不同来源大肠杆菌ESBLs基因分子流行病学研究

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学校代码：10564学号：2013202723分类号：S859.7密级：硕士学位论文不同来源大肠杆菌ESBLs基因分子流行病学研究曾莉指导教师：刘健华教授学院名称：兽医学院专业名称：基础兽医学答辩委员会主席：孙永学教授中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期：II 摘要超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpCβ-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对第三、四代头孢菌素类药物最重要的耐药机制。产CTX-M型ESBLs的大肠杆菌因其能高效水解临床一线药物——三代头孢菌素类药物，且食品源和动物源产ESBLs大肠杆菌可经食物链直接或间接传播给人，给人和动物的健康造成严重威胁。本研究通过比较不同来源（动物、食品和人）产CTX-M型ESBLs大肠杆菌及其质粒的相关性，为正确评估三代头孢菌素类药物在食品动物使用的风险性提供科学依据。2010-2014年间从广州市各地区采集不同来源样品，包括肉类食品（猪肉和鸡肉）、医院病人和社区健康人源、屠宰前食品动物（猪和鸡），分离了931株头孢噻肟非敏感大肠杆菌。采用PCR和测序方法对931株大肠杆菌进行5种ESBLs和pAmpC基因的检测和分析。结果显示，92.8%(864/931)的菌株检测到blaCTX-M、blaSHV、blaDHA和/或blaCMY基因，其中blaCTX-M-14、blaCTX-M-55和blaCTX-M-65是主要的流行型，分别有251株、150株和124株。另外，有73株携带blaCMY基因。blaCTX-M在肉类食品源大肠杆菌中检出率最高为86.5%；blaCMY在食品动物源中检出率最高10.6%。blaCTX-M-1G、blaCMY、blaCTX-M-55和blaCTX-M-24a阳性检出率在食品动物源菌株中最高，其次为肉类食品源和人源。blaCTX-M和blaCTX-M-65在肉类食品源菌株中检出率最高，说明肉类食品被耐药菌严重污染。blaCTX-M-14和blaCTX-M-15在人源菌株中检出率最高，其次为食品动物源和肉类食品源。采用琼脂稀释法测试了931株不同来源大肠杆菌对20种抗菌药的敏感性，结果发现，对氨苄西林、头孢噻肟、链霉素、复方新诺明和四环素的耐药率均超过70%，受试的所有菌株对亚胺培南敏感。人、食品动物和肉类食品三种不同来源大肠杆菌均表现对多种抗菌药物耐药，但对不同药物的耐药率有显著差异。采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和大肠杆菌系统进化分群方法研究100株blaCTX-M-55阳性菌株的克隆关系。结果表明大部分blaCTX-M-55阳性菌为非克隆传播关系，且多属于A组（45.0%），未检测出B2组大肠杆菌。采用接合实验、化学转化和质粒复制子分型方法研究blaCTX-M-55的水平传播和质粒特征。100株blaCTX-M-55阳性菌株成功获得了60株接合子和转化子，对质粒进行复制子分型，发现食品动物源blaCTX-M-55菌株以IncFII型质粒为主，而人源和肉类食品源菌株以IncFII型和IncI1型质粒为主。I 综上所述，产ESBLs大肠杆菌在人源、食品动物源和肉类食品源中分布广泛，且blaCTX-M-55的流行主要以IncFII型质粒水平传播为主，其可能通过食物链从动物传播到人。关键词：超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)；blaCTX-M；大肠杆菌II MolecularCharacteristicsofPlasmid-MediatedESBLsGenesinEscherichiacoliIsolatedfromAnimals,RetailMeatandHumansZengLi（GuangdongProvincialKeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticsDevelopmentandSafetyEvaluation,CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China）Abstract:Resitancetoextended-spectrumcephalosporinsinGram-negetivebacteriaismainlycausedbyextended-spectrumβ-lactamases(ESBLs)andplasmid-mediatedAmpCβ-lactamases(pAmpC).CTX-M-producingEscherichiacolicanhydrolyzeextended-spectrumcephalosporins.EscherichiacolicarriedtheESBLsgenesinfoodandanimalsourcescanbetransferedtohumandirectlyorindirectlybyfoodchain,whichcouldquickenthetransmissionofESBLgenesandposegreatthreattohumanandanimalshealthy.TheaimofthisstudywastocomparethemolecularcharacterizationofESBL-producingE.coliisolatesofdifferentorigins,soastoprovideabasisforriskevaluationoftheuseofcephalosporinsinfoodanimals.931cefotaxime-non-susceptiblestrainswereisolatedfromdifferentsources(animal,foodandhuman)inGuangzhouduring2010-2014.GenesencodingCTX-M,SHV,CMY,andDHAenzymeswereanalyzedbyPCRamplificationandsequencingamongthe931E.coliisolates.Theresultsshowedthat92.8%(864/931)oftheisolatescarriedblaCTX-M、blaSHV、blaDHAand/orblaCMYgenes,withblaCTX-M-14(251)、blaCTX-M-55(150)andblaCTX-M-65(124)bethemostpredominantgenes.Also73isolatescarriedblaCMYgene.blaCTX-M-1G、blaCMY、blaCTX-M-55andblaCTX-M-24aweremostprevalentinanimaloriginstrains,followedbyfoodoriginisolatesandhumanoriginisolates.TheprevalenceofblaCTX-MandblaCTX-M-65genesweredetectedhighestinfoodoriginalstrains,whichcouldillustratemeatfoodwereseriouslycontaminatedbydrug-resistantstrains.blaCTX-M-14andblaCTX-M-15genesweredetectedhighestinhumanstrains,followedbyanimalisolatesandfoodisolates.Antimicrobialsusceptibilitytestingofthe931isolatesto20antimicrobialagentswasperformedwiththeagardilutionmethod.Theresultsshowedmostoftheisolates(>70%)showedresistancetoampicillin,cefotaxime,streptomycin,sulfamethoxazole/trimethoprimandtetracycline.Alloftheisolatesweresusceptibletoimipenem.Isolatesofdifferentsourcesshoweddifferentresistancepatterns.III Pulsedfieldgelelectrphores(PFGE)andphylogeneticgroupmethodstoanalysisthepolygenenticandclonalrelationshipof100blaCTX-M-55positiveisolates.MostofCTX-M-55-producingE.coliisolatesbelongtophylogenenticgroupA（45.0%），nonebelongtoB2group.PFGEtypingrevealedthatmostblaCTX-M-55positiveE.coliclonallyunrelated.ConjugationandtransformationexperimentswereperformedtodeterminethetransferabilityofblaCTX-M-55genes.60outof100transconjugants/transformantswereobtained.PCRbasedplasmidreplicontypingresultsshowedthatmostofblaCTX-M-55-positiveplasmidsfromanimalisolatesbelongtoIncFII,whilemostblaCTX-M-55-positiveplasmidsfromhumanandfoodisolatesbelongedtoIncFIIandIncI1.Inconclution,E.colicarriedESBLsgeneswerewidelyspreadinhuman,animalandanimalfoods.ThespreadofblaCTX-M-55genewasmainlycausedbyhorizonaltransmissionofIncFIIplasmids,indicatingthepossibilityofthetransferofblaCTX-M-55genebyfoodchain.Keywords:ESBLs；blaCTX-M；EscherichiacoliIV 缩略词AMKAmikacin阿米卡星AMPAmpicillin氨苄西林APRApramycin安普霉素ATCCAmericanStandardCollection美国标准生物品收藏中心bpBasepair碱基对CIPCiprofloxacin环丙沙星CLSIClinicalandLaboratoryStanderdsInstitute临床实验室标准化委员会CTXCefotaxime头孢噻肟CAZCeftazidime头孢他啶CHLChloramphenicol氯霉素CLColistin黏菌素DNADeoxyribonucleicAcid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyrinediaminetriphoshate脱氧核糖核苷三磷酸DOXDoxycycline多西环素EBEthidiumBromide溴化乙锭EDTAEthylenediamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸ESBLsExtendedspectrumbeta-lactamases超广谱β-内酰胺酶FFCFlorfenicol氟苯尼考FOSFosfomycin磷霉素FOXCefoxitin头孢西丁FQUCefquinome头孢喹肟GENGentamicin庆大霉素IPMImipenem亚胺培南ISInsertionSequence插入序列MICsMinimumInhibitoryConcentration最小抑菌浓度NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation美国国家生物技术中心NEONeomycin新霉素OQXOlaquindox喹乙醇V ORFOpenReadingFrame开放阅读框PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PFGEPlusFieldGelElectrophoresis脉冲场凝胶电泳SDSSodiumDodecylSulphate十二烷基硫酸钠STRStreptomycin链霉素SXTSulfamethoxazole/Trimethoprim复方新诺明TETTetracycline四环素VI 目录1前言.....................................................................................................................................12材料与方法.........................................................................................................................62.1材料..................................................................................................................................62.1.1样品来源.......................................................................................................................62.1.2工程菌株.......................................................................................................................62.1.3抗菌药物.......................................................................................................................62.2细菌培养基和生化鉴定管..............................................................................................72.2.1酶和主要试剂...............................................................................................................72.2.2主要仪器和设备...........................................................................................................92.3方法................................................................................................................................102.3.1大肠杆菌的收集.........................................................................................................102.3.2ESBLs和pAmpC基因的检测..................................................................................112.3.3抗菌药物敏感性试验.................................................................................................132.3.4大肠杆菌种族系统进化分析.....................................................................................142.3.5脉冲场凝胶电泳.........................................................................................................152.3.6接合试验.....................................................................................................................172.3.7化学转化.....................................................................................................................182.3.8质粒提取.....................................................................................................................192.3.9质粒复制子分型.........................................................................................................212.3.10数据处理...................................................................................................................233结果...................................................................................................................................233.1ESBLs和pAmpC基因的检测.....................................................................................233.2ESBLs和pAmpC基因类型统计分析........................................................................243.3头孢噻肟非敏感大肠杆菌MIC结果..........................................................................303.4产CTX-M-55大肠杆菌种族系统进化关系结果........................................................313.5产CTX-M-55大肠杆菌PFGE结果............................................................................313.6blaCTX-M-55基因的接合、转化结果..............................................................................373.7blaCTX-M-55阳性复制子分型结果..................................................................................37VII 4讨论...................................................................................................................................394.1大肠杆菌ESBLs和pAmpC基因型流行特征............................................................394.2不同来源产CTX-M大肠杆菌耐药性分析.................................................................404.3blaCTX-M-55大肠杆菌遗传特征......................................................................................424.4blaCTX-M-55质粒复制子分型..........................................................................................425全文结论...........................................................................................................................43致谢..............................................................................................................................44参考文献........................................................................................................................45VIII 1前言抗生素和相关药物的使用使人类得以远离许多疾病，但是近几十年来，抗生素耐药细菌的出现及其传播给临床医生和科研人员带来了极大的挑战。现如今，细菌耐药性已经成为全球公共健康的一个巨大威胁，影响当前人类乃至后代的健康，也成为了二十一世纪主要的公共卫生安全挑战之一。在近代的动物养殖业中，不以治疗为目的的抗生素作为饲料添加剂被滥用，以期改善动物性能，提高养殖效益。随着长时间大量地使用抗生素，抗生素残留越来越多，动物体内及周围环境中细菌产生耐药并日趋严重。目前广泛流行的多重耐药细菌有：产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠杆菌、多重耐药沙门氏菌、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、氟喹诺酮类耐药弯曲杆菌和万古霉素耐药肠球菌等。这些细菌对目前常用的抗菌药物，如头孢菌素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类药物，均表现不同程度地耐药。耐药细菌的产生及快速传播，为临床治疗感染疾病增加了治疗成本和治愈风险，不仅对动物的健康造成危害，给养殖业带来经济损失，同时可经食物链传播给人，威胁人类健康。大肠杆菌作为共生菌，在人和动物的肠道及食品中广泛存在，一方面既保持了肠道内菌群的平衡，另一方面也成为了耐药基因的贮存库，为耐药基因在不同菌株间的传播创造了条件（Ahmedetal.,2007），在研究耐药基因的传播机制中至关重要。产ESBLs大肠杆菌能产生广谱β-内酰胺酶水解一线药物--广谱头孢菌素类药物，如头孢他啶、头孢噻肟和头孢曲松等药物，从而被认为是临床重要的多重耐药菌。产ESBLs大肠杆菌不仅对多种药物产生耐药，而且能释放毒力因子引起肠外感染（Pitout,2012）。产ESBLs大肠杆菌可由携带ESBLs基因的质粒在菌株间水平传播及菌株的克隆传播使得ESBLs基因快速广泛的流行，且协同氨基糖苷类、磺胺类和氟喹诺酮类耐药基因随质粒共同转移，进一步限制了大肠杆菌引起感染的治疗选择（Cantonetal.,2006）。产ESBLs大肠杆菌于二十世纪八十年代首次发现报道，之后迅速流行，并在二十一世纪前十年中期成为主要流行菌株。目前，ESBLs主要以TEM、SHV、CTX-M和OXA型较为常见，且各国、各地区ESBLs型亦有所不同。其中CTX-M型酶快速增长且由可转移性质粒介导在全球范围内迅速扩散，CTX-M型酶目前是大肠杆菌中最为普遍的ESBLs。CTX-M型ESBLs在二十世纪八十年代中期出现，以高度水解头孢噻肟为特征，对头孢他啶仅有轻度水解作用，水解活性可被酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦等抑制。CTX-M同TEM和SHV仅有40%的氨基酸序列相同。目前发现的1 CTX-M型ESBLs种类已有170多种（http://www.lahey.org/studies/），根据其氨基酸序列的差异（大于94%的相同序列认为是一个群，小于90%的相同序列认为是不同的群）分为5个群：CTX-M-1G、CTX-M-2G、CTX-M-8G、CTX-M-9G和CTX-M-25G（Cantonetal.,2012）。此酶已经成为亚洲某些国家如中国、日本、韩国的主要ESBLs类型；在欧洲，CTX-M型酶取代TEM、SHV成为其主要ESBLs。过去十年，CTX-M已经变成全球最流行的ESBLs型（Cantonetal.,2006；Cantonetal.,2012），其在动物源、食品源和人源的流行现状总结如下。（1）动物源在国内，2004-2007年间鸡源ESBLs大肠杆菌分离率为18.5%（Lietal.,2010），而后Li等（2010）报道鸡源ESBLs大肠杆菌分离率为25%，且以CTX-M型为主。郑红青等（2011）报道食品动物源产ESBLs大肠杆菌检出率为14.2%，其中CTX-M型占大比例，为83.4%。2003~2012年10年间食品动物源大肠杆菌CTX-M型ESBLs调查发现，CTX-M-55明显增加的趋势，甚至超过CTX-M-14，位居第一（Raoetal.,2014）。栾鹏等（2014）报道哈尔滨及周边地区鸡源产ESBLs大肠杆菌占79.6%，其中CTX-M占71.5%。郑新添等（2015）报道福建省猪源产ESBLs大肠杆菌占28.6%，且以CTX-M-15为主，占56.7%。曲志娜等（2013）报道山东莱西地区鸡源和猪源产ESBLs大肠杆菌检出率分别为81%和6%，且TEM和CTX-M型酶为主要流行型。曲志娜等（2015）报道青岛鸡源产ESBLs大肠杆菌占83.1%，TEM、OXA、CTX-M-65和CTX-M-55型酶占优势，且产ESBLs大肠杆菌对庆大霉素的耐药率高于非产ESBLs大肠杆菌，而对四环素和氟苯尼考的耐药率较低。2008年比利时报道鸡源60.3%大肠杆菌对头孢噻呋耐药，ESBLs基因主要为blaCTX-M-1和blaTEM-52（Smetetal.,2008）；2013年德国报道屠宰场鸡源肠杆菌中，81%为ESBLs，且主要为CTX-M型（Reichetal.,2013）；2015年罗马尼亚报道鸡源AmpC/ESBLs大肠杆菌分离率为69%，其中53%为CTX-M-15（Maciucaetal.,2015）。2015年韩国报道屠宰场肉鸡源产ESBLs大肠杆菌检出率为39.7%，且CTX-M-1G基因占40.3%（Limetal.,2015）。在意大利北部，食品动物源产ESBLs大肠杆菌检出率为26.8%（Stefanietal.,2014）。葡萄牙家禽源产ESBLs大肠杆菌检出率为18%，以CTX-M-1G、CTX-M-2G和CTX-M-9G为主（Mendoncaetal.,2016）。（2）人源2 自二十世纪九十年代报道国内第一株产SHV-2型ESBL菌株后，产ESBLs菌株迅速扩散，尤其是2000年后，其中最为普遍的是CTX-M型ESBLs，且分布明显高于美洲和大部分欧洲国家。Xia等（2014）报道，社区感染产ESBLs大肠杆菌在中国成为普遍致病菌，blaCTX-M-14最普遍，blaCTX-M-55和blaCTX-M-15呈快速增长。孟现民等（2016）对我国2005-2014年人医临床主要致病菌的研究指出，产ESBLs大肠埃希菌的占比基本维持在55%左右，近10年来大肠埃希菌的耐药性得到一定程度的遏制。张珍丹等（2016）研究指出，产ESBLs大肠埃希菌导致尿路感染者复发率高，且尿路感染复发与产ESBLs大肠埃希菌基因型CTX-M和TEM有相关性。钟文等（2016）报道尿路感染致病菌以大肠杆菌和肺炎克雷伯菌为主，且产ESBLs大肠埃希菌占55.3%。唐进春等（2016）收集住院患者尿路感染分离的大肠杆菌进行耐药性研究，检出CTX-M型酶占64.9%。2016年上海七家疗养院人源产ESBLs大肠杆菌中99%为产CTX-M，且CTX-M-14高达42%（Zhaoetal.,2016）。在玻利维亚，过去20年健康儿童粪便菌株产CTX-M型酶显著增加（Bartolonietal.,2013），且2011年报道，原来占主导优势的CTX-M-2G已被CTX-M-1G和CTX-M-9G取代（Redondoetal.,2013；Ruizetal.,2011）；Bartoloni等人（2016）报道医院引发尿路感染的产ESBLs大肠杆菌以CTX-M-15为主要流行酶型。2015年罗马尼亚报道的人源临床株中，blaCTX-M-15携带率最高（Lickeretal.,2015）。2016年荷兰报道分离自阿姆斯特丹健康人群粪便的产ESBLs大肠杆菌以CTX-M-1和CTX-M-15型为主（Reulandetal.,2016）。加纳人医临床源产ESBLs大肠杆菌全为CTX-M型，且98.4%为CTX-M-15（Agyekumetal.,2016）。土耳其社区获得性尿道致病菌中67%为大肠杆菌，其对磷霉素和阿米卡星较为敏感，其中24%为产ESBLs大肠杆菌（Yilmazetal.,2016）。乌拉圭人医临床非肠道源产ESBLs大肠杆菌中，CTX-M-15占67.3%，其次为CTX-M-2（14.6%）和CTX-M-14（9.1%）（Vignolietal.,2016）。2016年印度报道某医院产ESBLs大肠杆菌检出SHV型最多，其次为TEM和CTX-M型（Ravikantetal.,2016）。（3）肉类食品源在国内，市售猪肉和鸡肉存在大肠杆菌污染，且部分菌株已产生较为复杂的耐药性（何雪梅等，2014；孙晓明等，2010；周雪雁等，2014；邹立扣等，2012）。2016年Xie等报道深圳肉类食品源头孢噻肟耐药大肠杆菌中，产CTX-M大肠杆菌占67.3%。3 在西班牙，火鸡肉和肉鸡肉源ESBLs大肠杆菌的分离率从2007年的62.5%增长至2010年的93.3%，且CTX-M型ESBLs增加（Egeaetal.,2012）。在英国曾报道从南美洲进口的肉类中分离的耐单氧环头孢菌素的大肠杆菌，基因型以blaCMY和blaCTX为主，其中，CTX-M-2G和CTX-M-8G较为普遍（Dhanjietal.,2010）。2015年巴西报道鸡肉源产ESBLs/AmpC大肠杆菌以blaCMY、blaCTX-M-2blaCTX-M-8为主，但也首次发现鸡肉源大肠杆菌携带blaCTX-M-15基因（Botelhoetal.,2015）。2015年土耳其报道的鸡肉源和牛肉源产ESBLs大肠杆菌以CTX-M-1为主，占46.4%（Onenetal.,2015）。而加纳鸡肉源产ESBLs大肠杆菌以CTX-M-15为主（Rasmussenetal.,2015）。2015年越南报道市售肉类食品（鸡肉、猪肉和鱼虾）源产ESBLs大肠杆菌检出率为40.6%，其中blaCTX-M-1G(50.7%),blaCTX-M-9G(41.5%),blaTEM(59.9%)和blaSHV(2.8%)（Quocetal.,2015）。2016年越南报道胡志明市产ESBLs/AmpC大肠杆菌在食品样品中分布情况，从高到低依次为鸡肉、猪肉、牛肉和鱼虾（92.7%、34.8%、34.3%和29.3%），且基因型检出率从高到低为blaCIT、blaCTX-M-9G和blaCTX-M-1G(34.5%、31.2%和29.8%)（Nguyenetal.,2016）。2016年韩国对零售鸡肉、鸡场和屠宰场产ESBLs大肠杆菌流行情况的调查指出，鸡肉源中产ESBLs大肠杆菌最为丰富，且以CTX-M-15为主（Joetal.,2016）。CTX-M-55型ESBL最早于2007年在泰国被报道存在于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的质粒上，并报道了blaCTX-M-55的全序列（Kiratisinetal.,2007）。目前，CTX-M-55在全球各地均有报道，并且在亚洲地区逐步占据优势地位，仅次于CTX-M-14，且在环境、宠物、老鼠、食品动物、动物性食品及人均有报道，其发展趋势非常严峻。在中国，CTX-M-55于2008年首次在大肠杆菌中报道（李智山等，2008），而后在肺炎克雷伯菌（Shietal.,2009）、鼠伤寒沙门氏菌（Yuetal.,2011）、志贺氏菌（Zhangetal.,2011）中也有发现。国内尤其是食品动物和病人以及宠物，CTX-M-55的检出率接近25%，仅次于CTX-M-14（Sunetal.,2010；Xiaetal.,2014；Zhengetal.,2012）。2003-2012年10年间的食品动物源大肠杆菌CTX-M基因型研究发现，CTX-M-55呈明显增加的趋势，甚至超过CTX-M-14，位居第一（Raoetal.,2014）。在肉类食品（猪肉和鸡肉）中，CTX-M-55在CTX-M型ESBLs中检出率高达87.3%，成为最多的ESBL（Xuetal.,2014）。在日本，CTX-M-55在宠物及肉鸡中均有报道，且肉鸡中CTX-M-55型大肠杆菌占10%（Haradaetal.,2012；Kameyamaetal.,2013）。在韩国，CTX-M-55在流浪狗及健康食品动物中均有报道（Tamangetal.,2013；Tamangetal.,2012），且4 2012年从一名曾到中国旅行的韩国女性病人分离到携带blaCTX-M-55的宋内氏志贺杆菌（Leeetal.,2013）。同样，在瑞士，2009至2011年间，从4位病人身上分离的沙门氏菌均产CTX-M-55，且其中三位在生病前均有去过泰国，有趣的是CTX-M-55首次就是在泰国发现的（Gallatietal.,2013）。这也证实耐药菌株可通过旅行而在各国间传播扩散。总之，CTX-M-55型ESBL在亚洲各地的迅速传播，使得细菌耐药的形势异常严峻。2013年Leistner等人指出，经常食用猪肉与社区获得性产ESBLs大肠杆菌的定植有相关性。2011年荷兰报道了鸡肉源大肠杆菌所携带ESBLs基因与人源临床株携带的主要基因型相同，暗示鸡肉可能作为一种导致人感染产ESBLs大肠杆菌的来源（Overdevestetal.,2011）。2013年荷兰研究人员分别报道了鸡肉源产ESBLs大肠杆菌和含有携带blaCMY-2基因的IncK型质粒的大肠杆菌与同一地区的人源临床大肠杆菌耐药分子特征高度相似，预示着鸡肉中丰富的耐药大肠杆菌对人临床大肠杆菌的耐药有一定的贡献（Kluytmansetal.,2013；Platteeletal.,2013；Voetsetal.,2013）。然而，在屠宰场和食品加工过程中，工作人员与食品之间相互影响，也有报道称屠宰员未严格遵守要求，人源菌污染肉类食品（Gomes-Nevesetal.,2012；Jacksonetal.,2013）。另外，有报道食品称动物源大肠杆菌中携带众多与人源菌相似的ESBLs基因，暗示食品动物，尤其是家禽，也可作为人源产ESBLs大肠杆菌的储存库（Bergeronetal.,2012；Lajharetal.,2015）。此外，社区健康人群中产ESBLs大肠杆菌流行，也暗示着社区可能是医院ESBLs的潜在来源（Mathaietal.,2015）。然而，2014年加蓬报道从进口鸡肉中分离的23%产ESBLs大肠杆菌，以CTX-M-1为主，但并未在人源菌中发现（Schaumburgetal.,2014）。deBeen等（2014）用全基因组测序方法对传统分型方法认为从家禽到人是克隆传播的头孢菌素耐药大肠杆菌进行检验，结果并不支持是克隆传播，反而认为是通过质粒传播。虽然产ESBLs大肠杆菌已在社区、医院、家畜、食品、伴侣动物、野生动物及水体河流中广泛分布，但就其耐药发展过程及其在各种来源间的传播、维持一直都有争论，尚未形成定论，还需更多不同地区的研究数据来解析。β-内酰胺类药物，尤其是三代、四代头孢菌素类药物，无论在兽医临床还是人医临床，都是一类很重要的药物（Livermoreetal.,2007），随着这类药物在临床及生产上的广泛应用，细菌对这类药物的耐药性问题日益凸显出来，特别是质粒介导的5 ESBLs和AmpC耐药机制的出现，携带ESBLs和pAmpC耐药基因的质粒通过水平传播以及菌株的克隆传播机制，使耐药问题日益严重。其中CTX-M型ESBLs因其能高效水解临床一线药物--三代头孢菌素类药物且快速广泛传播，对人和动物的健康造成重大威胁。CTX-M型ESBLs的广泛，快速的传播所导致的抗生素耐药给临床的治疗带来巨大的挑战。对其传播机制和基因环境的研究有助于发现其传播的分子生物学基础，发掘潜在的药物靶点，找到有效的控制方法，以及合理有效的使用抗生素提供有力的依据。食品源和动物源ESBLs大肠杆菌可经食物链或直接、间接接触而传播给人，从而加大人类患病风险和治疗难度。质粒介导的blaCTX-M基因在动物源菌株上耐药数据已经有较多的报道，但blaCTX-M基因在不同来源（动物源到人源）的大肠杆菌中的传播机制是如何，携带blaCTX-M基因的质粒，其特征是什么，在动物源菌株和人源菌株间是如何传播，目前为止，这些疑问尚不明确。本研究拟对不同来源(食品动物、肉类食品和人)的大肠杆菌进行ESBLs(主要是blaCTX-M)基因流行特征和耐药情况调查，并比较分析其分子特征和相关性，研究携带blaCTX-M-55基因的质粒特征，揭示产ESBLs大肠杆菌传播规律，为临床合理用药、减缓耐药性传播提供一定的理论依据。2材料与方法2.1材料2.1.1样品来源肉类食品源样品采自2010年和2014年广州市的部分超市和农贸市场的鸡肉和猪肉，共采集407份肉样，其中猪肉253份，鸡肉154份。人源样品采自2011年和2013年广州地区的健康人群的粪便及部分医院患病人群的尿液和粪便，共1187份样品。食品动物源样品采自2012年广州市动物交易市场的鸡和猪的直肠棉拭子，共763份，其中猪源602份，鸡源161份。2.1.2工程菌株质控菌株：E.coliATCC25922，本实验室保存。工程菌：E.coliDH5α，本实验室保存。受体菌：E.coliC600，本实验室保存。2.1.3抗菌药物氯霉素北京普博欣生物科技有限责任公司纯度90%6 安普霉素濮阳泓天威药业有限公司效价599U/mg氨苄西林吉林康龙药业有限公司纯度99%庆大霉素广州翔博生物技术有限公司纯度90%盐酸四环素宁夏启元药业有限公司纯度95.0%盐酸多西环素北京普博欣生物科技有限责任公司纯度90%亚胺培南杭州默沙东制药有限公司纯度50%头孢西丁广州白云天心制药股份有限公司纯度90%黏菌素山东鲁抗医药股份有限公司纯度90%盐酸环丙沙星广州翔博生物技术有限公司纯度98%氟苯尼考浙江海翔药业纯度98%新霉素中国兽医药品监察所纯度70.3%头孢噻肟中国药品生物制品检定所纯度89.3%头孢他啶广州白云天心药业股份有限公司纯度90%头孢喹肟中国兽医药品监察所纯度99%阿米卡星山东鲁抗医药股份有限公司纯度90%链霉素山东鲁抗医药有限公司效价720U/mg磷霉素东北制药总厂纯度95%喹乙醇山东格瑞恩动物药业有限公司纯度95.0%甲氧苄啶中国药品生物制品检定所纯度100%磺胺甲噁唑中国药品生物制品检定所纯度100%2.2细菌培养基和生化鉴定管麦康凯琼脂(MacConkeyAgar)、伊红美兰琼脂(EMBAgar)、LB琼脂(LBAgar)，LB肉汤(LBBroth)、水解酪蛋白琼脂(MHAgar)、水解酪蛋白肉汤(MHBroth)、缓冲蛋白胨水(BPW)和Cary-Blair氏运送培养基均购自青岛市海博生物科技有限公司。肠杆菌科生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司2.2.1酶和主要试剂TM2+TaKaRaTaq(5U/μL)、dNTPMixture(2.5mM)、10×rTaqBuffer(MgPlus)、DL2000DNAMarker(50ng/μL)、λ-HindIIIdigest(50ng/μL)、内切酶XbaI(15U/μL)购自宝生物工程(大连)有限公司。琼脂糖(Biowestagarose，regular)，购自西班牙Biowest7 公司；低熔点琼脂糖(MegaBase琼脂糖)、PFGE级琼脂糖，LambdaLadderPFGEMarker均购自美国BIO-RAD公司。蛋白酶K和溶菌酶购自美国Sigma公司。其他试剂：十二烷基磺酸钠(SDS)、Tris碱(Tris-base)、EDTA、硼酸、乙酸钾、丙三醇、异丙醇、无水乙醇、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钙、氢氧化钠、二甲基甲酰胺、浓盐酸、冰醋酸、酚氯仿异戊醇(25:24:1)等购自广州化学试剂厂。脉冲场凝胶电泳用试剂：(1)~(7)(1)ESPbuffer的配制0.5molEDTA(pH9.0)1.0%十二烷基肌胺酸钠1mg/mL蛋白酶K(2)TE①的配制100mmolTris-HCl(pH8.0)100mmolEDTA(pH8.0)(3)TE②的配制10mmolTris-HCl(pH8.0)1mmolEDTA(pH8.0)(4)10×TEbuffer(1,000mL)的配制1molTris-HCl(pH8.0)500mmolEDTA(pH8.0)(5)10×TBEbuffer(1,000mL)的配制Tris108gNa2EDTA·2H2O7.44g硼酸5g(6)蛋白酶K的配制用灭菌的双蒸水溶解蛋白酶K粉末，制成浓度20mg/mL溶液。(7)溶菌酶溶液的配制用灭菌的蒸馏水配制成10mg/mL溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。碱裂解法提取质粒溶液的配制：(8)~(11)(8)50×TAE(1,000mL)储备液配制Tris242g8 冰乙酸13.75mL0.5mol的EDTA100mL(pH8.0)(9)P1溶液的配制25mmolTris-HCl(pH8.0)10mmolEDTA(pH8.0)50mmol20%葡萄糖(10)P2溶液的配制(100mL)20%SDS5mL1mol/LNaOH20mL蒸馏水75mL(11)P3溶液的配制(100mL)乙酸钾29.4g冰乙酸11.5mL蒸馏水88.5mL2.2.2主要仪器和设备微量移液器：德国Eppendorf公司；PCR扩增仪：德国Eppendorf公司和美国BIO-RAD公司；台式高速离心机：德国Eppendorf公司；超净工作台：苏州净化设备有限公司；电泳凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司；脉冲场凝胶电泳系统：美国BIO-RAD公司；HZC-280恒温振荡培养箱：广州深华实验仪器设备有限公司；ThermoScientificHeraeus恒温培养箱：美国ThermoFisherScientific公司；THZ-300恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；全自动酶标仪MultiskanFC：美国ThermoFisherScientific公司；电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；HVE-50高压灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；电子分析天平(BSA224S)：德国Sartorius公司；电动移液器：美国ThermoFisherScientific公司；JM-250小型数显电泳仪：大连捷迈科贸有限公司；9 HM-I型多功能水平电泳槽：大连捷迈科贸有限公司；可调速涡旋混合仪Vortex-Genie：美国MOBIO公司；PB-10标准型pH计：德国Sartorius公司；Milli-Q超纯水仪：美国Milipore公司。2.3方法2.3.1大肠杆菌的收集（1）菌株的复苏本实验室保存的临床分离菌是由30％甘油制成的甘油菌，保存于-80℃冰箱。从冰箱中取出，充分振荡混匀，吸取50μL接种到3mL的LB肉汤，37℃培养过夜。将37℃过夜培养的菌液，划线接种于含2μg/mL头孢噻肟的麦康凯平板上培养16～18h后挑取单菌落，挑取纯化后的单菌株划线接种于LB琼脂平板上以备提模板或重新保菌用。（2）食品动物源样品菌株的分离鉴定食品动物源样品主要为采集交易市场动物的粪便棉拭子，在超净工作台中将棉拭子直接在无菌环境中接种到LB肉汤中。接种后的LB肉汤37℃培养过夜，过夜培养的菌液，划线接种于含2μg/mL头孢噻肟的麦康凯平板上培养16～18h后挑取可疑单菌落，将可疑单菌株划线接种于新的麦康凯平板上培养16～18h后，挑取纯化后的单菌株划线接种于LB琼脂平板上以便进行生化鉴定和菌株保存及模板提取。（3）动物性食品源样品菌株的分离鉴定动物性食品源主要是购买自广州农贸市场和大型超市的新鲜和冷冻肉类，包括猪肉、鸡胸肉和鸡翅等。采集方法按照中华人民共和国国家标准GB/T4789.1-2008食品卫生微生物学检验总则中规定进行。样品采集后将其置于低温保存箱或常温条件下运送至实验室。肉类样品采用无菌操作的方法取表面的肉接种到10mLBPW中，置于37℃恒温摇床培养3-5h，将培养后的BPW吸取1mL接种到到4mL的LB肉汤中。接种后的LB肉汤37℃培养过夜，过夜培养的菌液，划线接种于含2μg/mL头孢噻肟的麦康凯平板上培养16～18h后挑取可疑单菌落，将可疑单菌株划线接种于新的麦康凯平板上培养16～18h后，挑取纯化后的单菌株划线接种于LB琼脂平板上以便进行生化鉴定和菌株保存及模板提取。（4）人源样品菌株的分离鉴定10 人源样品主要是尿液以及使用Cary-Blair氏运送培养基(Cary-BlairTransportMedium)采集人源的粪便，采集回来的样品需在4℃保存并在一个星期之内进行菌株分离。分离时在无菌操作台中将Cary-Blair氏运送培养基棉签抽出在LB肉汤中轻轻摆动；尿液样品则在无菌操作台中将尿液全部吸出加入LB肉汤中接种。接种后的LB肉汤37℃培养过夜，过夜培养的菌液，划线接种于含2μg/mL头孢噻肟的麦康凯平板上培养16～18h后挑取可疑单菌落，将可疑单菌株划线接种于新的麦康凯平板上培养16～18h后，挑取纯化后的单菌落划线接种于LB琼脂平板上以便进行生化鉴定和菌株保存及模板提取。2.3.2ESBLs和pAmpC基因的检测（1）DNA模板的提取煮沸法提取大肠杆菌DNA：将麦康凯板上生长的菌株单菌落接种于LB平板上培养12-16h刮取足量的菌苔转至含0.5mL1×TE的1.5mLEP管中混匀并置于沸水中水溶10min，随后置于冰上冰浴5min以13,000r/min离心5min取其上清液至一新的1.5mLEP管中即为DNA模板。（2）引物设计与合成参考Yan等(2001)和Lytsy等(2008)文献报道设计并合成相关引物，引物序列见表1，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司深圳分公司(下简称华大基因)合成。表1β-内酰胺酶耐药基因的PCR上下游引物序列目的基因长度(bp)引物序列blaCTX-M-1G949F:CTTCCAGAATAAGGAATCCCR:CGTCTAAGGCGATAAACAAAblaCTX-M-9G902F:TGACCGTATTGGGAGTTTGR:ACCAGTTACAGCCCTTCGblaSHV885F:CACTCAAGGATGTATTGTGR:TTAGCGTTGCCAGTGCTCGblaCMY-21143F:ATGATGAAAAAATCGTTATGCR:TTGCAGCTTTTCAAGAATGCGblaDHA387F:AACTTTCACAGGTGTGCTGGGTR:CCGTACGCATACTGGCTTTGC11 ISEcp1VariableF:CTATCCGTACAAGGGAGTGTorf477VariableR:CAGCGGAAGGAGAACCAGIS903VariableF:TTTCCACTCGCCTTCACC注：F，上游引物；R，下游引物。（3）PCR反应体系根据预实验优化反应体系最终确定50μL的PCR反应体系见表2。表2PCR反应体系体系组分用量(μL)模板DNA2.0上游引物1.0下游引物1.010×rTaqBuffer5.0dNTPMixture4.0rTaq0.25灭菌双蒸水加至50.0（4）PCR循环条件利用梯度PCR确定最佳的循环条件见表3。表3β-内酰胺酶耐药基因及其相关基因的PCR反应条件目的基因运行参数blaCTX-M-1G(94℃5m)+{(94℃45s)+(52℃45s)+(72℃60s)}×30+(72℃10min)blaCTX-M-9G(94℃5m)+{(94℃45s)+(60℃45s)+(72℃45s)}×30+(72℃10min)blaSHV(94℃5m)+{(94℃45s)+(55℃45s)+(72℃45s)}×30+(72℃10min)blaDHA(94℃5m)+{(94℃45s)+(56℃45s)+(72℃45s)}×30+(72℃10min)blaCMY-2(94℃5m)+{(94℃45s)+(55℃45s)+(72℃45s)}×30+(72℃10min)ISEcp1(94℃5m)+{(94℃45s)+(54.7℃45s)+(72℃45s)}×30+(72℃10min)orf477(94℃5m)+{(94℃45s)+(56.1℃45s)+(72℃45s)}×30+(72℃10min)IS903(94℃5m)+{(94℃45s)+(50℃45s)+(72℃45s)}×30+(72℃10min)12 （5）PCR产物的电泳分析取5μL的PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳以DL2000DNAMarker分子量标准做参考在135V的电压下进行电泳15~30min电泳结束后用凝胶成像系统观察拍照分析。（6）PCR产物的序列测定和分析对含ESBLs基因的PCR产物进行测序将测序结果提呈NCBI进行序列比对确认目的基因。2.3.3抗菌药物敏感性试验（1）受试药液的制备和稀释选取受试药物按照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准选取溶剂进行配制和稀释。配制的药液用质控菌株进行标定MICs在质控范围内为合格药液。分装保存于－20℃或－40℃冷冻保存备用。（2）含药琼脂平板的制备在一次性平板中分别加入倍比稀释的药物高压灭菌MH琼脂待琼脂冷却到50℃左右时加含药的平板中并且使琼脂和药物的体积比为9:1这样含药平板药的物浓度就以10:1的比例依次类推。吹干水蒸气备用。以上操作均在超净台中进行。每个药做2个空白对照琼脂板。（3）菌液的稀释将鉴定纯化的大肠杆菌和ATCC25922质控菌画线接种于麦康凯琼脂平板上挑取5单个菌落接种于含2mLMH肉汤的试管中37℃振荡培养当菌液达到5×10CFU/mL浊度时继续下一步试验。（4）MICs测定把稀释好的菌液用多点接种仪接种到平皿中把菌液晾干倒置放到37℃培养箱中培养16～18h后观察结果。（5）结果判定当接种前后两块空白的MH平板上的所有接种点的菌样均生长良好而未接种细菌的平皿均无菌落生长时实验组完全不见细菌生长的最低药物浓度为该药物对细菌的最小抑菌浓度。以MIC值位于CLSI规定的敏感(susceptible，S)、中介(intermediate，I)、耐药13 (resistant，R)折点值范围判断结果。2.3.4大肠杆菌种族系统进化分析（1）模板的提取：同2.3.2中的(1)。（2）引物设计及合成及PCR反应体系参考报道的引物序列由北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物序列见表4，根据参考文献推荐的反应体系进行（Clermontetal.,2013）。设立空白对照E群PCR及C群PCR操作时要分别加入内部对照引物作为阳性对照，因此分别都是双重PCR。PCR的50μL体系见表5。表4大肠杆菌种族系统进化关系引物PCR引物名称长度(bp)引物序列chuA.1b288F:ATGGTACCGGACGAACCAACchuA.2R:TGCCGCCAGTACCAAAGACAyjaA.1b211F:CAAACGTGAAGTGTCAGGAG四重yjaA.2bR:AATGCGTTCCTCAACCTGTGPCRTspE4C2.1b152F:CACTATTCGTAAGGTCATCCTspE4C2.2bR:AGTTTATCGCTGCGGGTCGCAceK.f400F:AACGCTATTCGCCAGCTTGCArpA1.rR:TCTCCCCATACCGTACGCTAE群ArpAgpE.f301F:GATTCCATCTTGTCAAAATATGCCPCRArpAgpE.rR:GAAAAGAAAAAGAATTCCCAAGAGC群trpAgpC.1219F:AGTTTTATGCCCAGTGCGAGPCRtrpAgpC.2R:TCTGCGCCGGTCACGCCC内部trpBA.f489F:CGGCGATAAAGACATCTTCAC对照trpBA.rR:GCAACGCGGCCTGGCGGAAG注：F，上游引物；R，下游引物。14 表5大肠杆菌种族进化性分析的四重PCR反应体系体系组分用量（μL）模板DNA3.0上游引物1.0下游引物1.010×rTaqBuffer5.0dNTPMixture4.0rTaq0.25灭菌双蒸水加至50.0（3）PCR反应程序四重PCR:94℃×5min+{（94℃×30s+59℃×30s+72℃×30s）}×30+72℃×7minE群或C群PCR:94℃×5min+{（94℃×30s+57℃×30s+72℃×30s）}×30+72℃×7min（4）PCR产物的电泳分析取7μlPCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳以DL2000DNAMarker分子量标准做参考在6v/cm电压下电泳15~30min结束后用凝胶成像系统观察拍照分析。2.3.5脉冲场凝胶电泳参照Gautom(1997)及美国CDCPulseNet的标准PFGE操作规程进行。（1）模块的制备取在LB平板上生长的适量菌体于1mLTE②中充分悬液菌体离心收集菌体。用2~3mLTE①溶液洗涤菌体2~3次然后用TE②溶液充分悬浮菌体并矫正其透光度使达到20%。取100μL细菌悬液转移到1.5mL离心管中。将溶菌酶和蛋白酶K加入上述细菌悬液中使两酶的终浓度分别为1mg/mL。颠转离心管几次以使菌体充分裂解。将上述酶-菌液混合物于37℃孵育10~15min。同时用TE②溶液制备1.2%浓度的低熔点琼脂糖凝胶并于55℃保温。将上述酶-菌液混合物7μL20%的十二烷基硫酸钠和140μL1.2%的低熔点琼脂糖迅速充分混合然后用移液器注入一端封口的模具中。4℃放置5~10min使模块凝固。（2）细菌原位裂解小心取出模具中的模块转入含有1.5mLESP缓冲液的圆底聚乙烯塑料管中并于15 55℃水浴轻微振荡2h。（3）模块洗涤小心取出上述蛋白酶水解结束的模块加入8~10mL预热至50℃的灭菌双蒸水于50℃水浴轻微振荡10min。然后用8~10mL预热至50℃的TE②缓冲液于50℃缓慢振荡洗涤15min重复此操作步骤3次。最后一次洗涤完毕后使模块在室温下于TE②缓冲液中缓慢冷却。（4）限制性内切酶消化按照表6的酶切体系加入酶、缓冲液、切下的模块、BSA等于37℃作用4h左右。剩下的胶块置于TE②溶液中4℃保存。表6限制性内切酶消化模块体系组分体积（μL）XbaI510×Mbuffer20BSA202×1mm的消化模块大约100灭菌双蒸水155总体积300（5）制备PFGE琼脂糖凝胶按照1.0%的比例用0.5×TBE电泳缓冲液制备PFGE凝胶。用刀片小心切取1/2~1/3体积的plugslice贴于相应的梳齿位置上。然后用55℃1.0%的低熔点琼脂糖对点样端封口。待胶块凝固后于4℃冰箱放置30min。（6）电泳加入2.5L0.5×TBE电泳缓冲液于CHEF-DR®ⅢSystem电泳槽中依次打开电源开关-循环泵开关-冷却系统I/O开关。脉冲场凝胶电泳参数设置见表7。待电泳缓冲液冷却至14℃时，开始电泳。16 表7脉冲电泳各个参数设置电泳参数设置起始缓冲时间0.5s结束缓冲时间63.8s电泳时间20.3h电压6V/cm温度14℃角度120°斜率线性（7）染色、拍照电泳结束后将电泳胶块放入浓度为1μg/mL的溴化乙锭溶液中染色30min以上用水冲洗凝胶块2~3次后每次10min放入凝胶成像系统照像并保存图像。条带解释参考Tenover等(1995)具体见表8。表8PFGE分型标准分类遗传变化片段差异流行学解释分型相同00流行株A密切相关12～3流行相关株A1、A2、A3…可能相关24～6可能流行株不同≥3≥7无关株B、C、D…2.3.6接合试验（1）接合试验步骤①预试验：分别将供体菌和受体菌大肠杆菌C600划线于含有3000μg/mL链霉素和2μg/mL头孢噻肟的麦康凯药板上，以及两种药的联合药板上观察是否生长；结果见9。17 表9接合预试验结果菌种CTX(2μg/mL)STR(3000μg/mL)CTX(2μg/mL)+STR(3000μg/mL)供体菌生长良好不长不长受体菌不长生长良好不长注：CTX为头孢噻肟，STR为链霉素。②分别将供体菌和受体菌划线于制备好的麦康凯药板上，分别挑取单菌落接种于2mL的LB肉汤中37℃培养过夜；③取供体菌、受体菌菌液各0.2mL分别接种于新鲜配制的2mL和4mL的LB肉汤中，在37℃震荡培养3~4h，使菌液的浓度达到OD600值0.5左右；④将上述培养好的供体菌液、受体菌液按照体积比1:4的比例混合，于37℃静置培养4h；⑤将上述混合培养菌液4000rpm离心5min，弃上清液，加高压灭菌的生理盐-1-2水0.2mL，重新混匀菌液，用无菌的生理盐水做10和10稀释梯度；⑥取上述菌液0.1mL均匀涂布于含3000μg/mL的链霉素和2μg/mL头孢噻肟的麦康凯双药板上，将平板正置培养30~60min，待菌液完全吸收后，倒置培养18~24h；（2）接合子的鉴定①挑取多个在双药板上生长的无色单菌落划线于同样的双药板上培养18~24h，以达到增菌的目的；②挑取扩增后的生长良好的菌落进行接合子供体原菌相对应携带的β-内酰胺酶耐药基因的菌落PCR检测；③对于菌落PCR鉴定为阳性的疑似接合子，做药敏试验以进一步确认是否接合成功；④对于药敏结果介于供体菌和受体菌之间，且同时PCR检测基因阳性的菌株确定为接合子后，保存于30%的甘油肉汤中，置于-80℃和-20℃冰箱保存备用。2.3.7化学转化（1）感受态细胞的制备①从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α单菌落，接种于5mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h；②吸取1.0mL培养后的细菌悬液接种于含有50mLLB液体培养基的三角瓶中，18 37℃振荡培养2~3h(OD600值约0.4~0.5之间)；③将菌液于超净台中转移到预冷灭菌的50mL离心管中，首先置于冰上10min，然后置于4℃离心机中4000rpm离心10min，弃去上清液收集菌体；④将菌体置于10mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液中并悬浮，冰浴25-30min；⑤于4℃4000rpm再次离心10min，弃上清，收集菌体；⑥用1.5mL预冷的含20%~30%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻的悬浮细胞，放置冰上10min后，即获得转化用感受态细胞，按每管100μL分装于灭菌的离心管中，置于-80℃冰箱保存备用。⑦质粒DNA的化学转化:对含有两条及以上质粒DNA的接合子，重新提取质粒DNA将其转移到感受态细胞中，以达到获取单目的质粒DNA的要求。⑧在制备的DH5α感受态细胞100μL中加入10μL的提取的质粒轻轻混匀，冰浴30min；⑨将离心管移入42℃水浴中加热90s后，迅速将离心管置于冰中2min；⑩加入890μL37℃预热的LB培养液，混匀后在37℃恒温振荡器上以150rpm培养45min，4000rpm离心5min后弃去900μL上清液，将剩下的100μL菌液混匀；○11将剩下的100μL悬浮的转化细菌培养液均匀涂布于含有2μg/mL头孢噻肟的麦康凯琼脂平板表面；○12将涂有菌液的琼脂平板正向放置于37℃培养箱内约1h使菌液完全被吸收，然后将平板倒置于37℃培养箱中培养；○1318~24h后，观察菌落生长情况。挑取无色菌落划线于新的含有浓度为2μg/mL头孢噻肟的麦康凯琼脂平板增菌，过夜培养以后，使用菌落PCR法检测相对应的β-内酰胺酶耐药基因。○14重组质粒的转化同时做两个对照管。阴性(只含受体菌)对照：100μL感受态细胞+10μL灭菌双蒸水后直接涂板；阳性(ControlInsert)对照：100μL感受态细胞+10μLControlInsertDNA溶液。2.3.8质粒提取（1）质粒中量提取法：参照QIAGENPlamidMidiKits使用手册提取接合子的质粒。①挑取单个过夜培养的菌落接种于2~5mL的LB肉汤培养基中，37℃恒温震荡19 培养8h；②将初始培养物以1:500至1:1000的比例接种于100mL的新鲜肉汤中，37℃恒温震荡培养12-16h；③收集菌体，将菌液倒入高压灭菌的50mL离心管中，在4℃6000rpm的条件下离心15min；④加入4mL的BufferP1，用振荡器重悬菌体沉淀，充分混匀；⑤加入4mL的BufferP2，轻轻的颠倒5-10次混匀，室温(15-25℃)下静止5min；⑥加入4mL预冷的BufferP3，立刻轻轻颠倒5-10次混匀，置于冰上15min，直至蓝色消失为止；⑦4℃20000rpm的条件下离心30min，将上清移至另一新的50mL离心管中；⑧再次4℃20000rpm离心15min；⑨用4mLBufferQB平衡QIAGEN-tip，在重力的作用下自然通过柱子；⑩将第⑧步离心的上清液立即转入到平衡过的QIAGEN-tip，重力的作用下，使清亮的裂解液自然通过QIAGEN-tip的树脂柱；○11用10mL的BufferQC洗涤QIAGEN-tip两次；○12用5mL的BufferQF洗涤树脂上的DNA，保留到一个新的50mL的离心管中；○13加入3.5mL室温放置的异丙醇沉淀DNA，混匀后在15000rpm4℃的条件下离心30min，小心吸取上清液；○14加入2mL室温放置的70%乙醇，洗涤DNA，再于15000rpm4℃离心10min；○15弃上清，将离心管放于超净台中干燥10min，加500μL灭菌双蒸水溶解DNA，置于-20℃保存；（2）质粒小量提取法：参照Takabashi等(1984)的碱裂解法进行抽提，具体步骤如下：①刮取过夜生长于含头孢噻肟浓度为2μg/mL的LB平板上的适量菌体到含有1mLTE溶液的1.5mL离心管中，10000rpm离心5min弃去管中的上清液，加入300μL含RNase的溶液P1，用微量移液器轻轻的悬浮菌体，混匀菌体后在冰上放置5~10min；②在悬浮的菌体里加入300μL溶液P2，轻轻上下颠倒5～10次，室温放置不超过5min；③加入300μL溶液P3，轻轻上下颠倒10~20次，在冰上放置10~15min，在4℃20 以15000rpm离心15min，将上清液转移至一个新的离心管中，在冰上再放置10min，再次以15000rpm在4℃离心机上离心20min；④小心吸取600-700μL上清液到一个新的2.0mL离心管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，上下颠倒5~10次，放于冰上10min，再以15000rpm在4℃离心10～20min，转移上层500μL水相至另一个离心管中；⑤加入350μL的异丙醇混匀后置于4℃离心机以15000rpm的转速离心30min，弃上清后，加入1mL70.0%的乙醇上下颠倒3～5次，离心10min，弃去上清液，放置在超净台中吹数分钟至酒精挥发干净；⑥用55℃预热的灭菌双蒸水溶解沉淀，0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，放置于-20℃冰箱待用。2.3.9质粒复制子分型（1）模版DNA的提取同2.3.2中的(1)。（2）引物合成参考有关文献（Carattolietal.,2005）的引物序列具体引物序列见表10。（3）PCR反应体系参照表2。表10复制子分型引物序列引物名称DNA序列靶位基因长度(bp)HI1FWGGAGCGATGGATTACTTCAGTACparA-parB471HI1RVTGCCGTTTCACCTCGTGAGTAHI2FWTTTCTCCTGAGTCACCTGTTAACACiterons644HI2RVGGCTCACTACCGTTGTCATCCTI1FWCGAAAGCCGGACGGCAGAARNAI139I1RVTCGTCGTTCCGCCAAGTTCGTXFWAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATOrir376XRVTGAGAGTCAATTTTTATCTCATGTTTTAGCL/MFWGGATGAAAACTATCAGCATCTGAAGrepABC785L/MRVCTGCAGGGGCGATTCTTTAGGNFWGTCTAACGAGCTTACCGAAGrepA55921 续表10NRVGTTTCAACTCTGCCAAGTTCFIAFWCCATGCTGGTTCTAGAGAAGGTGiterons462FIARVGTATATCCTTACTGGCTTCCGCAGFIBFWGGAGTTCTGACACACGATTTTCTGrepA702FIBRVCTCCCGTCGCTTCAGGGCATTWFWCCTAAGAACAACAAAGCCCCCGrepA242WRVGGTGCGCGGCATAGAACCGTYFWAATTCAAACAACACTGTGCAGCCTGrepA765YRVGCGAGAATGGACGATTACAAAACTTTPFWCTATGGCCCTGCAAACGCGCCAGAAAiterons534PRVTCACGCGCCAGGGCGCAGCCFICFWGTGAACTGGCAGATGAGGAAGGrepA2262FICRVTTCTCCTCGTCGCCAAACTAGATA/CFWGAGAACCAAAGACAAAGACCTGGArepA465A/CRVACGACAAACCTGAATTGCCTCCTTTFWTTGGCCTGTTTGTGCCTAAACCATrepA750TRVCGTTGATTACACTTAGCTTTGGACFIISFWCTGTCGTAAGCTGATGGCrepA270FIISRVCTCTGCCACAAACTTCAGCFrepBFWTGATCGTTTAAGGAATTTTGRNAI/repA270FrepBRVGAAGATCAGTCACACCATCCK/BFWGCGGTCCGGAAAGCCAGAAAACRNAI160KRVTCTTTCACGAGCCCGCCAAAB/ORVTCTGCGTTCCGCCAAGTTCGARNAI159注：FW，上游引物；RV，下游引物。（4）PCR反应条件除引物FrepBFW/FrepBRV用程序①外其他17对引物都用程序②：①(95℃5min)＋30×｛(94℃1min)＋(52℃30s)+(72℃1min)｝+(72℃5min)②(95℃5min)＋30×｛(94℃1min)＋(60℃30s)+(72℃1min)｝+(72℃5min)。（5）PCR产物的电泳分析22 取适量扩增产物经1.0%~2.0%琼脂糖凝胶电泳以DNA分子量标准做参考按照6V/cm电压电泳结束后用凝胶成像系统观察拍照分析。（6）PCR产物的序列测定将PCR产物直接送北京华大公司进行序列测定。测序结果提交NCBI(www.pubmLst.org/plasmid)进行BLAST比对分析确定复制子类型。2.3.10数据处理采用SPSS20.0软件进行方差分析。3结果3.1ESBLs和pAmpC基因的检测共分离或复活2010-2014年不同来源的头孢噻肟非敏感大肠杆菌931株，包括食品动物源292株(2012年)，其中猪源228株，鸡源64株；人源410株(2010年和2013年)，其中健康人源104株，均为粪便源，患病人源306株，其中门诊病人源74株，住院病人源232株，患病人源中188株尿液源，118株粪便源；肉类食品源229株(2011年和2014年)，其中猪肉源148株，鸡肉源81株。用煮沸法提取的大肠杆菌DNA模板，用表1所列引物进行PCR扩增，得到与目的基因大小一致的DNA片段，经PCR产物测序可知，blaCTX-M、blaCMY-2、blaSHV和blaDHA均被测得。不同基因型的PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统拍照见图1、2和3。图1blaCTX-M-1GPCR扩增产物电泳图注:1为blaCTX-M-1G阳性对照，B为阴性对照，其余为blaCTX-M-1G扩增产物；M为DL2000。23 图2blaCTX-M-9GPCR扩增产物电泳图注:1为blaCTX-M-9G阳性对照，B为阴性对照，其余为blaCTX-M-9G扩增产物；M为DL2000。图3blaCMY-2PCR扩增产物电泳图注:1为blaCMY-2阳性对照，B为阴性对照，其余为blaCMY-2扩增产物；M为DL2000。3.2ESBLs和pAmpC基因类型统计分析本研究对931株分离自不同来源的人、食品动物和肉类食品的头孢噻肟非敏感大肠杆菌进行β-内酰胺酶耐药基因检测。由表11可知，有790株(84.8%)携带至少一种blaCTX-M基因，其中肉类食品源检出率最高为86.5%(198/229)，其次为食品动物源85.6%(250/292)，人源83.4%(342/410)。只携带一种blaCTX-M基因的菌株共707株(89.6%)，同时携带两种blaCTX-M基因的为61株(7.7%)，22株同时携带pAmpC基因或blaSHV基因。另外，有73株携带blaCMY基因，其中食品动物源检出率最高为10.6%(31/292)，其次为肉类食品源9.2%(21/229)，人源为5.1%(21/410)。检测到的CTX-M酶类型有20种，基因亚型有28种。其中CTX-M-14(n=251)最为多见，其次是CTX-M-55和CTX-M-65，分别有150株和124株，随后依次是CTX-M-27(n=48)、CTX-M-15(n=43)、CTX-M-24a(n=22)、CTX-M-3(n=12)、CTX-M-130b(n=8)、CTX-M-24e(n=7)和24 CTX-M-123(n=6)。从表11中可看出，人源菌ESBLs和pAmpC基因分布广泛且较为复杂，blaCTX-M基因亚型高达19种，而肉类食品源和食品动物源基因型分布较为相似，分别为15种和16种。blaCTX-M阳性大肠杆菌中，三种来源菌株主要基因型分布相似，blaCTX-M-9G基因检出率最高，其次为blaCTX-M-1G和blaCMY，但是blaCTX-M-1G和blaCMY基因在不同来源中检出率有差异。产2种blaCTX-M菌株检出率在食品动物源最低，为4.0%，明显低于其他来源(肉类食品源9.1%，人源9.6%)。从图4可看出，blaCTX-M-1G阳性菌和blaCMY阳性菌检出率在食品动物源菌株最高，其次为肉类食品源和人源。blaCTX-M-9G阳性菌检出率在食品动物源中最高，其次为人源和肉类食品源。在人源菌株中，患病人源blaCTX-M阳性菌检出率高于健康人源(86.6%，74.0%)，差异显著(P<0.01)，患病人尿液源blaCTX-M阳性菌检出率高于患病人粪便源(87.2%，85.6%)，门诊病人源blaCTX-M阳性菌检出率高于住院病人源(87.8%，86.2%)；blaCTX-M-9G在病人粪便源检出率最高，为66.3%，在健康人源最低，为59.7%；blaCMY阳性菌检出率在患病人尿液源最高，为9.6%，在健康人源最低，为2.9%。在肉类食品源菌株中，猪肉源blaCTX-M和blaCMY阳性菌检出率高于鸡肉源(88.5%和11.5%，82.7%和4.9%)；blaCTX-M-1G检出率猪肉源低于鸡肉源(22.1%，35.8%)；blaCTX-M-9G则相反，猪肉源高于鸡肉源(66.4%，49.3%)。然而，在食品动物源菌株中，鸡源blaCTX-M阳性菌检出率高于猪源(92.2%，83.8%)；blaCTX-M-1G检出率猪源低于鸡源(22.3%，31.3%)；blaCTX-M-9G则相反，猪源高于鸡源(63.7%，57.1%)；blaCMY阳性菌检出率猪源高于鸡源(13.2%，1.6%)，差异显著(P<0.01)。25 100%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%blaCTX‐M阳性菌blaCTX‐M‐9GblaCTX‐M‐1GblaCMY其他基因或未检测到基因的菌图4ESBLs和pAmpC基因在不同来源大肠杆菌中的比例就单个基因亚型而言，不同来源菌株间存在较大差异。如图5所示，blaCTX-M-14在人源blaCTX-M阳性菌中检出率最高(40.9%)，明显高于肉类食品源(21.2%)(P<0.01)；患病人源blaCTX-M-14阳性菌检出率显著高于健康人源、食品动物源及肉类食品源(40.0%，4.2%，27.7%，21.2%)(P<0.01)；健康人源blaCTX-M-14阳性菌明显低于食品动物源及肉类食品源(4.2%，27.7%，21.2%)(P<0.01)。blaCTX-M-65在肉类食品源中检出率最高，为23.7%，明显高于人源(7.6%)(P<0.01)；鸡源blaCTX-M-65阳性菌检出率最高，为28.6%，显著高于猪源及人源(P<0.01)。blaCTX-M-55和blaCTX-M-24a在食品动物源中检出率最高(24.5%和5.6%)，明显高于人源(15.2%和0.9%)(P<0.01)。blaCTX-M-24a在猪源阳性检出率最高，为6.7%，明显高于鸡源及人源(P<0.01)。鸡肉源blaCTX-M-55阳性检出率明显高于猪肉源(31.3%，12.1%)(P<0.01)，且健康人源blaCTX-M-55阳性检出率高于患病人源。blaCTX-M-15阳性检出率在病人尿液源中最高，为14%，其在患病人源菌中明显高于肉类食品源(8.7%，2.5%)(P<0.01)。26 50%45%40%35%30%25%20%15%10%5%0%blaCTX‐M‐14blaCTX‐M‐65blaCTX‐M‐24ablaCTX‐M‐55blaCTX‐M‐15其他基因型图5几种主要blaCTX-M基因亚型在不同来源blaCTX-M阳性大肠杆菌中的比例27 表11不同来源头孢噻肟非敏感大肠杆菌ESBLs和pAmpC基因分布情况不同来源大肠杆菌（%）人源食品动物源肉类食品源基因型门诊住院患病病人病人健康总计总数鸡源猪源总数猪肉源鸡肉源总数病人病人人源尿液粪便人源(n=931)(n=410)(n=64)(n=228)(n=292)(n=148)(n=81)(n=229)(n=74)(n=232)(n=306)(n=188)(n=118)(n=104)blaCTX-M65200265164101773425919125013167198790阳性菌(87.8)(86.2)(86.6)(87.2)(85.6)(74.0)(83.4)(92.2)(83.8)(85.6)(88.5)(82.7)(86.5)(84.9)产2种8202822653355101081861blaCTX-M菌(12.3)(10.0)(9.2)(13.4)(5.9)(4.8)(9.6)(8.9)(2.6)(4.0)(7.6)(11.9)(9.1)(7.7)41124165986746211321231558733121487blaCTX-M-9G(63.1)(62.0)(62.3)(59.8)(66.3)(59.7)(61.7)(57.1)(63.7)(62.2)(66.4)(49.3)(61.1)(61.7)3076106673934140105969311142251blaCTX-M-14(40.5)(38.0)(40.0)(40.9)(38.6)(44.2)(40.9)(17.9)(30.6)(27.7)(23.7)(16.4)(21.2)(31.8)blaCTX-M-14b33225blaCTX-M-14e221122blaCTX-M-14f11111blaCTX-M-14g1111132023914326163551281947124blaCTX-M-65(4.6)(10.0)(8.7)(5.5)(13.9)(3.9)(7.6)(28.6)(18.1)(20.5)(21.4)(28.4)(23.7)(15.7)514191274233581521748blaCTX-M-27(6.8)(7.0)(7.2)(7.3)(6.9)(5.2)(6.7)(5.4)(2.6)(3.2)(11.5)(3.0)(8.6)(6.1)blaCTX-M-2411112221113113145522blaCTX-M-24a(1.0)(0.8)(0.6)(1.0)(1.3)(0.9)(1.6)(6.7)(5.6)(3.8)(2.5)(2.8)blaCTX-M-24d222202blaCTX-M-24e1232136117blaCTX-M-130a555blaCTX-M-130b134224123118blaCTX-M-104111223blaCTX-M-1251111228 续表11blaCTX-M-9111blaCTX-M-1911111blaCTX-M-121111blaCTX-M-12211116516741262289225678292453220blaCTX-M-1G(24.6)(25.5)(25.3)(25.0)(25.7)(28.6)(26.0)(39.3)(29.0)(31.3)(22.1)(35.8)(26.8)(27.9)6293524111752184361162137150blaCTX-M-55(9.2)(14.5)(13.2)(14.6)(10.9)(22.1)(15.2)(32.1)(22.3)(24.5)(12.2)(31.3)(18.7)(19.0)51823101332648125543blaCTX-M-15(6.8)(9.0)(8.7)(6.1)(12.9)(3.9)(7.6)(7.1)(4.1)(4.8)(3.8)(2.5)(5.4)blaCTX-M-342215443312blaCTX-M-644444115blaCTX-M-1234266blaCTX-M-13211111blaCTX-M-153111blaCTX-M-144111blaCTX-M-10111151318135321130311742173blaCMY(6.8)(5.6)(5.9)(6.9)(4.2)(2.9)(5.1)(1.6)(13.2)(10.6)(11.5)(4.9)(9.2)(7.8)blaDHA-111111blaCTX-M+pAmpC/5532497742622blaSHV29 3.3头孢噻肟非敏感大肠杆菌MIC结果931株头孢噻肟非敏感大肠杆菌对20种抗菌药物的药物敏感性结果见表12。结果显示，大肠杆菌对氨苄西林、头孢噻肟、链霉素、复方新诺明和四环素的耐药率均超过70%，对头孢他啶、头孢西丁、黏菌素以及阿米卡星的耐药率相对较低，分别是28.8%、13.6%、11.7%和9.0%，受试的所有菌株对亚胺培南敏感。在人、食品动物和肉类食品三种不同来源大肠杆菌中，除了氨苄西林、环丙沙星、庆大霉素和头孢西丁耐药率无显著差异，其他15种药物耐药率均有显著差异，表现为食品动物源菌株的四环素耐药率显著高于其他来源(P<0.01)，而头孢喹肟和头孢他啶耐药率显著低于其他来源(P<0.01)；人源菌株对阿米卡星、黏菌素、安普霉素、新霉素、氟苯尼考、喹乙醇、氯霉素、多西环素、链霉素和复方新诺明等10种药物的耐药率均显著低于其他来源(P<0.01)；肉类食品源菌株头孢噻肟和磷霉素耐药率显著高于其他来源(P<0.01)。在肉类食品源菌株中，鸡肉源菌株的黏菌素和磷霉素耐药率显著高于猪肉源菌株(P<0.01)。在食品动物源菌株中，鸡源菌株的安普霉素、磷霉素、环丙沙星和头孢喹肟耐药率显著高于猪源(P<0.01)。肉类食品源菌株与食品动物源菌株相比较，则鸡肉源菌株头孢他啶耐药率高于鸡源(P<0.01)，鸡源安普霉素高于鸡肉源(P<0.01)；猪肉源磷霉素、头孢他啶和头孢喹肟耐药率高于猪源(P<0.01)，猪源喹乙醇和多西环素耐药率高于猪肉源(P<0.01)。在人源菌株中，健康人源安普霉素和新霉素耐药率高于患病人源(P<0.01)，头孢他啶耐药率低于患病人源(P<0.01)；病人粪便源多西环素耐药率高于健康人粪便源(P<0.01)；住院病人源链霉素、新霉素、安普霉素、氟苯尼考和磷霉素耐药率高于门诊病人源(P<0.01)；尿液源头孢他啶耐药率高于粪便源(P<0.01)，而头孢西丁、链霉素、安普霉素、新霉素、庆大霉素、氯霉素、氟苯尼考、磷霉素、多西环素和喹乙醇等10种药物耐药率低于粪便源(P<0.01)。由表13，CTX-M-1组亚型（CTX-M-3，-15，-55，-64，-123，-132，-153，-144，-101）菌株与CTX-M-9组亚型（CTX-M-14，-24，-27，-65，-130，-104，-125，-9，-19，-121，-122）菌株的药敏试验结果相比较发现，CTX-M-1组菌株对新霉素、磷霉素、氟苯尼考、头孢喹肟和头孢他啶的耐药率显著高于CTX-M-9组（P<0.01），且携带该组基因的大肠杆菌对头孢噻肟、头孢喹诺和头孢他啶的半数抑菌浓度（MIC50s）分别为128mg/L、32mg/L和16mg/L，而CTX-M-9组的则是32mg/L、4mg/L和1mg/L。从CTX-M-1组亚型的大肠杆菌药敏结果中发现，产CTX-M-55的菌株对新霉素、氟30 苯尼考、阿米卡星和四环素的耐药率显著高于该组其他亚型（P<0.01）。3.4产CTX-M-55大肠杆菌种族系统进化关系结果随机挑选100株产CTX-M-55大肠杆菌的种族系统进化关系进行了研究，结果见表14。产CTX-M-55大肠杆菌有45.0%属于A组、16.0%属于B1组，分别有14.0%、6.0%和3.0%属于F、D和C组，未检测出B2和E组大肠杆菌，以及16株未分型成功。三种不同来源菌株系统进化结果并无明显差异，均为A组最多，但其次的顺序不同，食品动物源表现为B1、C、F、D组；肉类食品源表现为B1、F、D、C组;人源菌株表现为F、B1、D、C组。这一结果可能与人源较多样品来自患病人群有关。表14产CTX-M-55大肠杆菌种族系统进化关系结果分组人源（n=37)食品动物源（n=36)肉类食品源（n=27）总数（n=100)A14191245B145716C1113D3126F81514未分型成功790163.5产CTX-M-55大肠杆菌PFGE结果对100株不同来源的产CTX-M-55大肠杆菌XbaI酶切后进行脉冲场凝胶电泳，如图6所示，98株菌成功获得酶切图谱，2株菌未能成功获得图谱。以90%相似度为界，98株大肠杆菌共获得91种明显不同的谱型，说明大部分产CTX-M-55大肠杆菌为非克隆传播关系。90%相似度以上的有14株菌，共分为7簇，其中3簇的大肠杆菌来源于食品动物源，2簇均为猪源，1簇为鸡源和猪源；1簇为人源，1簇为肉类食品源，特别的1簇为人源和鸡源。31 表12不同来源头孢噻肟非敏感大肠杆菌对20种抗菌药物的耐药率人源食品动物源肉类食品源门诊住院患病病人病人健康总计药物名称总数鸡源猪源总数猪肉源鸡肉源总数病人病人人源尿液粪便人源(n=931)(n=410)(n=64)(n=228)(n=292)(n=148)(n=81)(n=229)(n=74)(n=232)(n=306)(n=188)(n=118)(n=104)氨苄西林10010010010010010010010099.699.710097.599.199.7R(%)头孢西丁5.411.610.15.314.911.510.57.817.115.119.613.617.513.6R(%)头孢噻肟98.694.895.893.199.198.196.398.49394.210010010096.6R(%)头孢他啶36.536.636.640.424.818.33214.117.116.435.145.738.928.8R(%)头孢喹肟7776.376.578.773.97576.17554.458.969.672.870.769.4R(%)链霉素51.470.76656.472.562.565.190.684.285.679.176.578.274.8R(%)新霉素6.821.117.69.632.935.622.270.353.557.25264.256.341.6R(%)阿米卡星2.765.23.28.68.76.110.98.38.910.122.214.49R(%)庆大霉素47.351.350.34257.25050.256.350.451.75061.754.151.7R(%)安普霉素1.412.19.51.128.434.615.971.953.157.247.340.74536R(%)黏菌素4.14.33.91.67.61.03.225.018.920.28.130.916.211.7R(%)氯霉素35.150.446.736.756.34947.382.88282.278.47978.666R(%)32 续表12氟苯尼考28.449.644.431.45951.946.373.477.276.476.477.876.963.3R(%)环丙沙星54.159.958.550.56455.857.870.354.457.958.174.163.859.3R(%)复方新诺明81.181.981.779.878.872.179.395.394.394.595.395.195.288R(%)四环素70.381.578.872.389.289.481.593.89393.285.888.986.986.5R(%)喹乙醇25.740.136.627.750.5504081.392.189.772.374.172.963.7R(%)磷霉素6.826.721.911.738.133.724.957.821.129.141.960.548.532.0R(%)多西环素55.448.35047.974.840.447.687.592.591.482.482.782.569.9R(%)亚胺培南00000000000000R(%)33 表13blaCTX-M阳性大肠杆菌的药物敏感性结果blaCTX-M-1G与blaCTX-M-9G菌株blaCTX-M-55与blaCTX-M-1G其他亚型菌株blaCTX-M-1G全部药物名称blaCTX-M-1GblaCTX-M-9GblaCTX-M-55P值其他亚型P值blaCTX-M（n=220)（n=487)(n=150)（n=70）阳性菌（n=790)氨苄西林R（%）100100100100100链霉素R（%）74.774.578.765.774.6新霉素R（%）36.347.7<0.015630<0.0140.6阿米卡星R（%）7.210.514.71.4<0.019.1庆大霉素R（%）51.548.245.354.350.9安普霉素R（%）32.638.242.728.634.6黏菌素R（%）10.914.211.310.013.0氯霉素R（%）63.269.57460<0.0164.6氟苯尼考R（%）58.770<0.017657.162.3环丙沙星R（%）58.56059.361.459复方新诺明R（%）869093.382.987.6四环素R（%）85.488.293.377.1<0.0186.7喹乙醇R（%）65.161.46651.463.834 续表13磷霉素R（%）43.628.3<0.0146.737.133.4多西环素R（%）69.87576.771.470.8头孢西丁R（%）5.7547.17.1头孢噻肟浓度范围(μg/mL)4->1280.125->12816->1284->1280.125->128MIC501283212812832MIC90>12864>128>128>128R（%）97.910010010098.7头孢喹肟浓度范围(μg/mL)1->1280.015->1281->1281->1280.015->128MIC5032432168MIC9012816646432R（%）64.396.4<0.0196.795.775.4头孢他啶浓度范围(μg/mL)0.5->1280.03->1280.5-1280.5->1280.03->128MIC5016116164MIC906416646432R（%）12.152.7<0.0151.355.727.135 图6blaCTX-M-55阳性大肠杆菌PFGE分型图谱36 3.6blaCTX-M-55基因的接合、转化结果对100株blaCTX-M-55阳性菌进行质粒接合试验、转化实验，通过PCR鉴定，初步获得60株接合子或转化子，PCR电泳图如图7。对接合子或转化子提取质粒，并且电泳检测质粒结果，初步确定60株转化或接合子为单质粒，质粒电泳图如图8。图7接合子blaCTX-M-1GPCR扩增产物电泳图注:1为blaCTX-M-1G阳性对照，B为阴性对照，其余为接合子blaCTX-M-1G扩增产物；M为DL2000。图8接合子、转化子质粒图注：1～6为blaCTX-M-1G阳性菌接合子、转化子质粒；M：λ-HindIIIdigest。3.7blaCTX-M-55阳性复制子分型结果通过5对三重PCR以及3对普通PCR，对获得的60株接合子、转化子质粒进行37 复制子分型，结果为35株属于IncFII型（IncFII:33，26株:食品动物源和肉类食品源各10株，人源6株；IncFII:2，5株:食品动物源3株，肉类食品源2株；IncFII:16，1株；IncFII:29，1株；IncFII:18，1株；IncFII:36,1株），14株为IncI1型（人源6株，肉类食品源8株），1株为IncFIB型，1株为IncFIC型，1株为IncN型，4株为IncFII与其他复制子型组成的复合复制子型(1株为IncFIA型，3株IncFIB型)，另外有1株为IncFIA型、IncFIB型与IncFIC型复合复制子。三种不同来源接合子质粒复制子型均以IncFII型为主，肉类食品源和人源均有IncI1型检出，而在食品动物源中未有发现，且其含有较多的复合复制子。各来源相应质粒复制子分型结果见表15。表15不同来源blaCTX-M-55阳性接合子、转化子质粒复制子分型结果不同来源blaCTX-M-55阳性菌复制子型食品动物源肉类食品源总计（n=100）人源（n=37）(n=36)(n=27)IncFⅡ8151235F:336101026F:2325F:2911F:1611F:3611F:1811IncI16814IncFIB11IncFIC11IncN11IncFⅡ&N213IncFⅡ&FIB33IncFⅡ&FIA11IncFIA&FIB&FIC11成功获得接合子1623216038 4讨论4.1大肠杆菌ESBLs和pAmpC基因型流行特征随着畜牧业的快速发展以及抗生素的不合理使用，细菌耐药性问题愈发严重，且不仅仅表现在人和动物源菌株，在食品源及水、土壤等环境源菌株中也有报道。产ESBLs大肠杆菌自二十一世纪起已在世界范围内广泛流行，且有越来越严重的趋势。目前，国内人医临床产ESBLs和AmpC酶大肠杆菌的检出率极高，给临床抗菌治疗的药物选择带来极大的困难。国内有关动物源和食品源大肠杆菌产ESBLs的研究相对较少，但近年来国外的研究报道显示，与动物密切接触的人中检测到与动物相同的耐药基因（Dahmsetal.,2015；Huijbersetal.,2015；Lazarusetal.,2015）。在本研究中，广州市不同来源大肠杆菌ESBLs以CTX-M为主，其中CTX-M-9G最为流行，其次是CTX-M-1G，CTX-M-55超过CTX-M-15；pAmpC以CMY-2为主。而Shi等（2015）报道的中国多家医院的临床产ESBLs大肠杆菌CTX-M-1G与CTX-M-9G均为主要流行型，且CTX-M-1G检出率高于CTX-M-9G。本研究中blaCTX-M-14和blaCTX-M-15在人源blaCTX-M阳性菌中检出率均为最高（40.9%，7.6%），且患病人源高于健康人源，而blaCTX-M-55阳性检在人源菌株中为15.2%，且健康人源高于患病人源。然而Xia等（2014）报道，社区感染产ESBLs大肠杆菌在中国成为普遍致病菌，CTX-M-14最普遍，CTX-M-55和CTX-M-15快速增长，人临床样品中分离产ESBLs大肠杆菌，96.2%含CTX-M，CTX-M-1G40.7%，CTX-M-55占24.8%，CTX-M-15占18.2%；CTX-M-9G48.7%，CTX-M-14占46.8%，以及Zhong等（2015）报道中国湖南健康人源产ESBLs大肠杆菌中CTX-M-14和CTX-M-15分别占48.4%和27.5%，均与本研究的结果有明显差异。西班牙科研人员报道医院人源大肠杆菌中，CTX-M-14仍为主要流行，其次为CTX-M-15和CTX-M-1（Garridoetal.,2014）。美国南部医院的调查结果表明产ESBLs大肠杆菌快速增长，且比ESBLs肺炎克雷伯菌更易引发尿道感染（Thadenetal.,2016）。本研究发现患病人尿液源产ESBLs大肠杆菌检出率高于患病人粪便源，且以CTX-M型为主，而印度研究人员报道的人医临床产ESBLs大肠杆菌主要来自尿液源菌株，且以SHV型为主，检出率为63.04%，CTX-M阳性检出率只有54.3%（Ravikantetal.,2016）。在本研究的食品动物源菌株中，blaCTX–M-14、blaCTX-M-55和blaCTX-M-65是主要的流行型，与国内其他报道（Raoetal.,2014；Lietal.,2010；Sunetal.,2010；Zhengetal.,39 2012）一致，但是与其他国家畜禽动物分离株以blaCTX-M-1、blaCTX-M-15和blaTEM-52为主流行型的报道不同（Smetetal.,2008）（Maciucaetal.,2015）。本研究中，鸡源blaCTX-M、blaCTX-M-1G和blaCTX-M-55阳性菌检出率高于猪源，而blaCTX-M-9G和blaCMY则相反，猪源高于鸡源，除了blaCTX-M，其他与Rao等（2014）的报道一致。而与曲志娜等（2013）报道鸡源产ESBLs大肠杆菌高于猪源一致。在本研究中，blaCTX-M、blaCTX-M-65和blaCTX-M-27阳性菌检出率在肉类食品源菌株中均为最高，说明肉类食品被耐药大肠杆菌严重污染。在肉类食品源菌株中，以blaCTX-M-65、blaCTX-M-14和blaCTX-M-55为主要流行基因型，这与国内报道（Xietal.,2015；Yuetal.,2015）相似，但和国外其他国家肉类食品分离株以blaCTX-M-1、blaCTX-M-15和blaCMY-2为主流行型的报道不同（Onenetal.,2015;Rasmussenetal.,2015;Joetal.,2016;（Botelhoetal.,2015）。在本研究中，blaCTX-M-24a、blaCMY和blaCTX-M-55阳性菌检出率在食品动物源菌株中均为最高，其次为肉类食品源和人源，据此可推测blaCTX-M-24a、blaCMY和blaCTX-M-55可通过食物链从动物传播到人，尤其是健康人群。这与荷兰研究人员报道的鸡肉中丰富的耐药菌株对人源产ESBLs大肠杆菌的传播有贡献相似（Overdevestetal.,2011）。2016年Borjesson等人报道了分离自瑞典人、动物和食品的产ESBLs和pAmpC大肠杆菌的传播途径，结果表明，产ESBLs和pAmpC大肠杆菌在各个来源中并非克隆传播，且鸡和鸡肉可能是产ESBLs和pAmpC大肠杆菌传播到人的储存库和传播路径（Borjessonetal.,2016）。但是目前也有较多研究表明产ESBLs大肠杆菌已在社区、医院、家畜、食品、伴侣动物、野生动物及水体河流中广泛分布，但就其耐药发展过程及其在各种来源间的传播路径尚未形成定论，还需更多不同地区的研究数据来解析。4.2不同来源产CTX-M大肠杆菌耐药性分析产ESBLs大肠杆菌为目前常见的多重耐药菌，其不仅对青霉素类药物、一、二、三代头孢菌素和氨曲南具有耐药性外，对氨基糖苷类、氯霉素类、氟喹诺酮类和磺胺类等药物同样存在交叉耐药现象（Ruppetal.,2003）。菌株对抗菌药物表现为不同程度的耐药性与这些药物在临床生产中的应用时长有很大的关系。本研究中，人、食品动物和肉类食品三种不同来源大肠杆菌除了对亚胺培南敏感，对多种抗菌药物表现耐药，且各个来源菌株耐药率有明显差异。本研究的菌株对庆大霉素和阿米卡星这两种氨基糖苷类药物的耐药率差异较大，主要原因是庆大霉素在临40 床上长期并反复使用，从而使细菌能在一个较长的时间内对其保持高耐药性，而阿米卡星为半合成的氨基糖苷类抗菌药物，药物价格高，兽医临床上使用频率小，以及此药对多数氨基糖苷类钝化酶稳定，不易产生耐药性。此外这些头孢噻肟非敏感大肠杆菌对不同的头孢菌素类药物耐药率差异大(13.6%~99.7%)，对头孢西丁耐药率最低（13.6%），对头孢他啶耐药性稍高，为28.8%。食品动物源菌株的四环素耐药率显著高于其他来源，而头孢喹肟和头孢他啶耐药率显著低于其他来源，原因可能是食品动物养殖过程中较少使用价格高的三代、四代头孢菌素。肉类食品源大肠杆菌对磷霉素耐药率最高，为43.7%，其次为食品动物源（29.1%）和人源（24.9%），高于国内以及其他一些国家在人医临床方面产ESBLs菌株对磷霉素的耐药率报道（12.4%）（Leeetal.,2012；朱德妹等，2012），由于磷霉素在国内并不批准用于家畜，食品动物高磷霉素耐药率这一现象很有可能是其他多种抗菌药物共同选择（例如头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素同时选择）或者非法使用磷霉素而导致的结果。食品动物源菌株对环丙沙星耐药率为57.9%，比国内其他报告要少（Raoetal,2014），但是仍然高于国外报道的情况（Mainalietal.,2013；Wasyletal.,2013），说明我国动物养殖过程中抗菌药物使用依然存在弊端，耐药形势依然严峻，有必要继续加强对养殖业抗生素使用的监管以及指导临床合理使用抗菌药物。人源菌株对阿米卡星、黏菌素、安普霉素、新霉素、氟苯尼考、喹乙醇、氯霉素、多西环素、链霉素和复方新诺明等10种药物的耐药率均显著低于其他来源，原因是黏菌素、安普霉素、新霉素、氟苯尼考、喹乙醇、氯霉素、链霉素和复方新诺明均为兽医常用药物，而人医临床较少使用。本研究中，产CTX-M-1组酶（主要是CTX-M-55）的菌株对磷霉素、头孢喹肟和头孢他啶的耐药性明显强于产CTX-M-9组酶的菌株，该结果与Sun等（2010）和Rao等（2014）的报道相似，这一发现进一步证实CTM-M-55对头孢他啶的水解活性相对较强（Kiratisinetal.,2007）。对头孢他啶水解能力较强的CTX-M酶（例如CTX-M-15）的出现，很有可能是临床上使用头孢他啶导致的结果。然而，国内并未批准头孢他啶用于家畜，动物源中CTX-M-55出现的真正原因还有待进一步调查。携带blaCTX-M大肠杆菌对于其他药物同时表现高耐现象，特别是对喹诺酮类、氨基糖苷类和磷霉素的高耐药率应该引起我们的关注，因为有效治疗产ESBLs大肠杆菌的抗菌药物选择将十分有限。因此，blaCTX-M的大范围传播不仅对动物产生危害，对人类健41 康同样具有很大威胁。4.3blaCTX-M-55大肠杆菌遗传特征根据Clermont等(2013)报道的四重PCR方法，可将大肠杆菌系统进化关系分为8组，分别是A、B1、B2、C、D、E、F和cladeⅠ组。共生型大肠杆菌主要分布在A组，而较多毒力因子的大肠杆菌主要分布在B2组，其次是F和D组（Clermontetal.,2013）。本研究中，随机挑选100株产CTX-M-55大肠杆菌的种族系统进化关系进行了研究，结果表明，不同来源产CTX-M-55大肠杆菌种族系统分组差异不明显，主要分布在A组，其次食品动物源和肉类食品源为B1组而人源菌株为F组。本次受试菌株多为共生型大肠杆菌，而人源大肠杆菌有部分为带有毒力因子的菌株，这一结果可能与人源较多样品来自患病人群有关。PFGE分型结果表明，blaCTX-M-55阳性菌呈现多样化指纹图谱，只有少数菌株相似性高达90%以上，说明克隆传播不是blaCTX-M-55的主要传播机制。90%相似性以上的菌株多为相同来源大肠杆菌，只有1簇2株菌为来自人源和鸡源，说明不同来源的菌株间存在克隆传播。4.4blaCTX-M-55质粒复制子分型耐药基因的传播机制包括克隆传播以及通过可移动元件，包括插入序列、转座子等和可接合性质粒的水平传播。其中，可接合性质粒在菌株间的水平转移，大大增加了细菌耐药基因的多样性以及菌体在环境中的适应性（Franciaetal.,2004）。deBeen等(2014)通过全基因组测序证明头孢耐药大肠杆菌从禽克隆传播到人失败，耐药基因主要通过质粒传播。本研究根据Carattoli等（2005）的PCR方法，对blaCTX-M-55接合转化子进行复制子分型，结果发现blaCTX-M-55主要位于IncFII型和IncI1型两种质粒上，且以IncFII型的F33:A-:B-型为主。食品动物源blaCTX-M-55菌株以IncFII型质粒为主要传播载体，而人源和肉类食品源菌株以IncFII型和IncI1型质粒为主。然而，在荷兰的鸡肉源和鸡肠道源携带blaCTX-M-1的质粒多为IncI1型质粒（Fischeretal.,2014），而且，Wang等(2014)研究员对16个来自人源和鸡源的可接合性质粒测序后发现，鸡源携带blaCTX-M-1的质粒多为IncI1型质粒，而人源携带blaCTX-M-1的质粒有IncFII型和IncI1型质粒。42 5全文结论1大肠杆菌ESBLs基因以blaCTX-M为主，其中blaCTX-M-14最为流行，其次是blaCTX-M-55和blaCTX-M-65；pAmpC以blaCMY-2为主。不同来源大肠杆菌流行基因型有差别。2人、食品动物和肉类食品三种不同来源大肠杆菌均表现对多种抗菌药物耐药，但对不同药物耐药率有显著差异。3大肠杆菌blaCTX-M-55的流行主要以菌株间的水平传播为主，食品动物源blaCTX-M-55基因以IncFII型质粒为主，而人源和肉类食品源菌株以IncFII型和IncI1型质粒为主。43 致谢本论文是在导师刘健华教授的悉心指导下完成的。尊敬的刘老师的高尚的品德、广博的学识、严谨的治学作风、坦荡的胸襟、淡定从容的人生态度、一丝不苟的求实作风、敏捷的思维及谦和的待人作风是我永远学习的榜样。在此谨向刘老师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！感谢本药理教研室陈杖榴教授、曾振灵教授、刘雅红教授、方炳虎教授、丁焕中教授、孙永学教授、陈建新教授、贺利民研究员、蒋红霞教授、陈红高级兽医师、黄显会高级兽医师、廖晓萍副教授、汤有志副教授、曾东平高级实验师、孙坚副教授、靳珍副教授，潘广方和蒋佩莲等众位老师在实验中给予大力帮助。在此特向以上各位老师致以深深的谢意！感谢本药理教研室各位老师在实验中给予大力帮助，感谢华南农业大学兽医药理研究室博士研究生陈孝杰、吕鲁超师兄和刘小琴、贺丹丹、王晶师姐在我实验过程中，给予我及我实验的真诚关心和帮助。感谢饶丽丽、杨小云、刘兰平、刘务玲、俞林锋、刘亦云、李伟、姚旭、植婵萍、伍盛鋆、郭泽文、张秀凤、宋倩华、罗娟、吴仁杰、郭保卫等研究生，感谢宋博文、刘青、唐永东、陈昕、胡雪、邝春曼、黎丽珍、许艳杰、吴焕等本科生给予本试验的大力帮助。谢谢大家在我试验各个环节各个方面给予大力支持和无私帮助。在此，表示衷心的感谢！感谢这些年来一直给我精神鼓励和物质支持的父母，同时感谢我所有的亲人对我的支持与帮助！感谢逆境、顺境中一直陪着我的朋友们！最后还要感谢所有帮助和关心我的人，谢谢大家！本研究得到973项目《畜禽病原菌重要耐药基因的传播机制与流行规律》(2013CB127200)的资助，特此感谢！44 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