然后按照兔脑解剖图谱，对标本进行脱水、石蜡包埋，使用切片机切片，每个实验对象制备3张切片，待行Aβ1-42染色及细胞凋亡染色。3.3免疫组化分析3.31TUNEL法检测细胞凋亡准备好切片，按照TUNEL试剂盒说明书分步进行，阳性细胞表现为棕黄色。a切片常规脱蜡，在切片滴加1%的Triton-100，25°C环境下放置15分钟进行通透；bPBS液浸洗3次，每次5分钟；c每个样本滴加100μlTDT酶反应液进行Tunel反应，约1h；dPBS液浸洗3次，每次5分钟；e加酶标亲和素，常温反应30分钟；fPBS液浸洗3次，每次5分钟；g对切片滴加2滴新配制的DAB液显色，镜下观察，待染色完成后，使用终止液19 大连医科大学硕士学位论文终止反应；h将切片置入苏木素染液中进行约10分钟的复染，蒸馏水冲洗；i使用二甲苯和梯度酒精脱水，常规封片；g使用高倍显微镜（×400）观察制备好的海马凋亡细胞染色切片，每张切片取10个不重叠区域，对T2DM组和NC组的凋亡细胞进行计数，并计算凋亡指数（AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%）。3.32Aβ1-42淀粉样蛋白染色准备好切片及所需试剂后进行Aβ1-42免疫蛋白染色，步骤如下。a切片常规脱蜡、水合：用二甲苯浸泡2次，每次5分钟；再使用95%、85%、70%乙醇进行浸泡，每次5分钟；PBS液浸洗3次，每次3分钟；b组织抗原修复：将待测切片放入盛有适量柠檬酸盐缓冲液的烧杯中，大火加热至沸，小火加热保持液体温度稳定，约20分钟后取出烧杯，自然冷却至室温，取出玻片，PBS液轻洗3次；c灭活酶：滴加2滴3%H2O2-甲醇，置于室温10分钟；d封闭：滴加50至100μl即用型山羊血清，置于室温20分钟；e抗原-抗体反应：稀释一抗（1：200），滴加50μl，置于37°C恒温箱2小时；f一抗二抗反应：滴加二抗50μl，置于37°C恒温箱30分钟，PBS轻洗3次；g显色：滴加2滴DAB溶液显色；显微镜下观察染色程度，待染至满意程度，使用终止液终止显色反应；h复染：将玻片置于苏木素染液复染，蒸馏水冲洗；i封片：将玻片按顺序置于70%、85%、95%、100%酒精浸泡一次，每次5分钟；二甲苯浸泡2次，每次10分钟，晾干后加中性树胶并盖盖玻片；g观察、统计：使用显微镜高倍镜（×400倍）观察NC组与T2DM组细胞质与细胞膜Aβ1-42的表达情况；使用Image-ProPlus对高倍镜拍照的图像进行分析，并计算平均光密度值，平均光密度值为积分光密度/观察区域面积。4统计学分析研究中计量数据采用SPSS20.0分析，用(x±s)表示。同一扫描时间点两组实验所测得的计量数据采用独立样本t检验分析。采用Person相关分析海马区SWI20 大连医科大学硕士学位论文相位值、DKI的MK值与Aβ1-42淀粉样蛋白、细胞凋亡之间的相关性。结果以P<0.05被认为存在显著差异。（二）结果1.T2DM组与NC组实验兔海马相位值造模成功后，T2DM组较NC组在第2周，第6周海马区SWI相位值比较逐渐减低，无统计学差异（P>0.05）；在第10周T2DM组海马区相位值显著低于NC组（p<0.05），详见（表2）。表2.T2DM组与NC组相位值比较(×10-3)组别第2周第6周第10周T2DM组（n=7）-38.03±9.87-43.23±7.85-61.73±10.23*NC组（n=5）-29.22±7.22-33.50±8.25-41.00±7.42t-1.785-2.056-4.069P0.1050.0720.002注：*为T2DM组与NC组存在显著性差异（P<0.05）。2.T2DM组与NC组实验兔海马DKI的MK值造模成功后，T2DM组较NC组在第2周，第6周海马区MK值比较逐渐增加，但无统计学差异（P>0.05）；在第10周T2DM组海马区MK值显著高于NC组（p<0.05），详见（表3）。表3.T2DM组与NC组MK值比较组别第2周第6周第10周T2DM组（n=7）0.370±0.0320.406±0.0280.525±0.080*NC组（n=5）0.364±0.0370.385±0.0390.443±0.028t0.3141.0902.704P0.7600.3010.022注：*为T2DM组与NC组存在显著性差异（P<0.05）。3.第10周T2DM组与NC组海马区Aβ1-42蛋白、凋亡细胞染色结果免疫组化片显示T2DM组海马区Aβ1-42染色较NC组明显（图5、图6），21 大连医科大学硕士学位论文经软件分析，T2DM组Aβ1-42平均光密度值较NC组高，具有显著差异（P<0.05）(表4)。细胞凋亡染色显示T2DM组海马区Aβ1-42染色较NC组相仿（图7、图8），经软件分析，T2DM组细胞凋亡指数较NC组未出现显著差异（P>0.05）(表4)。表4：NC组与T2DM组海马区Aβ1-42蛋白、凋亡细胞染色结果分组Aβ1-42（平均光密度）(×10-1)凋亡指数（100%）T2DM2.03±0.36*11.57±1.67NC0.85±0.1110.54±2.34t7.0670.897p0.0000.391注：*为T2DM组与NC组存在显著性差异（P<0.05）。图5NC组Aβ1-42蛋白染色(×400)图6T2DM组Aβ1-42蛋白染色(×400)注：细胞质及细胞膜出现棕黄色阳性反应。图7NC组细胞凋亡(×400)图8T2DM组细胞凋亡染色(×400)注：细胞核固缩、破碎，细胞体积缩小为阳性凋亡细胞；细胞均染，核仁明显为正常细胞。22 大连医科大学硕士学位论文4.相位值、MK值与Aβ1-42、细胞凋亡相关性分析SWI相位值与Aβ1-42之间存在明显负相关性（P<0.05），而与细胞凋亡之间无明显相关性（P>0.05）；MK值与Aβ1-42、细胞凋亡均无显著相关性（P>0.05）。表5：相位值、MK值与Aβ1-42、细胞凋亡相关性分析Aβ1-42细胞凋亡指数分组rprp相位值-0.8380.019*0.2890.530MK值-0.2770.548-0.1250.789注：*为T2DM组与NC组存在显著性差异（P<0.05）。（三）讨论糖尿病脑病是损伤脑组织的一种并发症，于20世纪60年代提出，以轻中度认知功能障碍为主要临床症状。造成糖尿病脑损伤的发病机制尚不明确，但是目前的研究显示DM所造成认知功能障碍与AD具有相似的疾病特征，包括出现β淀粉样蛋白沉积等特征性AD病理表现[26]。AD的研究显示AD患者出现典型症状之前就会出现β淀粉样蛋白的蓄积，那么在T2DM出现认知障碍是否会出现类似于AD的改变呢，如何能早期发现这种脑损伤是目前临床上需要解决的问题。本研究通过建立T2DM模型，进行SWI及DKI多次扫描，并对T2DM及NC组实验兔进行Aβ1-42、细胞凋亡检测。在第10周SWI及DKI敏感性指标出现显著性差异时，T2DM组较NC组出现显著的Aβ1-42的沉积（p<0.05），说明T2DM会加重脑组织的β淀粉样蛋白的蓄积，也表明SWI及DKI可以在一定程度上反映T2DM脑损伤。此时细胞凋亡检测未出现显著性差异，可能由于T2DM脑损伤尚处于早期阶段，仍需要进一步的探索。1T2DM和β淀粉样蛋白、细胞凋亡胰岛素是一种肽类激素，由51个氨基酸组成，与T2DM发病关系密切。胰岛素的主要功能是调节血糖和促进外周组织生长，其实胰岛素还有另一重身份——神经营养素，具有调节神经元增殖、凋亡、分化和突触形成的作用[27]。胰岛素23 大连医科大学硕士学位论文通过与胰岛素受体结合而发挥功能，表达胰岛素受体的部位很多，其中脑内主要在海马、皮质、杏仁体等部位表达，很明显这些脑区与记忆有关，因此胰岛素还可以影响着学习、记忆和认知[28]。大多数脑胰岛素主要由外周组织分泌，通过受体摄取机制进入大脑而发挥作用[29]。研究表明，适量的胰岛素浓度具有神经营养作用，当脑内胰岛素含量过高时，它会导致脑内β淀粉样蛋白清除障碍而蓄积。因为组织内调控胰岛素和β淀粉样蛋白含量的关键物质是胰岛素降解酶，胰岛素可以结合胰岛素和β淀粉样蛋白并使其水解。与β淀粉样蛋白相比，胰岛素降解酶与胰岛素亲和力更高，因此，当脑内胰岛素含量增加时，会导致β淀粉样蛋白的蓄积[30]。β淀粉样蛋白是由39-43个氨基酸残基组成的肽类物质，它来源于淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein，APP）[31]。APP生成β淀粉样蛋白主要有两种途径：其中一个途径是非淀粉样肽途径，该途径会产生可溶的sAPPα蛋白，由α分泌酶和γ分泌酶酶分解加工形成[32]。另一个途径是淀粉样肽途径，在此途径中，APP被β分泌酶分解，产生sAPPβ和C-末端片段（C99），随后在γ分泌酶的作用下产生Aβ肽[33]。β淀粉样蛋白最常见的亚型是Aβ1-40和Aβ1-42，Aβ1-42较Aβ1-40具有更高的疏水性和聚集性[34]。除了胰岛素会促进β淀粉样蛋白蓄积外，胰岛素抵抗可以通过改变胰岛素信号转导、β分泌酶活性促进β淀粉样蛋白的生成与蓄积[35]。本研究第一部分所建立的T2DM模型具有高胰岛素血症及胰岛素抵抗。在第二部分，本研究对NC组和T2DM组实验兔海马区进行Aβ1-42免疫蛋白染色，发现T2DM组较NC组海马区Aβ1-42的含量显著增多（P<0.05），证实了T2DM组实验兔海马区存在β淀粉样蛋白的蓄积。我们发现NC组也存在少量的Aβ1-42，表明随着实验周期的进展，兔龄也会促使脑组织产生β淀粉样蛋白，但仅仅是由于年龄不足以造成β淀粉样蛋白蓄积，除非伴随其它因素，这也表明T2DM会促进β淀粉样蛋白。海马在认知过程中起着重要作用，易受各种内源性物质刺激而导致神经元死亡，研究发现，在认知功能障碍的患者早期即可出现海马体积萎缩等改变。组织萎缩的主要原因是细胞形态缩小、细胞凋亡而致细胞数目减少。细胞凋亡是细胞生理性、程序性的死亡，β淀粉样蛋白的蓄积亦会激活脑内氧化应激及免疫系24 大连医科大学硕士学位论文统，从而促进细胞损伤甚至凋亡[36]。本研究对NC组及T2DM组使用TUNEL法检测细胞凋亡，结果显示，NC组与T2DM海马区均存在少量的凋亡细胞，但尚未出现显著的统计学差异（P>0.05），本研究分析，可能是由于实验周期尚短，不足以导致NC组与T2DM组细胞凋亡间出现显著的差异。2T2DM脑组织相位值改变SWI是一种基于梯度回波序列的影像学技术，基本原理是利用不同组织间磁敏感性不同而成像，具有分辨率高、信噪比高、三维等特点[37]。SWI技术早期主要用于脑静脉成像，后来研究发现SWI对铁沉积非常敏感，可以测量组织内仅1mg/g铁的含量[38]。因此在脑肿瘤分级、脑血管畸形、脑变性疾病等多方面也有广泛应用。影响着脑组织SWI相位值的主要物质是脑铁。铁对于许多大脑生理过程来说是必不可少的，比如基因表达、髓鞘形成、神经元发育、酶反应、多巴胺合成、电子传递以及通过改变价态而提供能量等多个方面[39][40]。此外，许多神经系统疾病，如帕金森氏病（PD）[41]、AD[42]和多发性硬化（MS）[43]等存在脑铁的异常，提示脑铁浓度的蓄积可能是促进疾病发生发展的重要物质。研究发现，β淀粉样蛋白聚合时存在铁的结合位点[44]；脑铁还可以通过影响APPmRNA的的表达来调节APP的形成，促进β淀粉样蛋白的生成[45]；这些研究表明脑铁含量与β淀粉样蛋白的生成与聚集之间存在相关性。目前对于β淀粉样蛋白的影像学检测只能依靠正电子发射断层显像（PET）β淀粉样蛋白放射性核素示踪剂成像，然而，由于空间分辨率的限制和放射性核素存在放射性，目前尚难以广泛应用[46]。探索其它影像学序列反映β淀粉样蛋白的沉积在临床应用中具有重要意义。2015年，Meadowcroft[47]使用小鼠模型研究SWI相位值与脑铁之间的关系时，发现影响SWI相位值改变的除了脑铁还有β淀粉样蛋白，β淀粉样蛋白可以缩短横向弛豫时间，从而影响SWI相位值。那么SWI相位值与β淀粉样蛋白蓄积之间是否存在着相关性呢？这个问题的解决将有助于SWI在β淀粉样蛋白相关性疾病中的应用。本实验对NC组及T2DM组实验兔进行多次SWI序列扫描，结果显示在25 大连医科大学硕士学位论文T2DM组造模成功后第10周，T2DM组海马区相位值较NC组出现显著变化（P<0.05）。之后，我们对海马区进行的β淀粉样蛋白与细胞凋亡检测，并与SWI相位值之间做相关性分析，结果显示SWI相位值与β淀粉样蛋白之间存在相关性，而与细胞凋亡之间无显著的相关性，说明SWI相位值可以在细胞凋亡前就能反映T2DM脑铁沉积，而异常铁沉积可能反映了β淀粉样蛋白蓄积，这对进一步探究T2DM脑损伤的机制具有重要意义。3T2DM脑组织微结构改变常用于MRI脑组织微结构的弥散成像包括两大类：DTI及DKI。其中DTI成像技术是以水分子自由扩散运动完全符合高斯分布为假设基础[48]，而实际上组织中的水分子由于所处复杂结构的影响，如细胞器，细胞间隙等限制水分子的扩散，阻碍其布朗运动，导致其并不完全符合高斯分布模式。因此，Jensen等[49]于2005年提出扩散峰度成像（DKI）模型，用扩散峰度模型对组织中水分子非高斯分布的扩散运动进行拟合，发现DKI可以更好的反映组织的微细结构。DKI是以DTI为基础，引入概率分布与四阶峰度，相当于DTI基础上的延伸。因此DKI除了具有DTI参量如部分各向异性分数(fractionalanisotropy，FA)、平均扩散系数(meandiffusion，MD），还具有其特定的参量，如平均峰度(meankurtosis，MK)、轴向峰度(axialkurtosis，AK)、径向峰度(radialkurtosis，RK)、峰度分数各向异性(kurtosisanisotropy，KA)以及扩散峰度各向异性(diffusionalkurtosisanisotropy，KFA)，其中MK值反映微观结构中水分子扩散受限的程度，目前是DKI中应用价值最高的参量[50]。DKI技术在临床研究中应用广泛，如急性脑梗塞范围与预后评估[51]、脑肿瘤分级[52]、一氧化碳中毒脑损伤[53]等。DKI序列中有两个重要的参数：扩散敏感梯度方向和扩散敏感因子b。扩散敏感梯度方向可以反映水分子运动方向的信息，DKI至少为15个方向；DKI临床中常使用多b值进行数据的采集，b值的增多可以更好的反映水分子的扩散运动，本研究的DKI序列采用了15个方向与3个b值对兔脑进行扫描。本研究发现随T2DM病程周期的增长，T2DM组实验兔较NC组在第10周海马区MK值出现显著性增高（P<0.05），说明T2DM会导致脑灰白质微结构的损伤。然而，我们将MK值与β淀粉样蛋白及细胞凋亡之间进行相关性分析，发26 大连医科大学硕士学位论文现并无显著的相关性。我们分析，可能是由于DKI反映着神经元微细结构的损伤，而这种损伤尚未造成明显的细胞凋亡差异，这也说明了DKI对脑微结构损伤的敏感性，将有助于T2DM脑病的早期发现与早期治疗。4局限性本研究样本量少，还需要进一步较大样本的研究对研究结果予以验证；此外，本研究缺少神经元轴突、髓鞘相关的病理检测，对DKI的敏感性指标MK值的改变也需进一步研究。（四）结论在第10周SWI相位值及DKIMK值出现显著性差异时，T2DM组较NC组出现显著的Aβ1-42的沉积（p<0.05），说明T2DM会加重脑组织的β淀粉样蛋白的蓄积，也表明SWI及DKI可以在一定程度上反映T2DM脑损伤。SWI的相位值与β淀粉样蛋白之间存在显著相关性，可以作为β淀粉样蛋白检测的MRI指标之一。（五）参考文献[1]BoutayebA,BoutayebS.Theburdenofnoncommunicablediseasesindevelopingcountries.InternationalJournalforEquityinHealth,2005,4(1):1-8.[2]Arrieta-CruzI,Gutiérrez-JuárezR.TheRoleofInsulinResistanceandGlucoseMetabolismDysregulationintheDevelopmentofAlzheimer´sDisease.RevistaDeInvestigacionClinica,2016,68(2):53-58.[3]BruehlH,WolfOT,SweatV,etal.ModifiersofCognitiveFunctionandBrainStructureinMiddle-AgedandElderlyIndividualswithType2DiabetesMellitus.BrainResearch,2009,1280(1280):186-194.[4]MehlaJ,ChauhanBC,ChauhanNB.ExperimentalInductionofType2DiabetesinAging-AcceleratedMiceTriggeredAlzheimer-LikePathologyandMemoryDeficits.JournalofAlzheimersDiseaseJad,2014,39(1):145-62.[5]MoranC,BeareR,PhanTG,etal.Type2diabetesmellitusandbiomarkersofneurodegeneration.Neurology,2015,85(13):1123-30.[6]SehlinD,FangXT,CatoL,AntoniG,LannfeltL,SyvänenS.Antibody-basedPET27 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大连医科大学硕士学位论文病(diabeticencephalopathy，DE)、糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)、视网膜疾病(diabeticretinopathy，DR)和各种与DM相关的心血管疾病[1]。DM主要分为两种类型：T1DM和T2DM，T1DM通常被认为是由免疫反应及免疫相关的介质，直接或间接的破坏产生胰岛素的胰腺β细胞而引起[2]。因此，它常被认为是一种自身免疫性疾病，以儿童和年轻成人最为多见[3]。T1DM的治疗方法主要是通过长期体外血糖监测并给予外源性胰岛素，这种治疗方法价格昂贵，难以长期坚持，而且如此长期不间断的调节血糖，也可能导致高血糖-低血糖失调及体内调节机制紊乱[4]。T2DM与机体组织器官产生胰岛素抵抗有关，机体胰腺细胞代偿功能缺失，胰岛素作用相对不足[5]。T1DM和T2DM有着多器官、多系统参与该疾病的发生，其发病机制是相当复杂的。由于DM发病机制的复杂性和并发症的多样性，实验模型的动物选择应该慎重，如何选择合适的动物主要取决于实验计划中研究疾病的哪个方面，如糖尿病发病机制、基因突变等。研究者可以通过各种不同的机制去获取以胰岛素缺乏为特征的T1DM动物模型，如化学药物损伤胰腺β细胞的动物模型、自发性自身免疫性T1DM动物模型等。目前用于T1DM研究的自发性自身免疫性动物模型是通过高度自交等有限的途径筛选繁育而来，与人类T1DM发病的相关性一直受到质疑[6]。而T2DM的动物模型种类繁多，从病理生理模型到各种并发症的模型[7]，这些动物模型以胰岛素抵抗模型和/或胰腺β细胞衰竭模型为主，另一方面，一些T2DM动物模型是肥胖的，和人类T2DM与肥胖有着密切关系存在着极高的相似度。T2DM动物模型大多数都存在与肥胖、葡萄糖耐量减低和/或胰岛素抵抗有关的单基因或多基因突变，从而导致血糖长期处于高水平[8]。2DM动物2.1ZDF(ZuckerDiabeticFatty)大鼠ZDF大鼠于1961年首次通过Merck(M系)和Sherman大鼠杂交后筛选繁育而来，由于瘦素受体基因(FA)突变导致食量增加，在4周龄即变得肥胖[9]。该系大鼠具有高脂血症，高胰岛素血症、高血压以及糖耐量减低等T2DM生理特征[10]。在高能量饲料喂养时，FA基因突变的雄性ZDF大鼠会发展为典型的T2DM模型，而雌鼠不会出现明显的糖尿病症状。ZDF大鼠在生长过程中，约3至8周龄33 大连医科大学硕士学位论文出现胰岛素抵抗并伴有糖耐量减低，约8至10周龄会出现明显的高血糖，约10至11周龄时随机血糖检测可高达500mg/dL。有研究证实血清胰岛素的含量与胰岛细胞数目存在着相关性，这表明ZDF大鼠在发展为高血清胰岛素时存在着胰腺细胞的增生[10]。体型肥胖的大鼠血清甘油三酯和胆固醇水平比体型瘦小的大鼠高，肥胖型大鼠骨骼肌内及胰腺细胞内会出现非氧化代谢脂肪酸沉积并产生脂毒性[11]。肥胖会导致一系列的并发症，如胰岛素抵抗、心血管疾病和DM等，肥胖并发症的出现通常被认为是由于组织中代谢产物的蓄积并损伤细胞功能，最终加速正常细胞调亡[12]。因此，通过使用高饱和脂肪和高糖饮食饲养ZDF大鼠，可以诱导出肥胖型ZDF大鼠，提高ZDF大鼠的成模率。ZDF大鼠体型肥胖，会引起繁殖能力的减低，这影响着大鼠筛选与培育，而对肥胖型大鼠注射丙酸睾丸素(TP)可以提高繁殖能力[13]。目前ZDF大鼠是通过该系由于基因突变出现糖尿病表型的Zucker大鼠进行近亲杂交培育而来。这种繁育方法所获得的ZDF大鼠没有Zucker大鼠肥胖，但是存在着更严重的胰岛素抵抗，而且不能通过胰腺β细胞增生而缓解[14]，ZDF大鼠在8周龄前出现高胰岛素血症，随后血清胰岛素水平下降[15]。目前的研究表明该系大鼠存在着胰腺结构的破坏、胰腺β细胞脱颗粒化、细胞凋亡数目增多，瘦素受体缺陷的雄性ZDF大鼠已逐渐演变为一个流行的T2DM预临床研究动物模型。2.2BB大鼠这种类型的大鼠是通过Wistar大鼠筛选繁殖而来，1974年加拿大生物繁殖机构首次发现了这种具有自身免疫性DM的大鼠，之后，通过近交繁殖、远交繁殖获取具有DM倾向的BB大鼠[16]。成年的BB大鼠DM发病率无明显的性别差异，在8至16周龄的大鼠约有90%出现严重的DM症状，表现为进展性高血糖、低胰岛素血症性体重减轻和胰岛素依赖的酮症。BB大鼠临床症状和代谢症状在胰腺组织形态学异常之前出现，这表明早期阶段仅能检测到胰岛细胞干扰素(IFN-γ)和主要组织相容性复合体(MHC)I类分子表达增强，之后才会通过组织学检查发现巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、T细胞和少量的B细胞逐步浸润胰岛细胞[17]。34 大连医科大学硕士学位论文虽然BB大鼠胰腺组织学检查可以观察到B细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞等，但是CD4+T淋巴细胞数量严重减少，CD8+T细胞几乎没有表达，T淋巴细胞减少是BB大鼠出现DM时最主要的病理特征[18]。由于人类T1DM患者亦具有淋巴细胞减少的典型特征，因此，BB大鼠常被用于研究人类T1DM[19]。T淋巴细胞是在出生时表达，与动物免疫缺陷具有密切关系，T淋巴细胞含量的减少说明BB大鼠存在着免疫缺陷。虽然BB大鼠血清中循环免疫球蛋白和各种特异性抗体水平正常，但是体内的依赖T细胞的特异性免疫能力降低[20]。目前，本模型发生T1DM时基因是否出现异常尚不明确[21]。在一些DM神经病变干预的研究，BB大鼠也常被使用[22]。BB大鼠的胰腺形态与人类T1DM相似，以特征Th1型淋巴细胞为主[23]。BB大鼠亦存在ART2+T细胞严重缺乏，ART2是存在成熟T细胞参与识别特异性抗原细胞及免疫调节[24]。导致自发性糖尿病BB大鼠出现胰腺β细胞自身免疫反应的机制尚不明确，可能涉及抗原提呈RT1u分子。给机体注射CD4+ART2+T细胞可克服淋巴细胞减少的影响，被认为是一个预防自发性糖尿病BB大鼠模型独特的治疗方式[25]，该治疗方式尚没有在人类T1DM患者上应用过。2.3GK（Goto-Kakizaki）大鼠GK大鼠在幼生期即可出现轻度高血糖的，是一种非肥胖型动物模型。这种T2DM模型是通过筛选出达到糖耐量上限的Wistar(W)大鼠进行反复近交繁殖[26]，糖耐量异常是由于遗传性胰腺β细胞的数量减少及功能的减退。长期暴露于高血糖(糖毒性)可能会进一步损害胰腺β细胞功能和并产生胰岛素作用，从而加重高血糖。另外，胰岛素抵抗可能是该模型高血糖出现进展的第二大关键因素。GK大鼠胰腺细胞可能发展成为具有特征性的“海星形”，主要是胰腺组织结构破坏合并纤维化，纤维分隔分离胰腺内分泌细胞形成类似海星的外观。在年轻GK大鼠的胰腺不会出现海星状的特点，其随着年龄的增长而发生发展[27]。成年GK大鼠的胰腺β细胞数量及胰岛素储存量几乎下降到正常的60%[28]。GK大鼠体内胰腺β细胞数目的减少不仅与β细胞凋亡的增加有关，在一定程度上还与β细胞复制增殖减少有关[29]。除了上述的影响因素外，GK大鼠β细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌的异常还与长期暴露在糖尿病的环境因素有关。长期暴露在轻微的慢性高血糖和高浓度非酯化脂肪酸的血液中，在一定程度上会损失着胰腺β细胞，即所谓的糖35 大连医科大学硕士学位论文脂毒性。有实验室在采用GK大鼠作为糖尿病模型的研究中，对GK大鼠进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，结果显示GK大鼠基础血糖水平显著降低，血糖浓度在60分钟达到高峰，然后血糖浓度才开始下降，表明存在着糖耐量受损。此外，GK大鼠的高血糖可通过运动进行调节。研究显示运动组GK大鼠空腹血糖水平较对照组显著降低，OGTT试验显示0min时间点运动组血糖为6.82±0.3mmol/L，而对照组为9.17±0.21mmol/L，在60min时间点运动组较对照组血糖为16.39±0.81mmol/L和20.51±0.58mmol/L，在120min时间点运动组较对照组血糖为14.58±0.88mmol/L和19.61±0.76mmol/L[29]，这表明适量运动可以预防或延缓T2DM，可能是由于运动状态下消耗血糖以此减少血糖在肌肉内的蓄积。2.4NOD（NonobeseDiabetic）小鼠NOD小鼠首先在1974年由日本Shionogi实验研究所培育而来[30]。在3周龄或4周龄出现胰腺炎性改变。在这个DM前期阶段，胰腺组织镜检可发现CD4+和CD8+淋巴细胞浸润，亦存在NK细胞和B细胞[31]。CD4+和CD8+淋巴细胞的胰腺浸润促进了DM的发生发展。胰腺炎性改变导致胰腺β细胞的破坏，而出现糖尿病的典型症状通常出现在10至14周龄，此时大约90%的胰腺细胞分泌胰岛素缺失，糖尿病症状会持续到30周龄。当出现典型DM症状时，NOD小鼠体重会迅速减轻，并且需要胰岛素治疗。NOD小鼠是研究T1DM最常用的模型之一。与其它自身免疫疾病的模型不同，该模型可以产生与人类T1DM类似的自发性DM。研究发现NOD小鼠模型存在于人类相似的自身抗原和生物标志物，这使得治疗T1DM的研究成为可能[32]。在NOD小鼠和人类中，有助于发生T1DM易感性的遗传因子就是MHC，在小鼠体内被称为idd1，在人类体内是IDDM1[33]。此外，在NOD小鼠和人类发现超过40个基因位点在调节T1DM易感性中起着重要作用，包括与免疫系统功能相关以及与胰岛β细胞功能相关的基因[34]。NOD小鼠的胰腺组织在3周龄即存在先天免疫细胞浸润，这些先天性免疫细胞包括淋巴细胞浸润前的树突状细胞(DC)、巨噬细胞和中性粒细胞[35]。同样，在人类T1DM患者也发现这些细胞的浸润[36]。几项研究表明，NOD小鼠MHCⅡ类蛋白与人类的结构相似，这可能表明其是NOD小鼠和人类产生该病易感性的因素之一[37]。NOD小鼠和人类T1DM具有相似的致病基因，这使得在T1DM机制和通道的研究更加深入[38]。因此，36 大连医科大学硕士学位论文NOD小鼠可以在调节自身免疫反应的治疗方法中作为一种非常具有潜力的模型。然而，也应该注意到，在NOD小鼠中有许多有效的药物，而在人类T1DM治疗中是无效的[39]。其中的一个主要问题是干预和治疗NOD小鼠时，科研人员可摘除NOD小鼠胰腺进行离体检查，而在人类却只能通过外周血检测生物标志物进行评定该干预措施是否有效[40]。从NOD小鼠到人类治疗中剂量转换也是问题之一。NOD小鼠出现糖尿病后亦会存在环境的改变，较少的与微生物接触，因此，为了维持DM的存活率及发病率，应在无特定病原体(SPF)条件下饲养小鼠。由于性别差异，发病的不可预测性，和SPF饲养条件的要求，这种NOD小鼠T1DM模型的较化学诱导的糖尿病模型更贵。有研究表明通过抽取糖尿病NOD小鼠的T细胞注射到未患糖尿病小鼠体内，可引起小鼠患糖尿病，从而提高患病率[41]。2.5Akita小鼠Akita小鼠是通过C57BL/6NSlc小鼠筛选出胰岛素2基因突变并导致胰岛素原产生路径异常的小鼠进行培育而来，最初在日本发现。该突变导致蛋白质异常折叠和聚集，伴有内质网应激。这些改变导致Akita小鼠在3至4周龄即出现明显的胰岛素依赖型糖尿病，并产生的啮齿类动物模型典型的DM症状，如高血糖、低胰岛素血症、多尿、多饮。它常被用于T1DM大血管病变和神经病变的研究中[42]。同样的，这种模型还被用于研究胰岛细胞内质网应激缓解剂的药物中。另外，Akita小鼠还具有一些T2DM的病理表现[43]。Akita小鼠出现Ins2C96Y突变，由于Ins2基因单碱基替换而形成。这种突变导致胰岛素蛋白质错异常折叠、胰腺β细胞产生毒性损伤和胰岛素分泌减少，导致T1DM[44]。Akita小鼠糖尿病模型表现出Ins2C96Y突变，使得胰岛素2链之间的二硫键的形成障碍，导致胰岛素蛋白质不能正常折叠和加工。错误折叠的前胰岛素原不能正常分泌并且存储在胰腺细胞的内质网(ER)内[45]，导致携带Ins2C96Y突变Akita小鼠逐步发展为T1DM。尽管新生Ins2C96Y突变的小鼠有正常大小的胰腺组织，并能分泌足够的胰岛素，随着时间的推移，基因突变的小鼠的胰腺β细胞数量逐渐减少。细胞凋亡数量的丢失与糖尿病的发生发展有关。Ins2akita的多态性表现为Akita小鼠的显性负效应，导致小鼠生命周期中持续出现严重的高血糖[46]。因此，Ins2C96Y可能表达对胰岛细胞产生毒性作用的物质，37 大连医科大学硕士学位论文导致胰腺β细胞数量的减少，引起Akita小鼠出现高血糖。有研究报道，Akita小鼠的糖尿病自主交感神经病变与其他啮齿类动物模型和人类的病理特征性改变密切对应[47]。Ins2C96YAkita小鼠也可以表现出高水平的蛋白尿和肾脏系统病理变化，因此，Akita小鼠模型亦常用于DN的研究中[48]。然而，没有出现蛋白尿的Ins2C96YAkita小鼠，肾脏病理改变仅表现为系模扩张，有人认为，出现这种改变的原因可能是Akita小鼠遗传背景可能对其肾损伤发展产生的影响。这种动物模型的缺点之一是Akita小鼠对抗神经病的药物无效，限制了其在DE中的应用[49]。综上，由于世界范围内DM患病率的增加，DM鼠模型在阐明DM及其并发症(如视网膜病变、肾病和神经病变)的发病机制中起重要作用。此外，DM鼠模型对于研究和开发新的DM药物及药物副作用是必不可少的。迄今为止，大鼠和小鼠模型为科研做出了重要贡献，但仍具有一定的局限性。因此，设计更好的DM动物模型，将能够对DM进行更进一步有关发病机制的研究和疾病的早期检测与治疗。建立糖尿病良好的动物模型，应该有以下一些主要的标准，如：DM动物模型应具有与人类相似的主要及次要致病机制，该模型应该对降糖药物敏感，模型需要适合于研究疾病的发病机制，以及治疗糖尿病常规药品的药物筛选。此外，疾病的动物模型有助于帮助科学家和研究人员更好地了解在临床前研究中的发病机制，但在临床试验中的治疗策略的疗效预测价值尚存争议。在这种情况下，需要进一步的研究来研究动物与药物治疗结合的作用。（二）参考文献[1]PapatheodorouK,BanachM,EdmondsM,etal.ComplicationsofDiabetes.Lancet,2015,2015(7666):264.[2]ToddJA.EtiologyofType1Diabetes.Immunity,2010,32(4):457–467.[3]HyttinenV,KaprioJ,KinnunenL,etal.GeneticLiabilityofType1DiabetesandtheOnsetAgeAmong22,650YoungFinnishTwinPairs.Diabetes,2003,52(4):1052–1055.[4]TaoB,PietropaoloM,AtkinsonM,etal.Estimatingthecostoftype1diabetesintheU.S.:apropensityscorematchingmethod.PlosOne,2010,5(7):e11501.[5]SolomonTP,SistrunSN,KrishnanRK,etal.Exerciseanddietenhancefatoxidationandreduceinsulinresistanceinolderobeseadults.JournalofAppliedPhysiology,2008,104(5):1313-1319.38 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大连医科大学硕士学位论文致谢首先，我要衷心感谢我的导师苗延巍教授对我的严格要求和悉心指导，本论文几番易稿都是在导师精心地指导下完成。导师渊博的学识、诲人不倦的高尚师德、严谨的治学精神、敬业的工作作风、独特的人格魅力，深深地激励着我，不仅使我树立了远大的学术目标，还使我明白了许多为人处世的道理，也永远是我学习生活的楷模和指路的明灯。值此学位论文完成之际，谨向三年来给予我亲切关怀和辛勤培育的导师致以最诚挚的谢意！衷心感谢大连医科大学附属第一医院放射科这个温暖的集体对我学习和工作上的大力支持和帮助，帮助我顺利的完成课题研究。衷心感谢郎志谨教授对我们青年一代的大力指导、无私帮助及谆谆教导，您渊博的知识、严谨的治学态度、实事求是的工作作风及朴实无华、平易近人的处事态度我都将铭刻于心，鞭策终生。衷心感谢大连医科大学第一附属医院放射科全体老师对我的帮助、指导和支持，让我少走了许多弯路，节省了时间。衷心感谢与我一同走过研究生阶段的所有师兄师姐、师弟师妹，与你们的深厚情谊是我今后人生中的巨大财富。还要感谢一直在我身后默默支持我的家人，感谢他们多年来对我的无微不至的关怀呵护，此文一并献给他们。最后，向在百忙之中抽空出来对本论文进行审阅、修改、评阅的专家还有参加本次论文答辩的所有老师表示真挚的感谢和祝福！谢谢！43 版权属大连医科大学所有
