基于抗氧化作用研究胶原蛋白肽干预糖尿病实验动物营养代谢特性

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学校代码：10264研究生学号：M150208403上海海洋大学硕士学位论文基于抗氧化作用研究胶原蛋白肽干预糖尿病题目：实验动物营养代谢特性Collagenpeptideinterventionnutritionand英文题目：metabolismcharacteristicsindiabeticexperimentalanimalbasedonantioxygenation专业：食品科学与工程研究方向：海洋生物制药姓名：欧爱宁指导教师：吴文惠包斌二O一八年五月二十日 上海海洋大学硕士学位论文基于抗氧化作用研究胶原蛋白肽干预糖尿病实验动物营养代谢特性摘要机体在正常代谢过程中及在外部的刺激情况都会产生大量的自由基，而过量的自由基不能及时清除就会引起细胞损伤和凋亡和酶失活，导致机体衰老和引发各种疾病，如糖尿病。报道显示胶原蛋白肽具有抗氧化性、生物相容性强和安全性高，能增强机体免疫性和抗氧化作用被广泛应用于保健食品和生物医药，胶原蛋白多肽-铬(Ⅲ)螯合物已被证实能活化免疫细胞、改善小鼠免疫功能，促进肝糖原的合成和糖尿病小鼠体内的葡萄糖磷酸化。因此，为了更好地开发胶原蛋白肽的医用功能，论文将探索胶原蛋白抗氧化特性，胶原蛋白肽溶解在不同离子环境中的抗氧化性和干预糖尿病实验动物降血糖作用的研究，为胶原蛋白肽的深入研究提供基础依据。胶原蛋白抗氧化作用评价。以WSC、C-1、C-2、SC、SKI-ASC、WCⅡ、WWSCⅡ、SCⅡ为原料，通过SDS-PAGE、氨基酸构成、还原力、•OH清除率、DPPH•清除率等指标分析胶原蛋白及其氨基酸构成与抗氧化活性的关系。SDS-PAGE分析显示，WSC、C-1、C-2、SC、SKI-ASC是Ⅰ型胶原蛋白，WCⅡ、WWSCⅡ、SCⅡ是Ⅱ型胶原蛋白。胶原蛋白的甘氨酸残基含量高为317-356残基/1000残基，其次是丙氨酸残基和脯氨酸残基。WWSCII还原力EC50为2.86mg/mL、清除•OH能力EC50为9.2mg/mL，清除DPPH•能力为4.3mg/mL，顺次是SCII、WSC、SKI-ASC、SC等。胶原蛋白可有效清除•OH和DPPH•，WWSCII的还原力回归方程为Y=0.0241X+0.0275，回归决定系数在0.99以上，其他胶原蛋白也呈现类似的结果，在2-10mg/mL浓度范围内，呈现出良好的量效关系。通过测定胶原蛋白肽溶解在乙酸、乙酸钠和乙酸钙中的还原力、清除•OH和DPPH•的能力，来判断离子对胶原蛋白肽抗氧化性的影响。结果显示，在H+、Na+环境中对GBB-10SP、TYPE-S的还原力降低了0.96-2.58倍，但对清除DPPH•影响效果较弱，H+环境中胶原蛋白肽无清除•OH的作用，0.1MNa+时，GBB-10SP（15mg/mL）和TYPE-S（80mg/mL）清除·OH的能力为11.94-60.56%和-4.31-15.90%呈显著性差异（p<0.05）。Ca2+对GBB-10SP、TYPE-S的还原力、•OH、DPPH•清除影响稍弱。采用小鼠糖尿病模型研究GBB-10SP降血糖的作用特性。对糖尿病模型小鼠 上海海洋大学硕士学位论文进行GBB-10SP灌胃处理，测定给药前后小鼠的空腹血糖值、体重、脏器指数与肝组织抗氧化能力，进行糖耐量试验。GBB-10SP处理组与模型组对比葡萄糖耐量曲线下面积降低至51.51-55.52mmol/L。肝脏指数和肾脏指数降低至40.44-41.52mg/g和16.27-16.59mg/g，脾脏指数提高至2.94-3.14mg/g，超氧化物歧化酶活力增强至90.05-103.90μ/mg，丙二醛含量降至2.94-3.03nmol/mg。与模型组相比，胶原蛋白肽处理的糖尿病模型小鼠，第28d的血糖值和第21d的AUC显著降低（p＜0.05），肝脏指数和肾脏指数下降，脾脏指数上升，肝组织抗氧化能力提高，但无降血糖效果，可以维持后期血糖值不持续升高。表明GBB-10SP可使糖尿病小鼠的肝脏抗氧化能力提高，促进糖尿病模型小鼠脏器损伤修复和提高自身免疫能力。采用小鼠糖尿病模型研究低分子量胶原蛋白肽联合苦瓜素辅助降血糖的作用特性。结果显示，胶原蛋白肽联合苦瓜素将糖尿病模型小鼠的血糖含量降低至7.5-17.8mmol/L，葡萄糖耐量曲线下面积降低至32.62-38.66mmol/min·L，肝脏指数和肾脏指数降低至44.98-57.17mg/g和11.29-17.95mg/g，脾脏指数提高至2.71-3.52mg/g，超氧化物歧化酶活力增强至88.18-158.38μ/mg，丙二醛含量降至1.66-3.00nmol/mg。与模型组相比，胶原蛋白肽联合苦瓜素处理的糖尿病模型小鼠，第28d的血糖值和第21d的AUC显著降低（p＜0.05），肝脏指数和肾脏指数下降，脾脏指数上升，肝组织抗氧化能力提高，其中石斑鱼骨胶原蛋白肽联合苦瓜素的中剂量组与罗非鱼皮胶原蛋白肽联合苦瓜素的中剂量组和高剂量组效果较显著。研究表明胶原蛋白肽联合苦瓜素可使糖尿病小鼠的血糖值显著降低（p<0.05），且血糖值降低与肝脏抗氧化能力提高相关联，同时胶原蛋白肽联合苦瓜素处理促进糖尿病模型小鼠脏器损伤修复和提高自身免疫能力。胶原蛋白具有多种生物活性，本研究结果显示胶原蛋白具有抗氧化作用，而WWSCⅡ抗氧化作用显著。H+、Na+对GBB-10SP、TYPE-S抗氧化作用影响呈显著性差异，而Ca2+影响稍弱。此外GBB-10SP对血糖值较高糖尿病小鼠无辅助降血糖效果，但可促进其机体脏器的修复。低分子量的胶原蛋白肽联合苦瓜素使糖尿病小鼠的血糖值显著降低（p<0.05），且血糖值降低与肝脏抗氧化能力提高相关联，同时胶原蛋白肽联合苦瓜素处理促进糖尿病模型小鼠脏器损伤修复和提高自身免疫能力。关键词：胶原蛋白肽，苦瓜素，抗氧化性，辅助降血糖，糖尿病I 上海海洋大学硕士学位论文CollagenpeptideinterventionnutritionandmetabolismcharacteristicsindiabeticexperimentalanimalbasedonantioxygenationABSTRACTThefreeradicalscanbeproducedbynormalmetabolismandexogenousstimuli.excessivefreeradicalsremainedmaycausecelldamageandapoptosisandenzymeinactivation,whichleadingtotheagingofthebodyandcausingavarietyofdiseases,suchasdiabetes.Itwasreportedthatcollagenpeptidehasgoodantioxidant,biocompatibilityandsafety.Itcanenhancetheimmuneandantioxidanteffectsofthebodyandiswidelyusedinhealthfoodandbiologicalmedicine.Thecollagenpolypeptidechromium(III)chelatehasbeenprovedtoactivateimmunecells,improvetheimmunefunctionofmice,andpromotethesynthesisofliverglycogenandtheglucosephosphorylationindiabeticmice.Therefore,inordertobetterdevelopthemedicalfunctionofcollagenpeptide,thepaperwillexploretheantioxidantpropertiesofcollagen,theantioxidationofcollagenpeptidedissolvedindifferentionenvironmentandinterventiononthehypoglycemiceffectofdiabeticexperimentalanimals.whichwillprovidethebasisforthein-depthstudyofcollagenpeptide.Evaluationoftheantioxidativeeffectofcollagen.WithWSC,C-1,C-2,SC,SKI-ASC,WCII,WWSCII,SCIIasrawmaterials,therelationshipbetweenthecompositionofcollagenanditsaminoacidcompositionandantioxidantactivitywasanalyzedbytheindexesofSDS-PAGE,aminoacidcomposition,reducingpower,•OHandDPPH•Scavengingability.SDS-PAGEanalysisshowedthatWSC,C-1,C-2,SCandSKI-ASCweretypeIcollagen,WCII,WWSCIIandSCIIweretypeIIcollagen.Thecontentofglycineresiduesincollagenwas317-356residue/1000residues,followedbyalanineresiduesandprolineresidues.Theabsorbancevaluesandofreducingpower,•OHandDPPH•ScavengingabilityEC50ofWWSCIIis2.86,9.2and4.3mg/mL,respectively.thenextisSCIISCIIWSCWSCSKI-ASCetc.TheregressionequationofreductiveforceofWWSCIIisY=0.0241X+0.0275,theregressionII 上海海洋大学硕士学位论文coefficientisabove0.99,andothercollagenshowssimilarresults.Intherangeof2-10mg/mLconcentration,italsoshowedagooddose-responserelationship.Theeffectofionsontheantioxidantactivityofcollagenpeptidewasjudgedbydeterminingthereducingpower,•OHandDPPH•Scavengingabilityofcollagenpeptideinaceticacid,sodiumacetateandcalciumacetate.TheresultsshowedthatthereducingpowerofGBB-10SPandTYPE-Sdecreased0.96-2.58foldinH+andNa+,ButithasaweakeffectonthescavengingactivityofDPPH•.ThecollagenpeptidehadnoScavengingabilityof•OHintheCa2+.thehydroxylradicalscavengingactivitywassignificantlyincreasedfrom11.94to60.56%and-4.31to15.90%forGBB-10SPandTYPE-Sat15and80mg/mLat0.1MNa+whicharesignificantdifference(p<0.05),respectively.Ca2+hadlittleeffectonthereducingpower,•OHandDPPH•ScavengingabilityofGBB-10SPandTYPE-S.ThecharacteristicsofhypoglycemiceffectofGBB-10SPweredeterminedinmicediabeticmodels.ThediabeticmodelmicewereadministratedGBB-10SPthroughintragastricadministrationandthenthevalueoffastingglucose,bodyweight,organmassandliverantioxidantcapacityofthemiceandgivenoralglucosetolerancetestweremeasured.AfterthetreatmentofGBB-10SP，TheareaunderCurvereducedto51.51-55.52mmol/L,liverindexandkidneyindexdecreasedto40.44-41.52mg/g,16.27-16.59mg/g,respectively.Thespleenindexincreasedto2.94-3.14mg/g,Superoxidedismutaseactivityincreasedto90.05-103.90μ/mgprotein,andthecontentofMDAdecreasedto2.94-3.03nmol/mgprotein.Comparedwiththemodelgroup,theAUCat21daysdecreasedsignificantly(p<0.05),liverindexandkidneyindexdecreased,butthespleenindexincreased.Theantioxidantabilityoflivertissueincreased.,butnobloodsugarreductioneffect,whichcanmaintainthelatebloodsugarvaluedoesnotcontinuetoincrease.GBB-10SPcanimproveofliverantioxidantcapacityofdiabeticmicemodel.Meanwhile,thetreatmentofcollagenpeptideandMomordicacharantiaextractscouldpromoteorganrepairandimprovetheabilityofautoimmunity.ThehypoglycemiceffectsoflowmolecularweightcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractsweredeterminedinmicediabeticmodelinvivo.AfterthetreatmentofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextracts,thebloodsugarvaluewasdecreasedto7.5-16.63mmol/L,liverindexandkidneyindexdecreasedto44.98-56.17mg/g,11.29-17.95mg/g,respectively.ThespleenindexincreasedtoIII 上海海洋大学硕士学位论文2.713.52mg/g,AreaunderCurvereducedto32.03-38.14mmol/min•L.Superoxidedismutaseactivityincreasedto89.18-154.72μ/mgprotein,andthecontentofMDAdecreasedto1.66-3nmol/mgprotein.Comparedwiththemodelgroup,thebonecollagenpeptideofEpinephelusspandMomordicacharantiaextractsofthemiddledosagetreatmentgroup,andtheskincollagenpeptideofOreochromismossambicuandMomordicacharantiaextractsofmiddleandhighdosagetreatmentgroupseffectwereremarkable.Thebloodsugarvalueat28daysandAUCat21daysdecreasedsignificantly,liverindexandkidneyindexdecreased,butthespleenindexincreased.Theantioxidantabilityoflivertissueincreased.TheresultsshowedthatthetreatmentofcollagenpeptideandMomordicacharantiaextractscouldsignificantlyreduce(p<0.05),andthebloodglucosevaluerelatedtotheimprovementofliverantioxidantcapacityofdiabeticmicemodel.Meanwhile,thetreatmentofcollagenpeptideandMomordicacharantiaextractscouldpromoteorganrepairandimprovetheabilityofautoimmunity.Collagenhasmanybiologicalactivities.Theresultsshowthatcollagenhasantioxidation,whileWWSCIIhassignificantantioxidantation.TheeffectsofH+andNa+onGBB-10SPandTYPE-Sweresignificantlydifferent,whileCa2+wasslightlyweaker.Furthermore,GBB-10SPhasnohypoglycemiceffectondiabeticmicewithhighbloodglucoselevel,butitcanpromotetherepairoforgans.ThelowmolecularweightcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractssignificantlyreducedthebloodsugarofdiabeticmice(p<0.05),andthebloodglucosevaluerelatedtotheimprovementofliverantioxidantcapacity.Meanwhile,thetreatmentofcollagenpeptideandMomordicacharantiaextractscouldpromoteorganrepairandimprovetheabilityofautoimmunity.KEYWORDS:collagenpeptide,MomordicaCharantiaextracts,antioxidant,assistedhypoglycemic;diabetesmellitusIV 上海海洋大学硕士学位论文目录摘要.................................................................................................................................ⅠABSTRACT....................................................................................................................Ⅲ第一章胶原蛋白及其功能作用.....................................................................................11.1胶原蛋白.............................................................................................................11.2胶原蛋白肽的生理功能.....................................................................................11.2.1皮肤修复作用............................................................................................11.2.2免疫调节作用............................................................................................11.2.3骨质疏松的防治作用................................................................................21.3胶原蛋白肽抗氧化功能的研究现状..................................................................21.3.1氨基酸组成对胶原蛋白肽抗氧化作用的影响........................................31.3.2分子量对胶原蛋白肽抗氧化作用的影响................................................31.4氧化性损伤对人体造成的危害.........................................................................31.4.1Ⅱ型糖尿病形成的过程.............................................................................31.4.2糖尿病的治疗药物....................................................................................41.4.3糖尿病模型的建立....................................................................................41.4.4胶原蛋白肽治疗糖尿病的研究进展........................................................51.5研究意义及内容..................................................................................................51.5.1研究意义....................................................................................................51.5.2研究内容....................................................................................................5第二章胶原蛋白抗氧化作用评价.................................................................................62.1材料与方法.........................................................................................................62.1.1材料与试剂................................................................................................62.1.2仪器与设备................................................................................................72.1.3方法............................................................................................................72.2结果与分析.........................................................................................................82.2.1胶原蛋白分子量的分析...........................................................................82.2.2胶原蛋白的氨基酸构成分析...................................................................92.2.3胶原蛋白的还原力特性..........................................................................102.2.4胶原蛋白清除·OH的特性......................................................................112.2.5.胶原蛋白清除DPPH•的特性..................................................................12V 上海海洋大学硕士学位论文2.3结论...................................................................................................................13第三章不同离子浓度对低分子量胶原蛋白肽抗氧化...............................................153.1材料与方法...........................................................................................................3.1.1材料与试剂..............................................................................................153.1.2仪器与设备..............................................................................................153.1.3GBB-10SP及TYPE-S的制备................................................................153.1.4方法..........................................................................................................163.2结果与分析.......................................................................................................173.2.1胶原蛋白肽的氨基酸构成分析.............................................................173.2.2H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽还原力特性的影响.............................183.2.3H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽清除·OH特性的影响.........................213.2.4H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽清除DPPH•特性的影响.....................243.3结论...................................................................................................................27第四章GBB-10SP降低血糖作用的研究....................................................................294.1材料与方法.......................................................................................................294.1.1材料与试剂..............................................................................................294.1.2仪器与设备..............................................................................................294.1.3动物..........................................................................................................294.2结果与分析.......................................................................................................324.2.1GBB-10SP对DM小鼠生活状态的影响...............................................324.2.2GBB-10SP对DM小鼠生长的影响.......................................................334.2.3GBB-10SP对DM小鼠血糖的影响.......................................................354.2.4GBB-10SP对DM小鼠葡萄糖耐量的影响...........................................364.2.5GBB-10SP对DM小鼠肝组织抗氧化能力的影响...............................364.2.6GBB-10SP对DM小鼠脏器指数的影响...............................................374.3结论...................................................................................................................38第五章低分子量胶原蛋白肽联合苦瓜素辅助降低糖尿病小鼠血糖作用特性的研究.....................................................................................................................................395.1材料与方法.......................................................................................................395.1.1材料与试剂..............................................................................................395.1.2仪器与设备..............................................................................................395.1.3动物..........................................................................................................395.2结果与分析.......................................................................................................41VI 上海海洋大学硕士学位论文5.2.1胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠生活状态的影响.................415.2.2胶原蛋白肽联合苦瓜素对DM小鼠生长的影响.................................425.2.3胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠血糖的影响..........................435.2.4胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠葡萄糖耐量的影响..............465.2.5胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠肝组织抗氧化能力的影响..465.2.6胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠脏器指数的影响..................475.3结论与讨论.......................................................................................................48全文总结.........................................................................................................................50参考文献.........................................................................................................................52VII 上海海洋大学硕士学位论文第一章胶原蛋白及其功能作用临床上由氧化损伤造成机体器管功能被破坏形成的糖尿病现象已非常常见，而传统的降血糖化学药物长期服用，会产生多种毒副作用[1-2]，研究学者们把重心转移到从天然的动植物上提取治疗降血糖的新型生物医药。胶原蛋白肽吸收性强，安全性高、无副作用，且具有抗氧化性、免疫调节等多种生物活性[3]。1.1胶原蛋白动物的皮、软骨、韧带和肌腱中存在大量的胶原蛋白，它具有支持、保护机体功能[4]，对维持血管壁、皮肤弹性和软骨润滑度，提高毛发亮度等都有重要作用[5-6]。已发现的胶原蛋白具有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型等多种类型[7]，其中Ⅰ型胶原蛋白占胶原蛋白的90%[8]，而在软骨组织蛋白质中Ⅱ型胶原蛋白占总量的80%左右[9]。Ⅰ型胶原蛋白的超螺旋结构是由2条α1链和1条α2链构成的，它是左手螺旋结构[10-12]。Ⅱ型胶原蛋白是由3条相同的α1（Ⅱ）链组成的三聚体超螺旋结构[13]。胶原蛋白中甘氨酸较高[14]。在空间位置中甘氨酸可以优化多肽链折叠构象，形成（Gly-Xaa-Yaa）n重复序列，增强三股螺旋的稳定性[15-17]。此外，机体细胞的形态、增殖与分化与胶原蛋白的独特的结构密切相关[18]。胶原蛋白具有优良的生物学性能[19-21]如抗菌性、抗氧化性等。1.2胶原蛋白肽的生理功能1.2.1皮肤修复作用胶原蛋白和胶原肽通过提高小鼠皮肤及血清中抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等），降低丙二醛含量（P<0.05），来缓解经紫外线照射引起的体内氧化和修复光老化造成的皮肤损伤，增强皮肤弹性[22]。据美国Skovgaard[23]等学者钻研报导对绝经女性进行口服鱼胶原蛋白影响皮肤的尝试，结果显示口服鱼胶原蛋白后可以削减前额、眼周和口周的皱纹，改良脸部色斑和黑眼圈(P＜0.05)。1.2.2免疫调节作用邓超[24]等人发现霞水母胶原蛋白肽可以促进吞噬细胞的吞噬活性及加强细胞1 上海海洋大学硕士学位论文和体液的免疫功效，并且具有增强机体免疫调节的作用。海蜇[25]胶原蛋白肽研究显示胶原蛋白肽使小鼠的吞噬指数、碳廓清指数和脾脏指数提高，促进免疫器官的修复。此外，庄永亮研究发现海蜇胶原蛋白和胶原肽可以防止免疫器官的萎缩[22]。1.2.3骨质疏松的防治作用据报道胶原蛋白肽能增加成骨细胞增殖、分化和骨基质矿化，能增加骨密度、避免骨吸收，增加Ⅰ型胶原蛋白和黏多糖产生，从而预防和治疗骨质疏松症[26]。Liu等[27]发现牛胶原蛋白肽能促进成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、碱性磷酸酶活性和骨钙素和骨基质矿化。Guillerminet等[28]研究发现切除卵巢＋胶原蛋白肽Peptan组和假切除卵巢对照组的骨密度较高于切除卵巢组（P＜0.05）；切除卵巢＋胶原蛋白肽Peptan组的股骨骨皮质面积和股骨极限强度较大于切除卵巢组（P＜0.05）；与切除卵巢组相比，切除卵巢＋胶原蛋白肽Peptan组和假切除卵巢对照组的胶原羧基末端肽（CTX）显著较低（P＜0.05），证明了胶原蛋白肽Peptan可以增添骨密度，防止骨吸收，增大骨皮质面积和加强骨骼的坚固度。Li等[29]等人对大鼠用维A酸引诱的骨质疏松症预防和医治结果显示：梅花鹿鹿茸胶原蛋白肽能增加骨质疏松症大鼠的骨密度、改良骨质疏松症状（骨小梁减少、宽度变窄、间距变大）、增加股骨最大载荷和最大应力。1.3胶原蛋白肽抗氧化功能的研究现状研究发现，不同酶解获得的鳕鱼骨胶原蛋白肽均具备清除·OH、DPPH·和O2-·自由基的本领，并呈剂量关系。使用不同酶制备的鳕鱼骨胶原蛋白肽对清除自由基的能力也各不相同[30]。Jeevithan等[31]人研究发现从鲸鲨软骨中提取酸溶性胶原蛋白肽（ASC）和酶溶性胶原蛋白肽（PSC）对DPPH自由基清除率分别为15.83%和19.70%，在700nm时还原力的OD值为0.15和0.18，证明ASC和PSC均具备抗氧化能力。王宁丽等人发现鱼皮低聚肽抗氧化活性表现鱼皮低聚肽对自由基具有清除能力，其中清除·OHIC50值为2.482mg/mL；清除DPPH·的IC50值为0.635mg/mL[32]。研究发现，1%胶原蛋白肽可显著降低机体活性氧和丙二醛含量(P<0.05)，促使抗氧化能力恢复正常(P<0.05)，加快血脂恢复到正常(P<0.05)，证实了胶原蛋白肽具有提高机体抗氧化的能力，有助于缓解高脂膳食造成的氧化应激造成的机体损伤，恢复和改善血脂代谢[33]。海蜇胶原蛋白肽能显著提高肝组织超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活力，且显著降低丙二醛的含量，证明海蜇胶原蛋白肽具有降血脂和增强机体组织的抗氧化性作用[25]。草鱼多肽能有效地提高血清及2 上海海洋大学硕士学位论文组织的超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物活性和总抗氧化能力值，能有效地降低实验小鼠血清和组织中的丙二醛含量，证明了草鱼多肽具有一定的抗氧化作用[34]。1.3.1氨基酸组成对胶原蛋白肽抗氧化作用的影响肽类的抗氧化活性强弱与分子量大小及氨基酸组成有一定的相关性[35]。研究表明，缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、脯氨酸、丙氨酸等都具有较好的清除自由基的能力[36-37]；除了这些疏水性氨基酸，含硫氨基酸类如蛋氨酸也具有抗氧化性[44]。从金枪鱼鱼骨胶原蛋白肽中分离纯化得到氨基酸序列Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Gln-Gly(GPAGPAGQEG)，具有清除自由基的能力，即羟自由基EC500.18mg/mL、DPPH•自由基EC500.97mg/mL、ABTS自由基(EC500.52mg/mL和超氧阴离子自由基EC500.38mg/mL。GPAGPAGQEG被证实了具有抑制脂质过氧化的作用[37]。Mendis等人研究显示鳕鱼皮酶解制备的多肽His-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu，具有清除DPPH•和O2-•能力[38]。Je等[39]研究发现金枪鱼鱼骨酶解的VKAGFAWTANQQLS肽序列，具有脂质过氧化反应和清除自由基能力。1.3.2分子量对胶原蛋白肽抗氧化作用的影响鳕鱼皮胶原蛋白肽可以清除DPPH•、•OH和O2-•，且清除率与浓度呈剂量关系；浓度为30mg/mL时，胶原蛋白肽对DPPH•、•OH和O2-•的抑制率分别为73.84%、85.76%、64.09%。胶原蛋白肽分子量在1ku以下，浓度为30mg/mL时DPPH•、•OH清除率为84%和90.97%；5ku以上的分子量，在30mg/mL时O2-•清除率能为到74.02%[40]。1.4氧化性损伤对人体造成的危害外界刺激及机体的正常代谢都会产生大量的自由基，过量的自由基不能被机体及时清除将会导致机体衰老和产生各种疾病，如心血管疾病、心脏病、糖尿病、动脉粥样硬化等[41-43]。因此，随着人口老龄的增加，关于抗氧化的研究已被社会人士广泛关注[44]。1.4.1Ⅱ型糖尿病形成的过程糖尿病是由于胰岛β细胞受损或胰岛素分泌缺陷引起的高血糖症状的疾病。2型糖尿病（type2diabetesmellitus,T2DM）患者占糖尿病患者的90%以上[45]。形成Ⅱ型糖尿病的主要原因之一是氧化应激反应[46]。氧化应激反应是一种因为活性氮和活性氧不能被及时清除而导致其积累过多，引起的机体细胞损伤的过3 上海海洋大学硕士学位论文程[47]。血糖过高是导致氧化应激的重要因素，高血糖是经过线粒体电子传递链[48]和多元醇通路等途径[49]时，积累过量超氧产物（如羟基自由基和过氧化氢）不能清除造成氧化应激。据研究显示，氧化应激反应会损伤胰岛β细胞与胰岛素抵抗从而形成糖尿病，严重时会伴随并发症的产生，像糖尿病神经病[50]、和糖尿病视网膜病[51]、糖尿病心血管病[52]等。图1-1ROS诱导胰岛β细胞功能损伤Fig1-1Aschematicofreactiveoxygenspecies(ROS)inducingisletβcelldysfunction.1.4.2糖尿病的治疗药物目前，全世界患有T2DM人数剧增，现在患者已超过2.46亿人左右[53]。经调研发现市场上常见的传统治疗T2DM的药物主要有格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、双胍类、噻唑烷二酮类、磺酰脲类及胰岛素等，这些药物长期服用均会出现一些不良反应和限制性，如低血糖、肥胖[54-60]等。市面上的二甲双胍和苯乙双胍属于双胍类药物，其中苯乙双胍易造成乳酸积累过多导致酸中毒的现象，具有较大安全风险。1920年据研究报道，发现二甲双胍具有降血糖和保护心血管的作用，并且通过大量的临床实践和研究证实了使用二甲双胍治疗药物的获益大于其带来的风险，目前已被许多国家用于治疗T2DM[54]，经查阅文献发现目前对糖尿病研究常用的阳性对照药物为双胍类药物。1.4.3糖尿病模型的建立随着时代的发展，人们的饮食状况发生了很大变化，患有2型糖尿病的人群越来越多，呈急剧上升状态。研究的发病机制已迫在眉睫，预防和治疗2型糖尿病也备受大众关注，因此糖尿病模型的建立在科研领域就具有重要意义。常见的2型糖尿病动物模型主要分为三大类：自发性、实验性和基因工程的2型糖尿病动物模型[61]。有ob/ob小鼠[62]、NSY小鼠[63-64]是常见的两种自发性2型糖尿病动物模型。特殊膳食诱导[65]、链脲菌素[66]或四氧嘧啶（Alloxan,ALX）[67]4 上海海洋大学硕士学位论文是实验性2型糖尿病建模常用方法主要包括转基因和基因敲除[68-69]。由于实验性2型糖尿病动物模型的造模时间短、实验成本较低，来源较多，因此实验性2型糖尿病动物模型常被用于科学研究，经查阅糖尿病方面文献发现大多数糖尿病的研究都是采用ALX方法造模。ALX的造模机制是通过抑制胰岛β细胞中的葡萄糖激酶分泌，选择性地降低胰岛素的敏感性引发血糖升高。1.4.4胶原蛋白肽治疗糖尿病的研究进展研究发现，在糖尿病中晚期的大鼠大血管中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的数量显著增加，中药组方—加味桃核承气汤已被证实在糖尿病大鼠病变的大血管中能够降低致纤维化因子胶原蛋白的表达，恢复和改善糖尿病大血管弹性作用，表明糖尿病大血管病变可能与胶原蛋白有关[70]。糖尿病小鼠经胶原蛋白多肽-铬(Ⅲ)螯合物治疗，体内的IL-2和TNF-α分泌增强、IgG抗体增加、IL-6的分泌降低。可证明胶原蛋白多肽-铬(Ⅲ)螯合物能够活化免疫细胞、修复小鼠机体的免疫功能[71-72]。1.5研究意义及内容1.5.1研究意义氧化可使机体内的器官损伤、功能作用受到阻碍。因此，研究对比多种胶原蛋白抗氧化作用和胶原蛋白肽溶解在乙酸、乙酸钠和乙酸钙中对其抗氧化性的影响，为研究胶原蛋白肽对糖尿病小鼠的降血糖作用提供基础，为其他生物活性的研究提供了新思路。1.5.2研究内容（1）采用氨基酸分析和SDS-PAG测定多种胶原蛋白的氨基酸残基构成和分子量组成，通过测定还原力、•OH和DPPH•清除率进行抗氧化能力的评价。（2）采用胶原蛋白肽溶解在不同离子浓度环境中测定不同离子浓度对其抗氧化性的影响。（3）采用小鼠糖尿病模型，测试GBB-10SP降血糖作用的研究。测定给药前后小鼠的空腹血糖值、体重、脏器指数与肝组织抗氧化能力和糖耐量试验。评价GBB-10SP对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用。（4）研究低分子量胶原蛋白肽联合苦瓜素辅助降血糖的作用特性。通过形态学观察以及对血糖、脏器指数、葡萄糖耐受量和肝脏组织抗氧化能力的测定，对低分子量胶原蛋白肽联合苦瓜素对实验性糖尿病小鼠的辅助降血糖作用的评价。5 上海海洋大学硕士学位论文第二章胶原蛋白抗氧化作用评价水生动物的胶原蛋白安全性较高、品质较好深受大众喜爱。刘成梅等人研究罗非鱼鱼皮多肽对油脂具有抗氧化作用[73]。目前，鱼胶原蛋白的抗氧化性虽有相关研究，但对于多种Ⅰ胶原蛋白的抗氧化性与氨基酸组成分析、分子量关系的研究较少。本文利用实验室自制的Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白，测定还原力、清除•OH和DPPH•活性的能力及其氨基酸组成，并对胶原蛋白抗氧化活性与氨基酸组成的关系进行初步分析，为胶原蛋白进一步研究提供参考依据。2.1材料与方法2.1.1材料与试剂表2-1材料与试剂Table2-1Materialsandreagents试剂名称生产厂家还原型谷胱甘肽国药集团化学试剂有限公司抗坏血酸国药集团化学试剂有限公司十二和磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限公司铁氰化钾（六氰合铁（Ⅲ）国药集团化学试剂有限公司十二烷基硫酸钠国药集团化学试剂有限公司过硫酸铵国药集团化学试剂有限公司考马斯亮蓝R250国药集团化学试剂有限公司二甲基亚砜瑞典LKB公司三羟甲基氨基甲烷瑞典LKB公司三氯乙酸上海西陇生化科技有限公司1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）美国Sigma公司冰乙酸美仑生物有限公司羟自由基测试盒南京建成生物工程研究所蓝鲨皮胶原蛋白（WSC）：第二军医大学生化实验室提供；C-1和C-2：由大6 上海海洋大学硕士学位论文连海洋大学实验室提供；Ⅱ型胶原蛋白（WCⅡ，MW：12-14KDa）和鲨鱼胶原蛋白（WWSCⅡ）：由本实验室王南平制备；SC，SKI-ASC和冷冻干燥制备的鲸鲨Ⅱ型胶原蛋白（SCⅡ）：实验室自制。2.1.2仪器与设备酶标仪（SH-1000）：天美（中国）科学仪器有限公司；电泳凝胶成像分体系统：美国UVP公司。2.1.3方法2.1.3.1SDS-PAGE分析利用SDS-PAGE测定胶原蛋白分子质量，参考Laemmli[74]的方法并稍作修改。采用8%分离胶和5%浓缩胶，浓缩胶80V、20min，分离胶250V、50min至终点，染色20min，脱色1.5h，凝胶成像系统分析成像。2.1.3.2氨基酸分析采用宋瑞瑞方法[75]称取胶原蛋白10mg，5mL6mol/L盐酸，110℃水解24h，用6mol/LNaOH中和，过滤，滤液用去离子水加至20mL，取400μL用0.02mol/L的优级纯盐酸稀释到2mL，用0.45nm滤膜，用氨基酸分析仪测定氨基酸组成。2.1.3.3还原力的测定采用铁氰化钾还原法[76]略微修改。表2-2还原力测定试剂配制(μL)Table2-2Preparationofreagentsfordeterminationofreducingpower(μL)处理空白管对照管测定管双蒸水25--VC/GSH-25-样品--25磷酸冲液(0.2mol/L，pH6.6)2525251%铁氰化钾25252550℃恒温20min10%三氯乙酸252525蒸馏水1001001000.1%FeCl3400400400静置10min后与700nm测吸光值2.1.3.4胶原蛋白清除羟自由基活性（•OH）的测定7 上海海洋大学硕士学位论文用羟自由基试剂盒进行测定。按照说明书配制试剂并以依次加样，混匀，37℃反应1min，立即加2mL显色剂终止反应，混匀，室温静置20min，超纯水调零，在550nm处测其吸光度值，羟自由基清除率计算如下：1（-A-A）样品本底对照羟自由基清除率（%）=×100%式（2-1）A空白对照A对照：为超纯水对照管在550nm下吸光度;A样品：为样品测定管在550nm下吸光度;2.1.3.5胶原蛋白清除DPPH•测定配制不同浓度的样品和对照品（VC和GSH）溶液，分别取50μL样品或对照品溶液，加入150μL选择好的合适浓度的DPPH•标准液（现配现用），以DMSO代替样品作为空白对照，混匀，静置30min，用酶标仪测定吸光值。DPPH自由基的清除率按公式计算：A-A空白对照样品DPPH清除率（%）=×100%式（2-2）A空白对照2.1.3.6统计学处理方法用SPSS（13.0版）软件进行数据分析，所有数据用均数±标准差(x±SD)表示，用LSD法检验p＜0.05为显著性差异具有统计学意义。采用Origin软件(8.0版)进行作图。2.2结果与分析2.2.1胶原蛋白分子量的分析由图1标准蛋白质的分子量得出以下七种胶原蛋白α条带的分子质量为130kD。与肖旭等[77]等人研究的羊软骨胶原蛋白分子质量为130kD一致。C-2、C-1、WSC、SC、SKI-ASC,是Ⅰ型胶原蛋白，WCⅡ、WWSCⅡ、SCⅡ是Ⅱ型胶原蛋白。陆雪芹等人发现[78]鸡胸软骨Ⅱ型胶原蛋白分子质量在130kD以上。Phanat等人的报道显示[79]斑竹鲨和黑鳍鲨软骨胶原蛋白分子质量在116kD以上。图2-1显示C-2、C-1和WSC电泳图谱中蛋白质分子量在130kD以上具有两条链，WWSCII、WSCⅡ只有一条130kα链。8 上海海洋大学硕士学位论文图2-1胶原蛋白SDS-PAGE电泳结果Fig.2-1SDS-PAGEofcollagen注：1:C-2,2：C-1,3:SC,4:SKI-ASC,5:WWSCⅡ,6:SCⅡ,7:WSC2.2.2胶原蛋白的氨基酸构成分析由表2-3可知胶原蛋白的甘氨酸残基含量较高，占317-356残基/1000残基，与斑竹鲨Ⅱ型胶原蛋白[79]检测结果一直，其次是丙氨酸残基和脯氨酸残基，而以下氨基酸含量较少如甲硫氨酸（5.03-10.48%）、异亮氨酸（7.5-20.67%）、苯丙氨酸(8.32-16.46%)、甲硫氨酸（5.03-10.48%）、异亮氨酸（7.5-20.67%）、苯丙氨酸(8.32-16.46%)。另外，氨基酸分析过程中WSC、WWSCⅡ/WCⅡ三种胶原蛋白检测出含有酪氨酸，而研究显示罗非鱼胶原蛋白[12]也含有酪氨酸，图中其他胶原蛋白均无酪氨酸检出，组氨酸显示只有C-1、WSCWWSCⅡ中含有，其他均检出。由表2-3得出不同物种胶原蛋白的氨基酸残基构成和比例均不同。研究显示疏水性氨基酸（Val,Ile,Leu,Met,Phe,Trp和Cys）比亲水性氨基酸清除自由基能力强[80-81]。胶原蛋白C-1、C-2、SC、SKI-ASC、WSC、WWSCⅡ、SCⅡ和WCⅡ疏水性氨基酸组成分别为：124.03、127.69、123.69、153.95、140.3、138.79、114.75和147.78。9 上海海洋大学硕士学位论文表2-3各胶原蛋白样本的氨基酸组成分析（残基数量/1000个氨基酸残基）Table2-3Aminoacidcompositionofdifferentcollagenpeptides(residuesper1000totalaminoacidresidues)斑竹鲨Ⅱ型罗非鱼胶原蛋白[82]氨基酸C-1C-2SCSKI-ASCWSCWWSCⅡWCⅡSCⅡ胶原蛋白[79]ASP27.9629.8228.5034.2727.4733.7741.2331.954265.09Thr24.0824.7224.9528.9622.6226.5431.4325.412312.4Ser29.2530.7130.6537.5333.6126.2739.8223.344140.19Glu45.9448.5248.2359.6549.2463.5865.2562.2778130.09Gly338.06337.25343.00345.94327.64345.53317.97356.84317249.99Ala197.78198.59196.89165.94187.54147.56144.79164.73104145.77Cys66.4664.7367.8657.3860.5545.9334.5139.3412.03Val12.5612.9812.0819.4916.7916.4920.5414.092524.95Met5.296.585.0310.487.928.578.507.76136.88Ile7.508.388.4820.6718.5815.2520.7010.491814.88Leu22.4924.4421.9234.8226.0540.3947.0731.612426.57Tyr0.000.000.000.004.960.0020.000.00010.46Phe9.7310.588.3211.1210.4112.1616.4611.461417.16Lys16.8017.0416.6221.6917.1312.7221.0312.202824.14His7.980.000.000.0011.678.010.000.00027.77Arg66.1765.6863.6752.7467.9464.2461.3068.835197.39Pro121.96119.97123.8399.34109.84132.98109.40139.6710984.7合计10001000100010001000100010001000-10002.2.3胶原蛋白的还原力特性胶原蛋白和GSH、VC的还原力的Abs值变化情况如下图所示，由图可知：VC和GSH的还原力较强，VC和GSH的浓度在0.035mg/mL时，其吸光度值分别为0.587、0.179，与之相比胶原蛋白的还原力稍微较弱，但是胶原蛋白具有还原力，且在一定范围内还原力随浓度的增加而增加。在图2-2(b)显示胶原蛋白还原力大小为：WWSCⅡ>SCⅡ>WSC>C-1>SKI-ASC>SC>WCⅡ>C-210 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）0.75C-1C-2SC0.60SKI-ASCWSCWWSCII0.45WCIISCII0.30Absat70.1500nm0.00246810Concentration(mg/mL)图2-2胶原蛋白的还原力Fig.2-2Reducingpowerofcollagen.2.2.4胶原蛋白清除·OH的特性图2-3所示，实验测得VC的浓度在0.3mg/mL时清除率为79.47%，GSH浓度在7mg/mL时的清除率达到76.49%，VC清除·OH的能力是GSH的23倍，对•OH的清除能力随浓度的增加呈近线性增加，浓度在10mg/mL时最终清除率可达到C-1、C-2、SC、SKI-ASC、WSC、WWSCII、WCII、SCII的•OH的清除率分别为：62.13%、89.24%、81.76%、93%、66.36%、67.38%、51.16%98.83%，表明胶原蛋白具有清除·OH的能力，从图2-3中我们的得出C-2、SKI-ASC在低浓度时清除•OH较高，随浓度的增加清除率增加幅度较慢。WSCII随浓度增加清11 上海海洋大学硕士学位论文除能力上升幅度较大。（a）（b）100C-1C-2SCSKI-ASCWSC80WWSCIIWCIISCII(%)6040OH20scaveng0ing246810raConcentration(mg/mL)te图2-3胶原蛋白清除·OH的能力Fig.2-3.Scavengingabilitytoward·OHofcollagen2.2.5.胶原蛋白清除DPPH•的特性胶原蛋白清除DPPH•的结果如图2-4所示，VC和GSH在0.008mg/mL时清除DPPH•的能力为59.7%和13.82%，而八种胶原蛋白样品对DPPH•的清除能力相对较弱，在10mg/mL时，WWSCII的DPPH•的清除能力较高达到29.88%，其次是SC、WCII、WSC、SKI-ASC，DPPH•的清除率分别为：20.05%、19.81%、18.89%、18.87%。胶原蛋白对DPPH•的清除能力与浓度呈剂量关系。12 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）100C-1C-2SCSKI-ASC80WSCWWSCIIWCIISCIIr60ate(%)4020DPPHs0cav246810engConcentration(mg/mL)ing图2-4胶原蛋白清除DPPH•能力Fig.2-4ScavengingabilitytowardDPPH•ofcollagen2.3结论在蛋白水解液的抗氧化活性中，分子量的分布和氨基酸的组成起着很重要的作用[83-84]。一般来说，分子量和抗氧化活性之间没有直接的关系，然而，很多研究表明不同分子量的蛋白水解产物具有不同的抗氧化活性。经测定WWSCII、WSCⅡ只有一条130kDα链，推测可能对其抗氧化活性有影响。胶原蛋白的活性与酸组成密切相关，本实验测定SKI-ASC、WSC、WWSCⅡ、WCⅡ的疏水性氨13 上海海洋大学硕士学位论文基酸含量较高，因此推断其复合叠加效应可使其抗氧化活性提高。在本次研究中，用3种方法评价胶原蛋白的抗氧化作用，分别是还原力、•OH和DPPH•的清除能力。结果表明WWSCII具有很好的体外还原力的能力和清除自由基的活性，其次是SCII、WSC、SKI-ASC、SC等。因此，胶原蛋白具有一定的抗氧化能力，可有效清除•OH和DPPH•，且在一定质量浓度范围内，呈量效关系。14 上海海洋大学硕士学位论文第三章不同离子浓度对低分子量胶原蛋白肽抗氧化特性的研究胶原蛋白具有抗氧化性应用范围较广，而胶原蛋白肽也具有独特的生物活性已广泛引起国内外研究学者的注意，将其应用于食品、化妆品、生物制药等方面。但是其应用过程中溶解及储存状态是否会影响胶原蛋白肽的生物活性还有待研究。本文主要研究的是低分子量的胶原蛋白肽溶解于不同浓度的乙酸、乙酸钠、乙酸钙中，其H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽抗氧化性的影响。3.1材料与方法3.1.1材料与试剂表3-1材料与试剂Table3-1Materialsandreagents试剂名称生产厂家还原型谷胱甘肽国药集团化学试剂有限公司抗坏血酸国药集团化学试剂有限公司十二和磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限公司铁氰化钾（六氰合铁（Ⅲ）国药集团化学试剂有限公司三氯乙酸上海西陇生化科技有限公司1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）美国Sigma公司冰乙酸美仑生物有限公司羟自由基测试盒南京建成生物工程研究所3.1.2仪器与设备酶标仪（SH-1000）：天美（中国）科学仪器有限公司。3.1.3GBB-10SP及TYPE-S的制备参照文献[85-86]的方法进行制备。原料用磷酸氢二钠（10mmol/LpH7.4-7.6）缓冲液浸泡冲洗，切块，清洗，溶胀和脱脂，用0.1mol/LNaOH在室温下浸泡3d，15 上海海洋大学硕士学位论文清洗至pH6.5-7.5。用胃蛋白酶乙酸缓冲液4℃酶解24h，3000r/min离心，沉淀再酶解。合并两次酶解液，10000r/min离心30min，取上清，透析至pH为中性。再胰蛋白酶酶解pH8，47℃，60min，分离纯化后得到胶原蛋白肽。3.1.4方法3.1.4.1氨基酸分析采用宋瑞瑞方法[75]称取胶原蛋白10mg于水解瓶中，加5mL6mol/L盐酸，110℃水解24h，再用6mol/LNaOH中和，过滤，滤液用去离子水加至20mL，取400μL用0.02mol/L的优级纯盐酸稀释到2mL，用0.45nm滤膜，用氨基酸分析仪测定氨基酸组成。3.1.4.2H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽还原力的测定采用铁氰化钾还原法[76]略微修改。表3-2还原力测定试剂配制(μL)Table3-2Preparationofreagentsfordeterminationofreducingpower(μL)处理空白管对照管测定管双蒸水25--VC/GSH-25-样品--25磷酸冲液(0.2mol/L，pH6.6)2525251%铁氰化钾25252550℃恒温20min10%三氯乙酸252525蒸馏水1001001000.1%FeCl3400400400静置10min后与700nm测吸光值,VC和谷胱甘肽溶液作对照3.1.4.3H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽清除•OH的测定用羟自由基试剂盒进行测定。按照说明书配制试剂和加样，混匀，37℃反应1min，立即加2mL显色剂终止反应，混匀，室温静置20min，超纯水调零，在550nm处测其吸光度值，羟自由基清除率计算如下：1（-A-A）样品本底对照羟自由基清除率（%）=×100%式（3-1）A空白对照16 上海海洋大学硕士学位论文A对照：为超纯水对照管在550nm下吸光度;A样品：为样品测定管在550nm下吸光度;3.1.4.4H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽清除DPPH•测定取130μL样品或对照品溶液，加入70μL选择好的合适浓度的DPPH•标准液（现配现用），以乙醇代替样品作为空白对照，混匀后，静置30min，用酶标仪测定吸光值。DPPH自由基的清除率计算如下：A-A空白对照样品DPPH•清除率（%）=×100%式（3-2）A空白对照3.1.4.5统计学处理方法用SPSS（13.0版）软件进行数据分析，所有数据用均数±标准差(x±SD)表示，用LSD法检验p＜0.05为显著性差异具有统计学意义。采用Origin软件(8.0版)进行作图。3.2结果与分析3.2.1胶原蛋白肽的氨基酸构成分析对GBB-10SP和TYPE-S氨基酸组成见表3-3。GBB-10SP和TYPE-S中甘氨酸含量高，其次是脯氨酸。这一结果与其他鱼胶原蛋白肽的研究结果一致[87-89]。然而GBB-10SP和TYPE-S中不含丙氨酸。GBB-10SP和TYPE-S中的疏水性氨基酸含量较高（Met,Trp,Phe,Val,Leu,Ile和Pro）（均是355.85氨基酸的每1000个氨基酸残基），占总量的1/3，其次是带电的极性氨基酸（酸性氨基酸和碱性氨基酸总量）（188.72和189.87个氨基酸的每1000个氨基酸残基），酸性氨基酸（Asp和Glu）（96.92和99.75个氨基酸的每1000个氨基酸残基），碱性氨基酸（Lys,Arg和His）（91.8和90.12个氨基酸的每1000个氨基酸残基），不带电荷的极性氨基酸（Ser，Thr和Met）（66.12和69.54个氨基酸的每1000个氨基酸残基）和硫含氨基酸（Met和Cys）（36.1和36.4个氨基酸的每1000个氨基酸残基）（数据未显示）。17 上海海洋大学硕士学位论文表3-3不同胶原蛋白肽的氨基酸组成分析（残基数量/1000个氨基酸残基）Table3-3Aminoacidcompositionofdifferentcollagenpeptides(residuesper1000totalaminoacidresidues)TilapiaskinCollagenAminoacidGBB-10SPTYPE-Speptide[90]ASP38.5740.4065.09Thr26.3826.5312.4Ser33.1335.4740.19Glu58.3559.35130.09Gly366.43363.40249.99Ala--145.77Cys29.4928.862.03Val15.4116.5124.95Met6.617.546.88Ile8.509.7314.88Leu23.8426.5926.57Tyr--10.46Phe10.3310.9817.16Lys18.2618.3224.14His7.509.9327.77Arg66.0461.8797.39Pro291.16284.5084.7Total1000100010003.2.2H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽还原力特性的影响如图3-1所示，在浓度为0.035mg/mL时，GSH和VC的吸光度值分别为0.179和0.587。表明VC的还原力比GSH强。GBB-10SP和TYPE-S的EC50值分别为：44.24和44.93mg/mL，在75mg/mL时，GBB-10SP和TYPE-S还原力的吸光度值分别为0.253和0.465，这表明在高浓度时胶原肽具有还原力，但还原力弱于VC和GSH。图3-1为不同浓度的H+对VC、GSH、GBB-10SP和TYPE-S还原力影响的作用，从图中可以得出：0.1-0.5M的乙酸对VC的还原力吸光度值降低1.03-1.9倍，GSH在0.155mg/mL的吸光度值与溶解在水中相比降低了1.25-2.62倍。GBB-10SP降低了01.58-2.08倍，TYPE-S降低了1.58-2.58倍，其中0.5M乙酸对还原力的吸光度值的降低幅度较大，呈显著性差异，表明胶原蛋白肽在0.5M乙酸环境中对其还原力影响较大。图3-2为不同浓度的乙酸钠对VC、GSH、GBB-10SP和TYPE-S还原力影响的作用，从图中可以的得出：不同浓度的乙酸钠对样品的还原力具有降低的趋势，18 上海海洋大学硕士学位论文其中乙酸钠对VC、GSH还原力影响结果较显著。将样品溶解在0.1-0.5M的乙酸钠中，测得结果如下：VC的还原力的吸光度值降低了1.28-4.42倍，在浓度为0.155mg/mL时GSH的还原力降低了2.03-2.67倍，GBB-10SP和TYPE-S分别降低了1.42-1.93和0.96-1.23倍。随着乙酸钠浓度的而增大下降趋势越明显，相比较0.5M乙酸钠对还原力的吸光度值的降低幅度较大，较显著，表明胶原蛋白肽在0.5M乙酸钠环境中对其还原力影响较大。我们研究不同浓度的钙离子对胶原肽还原力的影响。如图3-3所示，与水相比，乙酸钙显著降低了GSH的还原力（1.19-1.88倍），其中0.001M对乙酸钙对其影响较显著。此外，0.001M对乙酸钙对GBB-10SP的还原力几乎无影响（图3-3c），在0.004MCa2+显著降低了1.51-2.01倍，0.001-0.005M乙酸钙对TYPE-S的还原力几乎无影响（图3-3d）。（a）（b）0.900.90WaterWater0.1MCHCOOH30.1MCHCOOH0.2MCHCOOH30.7530.750.3MCHCOOH0.2MCH3COOH30.4MCHCOOH0.3MCHCOOH330.600.5MCHCOOH0.4MCHCOOH30.6030.5MCHCOOH30.450.45Ab0.30A0.30sbats7at00.1570.150n00mnm0.000.000.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.020.040.060.080.100.120.140.160.0350.0550.0750.0950.1150.1350.155VCConcentration(mg/ml)GSHGSHCoCncoenncetrnatrtaiotinon(m(mgg/m/mLl))（c）（d）0.900.90WaterWater0.1MCHCOOH0.1MCHCOOH330.750.2MCHCOOH0.2MCH3COOH30.750.3MCHCOOH0.3MCHCOOH330.4MCHCOOH30.4MCHCOOH0.6030.5MCHCOOH0.6030.5MCHCOOH30.450.45Abs0.30Ab0.30satat7000.15700.15n0mnm0.000.00115525303545455560657575151525303544555560657755GBB-10SPConcentration(mg/ml)GBB-10SPConcentration(mg/mL)TYPTEY-SPE-SConCcoenncternattriaotnio(nm(gm/gm/mLl))图3-1H+对胶原蛋白肽还原力影响Fig.3-1InfluenceofH+onreducingpowerofcollagenpeptide.19 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）0.900.90WaterWater0.1MCH3COONa0.1MCHCOONa0.7530.2MCHCOONa0.7530.2MCHCOONa30.3MCHCOONa30.3MCHCOONa0.4MCHCOONa30.6030.5MCHCOONa0.600.4MCH3COONa30.5MCHCOONa30.450.45Abs0.300.30aAtb7s00an0.15t0.15m700n0.00m0.000.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.020.0350.040.0550.060.0705.080.0905.100.101.5120.1305.140.1505.16GSHConcentration(mg/ml)VCConcentration(mg/ml)GSHConcentration(mg/mL)（（（caa）））（（（bdd）））0.900.90WaterWater0.1MCHCOONa0.1MCH3COONa30.750.2MCHCOONa0.750.2MCH3COONa30.3MCHCOONa0.3MCH3COONa30.4MCHCOONa0.4MCH3COONa0.6030.600.5MCHCOONa0.5MCH3COONa30.450.45AAbbs0.30s0.30aatt77000n0.150n0.15mm0.000.00153045607515304560751525354555657515253545556575GBB-10SPConcentration(mg/ml)TYPET-SYPE-SCoCncoenncternattriaotnio(mn(gm/mg/Lm)l)GBB-10SPConcentration(mg/mL)图3-2Na+对胶原蛋白肽还原力影响Fig.3-2InfluenceofNa+onreducingpowerofcollagenpeptide.20 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）0.900.90WaterWater0.0001MCa(CHCOO)0.001MCa(CHCOO)32320.0002MCa(CHCOO)0.002MCa(CHCOO)0.75320.75320.0003MCa(CHCOO)0.003MCa(CHCOO)32320.0004MCa(CHCOO)0.004MCa(CHCOO)32320.0005MCa(CHCOO)0.005MCa(CHCOO)0.60320.60320.450.45AbAs0.30bs0.30atat7000.15700.15n0mnm0.000.000.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.020.040.060.080.100.120.140.160.0350.0550.0750.0950.1150.1350.155VCConcentration(mg/ml)GGSHSHConcCenotnrcaetniotrnat(imong(/mmgL/m)l)（c）（d）0.90Water0.90Water0.001MCa(CHCOO)320.001MCa(CHCOO)320.002MCa(CHCOO)0.75320.002MCa(CHCOO)0.75320.003MCa(CHCOO)320.003MCa(CHCOO)320.004MCa(CHCOO)320.004MCa(CHCOO)320.600.005MCa(CH3COO)20.005MCa(CHCOO)0.60320.450.45AAbbssa0.30at0.30t770000nn0.15m0.15m0.000.00153045607515304560751525354555657515253545556575GBB-10SPConcentration(mg/ml)TYPE-SConcentration(mg/ml)GBB-10SPConcentration(mg/mL)TYPE-SConcentration(mg/mL)图3-3Ca2+对胶原蛋白肽还原力影响Fig.3-3InfluenceofCa2+onreducingpowerofcollagenpeptide.3.2.3H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽清除·OH特性的影响胶原蛋白肽清除羟自由基活性如图3-4所示。所有样品清除羟自由基的能力均呈剂量依赖型。在水中，VC在0.3mg/mL时对·OH清除率达到了79.47%，而GSH在7mg/mL时对·OH清除率达到了76.50%，GBB-10SP在45mg/mL时对羟基自由基的清除率为87.13%，TYPE-S在200mg/mL时清除率为53.75%。Vc、GSH、GBB-10SP和TYPE-S的EC50值分别为0.151、2.848、25、133.19mg/mL。乙酸对胶原蛋白肽清除羟自由基活性的影响如图3-4所示。乙酸对VC和GSH清除羟自由基能起促进作用（图3-4ab）。而GBB-10SP和TYPE-S在乙酸环境下无清除羟自由基能力（图3-4cd）。在0.1M乙酸溶剂中，GBB-10SP和TYPE-S清除羟自由基能力显著下降到-36.45%（GBB-10SP45mg/mL）和-8.42±1.59%（TYPE-S200mg/mL）。21 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）100100%(%()80)8060604040radaci20-l20cs7vaH0g/mL)0.30H6ney0.H0H(m0.25dy00.0L)5nigrdC0O.1O0.20r0.1(mg/m4gxo3C0.20.15xoCHCOOH0.23y0.30.10ly30.32l0.40.05r0.4Vda0.51G0.5C(ciSHma(g/m-lmLcsg/)amv（d）Le)（c）gnnig100100%(%()8080)6060404020200-200H-40g/mL)45-20L)200yH0.0(m40H0.0g/m180rdCO0O.1H35yCH0.O1H(m160xo3C0.230dCO0.2140y0.325r3(l20xo0.3120mar0.4y0.4100g/mcid0.515GBrl0.580TL)BaYP-la-10dEsSPci-Sac(mavg/m-lne+L)csnig图3-4H对胶原蛋白肽清va除•OH的影响gnegFig.3-4InfluenceofH+on•OHscniavengingofcollagenpeptideg■:Water,●:0.1MCH3COOH,▲:0.2MCH3COOH,★:0.3MCH3COOH,□:0.4MCH3COOH,☆:0.5MCH3COOH.图3-5ab中显示VC和GSH在在乙酸钠溶剂中清除羟自由基的能力显著降低。在0.5M乙酸钠中VC和GSH对的羟自由基清除率分别下降到56.6和26.91%。GBB-10SP在乙酸钠溶剂中清除·OH的能力增加。低浓度的胶原蛋白肽在0.1M乙酸钠溶剂中，GBB-10SP（15mg/mL）和TYPE-S（80mg/mL）清除·OH的能力为11.94-60.56%和-4.31-15.90%（图3-5cd）。TYPE-S清除·OH的活性先下降再上升的趋势显著（图3-5d）。22 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）100100%(%()80)806060404020200mL)mL)yH0.0(mg/0.30H0g/12dCH0.1ONa0.25dyH0.0Na(m10orCO0.20.20orCCO0O.18x30.15x30.26ly0.30.10ly0.3ar0.40.05ar0.44cid0.5Vd0.52GSCciH-la(ma(msg/ms-lg/macL)cL)（evc）（dva）nnenignigg100g100%(%()80)80606040402020H0mL)45H0g/mL)200dy0.0(mg/400.0a(m180rCH0.1Na35yCH0.O1N160xo3C000.230dCO14025r30.2ly0.320xo0.3120(mar0.415ly0.4100g/mcid0.5Gar0.580TL)BY-laB-1cidPEs0-Sac图3-5Na+对胶原SP蛋白肽清除-la•OH的影响v(emsng/macnig+L)evgFig.3-5InfluenceofNaon•OHscavenngingofcollagenpeptidegni■:Water,●:0.1MCH3COOH,▲:0.2MCH3COOH,★:g0.3MCH3COOH,□:0.4MCH3COOH,☆:0.5MCH3COOH.图3-6显示了钙离子对胶原蛋白肽清除·OH的能力的影响。当VC和GSH在乙酸钙中溶解时，它们清除·OH的能力急剧下降（图3-6ab），Ca2+对GBB-10SP清除·OH的能力几乎无影响（图3-6c），TYPE-S在浓度为200mg/mL时，清除·OH的能力下降到28.55%（图3-6d）。因此，钙离子没有显著改变胶原肽清除·OH的能力。23 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）100100%(%())8080606040402020H0.00000.30Hdy0.0010.200.25dy0.00001012rCa(CH0.0020.15Caor0.0018xoOO0.0030.10x(CHO0.002y3C0m.L0)040.05ly3CO0.00L36rl)(mg/Vr)(mg/m4a20.005Cda20.0042d(mci0.005GScig)Ha/m-la(m（-lc）L)（sd）g/mcsacL)va100ev100ne%(%(gnnig))ni80g80g6060404020200HHdy045dy182000Caor0.00040Cora0.0000.001160x(CH0.O0O0135yx(CHOO0.002140ly3C0.002mL)2530l3C0.m00L3)120r)(m0g/.003ar)mg/100da20.00420d2(0.004ci0.00515Gaci0.00580TY-laBB-lPs-10sE-Sac图3-6Ca2+对胶原SP蛋(白肽清除ac•OH的影响(mevmgevg/mn/mnLgLg)ni2+)nigFig.3-6InfluenceofCaon•OHscavengingofcollagenpeptide■:Water,●:0.1MCH3COOH,▲:0.2MCH3COOH,★:0.3MCH3COOH,□:0.4MCH3COOH,☆:0.5MCH3COOH.3.2.4H+、Na+、Ca2+对胶原蛋白肽清除DPPH•特性的影响如图3-7所示。所有样品清除羟自由基的能力均呈剂量依赖型。在水中，在0.0075mg/mL时VC对DPPH•清除率达到了64.48%，而GSH在0.3mg/mL时对DPPH•清除率达到了69.98%，在浓度为45mg/mL时，GBB-10SP对DPPH•的清除率为55.62%，TYPE-S清除率为55.20%。表明GBB-10SP和TYPE-S对DPPH•均有清除或抑制其产生的能力。乙酸对胶原蛋白肽清除DPPH•的能力影响如图3-7所示，乙酸对VC、GSH、GBB-10SP和TYPE-S清除DPPH•的能力影响较小（图3-7abcd）。0.5M乙酸在GSH浓度为0.9mg/mL时对DPPH•清除率为75.05%，在水中的76.33%。GBB-10SP和TYPE-S浓度为45mg/mL时对DPPH•清除率分为54.39%（水中55.63%），54.73%（水中55.20%）。表明乙酸对肽清除DPPH•的能力几乎不影响。24 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）100100WaterWater0.1MCHCOOH30.1MCHCOOH30.2MCHCOOH30.2MCHCOOH803800.3MCHCOOH30.3MCHCOOH(30.4MCHCOOH%(%30.4MCHCOOH)30.5MCHCOOH)3600.5MCH3COOH604040DDPPPH20P20Hsscacavevng0en0in0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.008gin0.020.040.060.080.30.60.9ggVCConcentration(mg/mL)GSHConcentration(mg/mL)（c）（d）100100WaterWater0.1MCHCOOH0.1MCHCOOH330.2MCHCOOH0.2MCHCOOH8038030.3MCHCOOH0.3MCHCOOH(%3(3%0.4MCHCOOH0.4MCHCOOH)3)30.5MCHCOOH0.5MCHCOOH6036034040DDPPPPH20H20ssccaavveenng0gin0in15202530354045g15202530354045gTYPE-SConcentration(mg/ml)GBB-10SPConcentration(mg/ml)图3-7H+对胶原蛋白肽清除DPPH•影响Fig.3-7InfluenceofH+onDPPH•scavengingofcollagenpeptide.乙酸钠对胶原蛋白肽清除DPPH•的能力影响如图3-7所示，乙酸降低VC和GSH清除DPPH•的能力，对GBB-10SP和TYPE-S清除DPPH•的能力影响较小（图3-8abcd）。0.5M乙酸钠在GSH浓度为0.9mg/mL时对DPPH•清除率为65.80%，在水中的76.33%。GBB-10SP和TYPE-S浓度为45mg/mL时对DPPH•清除率分为54.60%（水中55.63%），44.14%（水中55.20%）。表明乙酸钠对肽清除DPPH•的能力几乎不影响。25 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）100100WaterWater0.1MCHCOONa0.1MCHCOONa330.2MCHCOONa0.2MCHCOONa3808030.3MCHCOONa0.3MCHCOONa33(0.4MCHCOONa0.4MCHCOONa%3(3%)0.5MCH3COONa600.5MCHCOONa60)34040DDP20P20PHPsHcsavcaenv0g0en0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.008in0.000.020.040.060.080.30.60.9gginVCConcentration(mg/mL)GSHConcentration(mg/mL)g（c）（d）100100WaterWater0.1MCHCOONa0.1MCHCOONa330.2MCHCOONa0.2MCHCOONa803803(%0.3MCH3COONa(0.3MCH3COONa%)0.4MCHCOONa)0.4MCHCOONa33600.5MCH3COONa600.5MCH3COONa4040DDPPPHPs20H20csacvaevnegnin0gin0g15202530354045g15202530354045GBB-10SPConcentration(mg/ml)TYPE-SConcentration(mg/ml)图3-8Na+对胶原蛋白肽清除DPPH•影响Fig.3-8InfluenceofNa2+onDPPH•scavengingofcollagenpeptide.乙酸钙对胶原蛋白肽清除DPPH•的能力影响如图3-9所示，乙酸对VC、GSH、GBB-10SP和TYPE-S清除DPPH•的能力影响较小（图3-8abcd）。0.5M乙酸钙在GSH浓度为0.9mg/mL时对DPPH•清除率为53.06%，在水中的76.33%。GBB-10SP和TYPE-S浓度为45mg/mL时对DPPH•清除率分为53.06%（水中55.63%），54.96%（水中55.20%）。表明乙酸钙对肽清除DPPH•的能力几乎不影响。26 上海海洋大学硕士学位论文（a）（b）100100WaterWater0.1MCa(CHCOO)0.1MCa(CH3COO)2320.2MCa(CHCOO)800.2MCa(CH3COO)232800.3MCa(CHCOO)0.3MCa(CH3COO)2320.4MCa(CHCOO)0.4MCa(CH3COO)232((%0.5MCa(CH3COO)2%600.5MCa(CH3COO)2)60)4040DDP20P20PPHHssccaav0ve0en0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.008ng0.000.020.040.060.080.30.60.9ginVCConcentration(mg/mL)inGSHConcentration(mg/mL)gg（c）（d）100100WaterWater0.1MCa(CHCOO)320.1MCa(CHCOO)320.2MCa(CHCOO)320.2MCa(CHCOO)8032800.3MCa(CHCOO)320.3MCa(CHCOO)32(%0.4MCa(CHCOO)0.4MCa(CHCOO)3232)(0.5MCa(CHCOO)%0.5MCa(CHCOO)60326032)4040DPDP20H20PPsHcasvcaenv0g0en15202530354045in15202530354045gginGBB-10SPConcentration(mg/ml)TYPE-SConcentration(mg/ml)g图3-9Ca2+对胶原蛋白肽清除DPPH•影响Fig.3-9InfluenceofCa2+onDPPH•scavengingofcollagenpeptide.3.3结论（1）还原力：GBB-10SP降低了1.58-2.08倍，TYPE-S降低了1.58-2.58倍，在0.5M乙酸环境中对胶原蛋白肽的还原力显著性降低。乙酸钠中GBB-10SP和TYPE-S还原力分别降低了1.42-1.93和0.96-1.23倍。随着乙酸钠浓度的而增大下降趋势越明显。0.5M乙酸钠对还原力的吸光度值的降低幅度较大。乙酸钙对GBB-10SP、TYPE-S的还原力几乎无影响。（2）清除羟自由基方面：在0.1M乙酸中，GBB-10SP和TYPE-S清除羟自由基能力显著下降到-36.45%（GBB-10SP45mg/mL）和-8.42±1.59%（TYPE-S200mg/mL）。0.1M乙酸钠中，低浓度的GBB-10SP（15mg/mL）和TYPE-S（80mg/mL）清除·OH的能力为11.94-60.56%和-4.31-15.90%。在高浓度时GBB-10SP在乙酸钠溶剂中清除·OH的能力几乎不变。Ca2+对GBB-10SP清除·OH的能力几乎无影响，TYPE-S在浓度为200mg/mL时，清除·OH的能力下降到28.55%。结果表明，GBB-10SP和TYPE-S在乙酸环境下无清除羟自由基能力，乙酸钠对低浓度的胶原27 上海海洋大学硕士学位论文蛋白肽有影响。钙离子没有显著改变胶原肽清除·OH的能力。（3）清除DPPH•方面：在0.5M乙酸中，GBB-10SP和TYPE-S浓度为45mg/mL时对DPPH•清除率分为54.39%（水中55.63%），54.73%（水中55.20%）。.在0.5M乙酸钠中，GBB-10SP和TYPE-S浓度为45mg/mL时对DPPH•清除率分为54.60%（水中55.63%），44.14%（水中55.20%）。0.5M乙酸钙在GBB-10SP和TYPE-S浓度为45mg/mL时对DPPH•清除率分为53.06%（水中55.63%），54.96%（水中55.20%）。表明乙酸、乙酸钠、乙酸钙对胶原蛋白肽清除DPPH•的能力几乎不影响。28 上海海洋大学硕士学位论文第四章GBB-10SP降低血糖作用的研究我国患有糖尿病人口约5亿，其中Ⅱ型糖尿病占临床病例的90%以上[91]。胰岛B细胞缺陷导致胰岛素分泌不足引起高血糖是形成糖尿病的原因之一[92]。目前，用于糖尿病临床治疗的降血糖化学药物主要有二甲双胍、格列本脲、瑞格列奈、阿卡波糖、罗格列酮等，长期服用，会导致患者身体产生耐药性和低血糖等副作用[93-94]。因此，开发新型、高效低毒促进胰岛素分泌的药物成为生物医药领域关注的热点。研究报道对于颅脑损伤术后患者，口服富含胶原蛋白肽的肠内营养制剂，可以降低感染率，增强免疫力，促进病情恢复[95]。本文通过形态学观察以及对血糖、脏器指数、葡萄糖耐受量和肝脏组织抗氧化能力的测定，研究GBB-10SP对四氧嘧啶诱导的实验性糖尿病小鼠的降血糖作用，并探讨其可能的降血糖途径。4.1材料与方法4.1.1材料与试剂石斑鱼骨胶原蛋白肽（CollagenpeptideofEppinepphelusspp，GBB-10SP）相对分子质量为800-1000Da占90%以上，实验室自制；苦瓜素（MomordicaCharantiaextracts，MCE）含量10%，西安天宝生物科技有限公司。四氧嘧啶，东京化成工业株式会社；丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒，南京建成生物工程研究所。4.1.2仪器与设备-80℃超低温冷冻冰箱，海尔股份有限公司；McroplateReaderSH-1000酶标仪，CoronaElectricCo.,Ltd；三诺血糖试纸，三诺生物传感器股份有限公司。4.1.3动物ICR雌性小鼠40只，清洁级，四周龄，许可证号SCXK（沪）2013-0006，14-16g，自然昼夜，自由进水，分笼饲养，上海杰思捷实验动物有限公司。4.1.3.1小鼠糖尿病模型的制备及其处理健康雌性ICR小鼠40只，适应性喂养1周，随机取8只作A空白对照组，其余32只腹腔注射四氧嘧啶180mg/kg•bw（生理盐水配制），空白对照组小鼠注射29 上海海洋大学硕士学位论文等量的生理盐水，3d后断尾取血，测定血糖，血糖值≥11.1mmol/L[96-97]的动物用于实验。4.1.3.2小鼠的降血糖实验依据体重与血糖均衡原则随机分为5组，每组8只，分为空白对照组（BC）、模型组（MC，0.86%生理盐水）、、D低剂量GBB-10SP处理组（LG，3.6g/kg•bw/d）、E中剂量GBB-10SP处理组（MG，10.8g/kg•bw•d）、F高剂量GBB-10S处理组（HG，18g/kg•bw/d）。DM小鼠灌胃GBB-10SP，模型组MC及空白对照组BC给予等体积的生理盐水灌胃，各组连续给药28d。4.1.3.3形态学观察指标实验期间每天观察记录小鼠的进食状况，皮毛，精神状况，排尿量，及其体重变化。4.1.3.4血糖检测方法各组小鼠连续喂养28d，将5组小鼠只禁食不禁水过夜，于次日早上8:00尾静脉取血用快速血糖仪测定小鼠空腹血糖值，每隔4d检测一次。4.1.3.5脏器指数检测方法实验第28d，麻醉处死小鼠，解剖，取脾脏、肝脏、肾脏，肉眼观察有无病变，用冷生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称重，计算肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数。计算公式为：脏器湿重脏器指数=式（4-1）动物体重4.1.3.6葡萄糖耐量检测方法DM小鼠给药21d后，禁食过夜，于次日早上8:00给药，60min后再灌胃给予50mmol/kg葡萄糖，用快速血糖测定仪测定小鼠灌胃前（0min）灌胃后30、120min的血糖值，并计算葡萄糖耐量曲线下面积(AreaunderCurve，AUC)。0min血糖值+4×30min血糖值+3×120min血糖值AUC=式（4-2）44.1.3.7肝组织抗氧能力检测方法实验第28d，麻醉处死小鼠，解剖取小鼠肝脏，用10%的生理盐水清洗去血渍和其他结缔组织，称重，剪碎加入9倍体积0.86%生理盐水，匀浆，离心（2500r/min,10min）后取上清液，用丙二醛试剂盒和超氧化物歧化酶试剂盒测定。1）肝组织中SOD测定组织中SOD活力测定按照试剂盒操作表4-1进行如下操作：30 上海海洋大学硕士学位论文表4-1SOD操作表Table4-1SODoperationtableSOD活力对照孔对照空白孔测定孔测定空白孔待测样本（μL）--2020双蒸水（μL）2020--酶工作液（μL）2020-酶稀释液（μL）-20-20底物应用液（μL）200200200200混匀，37℃孵育20min，波长450nm，酶标仪测定吸光度值。组织中SOD活力的计算公式（4）如下：(A-A）（-A-A）对照对照空白测定测定空白SOD抑制率（%）=×100%式（4-3）(A-A)对照对照空白120ulSOD活力（U/mgprot）=SOD抑制率÷50%×反应体系稀释倍数（）÷待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）式（4-4）10ul2）肝组织中MDA测定组织中MDA活力按照试剂盒进行如下表4-2操作：31 上海海洋大学硕士学位论文表4-2MDA操作表Table4-2MDAoperationtableMDA活力空白管标准管测定管对照管10nmol/ml（μL）-20--无水乙醇（μL）20---测试样品（μL）--2020试剂一（μL）20202020混匀（摇动几下试管架）（μl）试剂二应用液（μL）150150150150试剂三应用液（μL）150150150-50%冰乙酸（μL）---150旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴80min，取出后流水冷却，然后4000r/min，离心10min。取上清，532nm处，双蒸水调零，测各管吸光度值。组织中MDA含量计算公式（5）如下：OD-OD测定对照组织中MDA含量（nmol/mgprot）=×10÷待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）式（4-5）OD-OD标准空白4.1.3.8统计学处理方法用SPSS（13.0版）软件进行数据分析，所有数据用均数±标准差(x±SD)表示，用LSD法检验p＜0.05为显著性差异具有统计学意义。采用Origin软件(8.0版)进行作图。4.2结果与分析4.2.1GBB-10SP对DM小鼠生活状态的影响观察DM小鼠每天的生活状态（表4-3）。空白对照组小鼠毛色光亮，活动频繁，糖尿病小鼠毛发枯黄，光泽度下降，精神萎靡，多尿；给予GBB-10SPDM小鼠处理后与空白对照组相比毛枯黄、少动萎靡，反应较慢，与模型组对比小鼠毛色枯黄程度稍轻。32 上海海洋大学硕士学位论文表4-3GBB-10SP对DM小鼠生活状态的影响Table4-3EffectofGBB-10SPtreatmentonlifestatusofDMmice组别皮毛状况精神状态排尿量空白对照组毛色光亮，浓密，整齐多动，反应灵敏少，垫料干燥枯黄，无光泽，较稀疏，少动萎靡，反应较慢多，垫料湿模型组凌乱两周后毛枯黄，无光泽，两周后少动萎靡，反应两周后多，垫料湿GBB-10SP低剂量组较稀疏，凌乱较慢两周后毛枯黄，无光泽，两周后少动萎靡，反应两周后多，垫料湿GBB-10SP中剂量组较稀疏，凌乱较慢两周后毛枯黄，无光泽，两周后少动萎靡，反应两周后多，垫料湿GBB-10SP高剂量组较稀疏，凌乱较慢4.2.2GBB-10SP对DM小鼠生长的影响糖尿病小鼠模型建立成功后，给予GBB-10SP处理DM小鼠28d（图4-1），空白对照组小鼠体重随时间呈现缓慢增加趋势；模型组DM小鼠在前16d体质量整体下降，由最初的23.47g下降至21.53g，具有显著性差异（p＜0.05），随后体重增加，但体重始终低于GBB-10SP治疗组和空白对照组；GBB-10SP处理组小鼠前8d体重上升，8-12d下降呈显著性差异（p＜0.05），12-20d体重再次上升，且GBB-10SP低剂量组小鼠体重高于其他DM小鼠组，而后又下降在上升。经过GBB-10SP治疗后糖尿病小鼠的体重比模型组高并趋向稳定，推测给药处理后糖尿病损伤机体逐渐修复。33 上海海洋大学硕士学位论文36BCMC33LGMGHG3027Weig24ht(g)21180481216202428Time(d)图4-1GBB-10SP对糖尿病小鼠体重的影响Fig.4-1EffectofGBB-10SPonbodyweightofDMmice注：BC：空白对照组，C：模型组，LG：GBB-10SP低剂量组，MG：GBB-10SP中剂量组，HG：GBB-10SP高剂量组。图4-2、图4-3同。经测定小鼠每天平均进食量如图4-2所示，在灌胃GBB-10SP治疗后，空白组和DM小鼠在0-8d进食量均上降，且DM小鼠进食量均高于空白组，原因可能为血糖较高引起的糖尿病小鼠多食。8-12d时小鼠进食量急剧下降，推测有可能是禁食造成的整体下降，小鼠进食量也是下降上升在下降，此后GBB-10SP治疗组的饮食量均高于模型组低于空白对组，表明GBB-10SP处理组可调节糖尿病的进食，促进机体机能的修复的可能，而模型组小鼠的机体损伤可能进一步严重。34 上海海洋大学硕士学位论文32BCMC28LGMG24HG20F16oodinta12ke(g)840481216202428Time(d)图4-2GBB-10SP对DM小鼠进食量的影响Fig.4-2EffectofGBB-10SPondietofDMmice4.2.3GBB-10SP对DM小鼠血糖的影响检测GBB-10SP处理组的小鼠血糖值，结果见图4-3。35BCMC30LGMGHG25201510Bloo5dsuga0481216202428rvaTime(d)lue(mm图4-3GBB-10SP对DM小鼠空腹血糖的影响ol/LFig).2EffectofGBB-10SPonfastingbloodglucoseofDMmice经注射四氧嘧啶后，小鼠血糖值约为21mmol/L以上，均≥11.1mmol/L，表明35 上海海洋大学硕士学位论文糖尿病小鼠造模成功。GBB-10SP处理前，空白对照组、模型组、GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组的血糖值分别：4.33、21.93、22.43、21.53、21.23mmol/L，GBB-10SP处理后，在0-4d时模型组与GBB-10SP高剂量组的血糖值下降，其他糖尿病小鼠组上升，在4d后模型组小鼠血糖值持续上升。16d后GBB-10SP处理组的血糖值趋于稳定且无下降趋势。28d时空白对照组、模型组、GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组的血糖值分别为：6.1、29.57、25.47、26.17、26.93mmol/L。表明GBB-10SP对过高血糖的糖尿病小鼠作用效果不明显，但可以维持血糖值不加重。4.2.4GBB-10SP对DM小鼠葡萄糖耐量的影响检测GBB-10SP处理21d，对DM小鼠口服葡萄糖耐量结果见表4-4。表4-4GBB-10SP处理对DM小鼠糖耐量的影响(n=8)Table4-4EffectsofGBB-10SPtreatmentonglucosetoleranceofDMmice(n=8)血糖值（mmol/L）AUC处理组0min30min120min(mmol/min·L)空白对照组5.93±0.68b18.43±1.00b5.87±0.12b24.19±1.21b模型组29.67±2.76a32.43±0.96a31.27±0.89a63.30±2.19aGBB-10SP低剂量组25.15±4.31a29.15±3.46a23.20±1.27ab52.86±5.47abGBB-10SP中剂量组24.77±2.23ab30.6±1.67a24.97±5.27ab55.52±6.03abGBB-10SP高剂量组23.87±0.64ab29±1.57ab22.07±2.02ab51.52±3.20ab注：不同小写字母表示同列组间差异显著性，p<0.05；表4-5，4-6同。在各组小鼠灌胃给予葡萄糖后，30min血糖值急剧升高，经过120min后血糖值有所降低。同空白组相比，模型组与给药组的葡萄糖耐量下降趋势平缓。在0、30、120min时各给药组小鼠血糖值均低于模型组小鼠，给药组与空白组具有差异显著性（p<0.05）。给药组血糖值120min后均恢复至灌胃前血糖值以下。空白对照组、模型组、GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组AUC分别为：24.19、63.30、52.86、55.52和51.52mmol/min·L，空白组和模型组具有显著性差异（p<0.05），GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组与模型组对比糖耐量曲线下面积减小。表明GBB-10SP处理能抑制糖尿病小鼠餐后血糖升高，并显著增强糖尿病小鼠葡萄糖负荷糖耐量，推测出GBB-10SP处理具有修复糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤的能力。4.2.5GBB-10SP对DM小鼠肝组织抗氧化能力的影响36 上海海洋大学硕士学位论文GBB-10SP处理对DM小鼠肝组织的SOD活性及MDA含量检测结果见表4-5。表4-5GBB-10SP对DM小鼠肝组织抗氧化能力的影响(n=8)Table4-5EffectofGBB-10SPonantioxidantcapacityoflivertissueofDMmice(n=8)SOD活力MDA活力处理组(μ/mgprot)(nmol/mgprot)空白对照组119.66±26.83b3.08±0.03b模型组88.98±6.27a4.26±0.30aGBB-10SP低剂量组91.49±14.89b2.99±1.12bGBB-10SP中剂量组103.90±11.55b3.03±0.39bGBB-10SP高剂量组90.05±8.82b2.94±0.45bSOD酶活性已经作为评价药物抗氧化能力的重要指标[12-13]。丙二醛的含量的多少直接反映了机体氧化损伤的程度[14-15]。从表4-5中可以看出，模型组体内SOD活性88.98μ/mgprot低于空白对照组119.66μ/mgprot呈显著性差异（p<0.05），而MDA4.26nmol/mgprot高于空白对照组3.08nmol/mgprot呈显著性差异（p<0.05）。经GBB-10SP处理后，SOD活性均提高，MDA含量显著降低，GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组与模型组SOD活性呈显著性差异（p<0.05），GBB-10SP中剂量组组SOD活性较高为103.90μ/mgprot，MDA含量较低为3.03nmol/mgprot，GBB-10SP处理组的MDA含量均低于空白对照组，表明GBB-10SP处理可提高糖尿病小鼠肝组织的抗氧化能力，推测出GBB-10SP处理对糖尿病小鼠肝脏损伤具有修复能力。4.2.6GBB-10SP对DM小鼠脏器指数的影响GBB-10SP处理对DM小鼠肝脏、肾脏、脾脏指数测定结果见表4-6。表4-6GBB-10SP对DM小鼠脏器指数的影响(X±S,n=8)Table4-6EffectofGBB-10SPtreatmentonorganindexofDMmice(X+S,n=8)处理组肝脏指数(mg/g)肾脏指数(mg/g)脾脏指数(mg/g)空白对照组24.71±4.87b8.61±4.25b3.48±0.69b模型组43.26±10.25a17.68±1.57a2.62±0.63aGBB-10SP低剂量组41.52±1.46a16.27±0.38a3.04±0.39aGBB-10SP中剂量组40.58±4.41a16.34±0.25a3.14±0.08aGBB-10SP高剂量组40.44±1.92a16.59±1.68a2.94±0.31a37 上海海洋大学硕士学位论文经解剖观察，模型组小鼠的肝脏和肾脏器官明显肿胀，脾脏器官萎缩，测定肝脏指数、肾脏指数高于空白对照组呈显著差异(p<0.05)，脾脏指数低于对照组，表明DM小鼠的脏器功能显著下降。GBB-10SP处理后，DM小鼠肝脏指数、肾脏指数降低，脾脏指数升高具有统计学意义。GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组的肝脏指数为41.52、40.58、40.44mg/g，肾脏指数为：16.27、16.34、16.59mg/g，低于模型组，脾脏指数为3.04、3.14、2.94mg/g高于与模型组。表明GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组对DM小鼠肝脏和肾脏器官具有修复和保护作用，对脾脏具有促进生长作用。4.3结论胶原蛋白肽的营养制剂可防治营养缺乏，增强应答功能，维持正常免疫反应，减轻炎症反应，即胶原蛋白肽与免疫营养密切相关[101]。抗氧化物可以上调抗氧化酶活性，减少有毒过氧化产物的生成，增强机体抗氧化能力。Qiu等[98]研究黄芪皂苷具有抗氧化作用，可以提高超氧化物歧化酶水平和活力。GBB-10SP处理DM4周后，空白对照组、模型组、GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组的血糖值分别为：6.1、29.57、25.47、26.17、26.93mmol/L，显示GBB-10SP无降血糖效果，但可以维持血糖值后期不加重。GBB-10SP低剂量组、GBB-10SP中剂量组、GBB-10SP高剂量组与模型组对比糖耐量曲线下面积减小。表明GBB-10SP处理能抑制糖尿病小鼠餐后血糖升高，并显著增强糖尿病小鼠葡萄糖负荷糖耐量，推测出GBB-10SP处理具有修复糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤的能力。经GBB-10SP处理处理组与模型组相比较，GBB-10SP均能提高肝SOD活力，降低肝MDA含量。肝脏和肾脏的指数降低，脾脏指数显著提高。GBB-10SP无降血糖作用，但可以提高DM小鼠肝组织抗氧化能力，改善肝脏和肾脏的损伤和促进修复。基于研究结论能认为，GBB-10SP处理，能增强自身免疫，具有恢复胰岛β细胞功能和促进胰岛素分泌的可能。38 上海海洋大学硕士学位论文第五章低分子量胶原蛋白肽联合苦瓜素辅助降低糖尿病小鼠血糖作用特性的研究DM患者症状主要是慢性高血糖、糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。第四章中的研究发现，以低分子量胶原蛋白肽灌胃糖尿病小鼠，可维持DM小鼠高血糖病情不恶化。本章进一步研究两种低分子量胶原蛋白肽联合植物提取物苦瓜素作为实验材料，建立小鼠T2DM模型，并选用二甲双胍作为阳性对照，通过观察小鼠通过形态学观察以及对血糖、脏器指数、葡萄糖耐受量和肝脏组织抗氧化能力的测定，初步探讨该种复合天然提取物对于小鼠降血糖作用的机理。5.1材料与方法5.1.1材料与试剂苦瓜素（MomordicaCharantiaextracts，MCE）含量10%，西安天宝生物科技有限公司。5.1.2仪器与设备-80℃超低温冷冻冰箱，海尔股份有限公司；McroplateReaderSH-1000酶标仪，CoronaElectricCo.,Ltd。5.1.3动物ICR雌性小鼠72只，清洁级，四周龄，许可证号SCXK（沪）2013-0006，14-16g，自然昼夜，自由进水，分笼饲养，上海杰思捷实验动物有限公司。5.1.3.1小鼠糖尿病模型的制备及其处理健康雌性ICR小鼠72只，适应性喂养1周，随机取8只作A空白对照组，其余64只腹腔注射四氧嘧啶200mg/kg•bw（四氧嘧啶临用前用生理盐水配制），空白对照组小鼠注射等量的生理盐水，3d后断尾取血，测定血糖值，血糖值≥11.1mmol/L[96-97]的动物用于实验。5.1.3.2小鼠的降血糖实验依据体重与血糖均衡原则随机分为8组，每组8只，分为A空白对照组、B39 上海海洋大学硕士学位论文模型组（0.86%生理盐水）、C阳性对照组（二甲双胍，1mg/kg•bw/d）、D低剂量GBB-10SP联合苦瓜素处理组（LGinterMCE，3.6g/kg•bw/d）、E中剂量GBB-10SP联合苦瓜素处理组（MGinterMCE，10.8g/kg•bw•d）、F高剂量GBB-10SP联合苦瓜素处理组（HGinterMCE，18g/kg•bw/d）、G低剂量TYE-S联合苦瓜素处理组（LTinterMCE，3.6g/kg•bw/d）、H中剂量TYPE-S联合苦瓜素处理组（MTinterMCE，10.8g/kg•bw•d）、I高剂量TYPE-S联合苦瓜素处理组（HTinterMCE，18g/kg•bw/d）。对DM小鼠前15d分别灌胃GBB-10SP和TYPE-S，第16d开始灌胃苦瓜素，其中模型组B及对照组A给予等体积的生理盐水灌胃，各组连续给药28d。5.1.3.3形态学观察指标实验期间每天观察记录小鼠的进食状况，皮毛，精神状况，排尿量，及其体重变化。5.1.3.4血糖检测方法各组小鼠连续喂养28d，将9组小鼠只禁食不禁水过夜，于次日早上8:00尾静脉取血用快速血糖仪测定小鼠空腹血糖值，每隔4d检测一次。5.1.3.5脏器指数检测方法实验第28d，麻醉处死小鼠，解剖，取小鼠脾脏、肝脏、肾脏称湿重，其肝脏、肾脏和脾脏，肉眼观察有无病变，用冷生理盐水冲洗，滤纸吸干残留水分，称重，计算肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数。计算公式为：脏器湿重脏器指数=式（5-1）动物体重5.1.3.6葡萄糖耐量检测方法DM小鼠给药21d后，禁食过夜，于次日早上8:00给药，60min后灌胃50mmol/kg葡萄糖，用快速血糖测定仪测定小鼠灌胃前（0min）灌胃后30、120min的血糖值，并计算葡萄糖耐量曲线下面积(AreaunderCurve，AUC)。0min血糖值+4×30min血糖值+3×120min血糖值AUC=式（5-2）45.1.3.7肝组织抗氧能力检测方法实验第28d，麻醉处死小鼠，解剖取肝脏，用10%的生理盐水清洗去血渍和剪除其他结缔组织，称重，剪碎加入9倍体积0.86%生理盐水，匀浆，离心（2500r/min,10min）后取上清液，用丙二醛试剂盒和超氧化物歧化酶试剂盒测定。5.1.3.8统计学处理方法40 上海海洋大学硕士学位论文用SPSS（13.0版）软件进行数据分析，所有数据用均数±标准差(x±SD)表示，用LSD法检验p＜0.05为显著性差异具有统计学意义。采用Origin软件(8.0版)进行作图。5.2结果与分析5.2.1胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠生活状态的影响观察DM小鼠每天的生活状态（表5-1）。对照组小鼠毛色光亮，活动频繁，糖尿病小鼠毛发枯黄，光泽度下降，精神萎靡，多尿；给予胶原蛋白肽联合苦瓜素DM小鼠处理比阳性对照组小鼠毛色光泽度高，小鼠活动更为频繁，垫料相对更为干燥。表5-1胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠生活状态的影响Table5-1EffectofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractstreatmentonlifestatusofDMmice处理组皮毛状况精神状态排尿量空白对照组毛色光亮，浓密，整齐多动，反应灵敏少，垫料干燥枯黄，无光泽，较稀疏，少动萎靡，反应较慢多，垫料湿模型组凌乱两周后较白，光泽度良三周后活动量增加，三周后排尿量减阳性对照组好，较为浓密、整齐反应较灵敏少，垫料较湿两周后较白，光泽度良三周后活动量增加，三周后排尿量减LGinterMCE组好，较为浓密、整齐反应较灵敏少，垫料较湿两周后较白，光泽度良三周后活动量增加，三周后排尿量减MGinterMCE组好，较为浓密、整齐反应较灵敏少，垫料较干燥两周后枯黄略微改善，光三周后活动量有所增三周后排尿量减HGinterMCE组泽度良好，浓密，整齐加，反应稍灵敏少，垫料较湿两周后较白，光泽度良三周后活动量增加，三周后排尿量减LTinterMCE组好，较为浓密、整齐反应较灵敏少，垫料较湿两周后较白，光泽度良三周后活动量增加，三周后排尿量减MTinterMCE组好，较为浓密、整齐反应较灵敏少，垫料较干燥两周后较白，光泽度良三周后活动量增加，三周后排尿量减HTinterMCE组好，较为浓密、整齐反应较灵敏少，垫料较干燥41 上海海洋大学硕士学位论文5.2.2胶原蛋白肽联合苦瓜素对DM小鼠生长的影响糖尿病小鼠模型建立成功后，给予胶原蛋白肽处理DM小鼠16d（图5-1），对照组小鼠体重随时间呈现缓慢增加趋势；模型组DM小鼠在前4d体质量整体下降，由最初的24.87g下降至23.97g，无显著性差异，随后体重增加；阳性对照组小鼠体重增加，LGinterMCE组小鼠前4d体重下降，随后上升呈显著性差异（p＜0.05），其他组体重均上升。第16d时TYPE-S处理组小鼠体重比阳性对照组略高0.5-2.4g，比模型组低0.6-2.5g。GBB-10SP处理组小鼠体重比阳性对照组略低。第16d后给予苦瓜素处理，24d后糖尿病小鼠体重变化不明显，经过胶原蛋白肽联合苦瓜素治疗后糖尿病小鼠的体重趋向稳定，表明给药处理后糖尿病损伤机体逐渐修复。36ABC33DEF30GHI27Weight(24g)21048121620242832Time(d)图5-1胶原蛋白肽和苦瓜素对DM小鼠体重的影响Fig.5-1EffectofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractsonbodyweightofDMmice注：A：空白对照组；B：模型组；C：阳性对照组；D：LGinterMCE组;E：MGinterMCE组；F：HGinterMCE组；G：LTinterMCE组；H：MTinterMCE组；I：HTinterMCE组；图5-2、图5-3同。经测定小鼠每天平均进食量如图5-2所示，在灌胃胶原蛋白肽时期，空白组和DM小鼠在0-4d进食量均下降，原因可能为血糖较高影响糖尿病小鼠进食。4-8d后小鼠进食量平缓增加，12-16d小鼠进食量剧增（除F组外）。在第16d时，LGinterMCE组、HGinterMCE组和MTinterMCE组小鼠进食量分别高于阳性对照42 上海海洋大学硕士学位论文组：2.5、4.83和1.8g，且高于模型组，表明胶原蛋白处理组可调节糖尿病的进食，促进机体机能的修复，且效果由于阳性对照组。给予苦瓜素阶段，DM小鼠进食量波浪型，与苦瓜素性味苦寒影响小鼠食欲有关。A24BCDE20FGH16I12Foodi8ntake(g4)048121620242832Time(d)图5-2胶原蛋白肽和苦瓜素对DM小鼠进食量的影响Fig.5-2EffectofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractsondietofDMmice5.2.3胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠血糖的影响检测胶原蛋白肽处理阶段和苦瓜素处理阶段不同处理组的小鼠血糖值，结果见表5-2和图5-3。43 上海海洋大学硕士学位论文表5-2胶原蛋白肽联合苦瓜素对DM小鼠空腹血糖的影响（n=8）Table5-2EffectofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractsonfastingbloodglucoseindiabeticmice(n=8)胶原蛋白肽处理阶段苦瓜素处理阶段处理组血糖(mmol/L)血糖(mmol/L)血糖下血糖下降百分降百分给药前给药16d后率（%）给药前给药12d后率（%）空白对照组8.45±0.35a7.93±0.91a6.157.93±0.91a7.16±1.27a9.71模型组20.20±2.97b23.77±3.56b17.6723.77±3.56b20.93±1.56b11.95阳性对照组19.43±1.88b15.76±0.75c18.8915.76±0.75c15.30±1.08ce2.92LGinterMCE组19.85±1.48b14.70±2.76c25.9414.70±2.76c10.03±0.37d31.77MGinterMCE组19.25±0.64b15.26±2.83c20.7315.26±2.83c8.57±1.21ad43.84HGinterMCE组19.80±1.41b22.36±1.21b17.9722.36±1.21b16.63±0.70c25.63LTinterMCE组19.73±0.77b15.40±1.30c21.9515.40±1.30c13.85±0.35e10.06MTinterMCE组20.40±0.00b12.40±2.25c39.2212.40±2.25c8.60±1.67ad30.65HTinterMCE组20.23±0.35b12.20±2.83c39.6912.20±2.83c7.50±0.71a38.52注：不同小写字母表示同列组间差异显著性，p<0.05；表5-3-表5-5同。44 上海海洋大学硕士学位论文30ABCD24EFGHI1812Bloodsu6garvalue(m048121620242832moTime(d)l/L)图5-3胶原蛋白肽联合苦瓜素对DM小鼠空腹血糖的影响Fig.5-3EffectofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractsonfastingbloodglucoseofDMmice与空白对照组相比，糖尿病小鼠血糖值显著升高，且均高于11.1mmol/L，但组间无明显差异，表明造模成功。在胶原蛋白肽处理阶段，LTinterMCE组、MTinterMCE组、HTinterMCE组血糖下降百分率为：21.95%、39.22%、39.69%，高于阳性对照组和GBB-10SP处理组。表明TYPE-S胶原蛋白肽降血糖效果优于GBB-10SP；在苦瓜素处理阶段，LGinterMCE组、MGinterMCE组、HGinterMCE组苦瓜素处理血糖下降百分率31.77%、43.84%、25.63%优于GBB-10SP处理25.94%、20.73%、17.97%，表明对MGinterMCE、HTinterMCE组苦瓜素处理降血糖效果优于GBB-10SP与TYPE-S胶原蛋白肽。MGinterMCE组在苦瓜素处理阶段降血糖显著高于HTinterMCE组，可能是由胶原蛋白肽处理阶段，过高剂量的胶原蛋白处理扰乱小鼠机体代谢水平，糖尿病机体损伤加重，后期用苦瓜素治疗时，机体修复缓慢，作用效果弱于MGinterMCE组，而TYPE-S联合苦瓜素组降血糖效果呈剂量关系，表明不同来源胶原蛋白肽降血糖作用具有差异性。胶原蛋白肽处理阶段和苦瓜素处理阶段对DM小鼠空腹血糖作用效果对比图5-3所示，胶原蛋白肽阶段的HGinterMCE组、LTinterMCE组、MTinterMCE组在第8d时血糖下降幅度显著，HTinterMCE组、LGinterMCE组在第12d时下降幅45 上海海洋大学硕士学位论文度较快。苦瓜素处理后MGinterMCE组、HGinterMCE组第24d时血糖下降幅度较快，后又缓慢，其他组下降幅度均低于胶原蛋白肽组，并下降幅度缓趋于不变。5.2.4胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠葡萄糖耐量的影响检测胶原蛋白肽联合苦瓜素处理21d，对DM小鼠口服葡萄糖耐量结果见表5-3。表5-3胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠糖耐量的影响(n=8)Table5-3EffectsofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractstreatmentonglucosetoleranceofDMmice(n=8)血糖值（mmol/L）处理组AUC(mmol/min·L)0min30min120min空白对照组8.52±0.57a16.08±2.32a7.65±0.31a23.94±2.35a模型组26.73±3.2b33.30±0.00b29.07±3.22b61.78±2.96b阳性对照组17.47±0.61c20.97±0.90ce14.60±1.28c36.28±0.98ceLGinterMCE组14.36±1.15de22.30±0.50cd12.43±0.68d35.22±0.65cfMGinterMCE组13.7±0.86e19.33±0.85e12.37±0.68d32.03±0.29dHGinterMCE组17.57±1.16c23.50±1.96d13.67±0.38cd38.14±1.48eLTinterMCE组16.43±1.36cd22.43±1.35cd12.27±0.65d35.74±1.46ceMTinterMCE组16.27±1.55cde22.23±1.50cd8.20±0.61a32.45±1.25dHTinterMCE组13.67±2.04e19.20±1.51e13.67±0.81cd32.87±0.58df小鼠灌胃给予葡萄糖后，同正常组相比，模型组与给药组的葡萄糖耐量下降趋势平缓。在0、30、120min时各给药组小鼠血糖值均低于模型组小鼠，给药组与模型组具有差异显著性（p<0.05）。给药组血糖值120min后均恢复至灌胃前血糖值以下。MGinterMCE组、MTinterMCE组、HTinterMCE组、阳性组与模型组AUC分别为：32.03、32.45、32.87、36.28和61.78mmol/min·L，前四组和模型组相比具有显著性差异（p<0.05），MGinterMCE组、MTinterMCE、HTinterMCE组与阳性组和模型组对比糖耐量曲线下面积减小。表明胶原蛋白肽联合苦瓜素处理能抑制糖尿病小鼠餐后血糖升高，并显著增强糖尿病小鼠葡萄糖负荷糖耐量，推测出胶原蛋白肽联合苦瓜素处理可以修复糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤。5.2.5胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠肝组织抗氧化能力的影响胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠肝组织的SOD活性及MDA含量检测结果见表5-4。46 上海海洋大学硕士学位论文表5-4胶原蛋白肽联合苦瓜素对DM小鼠肝组织抗氧化能力的影响(n=8)Table5-4EffectofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractsonantioxidantcapacityoflivertissueofDMmice(n=8)SOD活性MDA含量处理组(μ/mgprot)(nmol/mgprot)a3.67±0.98a空白对照组101.48±5.01模型组57.63±3.61b7.39±1.59b阳性对照组75.41±4.90c3.35±0.47acLGinterMCE组110.74±1.95d3.00±0.02adeMGinterMCE组154.72±4.80e1.66±0.10cHGinterMCE组89.18±3.52f2.59±0.001bceLTinterMCE组104.49±3.75ad2.26±0.05bdMTinterMCE组94.78±4.58af2.37±0.003bdf2.45±0.59bdHTinterMCE组92.43±6.56超氧化物歧化酶是生物体内唯一能催化超氧化物歧化的生物酶，是评价抗氧化能力的重要指标[12-13]。丙二醛的含量的多少直接反映了机体氧化损伤的程度[14-15]。从表5-4中可以看出，模型组体内SOD活性57.63μ/mgprot低于对照组101.48μ/mgprot呈显著性差异（p<0.05），而MDA7.39nmol/mgprot高于对照组3.67nmol/mgprot呈显著性差异（p<0.05）。经胶原蛋白肽联合苦瓜素处理后，SOD活性均提高，MDA含量显著降低，LGinterMCE组、MGinterMCE组、HGinterMCE组与阳性对照组SOD活性呈显著性差异（p<0.05），MGinterMCE组SOD活性较高为154.72μ/mgprot，MDA含量较低为1.66nmol/mgprot，LGinterMCE组SOD活性显著高于正常组，MDA含量低于正常组，表明经LGinterMCE组处理后促进鼠机内肝组织修复和提高抗氧化作用显著，HGinterMCE组SOD活性较低与前面过高剂量的胶原蛋白肽无降血糖作用一致，可能是过高剂量使机体代谢失衡，肝组织损伤导致。LTinterMCE组、MTinterMCE组、HTinterMCE组SOD活性高于阳性组呈显著性，MDA含量均低于阳性组呈显著性差异（p<0.05）。表明胶原蛋白肽联合苦瓜素处理可提高糖尿病小鼠肝组织的抗氧化能力，推测出胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对糖尿病小鼠肝脏损伤具有能力。5.2.6胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠脏器指数的影响47 上海海洋大学硕士学位论文胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠肝脏、肾脏、脾脏指数测定结果见表5-5。表5-5胶原蛋白肽联合苦瓜素处理对DM小鼠脏器指数的影响(X±S,n=8)Table5-5EffectofcollagenpeptideandMomordicaCharantiaextractstreatmentonorganindexofDMmice(X+S,n=8)处理组肝脏指数(mg/g)肾脏指数(mg/g)脾脏指数(mg/g)空白对照组44.18±1.73a10.68±0.60a2.98±0.27ac模型组59.07±2.76b16.26±1.46bd2.54±0.32c阳性对照组48.50±0.54ac13.64±0.82ce2.97±0.42acLGinterMCE组54.60±3.59bd12.42±0.92ac3.52±0.37bMGinterMCE组51.82±4.36cde12.15±1.47ac2.96±0.69acHGinterMCE组56.17±3.46bd17.28±3.33d2.71±0.42aLTinterMCE组51.68±4.39cde13.93±2.35bc3.35±1.25aMTinterMCE组44.98±1.62a11.29±0.07ae3.18±0.44acHTinterMCE组48.49±4.46ae11.54±1.13ac2.98±0.64ac经解剖观察，模型组小鼠的肝脏和肾脏器官明显肿胀，脾脏器官萎缩，测定肝脏指数、肾脏指数高于对照组呈显著差异(p<0.05)，脾脏指数低于对照组，表明DM小鼠的脏器功能显著下降。胶原蛋白肽联合苦瓜素处理后，DM小鼠肝脏指数、肾脏指数降低，脾脏指数升高具有统计学意义。MGinterMCE组、MTinterMCE组、HTinterMCE组的肝脏指数为51.82、44.98、48.49mg/g，肾脏指数为：12.15、11.29、11.54mg/g，低于阳性组，脾脏指数为2.96、3.18、2.98mg/g与阳性组相当。表明MGinterMCE组、MTinterMCE组、HTinterMCE组对DM小鼠肝脏和肾脏器官具有修复和保护作用，对脾脏具有促进生长作用，且效果显著。5.3结论与讨论胶原蛋白肽易被肠道直接吸收，能提供机体需要的营养物质，还具有避免机体损伤造成的蛋白分解、糖、脂代谢紊乱，体重急剧下降等症状[99]。苦瓜提取物使Ⅱ型糖尿病受损的胰岛素β细胞恢复正常的分泌功能，增强胰岛素抵抗降低大鼠的空腹血糖，且血糖正常后保持稳定持久[100-102]，因此本实验采用胶原蛋白肽改善机体免疫和营养代谢特性后，联合苦瓜素辅助降低小鼠血糖下降，实现营养代谢48 上海海洋大学硕士学位论文改善后调节血糖的目标。胶原蛋白肽联合苦瓜素处理DM4周后能明显降低血糖水平，空腹血糖降到7.5-16.63mmol/L，其中MGinterMCE组、MTinterMCE组、HTinterMCE组血糖恢复到8.6mmol/L以下，降血糖效果显著（p<0.05），且糖尿病小鼠血糖曲线下面积明显减少，改善糖尿病小鼠糖耐量异常。但HGinterMCE组血糖值在灌胃胶原蛋白肽处理时，血糖值上升，而灌胃苦瓜素处理后略有下降。推测胶原蛋白肽灌胃量过高造成调节失衡而无降血糖作用，并且不同胶原蛋白肽的功效存在差异。这需要后续试验继续研究。四氧嘧啶通过破坏胰岛β细胞，引起血糖升高，造成实验性糖尿病[103-104]。四氧嘧啶破坏β细胞产生氧自由基，使SOD活力降低等，引起糖尿病人和糖尿病动物模型的抗氧化能力均下降[23]。胶原蛋白肽联合苦瓜素处理DM4周后，血糖含量降低的同时肝组织抗氧化能力提高，MGinterMCE组、MTinterMCE组、HTinterMCE组显著提高肝SOD活力，降低肝MDA含量。MGinterMCE组、MTinterMCE组、HTinterMCE组处理组与模型组相比较，肝脏和肾脏的指数降低，脾脏指数显著提高。胶原蛋白肽联合苦瓜素降低血糖和提高DM小鼠肝组织抗氧化能力的同时，改善肝脏和肾脏的损伤和促进修复。基于研究结论能认为，胶原蛋白肽联合苦瓜素处理，能增强自身免疫，恢复胰岛β细胞功能，促进胰岛素分泌，调节血糖趋于正常水平，减轻机体糖尿病症状。49 上海海洋大学硕士学位论文全文总结胶原蛋白肽具有多种生理功能如抗氧化、抑菌活性及清除自由基等。已有研究发现胶原蛋白具有降血糖的效果。因此本文探索对多种胶原蛋白抗氧作用进行对比，不同溶解环境对低分子量胶原蛋白肽抗氧化活性的影响及其降血糖作用的研究。（1）WSC、C-1、C-2、WCⅡ、WWSCⅡ、PSC、SKI-ASC、WSCⅡ均含有α链。C-2、C-1、WSC含有β链。胶原蛋白的甘氨酸含量较高，其次是丙氨酸残基和脯氨酸残基。WSC、WWSCⅡ/WCⅡ含有酪氨酸。WWSCII具有很好的体外还原力的能力和清除自由基的活性，其次是WSCII、WSC、SKI-ASC、PSC等。因此，胶原蛋白具有一定的抗氧化能力，可有效清除•OH和DPPH•，且在一定质量浓度范围内，呈现出良好的量效关系。（2）还原力方面：乙酸、乙酸钠对GBB-10SP和TYPE-S的还原力降低效果显著，乙酸钙对还原力影响力较小。清除·OH方面：GBB-10SP和TYPE-S在乙酸环境下无清除羟自由基能力。乙酸钠对低浓度的胶原蛋白肽的清除羟自由基能力影响较大，对高浓度的胶原蛋白肽影响力较小。乙酸钙对胶原蛋白肽清除·OH的能力无显著性改变。清除DPPH•方面：乙酸、乙酸钠和乙酸钙对GBB-10SP和TYPE-S清除DPPH•的能力几乎不影响。（3）采用小鼠糖尿病模型研究GBB-10SP降血糖的作用特性。与模型组相比，GBB-10SP处理的糖尿病模型小鼠，第28d的血糖值和第21d的AUC显著降低（p＜0.05），肝脏指数和肾脏指数下降，脾脏指数上升，肝组织抗氧化能力提高，MDA含量降低，但无降血糖效果，后期只可以维持血糖值不持续升高。（4）采用小鼠糖尿病模型研究低分子量胶原蛋白肽联合苦瓜素辅助降血糖的作用特性。胶原蛋白肽联合苦瓜素处理的糖尿病模型小鼠，第28d的血糖值和第21d的AUC显著降低（p＜0.05），肝脏指数和肾脏指数下降，脾脏指数上升，肝组织抗氧化能力提高，其中石斑鱼骨胶原蛋白肽联合苦瓜素的中剂量组与罗非鱼皮胶原蛋白肽联合苦瓜素的中剂量组和高剂量组效果较显著。胶原蛋白具有多种生物活性，本研究结果显示WWSCII具有较好抗氧化活性，乙酸乙酸钠对低分子量胶原蛋白肽抗氧化活性影响较大，乙酸钙影响稍弱。此外50 上海海洋大学硕士学位论文GBB-10SP对血糖值较高糖尿病小鼠无辅助降血糖效果，但可以促进其机体脏器的修复。低分子量的胶原蛋白肽联合苦瓜素可使糖尿病小鼠的血糖值显著降低（p<0.05），且血糖值降低与肝脏抗氧化能力提高相关联，同时胶原蛋白肽联合苦瓜素处理促进糖尿病模型小鼠脏器损伤修复和提高自身免疫能力。51 上海海洋大学硕士学位论文参考文献[1]杨志寨.糖尿病治疗现状[J].中外医疗,2011,30(27):183-184.[2]邹宇晓,廖森泰,刘学铭,等.桑树资源治疗糖尿病研究[J].天然产物研究与开发,2004,16(3):265-268.[3]祝婧.海鲈鱼胶原蛋白肽的制备分离及对皮肤伤口的愈合作用[D].福建农林大学,2014.[4]李英民,王天舒,刘伟华,等.动物胶原蛋白的应用研究进展[J].中国胶粘剂,2016(9):46-51.[5]文卓琼,黄爱妮.鱼类胶原蛋白的研究进展[J].黑龙江科技信息,2016(14):95-96.[6]何静.胶原蛋白在生物医药工程中的应用研究进展[J].河南科技,2015(10):104-105.[7]刘振锋,吕卫金,戴圣佳,等.胶原蛋白的提取、改性及应用研究进展[J].食品与药品,2014,16(6):443-447.[8]ReedMJ,VernonRB，AbrassIB,etaLTGF-P1inducestheexpressionoftypeIcollagenandSPARC，andenhancescontractionofcollagengels，byfibroblastsfromyoungandageddonors[J].Journalofcellularphysiology,1994,158(1):169-179.[9]GelseK,PschlE,AignerT.Collagens-structure,function,andbiosynthesis[J].AdvDrugDelivRev,2003,55(22):1531.[10]ChiHL,SinglaA,LeeY.Biomedicalapplicationsofcollagen[J].IntJPharmaceut,2001,221(1-2):1-22.[11]Gómez-GuillénMC,GiménezB,López-CaballeroME,etal.Functionalandbioactivepropertiesofcollagenandgelatinfromalternativesources:Areview[J].FoodHydrocolloid,2012,25(8):1813-1827.[12]张达江,王亮.Ⅰ型胶原蛋白的结构、功能及其应用研究的现状与前景[J].生物技术通讯,2006,17(2):265-269.[13]GelseK,PschlE,AignerT.Collagens-structure,function,andbiosynthesis[J].AdvDrugDelivRev,2003,55(22):1531.[14]李卫林,曹健,汤克勇,等.胶原蛋白结构和稳定性关系研究[J].中国皮革,2005,34(23):14-16.[15]BergRA,ProckopDJ.Thethermaltransitionofanon-hydroxylatedformof52 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