基于新一代高通量测序的病原体快速检测技术开发及应用

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专业学位硕士学位论文基于新一代高通量测序的病原体快速检测技术开发及应用作者姓名关晴辉学位类别工程硕士指导教师郑穗平教授叶明芝助理研究员所在学院生物科学与工程学院论文提交日期2017年4月13日 RapidDetectionMethodofPathogenicMicroorganismByNext-GenerationSequencing（NGS）ADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：GuanQinghuiSupervisor：Prof.ZhengSuipingProf.YeMingzhiSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,China 分类号：Q5学校代号：10561学号：201120209223华南理工大学硕士学位论文基于新一代高通量测序的病原体快速检测技术开发及应用作者姓名：关晴辉指导教师姓名、职称：郑穗平教授、叶明芝助理研究员申请学位级别：硕士学位学科专业名称：生物工程研究方向：基因工程论文提交日期：2017年4月13日论文答辩日期：2017年6月6日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：王菊芳教授委员：林炜铁教授、崔堂兵教授、张毅副教授、张菊梅研究员 华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研宂所取得的研宄成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名期：祕＾年ｓ月外日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研宄生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南理工大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅（除在保密期内的保密论文外）；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文一。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相致。本学位论文属于：口保密，（校保密委员会审定为涉密学位时间：年月日）于年月日解密后适用本授权书。ｖ不保密意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议，同的单位浏览；同意将本人学位论文提交中国学术期刊（光盘版）电子杂志社全文出版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，传播学位论文的全部或部分内容。“”Ｖ（请在以上相方内打）ｆ＾作者签名：日期：７指导教师签名：日期．．２〇（７，＾＞冰＊￥作者联系电话：｜电子邮箱：］联系地址（含邮编）： 摘要呼吸道传染病具有病原种类多，人群普遍易感，传播性强，控制较难等特点。世界卫生组织（WHO）于2012年更新的全球人类死亡原因数据库中，呼吸道感染列第三位。然而目前常规病原学诊断技术滞后，难以满足临床需要，经验性抗感染治疗普遍存在。经验性治疗通常使用大量广谱抗生素导致耐药菌的产生同时也不利于新发传染病的治疗。因此要不断开发和完善更有效的检测手段。测序技术可通过核酸序列特异性对病原体直接检定，使得检测更加快速准确，能够有效地实现针对性治疗。本研究优化完善了前处理、提取及建库过程的各个关键技术要点。通过实验确定了痰液在进行核酸提取前需要通过5%二硫苏糖醇进行前处理，鼻咽拭子、脑脊液等样本可用Millipore超滤管进行浓缩，利用过滤法去除宿主核酸提高病原核酸比例，利用天根的微量样品基因组提取试剂盒可以用较低的成本达到较好的提取效果，在DNA建库时磁珠纯化量的最佳比例是末端修复后采用1.6倍体积磁珠纯化，接头连接后采用1.2倍体积磁珠纯化，利用磁珠对建库后DNA进行片段选择既节约成本又省时间。最后形成了一套从样本接收到报告发放的完整流程。实现了整个流程在48小时内完成。并且从敏感性、稳定性、特异性和准确性几方面验证了该技术的可行性和准确性。关键词：病原体；Proton；高通量测序；检测I AbstractRespiratorytractinfectionscanbecausedbyalargerangeofpathogens,includingviruses,bacteriaand(lessoften)fungi,whichleadtoitsprevalenceinepidemicanddifficultiesinprevention.In2012,theworldhealthorganization(WHO)rankedtherespiratorytractinfectionasthetopthirdcauseofmortalityworldly.Theconventionalpathogendiagnosismethodsinclinicaretimeconsumingandlowefficient.Therapytreatmentofrespiratorytractinfectionusuallyrequiresempiricallytestingalargecollectionofantibioticagentsmeanwhileitalsoincreasestheriskofgeneratingbroad-spectrumantibioticresistantpathogens.Toaddressthislimits,here,weproposetodevelopadeepsequencing-basedmethodtoidentifythediseasecausingpathogensofindividualpatients,whichwillprovideguidanceforeffectivetherapeutictreatments,asawayofprecisionmedicine.Usingdeepsequencingmethods,wecancomprehensivelymapalltheidentitiesofpathogensinindividualpatientinahigh-throughputandrobustfashion;meanwhilewecaneasilyexcludethehostDNA/RNAcontaminationthroughbioinformaticsanalysis.Thisresearchhasoptimizedandperfectedthekeytechnicalpointsofpreprocessing,extractionanddatabaseconstruction.ThesamplesofnasopharyngealswabsandcerebrospinalfluidwereconcentratedbyMilliporeultrafiltrationtube,andthecontentofpathogenicnucleicacidwasincreasedbyfiltration.Theresultsshowedthatsputumcouldbepretreatedby5%dithiothreitolbeforenucleicacidextraction.TheuseoftheTIANampMicroDNAKitcanbeusedatalowercosttoachievebetterextractionresults,DNAinthelibrarywhenthebestratiooftheamountofpurifiedbeadsistheendoftherepairwith1.6timesthevolumeofmagneticbeads,Aftertheconnectionwith1.2timesthevolumeofmagneticbeadspurification,theuseofmagneticbeadsonthedatabaseaftertheDNAfragmentselectioncostsavingsandsavetime.Finally,acompleteprocessofreceivingreportsfromthesamplesisformed.Toachievetheentireprocessin48hourstocomplete.Andthefeasibilityandaccuracyofthetechnologyareverifiedfromtheaspectsofsensitivity,stability,specificityandaccuracy.Keywords：PathogenicMicroorganism、Proton、NGS（Next-GenerationSequencing）、DetectionII 目录摘要.................................................................IAbstract.................................................................II第一章引言...............................................................11.1本课题的意义及相关的研究............................................11.2本课题的技术路线....................................................2第二章DNA测序技术的介绍.................................................32.1第一代测序技术......................................................32.1.1Sanger双脱氧链终止法............................................32.1.2Maxam-Gilbert化学降解法.........................................42.2第二代测序技术（Next-GenerationSequencing，NGS）...................42.2.1焦磷酸测序技术..................................................42.2.2Solexa测序技术..................................................52.2.3SOLiD测序技术...................................................52.2.4半导体测序技术..................................................62.3第三代测序技术......................................................92.3.1并行单分子合成测序技术..........................................92.3.2单分子实时合成测序技术..........................................92.3.3纳米孔单分子测序技术............................................10第三章材料与方法........................................................113.1实验材料...........................................................113.1.1主要试剂与耗材..................................................113.1.2主要仪器与设备..................................................123.2样本的采集、保存和运输.............................................123.2.1样本的采集和保存................................................123.2.2样本的运输......................................................143.3实验方法...........................................................143.3.1样本前处理......................................................143.3.2降低宿主核酸....................................................143.3.3DNA提取........................................................15III 3.3.3病原建库........................................................153.3.4信息分析........................................................163.3.5报告解读........................................................163.3.6敏感性测试......................................................163.3.7重复性测试......................................................173.3.8特异性测试......................................................173.3.9准确性测试......................................................17第四章技术流程确立及方法学验证..........................................184.1检测技术的流程确立.................................................184.1.1痰液液化处理方法优化............................................184.1.2样本浓缩技术研究................................................184.1.3降低宿主核酸方法确定.............................................194.1.4DNA提取方法确立.................................................214.1.5病原建库方法优化................................................224.2检测技术的方法学验证...............................................254.2.1敏感性验证......................................................254.2.2稳定性验证......................................................284.2.3特异性验证......................................................294.2.4准确性验证......................................................29检测技术的应用.....................................................31第五章结论与展望........................................................345.1结论...............................................................345.2展望...............................................................34参考文献.................................................................36攻读硕士学位期间取得的研究成果...........................................39致谢.....................................................................40IV 第一章引言第一章引言1.1本课题的意义及相关的研究病原体是侵犯人体，引起感染甚至传染病的一类病原生物。其中病原微生物尤为难以辨认，其形体微小，往往需要通过光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、上千倍甚至数万倍才能观察。准确地寻找出病原微生物对我们治疗感染性及传染性疾病有着极其重要的意义。在感染性疾病的实验室诊断中，现有的检测方法如涂片、镜检，存在检出率较低的问题；培养法操作繁琐而且耗时较长，对一些病毒以及厌氧菌存在培养困难的问题；血清学、生物化学及PCR检测，针对的病原体种类有限，无法对其他感染做出判定；对不明或者新发病原体的快速检测更是存在空白。因此要不断开发和完善更有效的检测手段。测序法（特别是新一代高通量测序）是鉴定微生物最为准确可靠的方法之一。一代测序法耗时长、成本高、通量低，无法满足对未知病原的分析。使用高通量测序技术无需对病原微生物群体逐一分离，而是提取核酸后进行测序，通过得到的大量序列信息，从整体上把握病原微生物群体的组成情况，也可获得含量低的病原序列，还可通过未知序列鉴定新的物种。将测序结果与现有的微生物基因信息数据库进行逐一比对，可以迅速识别各类病原微生物，使诊断时间缩短，诊断结果更加精确。近年来发达国家的一些研究小组利用高通量测序技术发现了一批对人类健康有重要意义的新病原体，而此前利用传统的生物技术手段并未发现这些病原体，这标示着在发现病原微生物方面，高[1,2]通量测序技术具有重大意义。2008年Palacios等人报告了一个典型的利用高通量测序发现全新未知致病微生物的案例。在一家医院的器官移植之后，三名器官移植受体全部死亡，通过传统的免疫学和PCR方法均未发现有已知的致病微生物，后来采用高通量测序技术明确发现供体和受体受到一种全新的沙粒病毒的感染，随后用特异引物PCR等试验也证实该新型沙粒病毒[3]为三名器官受体致死的原因。2008年南部非洲赞比亚发生一次未知病原体导致的出血热疫情，80%的患者死亡。通过高通量测序，研究人员在72小时内就检测到一种新型的[4]高致病性Lujo病毒。充分地体现出相比传统的技术，高通量测序技术在对未知病原的检测，特别是一些新型的病原体的发现方面具有突出的优势。同时在准确性方面，通过对基因组的分析可以更精准的定位病原体的种属。2010年KurodaM等人利用深度测序证明一例肺炎死亡患者体内为流感病毒A/H1N1/2009感染而不是肺炎球菌，进一步生物1 华南理工大学硕士学位论文[5]信息学分析结果证明该病毒是H1N1的亚种A/Angano/RCI-L/2009(H1N1)。2014年Wilson等人通过高通量测序技术成功将一名持续发热引起严重联合免疫缺陷疾病的14岁男孩的发病原因诊断为钩端螺旋体感染，用青霉素对其进行治疗，结束了其长达4个[6]月的持续发热症状。在我国，YongFeng等在未知病毒基因组信息情况下，运用Illumina测序从患者拭子标本里检测出2009年北京流行的新甲型H1N1流感病毒和季节性甲型[7]H3N2流感病毒。Greninger等运用Illumina测序从17例呼吸道感染患者鼻咽拭子里检测到甲型H1N1流感病毒，并运用短读长序列数据构建了接近全长的病毒基因组片段[8]。国内外的研究都表明利用第二代测序技术可以检出一定类型的样本中的病原微生物。这为本研究的内容提供了理论基础。但何利用第二代测序技术流程化标准化地实现病原体的快速检测是本研究的研究目的。如何处理诸多类型的样本，如何明确提取的方法，如何确定和优化建库流程保证病原体被有效地检出避免漏检，这项检验技术的敏感性、稳定性、特异性和准确性都是前人的实验研究中没有涉及到的。这些都是本研究内容的意义。1.2本课题的技术路线本研究的技术路线如图3-1所示。在本技术路线中提取建库的质量直接影响到后续测序结果，对能否准确检出病原体起着举足轻重的作用。因此本研究将重点针对以下技术要点进行突破：如何对特殊样本类型进行提取核酸前的处理，如何尽可能地去除宿主细胞降低对测序的影响，对提取方法进行评估，建库过程各关键条件的确定。样本样本接收核酸提取文库构建前处理报告生成数据分析高通量测序Qubit定量文库末端接头PCR片段构建修复连接扩增选择图3-1技术流程示意图2 第二章DNA测序技术的介绍第二章DNA测序技术的介绍2.1第一代测序技术[9]1975年，Sanger建立了DNA测序的双脱氧链终止法。在1977年Maxam和Gilbert[10]建立了DNA测序的化学降解法。以传统的链终止法和化学降解法为原理的DNA测序法[11]均称为第一代DNA测序技术（thefirst-generationDNAsequencing）。第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划(Humangenome[12]project，HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。2.1.1Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法又称为Sanger法。在DNA聚合反应体系中加入一定比例的2’，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为终止剂，2’脱氧核苷三磷酸（dNTP）和2’，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）结构相似，只是ddNTP的核糖基3’-碳原子上连接的是氢原子而不是羟基。由于DNA聚合酶无法识别两者之间的区别，ddNTP可以掺入到新合成的单链中，掺入后使其不能与下一个核苷酸（dNTP或ddNTP）形成磷酸二酯键，则合成的新链被终止，终止点由反应中相应的双脱氧核苷三磷酸而定。将同一种待测的DNA模板、引物（经过放射性同位素标记）、DNA聚合酶I、四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）加入四个反应管中，同时往四个反应管中分别加入不同的2’，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP：ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP）。经过反应后，将会产生一系列不同长度的DNA片段混合物，它们都具有相同的5’端和带有ddNTP的3’端。将四个反应体系合成的DNA片段在同一块聚丙烯酰胺凝胶上进行变性电泳，DNA片段就会按照不同的长度分离，形成阶梯状区带。将凝胶电泳区带显影后可获得DNA图谱。从DNA图谱上即可读出待测DNA的碱基序列。由于DNA合成的方向是5’→3’，因此DNA链终止的越早，终止位点离5’端越近。所以按照从小到大的顺序读出的是合成片段5’→3’方向的碱基序列，即为待测序DNA的互补序列。3 华南理工大学硕士学位论文2.1.2Maxam-Gilbert化学降解法化学降解法是利用一些特殊的化学试剂对原DNA进行化学降解。不同的化学试剂分别作用于四种不同的碱基，这些碱基经过化学试剂处理后很容易从DNA链上脱落下来，造成DNA链在碱基缺失处的断裂。首先对待测DNA链末端进行放射性标记，再通过五组相互独立的化学反应分别得到部分降解产物，其中每组含不同的特定化学试剂，特异性地针对某一种或者一类碱基进行作用，只要严格控制反应条件，即可使各族中的DNA单链分子在特定的碱基位点上发生降解，使其断裂。因此产生5组不同长度的放射性标记的DNA片段，每组的每个片段都有放射性标记的共同起点，但长度取决于改组反应针对的碱基在原样品DNA分子生的位置。此后各组反应物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通过放射自显影检测末端标记的分子，即可直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。2.2第二代测序技术（Next-GenerationSequencing，NGS）第一代测序技术帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等的大量测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，所以并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，第二代测序技术应运而生。使用Sanger测序技术完成人类基因组计划花费了30亿美金的巨资，用了三年的时间。然而使用第二代Solexa测序技术，完成一个人的基因组测序只需要10天的时间。目前发展得比较广泛[13]的技术是焦磷酸测序、合成测序、连接测序以及芯片测序。2.2.1焦磷酸测序技术[14]454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台，该技术是基于检测DNA合成过程中释放的焦磷酸从而鉴别是否有特定核苷酸整合到DNA的合成链中发展的测序技术。首先，将DNA待测样品经过打断成为小的片段，并且在片段的两端加上不同的接头，通过生物素标记的接头提取单链的DNA，从而构建出单链的DNA文库；这些单链DNA通过接头序列可特异性地连接到不同的磁珠（磁珠上带有大量的与接头序列互补的引物）上，将磁珠放置在油包水的PCR反应体系中，进行乳化PCR（emulsion），获得测序所需量的模板DNA；将这些磁珠连同其上大量扩增的单链DNA转移到含有许多小孔的一种叫做PicoTiterPlate平板（PTP）上，每个小孔只能容纳一个磁珠，然后开始测序反应。在每一轮测序反应中，只有一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)被加入到反应体4 第二章DNA测序技术的介绍系中。如果它刚好能与DNA模板的下一个碱基配对，就会在DNA聚合酶的作用下，被连接到测序引物的3’末端，同时释放出一个焦磷酸分子(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP，在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。此时一个特异的检测峰可以被微弱光检测装置及处理软件检测到，峰值的高低与结合上的碱基数成正比。如果加入的dNTP未能和DNA模板的下一个碱基产生配对，则不会发生上述反应，也就不会出现检测峰。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP会在Apyrase的作用下发生降解。待一轮反应结束后，加入另一种dNTP，重复进行上述反应，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。以上就是焦磷酸测序的整个反应过程。2.2.2Solexa测序技术基于Solexa测序技术的GenomeAnalyzer测序仪于2006年由Solexa公司开发，[15]该测序系统采用DNA分子簇、桥式PCR（bridgePCR）和可逆阻断等核心技术，以边合成边测序的方式（sequencebysynthesis，SBS），按“去阻断→延伸→激发荧光→切割荧光基团→去阻断”循环的方式按顺序读取模板DNA片段上的碱基序列信息。测序时向反应体系中同时添加接头引物、DNA聚合酶以及四种具有特异性荧光标记的dNTP。由于这些dNTP的3’羟基被化学方法保护，因此每轮合成反应都只能向合成链上添加一个dNTP。当dNTP被添加到合成链之后，未使用的游离dNTP和DNA聚合酶都会被特定的试剂洗脱掉。再加入荧光激发所需要的缓冲液，并激光激发使其产生荧光信号，利用光学检测设备完成荧光信号的收集，再通过计算机分析后转换成相应的序列结果。2.2.3SOLiD测序技术在2007年10月SOLiD测序系统正式投入商业使用，它是基于连接酶测序法，即利[16]用DNA连接酶在连接过程中进行测序的。在测序反应时，并没有常规的在聚合酶作用下的DNA合成反应，模板链的延伸是在测序引物的末端连接一段寡核苷酸，并且持续延伸多次。SOLiD测序技术在序列读取方面是依赖于寡核苷酸测序探针的设计和标记方式。测序时向体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和具有3’-XXnnnzzz-5’结构的8聚核苷酸测序探针。在这个8聚核苷酸中，3’端第1和第2位（XX）上的碱基是确定的，也是用来测定模板序列的；5’端可分别标记“Cy5，TexasRed，Cy3，6-FAMTM”45 华南理工大学硕士学位论文种颜色的荧光染料，第1和2位核苷酸序列与5’端的荧光标记的种类相对应，通过“双碱基编码矩阵”规定了16中双核苷酸排序和4中荧光标记颜色的对应关系，并由这两个核苷酸的序列来判读模板的序列，这种由两个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序（twobaseencoding）。探针3’端第3-5位的“n”表示随机序列的核苷酸，6-8位的“z”指的是可以和任何碱基配对的特殊碱基。由此可以看出，SOLiD连接反应中的探针是多种不同序列的寡核苷酸混合物。在SOLiD测序反应中，首先由测序引物与模板退火，然后测序探针中的一种8聚核苷酸的第1和第2位与模板配对从而在连接酶的作用下与测序引物连接，此时会发出5’端对应的荧光信号。在记录下荧光信息后，通过化学方法在测序探针的第5和第6位之间进行切割，猝灭荧光信号。然后进行第二次测序连接反应，共进行5-7次反应。通过这种方法，每次测序的位置都相差五位，即第一次测第1和第2位，第二次测第6和第7位，以此类推。在测到末尾后，将新合成的连变性、洗脱。而后用通用测序引物n-1进行第二轮测序连接反应。通用测序引物n-1与通用测序引物n的差别是，二者在与模板DNA配对的位置上相差一个碱基。因此在加入DNA连接酶和8聚核苷酸探针后，可以测定第0位和第1位、第5位和第6位等位置的序列。第二轮测序完成后，接下来再分别加入通用测序引物n-2、n-3和n-4进行第三轮、第四轮和第五轮测序连接反应，最终可以完成全部位置的测定，并且每一个位置均被测定了两次。最后，通过荧光信号分析比对，得到模板DNA的核苷酸序列。2.2.4半导体测序技术2.2.4.1半导体测序原理2010年，LifeTechologies公司推出了基于离子肼（iontorrent）的IonPersonal[17]GenomeMachine（IonPGM）测序仪。它的设计是基于半导体芯片技术，在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后按一定顺序掺入无需标记的A、T、C、G的dNTP流。在DNA聚合酶的作用下，随着每个配对碱基的掺入，新生链中每加入一个碱基就会相应释放出一个氢离子，这些氢离子在它们穿过半导体芯片孔底部时能被检测到，从而实现边合成边测序的目的。在自然状态下，DNA在细胞内合成的时候，新生链中每加入一个碱基就会相应释放出一个氢离子。IonTorrent采用半导体芯片技术，在半导体芯片中有许多微孔，每个6 第二章DNA测序技术的介绍微孔中固定着不同的单链DNA模板。此外，在测序芯片微孔的底部紧连着离子敏感层和一个离子感应层，用于感应反应中是否释放出了氢离子。测序时采用的是边合成边测序的策略。DNA聚合酶和dNTP按照一定的顺序添加进去，在每个微孔中以固定的DNA单链为模板进行DNA合成，当反应中有一个碱基掺入，会有一个氢离子释放出来。氢离子的释放会改变体系中的离子浓度，从而改变体系中的pH值。pH值的微量改变会被微孔下的离子感应器检测到，并将离子信号转变为数字信号，从而在测序仪上直接读出掺入的碱基。一个反应过后对芯片进行冲洗，再进入下一个循环。如果下一个循环中，加入的碱基在模板中没有配对，则新生链中不会有新碱基的掺入，那么就不会有氢离子的释放和pH值的改变，最后在测序仪上体现出平稳的曲线。如果在一个循环中，模板链中有两个连续相同的碱基，则在新生链中会有两个新碱基的掺入，那么释放出来的氢离子也会加倍，这样引起的pH值的改变也会加倍。最后在测序仪上体现出一个2倍高度的峰。2.2.4.2半导体测序工作流程IonTorrentProton的操作流程主要分为文库制备、模板制备、芯片测序及信息分析四个步骤。文库制备首先将样本DNA切割成为含有约数百个碱基的片段，将两个特定的IonTorrent接头（接头A和接头P）分别连接到DNA片段的两端，形成具有两个不同接头的DNA文库。经过末端修复、片段筛选等步骤后得到长度一定的DNA片段。若片段数量较少，则可通过PCR扩增以获得足够的模板文库。模板制备双链DNA片段通过其中一端接头A固定在离子微球颗粒（IonSphereParticles,ISP）上，被扩增试剂乳化，进行油包水的PCR扩增，直至模板DNA布满整个ISP。然后将另一端接头P连接到磁珠上，固定在磁力架上进行洗脱纯化以及NaOH变性，解开DNA双链。如此，每个ISP上均携带有数百个相同序列的单链DNA片段。芯片测序将携带有模板的ISP转移到Ion芯片，放入Proton仪器测序。按照一定的顺序掺入G、C、A、T的dNTP流，在引物与DNA聚合酶的共同作用下，当dNTP+与模板结合，即释放相应数量的H，位于芯片下方的传感器会检测到相应的pH值变化并识别出相应的碱基。每次dNTP流经过后都会有一个洗脱的过程，将未反应的dNTP洗脱掉。数据分析IonTorrentProton测序仪上产生的数据，将会被自动传输到IonTorrent自带的服务器上进行分析。通过信号处理以及特定的碱基算法分析，即可产生单次读长相关的DNA序列。7 华南理工大学硕士学位论文2.2.4.3半导体测序的特点2.2.4.3.1拓展性强IonTorrent的半导体芯片中含有微孔，测序反应体系在微孔内进行。IonTorren测序+反应是将DNA聚合反应中释放出的H所产生的化学信号转化为数字信号的过程。因此半导体芯片的传感器的密度决定了测序仪的通量。IonTorrent测序仪配有型号为Ion314、Ion316及Ion318等多种不同芯片以满足不同通量的要求。2.2.4.3.2准确度高[17]RbothbergJM等对测序准确度的评估显示，前50个碱基测序准确度可达99.569%+0.001%，与其他光学测序法的准确度相接近；前100个碱基测序的准确度为98.897%+0.001%，高于其他光学测序法；对连续5个相同碱基的重复序列，测序准确度为97.328+0.023%，高于焦磷酸测序法。该项研究结果表明：IonTorrent测序技术具有极高的准确性。2.2.4.3.3覆盖率均匀导致覆盖率偏倚的原因有级联酶反应、核苷酸的修饰和复杂的光学检测方法等。与其他二代测序技术不同，IonTorrent由于合成反应和检测方法简单，不需上述步骤，因此覆盖率十分均匀。研究表明，用314型芯片对大肠杆菌DH10B进行简单的测序循环，[18]G+C含量变化对测序覆盖率无明显影响。2.2.4.3.4快速、经济且便捷[19]因IonTorrent系统直接记录碱基的合成过程，测序与数据分析实时进行。每个碱基的合成测序需要时间约4S，1h就能完成一条100~200bpDNA片段的完整。标准测序时间仅为3h，24h内可完成6~8轮实验。因不需特殊修饰dNTP和昂贵的光学设备，极[20]大地降低测序成本。其约为5万美元的售价是其他主流二代测序仪售价的十分之一。IonTorrent测序仪器优点明显：集成度高，操作简便且对操作人员要求较低；不同密度的芯片可以分别满足低、中、高不同通量测序对象的需求，因而更容易在普通实验室中普及。2.2.4.3.5局限性当连续的单碱基重复出现在待测模板链上时，相应的dNTP溶液流过将造成多个碱基的合成，会使得成倍的H+随之释放，导致单一循环内微孔溶液检测到的pH值大幅度降低，传感器输出的电信号强度增加，但处理器检测检测碱基重复数目的准确度则大大[21]降低，从而影响对其重复序列的检测效能。8 第二章DNA测序技术的介绍2.3第三代测序技术近来能实现单分子测序的技术不断发展，这些相关的测序技术被称为第三代测序技术。与前两代技术相比，它们最大的特点就是可以实现单分子测序（Singlemoleculesequencing，SMS），对于那些稀有样本的测序方面具有无可替代的优势。2.3.1并行单分子合成测序技术[22,第一个设计并且开发单分子测序方法技术平台的公司是HelicosBiosciences23][24]，其主要是基于边和成边测序的思路。在测序时首先将待测的DNA片段随机打断成小片段并在3’末端加入polyA，在接头的末端用末端转移酶加上Cy3荧光标记，同时在平板上固定多个具有寡聚polyT的引物，然后将小片段与平板的polyT引物进行杂交，从而将测序模板固定在平板上。测序时，逐一加入具有Cy5荧光标记的单色末端终止子及DNA聚合酶和混合液进行DNA合成反应。将未参与合成的末端终止子和DNA聚合酶洗脱。利用全内反射显微镜检测每一步延伸反应是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种终止子。然后用化学试剂切开荧光标记和抑制基团以便进行下一轮反应。经过不断地掺入、合成、洗脱、检测和切除的循环实现实时测序。2.3.2单分子实时合成测序技术HelicosBiosciences公司虽然是第一个成功开发了单分子测序技术的公司，但将这项技术成功地进行商业化的是PacificBiosciences公司推出的单分子实时DNA测序仪（SMRT）。SMRT技术也是基于边和成边测序的思路，以SMRT芯片为测序的载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多零模式波导孔（zero-modewaveguides，ZMW）的厚度为100nm的金属片，ZMW则是一种直径只有几十纳米的微孔。将待测序列、DNA聚合酶和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部进行聚合反应。与其他技术相比，其最大的特点是荧光标记的位置不在碱基上而是在磷酸基团上。当每一个dNTP结合到合成链上的同时，被不同荧光标记的dNTP会进入ZMW孔的荧光信号检测区并且在激光束的激发下产生荧光，根据荧光的种类就可以判定结合到合成链上的dNTP的种类。此外由于dNTP在它进入和离开的时间（微秒级）与荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）相比会很短，所以信号会很大。其他未参与合成的dNTP由于没进入荧光信号检测区因此9 华南理工大学硕士学位论文不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。SMRT技术的测序速度[19]具有很大优势。利用这种技术进行测序，速度可以高达每秒10个碱基。2.3.3纳米孔单分子测序技术OxfordNanoporeTechnologics公司研发的测序技术完全不同于前两种。纳米孔单分子测序技术是一种基于电信号测序的技术。该技术核心就是在一个微孔上放置其中一面含有一对电极的特殊的脂质双分子层，很多由α-溶血素蛋白组成的纳米孔分布在该双分子层中并且结合了一个核酸外切酶。当DNA模板进入每个孔道时，孔道中的核酸外切酶会“捕捉”DNA分子，利用核酸外切酶顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时会与孔内的环糊精相互作用，短暂影响流过纳米孔的电流强度。根[25]据阻断电流的变化就能识别出相应碱基的种类，最终得到待测DNA分子的序列。10 第三章材料与方法第三章材料与方法3.1实验材料3.1.1主要试剂与耗材序号试剂耗材名称型号/规格厂家1医用级无水乙醇500mL西陇化工NextMicrobiomeDNA250prepsNEBEnrichmentKit3QIAampDNAMiniKit50prepsQIAGEN4TIANampMicroDNAKit50preps天根生化科技5AgencourtAMPureXP450mLBeckman6Nuclease-FreeWater150mLPromega7T4PolynucleotideKinase1500μLEnzymatics8dNTPSolutionSet750μmol/包Enzymatics9T4DNAPolymerase1500μLEnzymatics10XT4PNKreaction101500μLEnzymaticsbuffer11KlenowFragment300μLEnzymatics12ATP25μmolFermentas13T4DNALigase1500μLEnzymatics1410XLigationbuffer1500μLEnzymatics15PEAdapter250pmol/μLInvitrogen16Barcode250pmol/μLInvitrogen1710xPfxamplicationbuffer250rxnsInvitrogen18MgSO4250rxnsInvitrogen19T-PCR-A250pmol/μLInvitrogen20Plamp250pmol/μLInvitrogenPlatinumPfxDNA21250rxnsInvitrogenpolymeraseMilliporeAmicon®Ultra2296个/盒MILLIPORE超滤离心管测序反应通用试剂盒（半238RUNS华大制造导体测序法）V424一次性鞋套200双/包新乡市华西卫材25无粉乳胶手套M/S施睿康26一次性口罩20个/包新乡市华西卫材27一次性PE手套M新乡市华西卫材28医用帽10*1新乡市华西卫材2910μL透明吸头1000个/包AXYGEN30200μL黄吸头1000个/包AXYGEN11 华南理工大学硕士学位论文311000μL蓝吸头1000个/包AXYGEN321.5mL离心管1000个/盒AXYGEN3350mL离心管25个/包CORNING340.2mLPCRTubes1000个/盒AXYGEN3.1.2主要仪器与设备序号仪器名称型号厂家1ESCO生物安全柜CLASSⅡTYPEB2ESCO2高速冷冻离心机Centrifuge5430REppendorf3微量恒温器HW-8C绍兴市卫星医疗设备4掌氏离心机LX-200海门其林贝尔5漩涡振荡器QL-901海门其林贝尔台式高速离心机H1650湘仪6垂直混合仪HS-3SCIENIZ7PCR仪ABI9700ABI8数显干式热双模块D1200-230VLabnetSteponePlusReal-Time9Q-PCRABIPCRSystem102100生物分析仪Agilent2100BioanalyzerAgilent11荧光定量仪Qubit3.0LifeTechnologies12测序仪BGISeq-100LifeTechnologies132.5μL单道移液器EppendorfResearchEppendorf1410μL单道移液器EppendorfResearchEppendorf1520μL单道移液器EppendorfResearchEppendorf16100μL单道移液器EppendorfResearchEppendorf17200μL单道移液器EppendorfResearchEppendorf181mL单道移液器EppendorfResearchEppendorf19海尔冰箱HYCD-205海尔20海尔冰柜DW-25W518海尔21磁力架16孔DynaMag2LifeTechnology22舒适型恒温混匀仪1.5mLEppendorf3.2样本的采集、保存和运输3.2.1样本的采集和保存3.2.1.1血液按标准的外周血采集操作抽取外周血，成人的抽血量为大于等于5mL，婴幼儿的12 第三章材料与方法抽血量为大于等于1.5mL；采集完毕后，轻轻颠倒混匀避免凝固或溶血，4℃放置，4小时以内分离血浆，切勿冷冻（防止溶血）。血浆于-20℃保存时间不超过一周，-80℃可长期保存。3.2.1.2胸水/腹水取样量不少于10mL，取样后样本应置于无菌、干燥、洁净的塑料冻存管中，于-20℃保存时间不超过一周，-80℃可长期保存。3.2.1.3脑脊液取样量为3-5mL，取样后样本应置于无菌、干燥、洁净的塑料冻存管中，于-20℃保存时间不超过一周，-80℃可长期保存。3.2.1.4痰液一般以晨痰为佳，取样量3-5mL，取样后样本应置于无菌、干燥、洁净的塑料冻存管中，于-20℃保存时间不超过一周，-80℃可长期保存。3.2.1.5唾液取样量5-10mL，取样后样本应置于无菌、干燥、洁净的塑料冻存管中，于-20℃保存时间不超过一周，-80℃可长期保存。3.2.1.6肺泡灌洗液取样量3-5mL，取样后样本应置于无菌、干燥、洁净的塑料冻存管中，于-20℃保存时间不超过一周，-80℃可长期保存。3.2.1.7鼻/咽拭子以早晨起床后采集为宜。取咽拭子标本时，患者应先用生理盐水或温开水漱口2-3次。每位患者应取两份拭子，通过挤压或振荡的方式分别将其溶于1.5ml生理盐水中，500rpm离心5min收集溶解物。每位患者的两份标本将分别编号标记并保存，于-20℃保存时间不超过一周，-80℃可长期保存。3.2.1.8注意事项：采集与保存过程中应保持无菌操作，避免杂菌污染；采集样本时需在样本信息表上填写详细的临床信息，并尽可能多的收集信息，以便对检测结果的解读；最佳采集时间为患者入院当日或应用抗生素之前，每例病患都应尽量留有两份样本，即入院时的标本和治疗2天后的标本，考虑到肺泡灌洗液一般取一次，因此在入院做检查取得，治疗后如能取到就再加一份；13 华南理工大学硕士学位论文取样部位重点考虑感染部位的样本，若无明显感染部位，则主要考虑血液。3.2.2样本的运输样本应采取干冰运输，样本运输前应严格按要求包裹，避免样本污染或外泄，同时确保样品在送达接收地点时有足量的干冰剩余。3.3实验方法3.3.1样本前处理3.3.1.1痰液液化将同一份痰液分成3等份后，分别采用以下3种方法进行液化处理。液化完成后使用QIAampDNAMiniKit试剂盒进行核酸提取，并对核酸提取物进行定量。表3-1痰液液化方法编号主要成分液化条件10.5%二硫苏糖醇室温震荡20.5%二硫苏糖醇，25%乙醇，0.02%聚乙二醇，0.003%利福平室温震荡30.5%胰蛋白酶37℃震荡3.3.1.2样本浓缩以Millipore超滤管（UFC806024，AmiconUltra，30kDa）对样本进行浓缩处理，增加单位体积内的病原数。3.3.2降低宿主核酸3.3.2.1试剂盒去宿主核酸使用3份不同宿主比例的模拟样本，唾液与多种细菌混合液分别按5:1（样本1）、10:1（样本2）、50:1（样本3）比例混合，每份样本均分两小份，一份使用NEBNextMicrobiomeDNAEnrichmentKit试剂盒进行去宿主处理（MBD2-Fc+），另外一份未做去宿主处理（MBD2-Fc-）。处理完后以16sRNA为参照基因，h19为目的基因，通过实时荧光定量PCR的方法检测宿主核酸的相对比例，并且使用Proton进行测序验证。3.3.2.2过滤法去宿主细胞14 第三章材料与方法同样使用3份不同宿主比例的模拟样本，唾液与多种细菌混合液分别按5:1（样本1）、10:1（样本2）、50:1（样本3）比例混合，每份样本均分两小份，一份用5μm孔径的过滤器对样本进行去宿主处理（BRH+），另外一份不做去宿主处理（BRH-）。样本处理完后以16sRNA为参照基因，h19为目的基因，通过实时荧光定量PCR的方法检测宿主核酸的相对比例，并且使用Proton进行测序验证。3.3.3DNA提取3.3.3.1细菌DNA提取用QIAGEN公司的QIAampDNAMiniKit（51304）和天根公司的微量样品基因组提取试剂盒（DP316）两种试剂盒对痰液和肺泡灌洗液样本进行核酸提取，通过Qubit3.0定量评估其提取效果。3.3.3.2真菌DNA提取采用溶壁酶裂解法（加600ul山梨醇缓冲液：1mol/L山梨醇、100mmol/LEDTA、14mmol/Lβ-巯基乙醇，200U溶壁酶，30℃30min，300g离心10min，沉淀用180ulATL重悬）、SDS裂解法（加400ulSDS提取缓冲液，65℃水浴45min，10000g离心5min，取上清）、超声破碎法（加600ul山梨醇缓冲液，加入超声处理器中180W60s）三种方2345法分别对拷贝数为10、10、10、10四个梯度的白假丝酵母菌处理后，使用QIAampDNAMiniKit试剂盒进行DNA提取，再进行实时荧光定量PCR检测。3.3.4病原建库3.3.4.1磁珠比例优化使用临床痰液提取的DNA样本，根据已有的常规实验流程和商业化磁珠使用手册，末端修复后纯化分别选择1.8倍、1.6倍和1.4倍AgencourtAMPureXP磁珠纯化，接头连接后选择1.2倍和1.1倍磁珠纯化进行建库比较。出库后的文库使用Agilent2100检测对比结果。3.3.4.2片段选择对比切胶（E.Z.N.A.TMGelExtractionKit）选择和磁珠（AgencourtAMPureXP）选择两种片段选择方法对PCR后的DNA进行选择纯化后使用Agilent2100检测对比结果。15 华南理工大学硕士学位论文3.3.5信息分析将低质量的reads和能与人源序列匹配的Reads从从测序所得数据中过滤掉；将未能与人源序列匹配的Reads分别与细菌、病毒及真菌数据库比对，并且将比对结果输出。主要包括：GenBankID（基因ID），Species（物种），Coverage（覆盖度），CovRate（覆盖比例），Depth（深度），AllReads（所有匹配片段），UniqueReads（唯一匹配片段）。3.3.6报告解读样本经过华大基因自主研发的信息分析软件进行生物信息学分析，得到临床样本中微生物的分布结果，根据coverage进行排序，主要对排名前20位的病原菌进行关注。然后挑选Uniquereads大于10条的病原菌作为候选菌，再查找相关文献或数据库，以确定候选菌是否具有感染性。然后将相对排名较高的具有感染性的可能致病菌列为疑似病原，并且在正式报告中列出检出疑似致病菌的相关信息。3.3.7敏感性测试取临床检验结果为阴性的肺泡灌洗液样本（来源于中山医科大学附属第一医院）和菌株或病毒样本（来源于广州医科大学附属第一医院）按照下表比例混合后，用本检测技术进行高通量测序检测。表3-2敏感性测试样本混合比例样本编号菌株/病毒类型信息菌株/病毒浓度UPIS0017-1嗜麦芽窄食单胞菌S.Maltophilia10000copies/mLUPIS0018-1~5嗜麦芽窄食单胞菌S.Maltophilia1000copies/mLUPIS0019-1~5嗜麦芽窄食单胞菌S.Maltophilia100copies/mLUPIS0020-1~5嗜麦芽窄食单胞菌S.Maltophilia50copies/mLUPIS0021-1~2嗜麦芽窄食单胞菌S.Maltophilia10copies/mLUPIS0022-1嗜麦芽窄食单胞菌S.Maltophilia1copies/mLUPIS0023-1屎肠球菌E.Faecium10000copies/mLUPIS0024-1~5屎肠球菌E.Faecium1000copies/mLUPIS0025-1~5屎肠球菌E.Faecium100copies/mLUPIS0026-1~5屎肠球菌E.Faecium50copies/mLUPIS0027-1~2屎肠球菌E.Faecium10copies/mLUPIS0028-1屎肠球菌E.Faecium1copies/mL16 第三章材料与方法UPIS0035-1~5EBV病毒10000copies/mLUPIS0038-1~5EBV病毒1000copies/mLUPIS0039-1~5EBV病毒500copies/mLUPIS0040-1~2EBV病毒100copies/mL3.3.8重复性测试使用50copies/mL的嗜麦芽窄食单胞菌和屎肠球菌、1000copies/mL的EBV，分别从核酸提取起对本检测技术进行5次批间重复，从建库起进行了3次批间重复及3次批内重复测试。3.3.9特异性测试将标准的嗜麦芽窄食单胞菌、屎肠球菌和EBV投放阴性样本中进行检测。根据测试结果检验该检验方法的特异性。3.3.10准确性测试取来源于多个医院的58例临床样本，用本检验方法进行测试。与临床检验结果进行对照判断本方法的准确性。17 华南理工大学硕士学位论文第四章技术流程确立及方法学验证4.1检测技术的流程确立4.1.1痰液液化处理方法优化在诸多实验样本类型中，痰液的构成是最为复杂的。由于痰液中的粘液较多，其中的酸性糖蛋白会对提取痰液中的DNA造成极大的影响。因此对痰液进行液化处理的效[26]果会直接影响到所得DNA的总量。二硫苏糖醇（DTT）法，由桥木等人首先应用，[27]同时也有许多资料表明其对痰液液化有较好的效果。本研究中对比了DTT法、Saccomanno液联合DTT法和酶解法，结果如表4-1所示。每组实验均进行三例重复试验取平均值进行比较。表4-1痰液液化方法效果比较编号耗时平均核酸核酸A260/280总量（ng）130min32461.802230min33541.7993120min35281.850根据实验结果可看出方法3处理痰液能提高所得核酸的总量，方法1和方法2没有显著差异。虽然酶解法提出的DNA会比DTT法高约10%，但其操作耗时是DTT法的4倍，同时成本方面也是DTT法的数倍。由于本研究开发的是用于商业用途，因此综合考虑时间、成本以及液化效果各方面的因素，方法1（即：0.5%二硫苏糖醇）比较理想（耗时短、低成本、所得核酸与其余两个方法相比无显著差异），后续实验均采用该方法进行痰液的液化。4.1.2样本浓缩技术研究部分样本（如鼻咽拭子、脑脊液）中病原浓度极低，这样的情况不利于病原体的检出。因此需要对样本进行浓缩处理，较少因浓度不足而导致实验失败。本研究通过使用millipore超滤管对样本进行浓缩，实验证明其浓缩倍数可以高达10倍左右。18 第四章技术流程确立及方法学验证4.1.3降低宿主核酸方法确定在临床样本中通常含有大量人体细胞和核酸，而病原含量很少（低于1%）。这些体细胞以及核酸会对后续测序所得到可分析的有效数据量影响较大。因此通过去宿主处理的方法提高病原核酸的比例对于增加检测的准确性、灵敏性，和降低检测成本均具有重要作用。本研究在降低宿主干扰方面主要从核酸和细胞两个层面上开展。从核酸层面上，采用NEBNextMicrobiomeDNAEnrichmentKit的方法进行人源性核酸的去除测试，其原理是人源核酸存在大量甲基化位点，将能特异性结合甲基化位点的蛋白结合(MBD2-Fc)到磁珠，然后通过该蛋白结合甲基化核酸，再通过磁珠吸附的方式分离出甲基化核酸，从而达到人源核酸和病原核酸分离的目的。而另一方面，从细胞层面方面考虑，由于细菌直径大小一般不超过5μm，病毒则更小，而人体细胞一般为20-30μm，因此采用5μm孔径滤膜通过过滤的方法分离病原体与人细胞。两种方法的比较结果如下：采用NEB试剂盒处理过程耗时约40min/样本。实时荧光定量PCR结果如下图所示：12010010010010080605140222070MBD2-Fc-MBD3-Fc+MBD2-Fc-MBD3-Fc+MBD2-Fc-MBD3-Fc+样本1样本2样本3图4-1NEB试剂盒去宿主核酸Real-timeRCR结果从图中的实时荧光定量PCR结果显示，3个不同宿主比例的样本经过试剂盒处理后，宿主含量均有明显的下降。测序结果如下表所示：19 华南理工大学硕士学位论文表4-2NEB试剂盒去宿主核酸测序结果比较样本编号处理条件Reads总数宿主百分比细菌百分比MBD2-Fc-6,264,83465.1134.44样本1MBD3-Fc+6,909,95827.7671.30MBD2-Fc-5,948,54991.827.41样本2MBD3-Fc+6,952,01781.9216.26MBD2-Fc-6,732,21896.2313.75样本3MBD3-Fc+7,959,13686.7813.12测序结果显示，试剂盒法对于高病原体浓度的样本去宿主比例能达到37.35%；对低病原体浓度的样本去宿主比例为9.45%。3份经去宿主处理的样本，其去宿主前后宿主比例的变化趋势与实时荧光定量PCR结果一致，表明NEB试剂盒能去除一定比例的宿主核酸。用过滤法处理耗时约为20min/组样本（18-30例）。实时荧光定量PCR结果如下图所示：120100100100100806048.214027.272014.160BRH-BRH+BRH-BRH+BRH-BRH+样本1样本2样本3图4-2过滤法去宿主核酸Real-timePCR结果从图中的实时荧光定量PCR结果显示，3个不同宿主比例的样本经过过滤法处理后，宿主含量均有明显的下降。测序结果如下表显示：20 第四章技术流程确立及方法学验证表4-3过滤法去宿主核酸测序结果比较样本编号处理条件总Reads数宿主百分比细菌百分比BRH-6,264,83465.1134.44样本1BRH+7,810,65129.0269.75BRH-5,948,54991.827.41样本2BRH+10,257,78564.9530.81BRH-6,732,21896.233.75样本3BRH+10,622,32387.9911.88从测序结果来看，过滤法对高病原体浓度的样本去宿主比例能达到36.09%；对低病原体浓度的样本去宿主比例为8.24%。3份经去宿主处理的样本，其去宿主前后宿主比例的变化趋势与实时荧光定量PCR结果一致，表明过滤处理能去除一定比例的宿主核酸。综合上述测试结果，两种方法在去宿主方面均能起到一定的作用，且去除宿主的效果相差不大。综合考虑成本和耗时，后续实验均选用过滤法做去除宿主处理。4.1.4DNA提取方法确立4.1.4.1细菌DNA提取方法确立传统的核酸提取方法主要是先通过物理或化学方法（如超声裂解、碱裂解、酶裂解等）破碎细胞，再使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀或异丙醇沉淀等方法获得核酸。但传统方法操作步骤多，耗时长，人为因素对结果影响较大，因此不适合大规模的提取实验。目前，商业化提取试剂盒已非常成熟，相对于传统方法更适合于提取检测的需要。通过对比了当前评价比较好的两款试剂盒，QIAGEN公司的QIAampDNAMiniKit（51304）和天根公司的微量样品基因组提取试剂盒（DP316），分别用这两种试剂盒对痰液和肺泡灌洗液样本进行核酸提取，通过Qubit3.0定量评估其提取效果，结果如下：表4-4不同提试剂盒核酸提取效果比较样本类型提取量提取量（QIAGEN试剂盒）（天根试剂盒）痰液3950ng3780ng肺泡灌洗液305ng340ng从提取效果来看，两种方法并没有明显差距，且两者耗时相近。但从成本考虑，QIAGEN试剂盒的价格为天根试剂盒的2倍左右，故后续研究实验主要选择天根微量样品21 华南理工大学硕士学位论文基因组提取试剂盒（DP316）。4.1.4.2真菌DNA提取方法探究由于真菌的细胞壁坚韧而且成分复杂，难以充分裂解，会导致核酸提取难度大大增加，影响到测序检测的灵敏度，因此需要探索有效的提取真菌核酸的方法。目前，已知裂解真菌细胞壁的方法主要包括物理法（如：超声裂解、液氮冻融）和化学法（如：酶消化、SDS裂解）。本研究主要采用溶壁酶裂解法、SDS裂解法、超声破碎法三种方法比较提取不同浓度白假丝酵母菌的核酸，并通过实时荧光定量PCR检测提取效率。设置不同浓度梯度的真菌模拟样本，经过不同方法处理后，再进行核酸提取，其中试剂盒使用QIAampDNAMiniKit试剂盒进行提取，再进行实时荧光定量PCR检测，检测结果见下表：表4-5不同方法提取真菌核酸结果对比样本Ct值2345真菌含量copies10101010酶解+试剂盒提取38.5236.6935.4927.38SDS裂解+试剂盒提取38.1636.96—32.98超声打断+试剂盒提取36.96—35.64—试剂盒提取37.44—37.5734.84以上数值为3次重复的平均值。Ct值越小模板含量越高，Ct值大于35可将模板视为0。从上述结果可以看出，酶解法的效率相对较好，但所有方法获得的核酸含量均很低，无法满足实时荧光定量PCR定量的检测限要求，即目前还未找到有效提取真菌核酸的方法。因此，本研究先以细菌和DNA病毒为主进行技术开发，后续研究中再改进补充RNA病毒与真菌方面的方法。4.1.5病原建库方法优化4.1.5.1建库方法的确定一般感染类病原体可分为细菌、真菌和病毒，其中细菌和真菌核酸为DNA，病毒包括DNA病毒和RNA病毒，即DNA类型病原体占多数，另外由于DNA比RNA更稳定，RNA操作过程中易降解，建库过程也需要更多的优化。因此，本研究首先选择DNA建库方式，在较短时间内完成大多数病原体的检测，RNA建库方式将在后续研究中进一步摸索完成。4.1.5.2建库流程的优化22 第四章技术流程确立及方法学验证4.1.5.2.1磁珠比例的优化由于末端修复后核酸片段大小与接头连接后不同，因此这两步磁珠纯化的磁珠用量需要进一步的确定。根据末端修复后纯化分别选择1.8倍、1.6倍和1.4倍磁珠纯化，接头连接后选择1.2倍和1.1倍磁珠进行比较。对上述两个步骤分别按手册中的不同磁珠比例进行组合完成建库后，文库的Agilent2100检测结果如下图所示：（1.4倍、1.6倍、1.8倍）末端修复后纯化+1.2倍连接后纯化（1.4倍、1.6倍、1.8倍）末端修复后纯化+1.1倍连接后纯化23 华南理工大学硕士学位论文图4-3接头连接与末端修复后不同比例磁珠下的文库构建情况比较从图中可以看出在末端修复后纯化使用1.6倍和1.8倍磁珠的结果类似，但是1.4倍磁珠纯化的文库浓度有降低的趋势，因此使用1.6或1.8倍较为合适。而从成本方面考虑，优先选择1.6倍的磁珠量对末端修复后核酸进行纯化。接头连接后纯化使用1.2倍和1.1倍磁珠对文库浓度影响不大，但1.2倍磁珠纯化后的文库片段大小比1.1倍纯化后的略大，考虑到文库主峰偏小的情况，接头连接后的纯化优先采用1.2倍磁珠纯化。综上所述，建库过程中磁珠纯化的最佳配比为末端修复后优先采用1.6倍体积磁珠纯化，接头连接后优先采用1.2倍体积磁珠纯化。4.1.5.2.2片段选择方法选择建库过程中由于片段过短的序列在拼接的过程中容易出现较低的评分而被过滤掉，过长的片段机器无法检测超出范围的部分，因此需要对文库进行片段选择。目前主流的片段选择方式有两种，分别是切胶选择和磁珠选择。切胶选择的原理是通过琼脂糖凝胶电泳后对目标片段进行切胶纯化。磁珠选择原理是：第一步加入一定比例的磁珠用于吸附大片段，而目的片段存留于上层清液中，分离磁珠和上清液后，第二步在上清液中加入一定比例磁珠用于吸附目的片段，再洗涤磁珠、晾干，后加入洗脱液洗脱，即可获得所需目的文库。根据切胶试剂盒标准操作切胶选择与磁珠片段选择的文库结果对比如下所示：切胶法片段选择24 第四章技术流程确立及方法学验证磁珠法片段选择图4-4片段与未片段化处理后的文库构建效果比较从上图可以看出，两种方法得到的文库主峰大小相差不大，主要区别在于切胶选择的文库较集中，磁珠片段选择文库在300-400bp间存在的大片段较多。根据Proton测序仪的最长读长为300bp，而超过读长后的区段不会被检出，但大片段部分不会对测序造成明显影响。同时采用电泳后切胶的方式进行片段选择，一般耗时2h左右，若样本量较大则会显著增加实验时间。对比下用磁珠进行片段选择，操作时间可缩短1h以上。因此综合考虑，后续实验中选取磁珠纯化较为符合大规模的实验。4.2检测技术的方法学验证4.2.1敏感性验证通过本项测试来评估本检测技术能检出的病原微生物的最低浓度值（检测限）。通常检测限越低，则检测技术的适用范围越广。本研究利用病原检测结果呈阴性的肺泡灌洗液样本（来源于中山大学附属第一医院）和菌株样本（嗜麦芽窄食单胞菌、屎肠球菌和EBV病毒，来源于广州医科大学附属第一医院）来构建不同病原体浓度的模拟样本，以此进行本检测技术的敏感性测试。其中，以嗜麦芽窄食单胞菌作为革兰氏阴性菌的代表，其测试结果见表4-7。结果显示本检测技术能稳定检测出浓度大于等于50copies/mL的嗜麦芽窄食单胞菌，而未能稳定检出10copies/mL的嗜麦芽窄食单胞菌；以屎肠球菌作为革兰氏阳性菌的代表，其敏感性测试结果见表4-8。结果显示本检测技术能稳定检25 华南理工大学硕士学位论文测出浓度大于或等于50copies/mL的屎肠球菌，而未能稳定检出10copies/mL的屎肠球菌。以EBV病毒作为DNA类病毒微生物的代表，其敏感性测试的结果见表4-9。结果3显示本检测技术能稳定检测出浓度大于等于10copies/mL的EBV病毒，而未能稳定检出500copies/mL及以下浓度的EBV病毒。表4-7嗜麦芽窄食单胞菌（S.Maltophilia）敏感性检测结果样本编号模拟样本信息NGS检测样本编号模拟样本信息NGS检测S.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0017-1检出UPIS0019-5检出10000copies/mL100copies/mLS.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0018-1检出UPIS0020-1检出1000copies/mL50copies/mLS.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0018-2检出UPIS0020-2检出1000copies/mL50copies/mLS.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0018-3检出UPIS0020-3检出1000copies/mL50copies/mLS.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0018-4检出UPIS0020-4检出1000copies/mL50copies/mLS.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0018-5检出UPIS0020-5检出1000copies/mL50copies/mLS.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0019-1检出UPIS0021-1检出100copies/mL10copies/mLS.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0019-2检出UPIS0021-2未检出100copies/mL10copies/mLS.MaltophiliaS.MaltophiliaUPIS0019-3检出UPIS0022-1未检出100copies/mL1copies/mLS.MaltophiliaUPIS0019-4检出100copies/mL表4-8屎肠球菌（E.Faecium）敏感性检测结果样本编号模拟样本信息NGS检测样本编号模拟样本信息NGS检测E.FaeciumE.FaeciumUPIS0023-1检出UPIS0025-5检出10000copies/mL100copies/mLE.FaeciumE.FaeciumUPIS0024-1检出UPIS0026-1检出1000copies/mL50copies/mLE.FaeciumE.FaeciumUPIS0024-2检出UPIS0026-2检出1000copies/mL50copies/mLE.FaeciumE.FaeciumUPIS0024-3检出UPIS0026-3检出1000copies/mL50copies/mLE.FaeciumE.FaeciumUPIS0024-4检出UPIS0026-4检出1000copies/mL50copies/mLE.FaeciumE.FaeciumUPIS0024-5检出UPIS0026-5检出1000copies/mL50copies/mL26 第四章技术流程确立及方法学验证E.FaeciumE.FaeciumUPIS0025-1检出UPIS0027-1检出100copies/mL10copies/mLE.FaeciumE.FaeciumUPIS0025-2检出UPIS0027-2检出100copies/mL10copies/mLE.FaeciumE.FaeciumUPIS0025-3检出UPIS0028-1未检出100copies/mL1copies/mLE.FaeciumUPIS0025-4检出100copies/mL表4-9EBV敏感性检测结果样本编号模拟样本信息NGS检测样本编号模拟样本信息NGS检测EBVEBVUPIS0035-1检出UPIS0038-5检出10000copies/mL1000copies/mLEBVEBVUPIS0035-2检出UPIS0039-1检出10000copies/mL500copies/mLEBVEBVUPIS0035-3检出UPIS0039-2检出10000copies/mL500copies/mLEBVEBVUPIS0035-4检出UPIS0039-3未检出10000copies/mL500copies/mLEBVEBVUPIS0035-5检出UPIS0039-4未检出10000copies/mL500copies/mLEBVEBVUPIS0038-1检出UPIS0039-5未检出1000copies/mL500copies/mLEBVEBVUPIS0038-2检出UPIS0040-1未检出1000copies/mL100copies/mLEBVEBVUPIS0038-3检出UPIS0040-2未检出1000copies/mL100copies/mLEBVUPIS0038-4检出1000copies/mL综上所述，可以确定本研究检测技术对细菌类病原体的检测限为50copies/mL，而3对DNA病毒的检测限为10copies/mL。与市场上常规的检测手段相比，本检测技术对细菌和病毒的检测敏感性明显要高，因此能检测目前常规检测手段因敏感性低而不能或难以检测的样本。这对于在发病期或者是危重病人有着明确的指导意义，对其用药的指导有关键性的作用。但由于在感染性疾病发生的早期，病原微生物仍处于潜伏阶段，因此在血液或者是其他部位中的拷贝数都比较低。因此如何提高本检测技术的最低检出限对疾病早期干预有着重要的意义。后续随技术的不断优化升级，其性能将会变得更为优异。27 华南理工大学硕士学位论文4.2.2稳定性验证稳定性是产品或技术的一项重要的性能指标，一种好的检测技术必须具备良好的稳定性。本研究使用50copies/mL的嗜麦芽窄食单胞菌和屎肠球菌、1000copies/mL的EBV，分别从核酸提取起对本检测技术进行5次批间重复，从建库起进行了3次批间重复及3次批内重复测试。测试结果（见表4-10~4-12）显示，细菌和病毒的批内及批间重复检测的稳定性均>99%，表明了本检测技术稳定可行，符合国家检测技术标准的。表4-10嗜麦芽窄食单胞菌（S.Maltophilia）重复性测试结果样本编号样本类型第1次第2次第3次S.Maltophilia批内重复UPIS0020-5检出检出检出50copies/mL批间重复S.MaltophiliaUPIS0045-1-1~3检出检出检出（建库）50copies/mLS.MaltophiliaUPIS0020-1检出50copies/mLS.MaltophiliaUPIS0020-2检出50copies/mL批间重复S.Maltophilia（DNA提取UPIS0020-3检出50copies/mL开始）S.MaltophiliaUPIS0020-4检出50copies/mLS.MaltophiliaUPIS0020-5检出50copies/mL表4-11屎肠球菌（E.Faecium）重复性测试结果样本编号样本类型第1次第2次第3次E.Faecium批内重复UPIS0026-5检出检出检出50copies/mL批间重复E.FaeciumUPIS0026-5-1~3检出检出检出（建库）50copies/mLE.FaeciumUPIS0026-1检出50copies/mLE.FaeciumUPIS0026-2检出50copies/mL批间重复E.Faecium（DNA提取UPIS0026-3检出50copies/mL开始）E.FaeciumUPIS0026-4检出50copies/mLE.FaeciumUPIS0026-5检出50copies/mL28 第四章技术流程确立及方法学验证表4-12EBV病毒重复性测试结果样本编号样本类型第1次第2次第3次EBV批内重复UPIS0038-6检出检出检出1000copies/mL批间重复EBVUPIS0045-1-1~3检出检出检出（建库）1000copies/mLEBVUPIS0038-1检出1000copies/mLEBVUPIS0038-2检出1000copies/mL批间重复EBV（DNA提取UPIS0038-3检出1000copies/mL开始）EBVUPIS0038-4检出1000copies/mLEBVUPIS0038-5检出1000copies/mL4.2.3特异性验证为评估本检测技术的特异性，本研究将标准的嗜麦芽窄食单胞菌、屎肠球菌和EBV投放阴性样本中进行检测。经过3例的重复试验根据测试结果显示，在加入了上述三种病原体的样本中能有效地检测到检测到相应的病原体核酸序列，而在未添加上述三种病原体的样本中则未检测到任何与其相关的核酸序列。经结果的统计显示，本检测技术的特异性>99%，能够有效地避免假阴性的检测结果。4.2.4准确性验证本研究共检测了来源于多个医院的58例临床样本。其中46例为临床阳性样本（NGS检测结果与临床结果一致的43例，不一致的3例），12例为临床阴性样本（NGS检测结果与临床结果一致的5例，不一致的7例）。为此，本研究进一步对NGS检测结果与临床结果不一致的10例样本进行Sanger验证，验证结果与NGS结果一致，表明NGS检测准确性高于临床检测方法。表4-13为部分样本NGS检测与临床检测结果的对比。表4-13部分临床样本检测结果样本编号样本类型临床检测结果NGS检测结果UPSW14口腔拭子手足口病毒人柯萨奇病毒A10BJ0002UPSW14口腔拭子手足口病毒人柯萨奇病毒A1629 华南理工大学硕士学位论文BJ0003UPIS14G肺泡灌洗液腺病毒7型腺病毒7型Y0001UPIS14G肺泡灌洗液人偏肺病毒人偏肺病毒Y0003UPIS14G肺泡灌洗液阴性阴性Y0004UPSP14S痰液阴性肺炎支原体Z0023UPSP15G痰液溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌Y0043UPSP15G痰液嗜麦芽窄食单胞菌嗜麦芽窄食单胞菌Y0044UPSP15G痰液伯克霍尔德菌伯克霍尔德菌Y0045UPSP15G痰液肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌Y0049UPSP15Z痰液鲍曼不动杆菌鲍曼不动杆菌S0050UPAS15Z腹腔引流液解脲支原体解脲支原体S0002UPSP15G痰液抗酸杆菌结核分枝杆菌Y0051UPSP15G痰液金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌Y0052UPSP15G痰液表皮葡萄球菌表皮葡萄球菌Y0053UPSP15G痰液屎肠球菌屎肠球菌Y0060UPSP15G痰液铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌Y0062UPSP15G痰液副流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌Y0065利用二代测序的方法应用在临床上检测病原微生物是相对比较新颖的一种方法。在数据支持一块相对较少。由于该方法在临床上的推广度不高因此只收集到了58例临床样本。但后续在利用本项技术应用于临床性检测方面仍需大量的数据支持。在应用的早期阶段，需要在本项技术检测的基础之上结合部分的传统检测手段或者是临床的诊断结果相结合以增加支持准确性的相应数据。综上所述，本研究建立的病原体检测技术的特异性和准确性均>99%，能检测病毒、细菌、支原体等病原微生物。通过对比，本项检测技术的准确性高于目前常规的检测方30 第四章技术流程确立及方法学验证法，特别是那些较难检测的病原体，如：肺炎支原体、钩端螺旋体等。本项检测技术对常规检测方法无法检出或难以鉴定病原体的临床感染患者具有非常重要的意义。由于该技术的病原检测范围广、快速及准确等特点，在ICU等临床科室、公共卫生监控方面具有广泛的需求。4.3检测技术的应用至此，整套检测流程已经比较完善。以下是使用该流程检测的一例痰液样本的结果展示：表4-14一例痰液样本信息分析输出结果覆盖唯一匹配中文名拉丁名深度度/%Reads数鲍曼不动杆菌Acinetobacter_baumannii9615342013变栖克雷伯氏菌Klebsiella_variicola161.22463肺炎克雷伯菌Klebsiella_pneumoniae161.22735醋酸钙不动杆菌Acinetobacter_calcoaceticus2.73.81155-Acinetobacter_oleivorans2.13.2830产气肠杆菌Enterobacter_aerogenes1.51.2544副流感嗜血杆菌Haemophilus_parainfluenzae1.21.1136产黑色普氏菌Prevotella_melaninogenica1.21222-Prevotella_oral1.1138产酸克雷伯菌Klebsiella_oxytoca0.871.6267Acinetobacter_phage_YMC/09鲍曼不动杆菌噬菌体79183628/02/B1251_ABA_BP肠杆菌噬菌体Enterobacteria_phage_HK0222.32.816肠杆菌噬菌体Enterobacteria_phage_P11.51.65-Bacillus_phage_BMBtpLA1.210志贺氏菌属噬菌体Shigella_phage_SfIV1.11.31Acinetobacter_phage_YMC-13-16.10-01-C62Acinetobacter_bacteriophage_鲍曼不动杆菌噬菌体18.121AP22Acinetobacter_phage_YMC11/-0.8810012/R2315Human_herpesvirus_1_strain_-0.641617Stx2转换噬菌体Stx2-converting_phage_17170.612针对此例样本，经过与数据库比对得出鲍曼不动杆菌、变栖克雷伯氏菌、肺炎克雷伯菌、醋酸钙不动杆菌、产气肠杆菌、副流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌和产酸克雷伯菌都属于致病菌。而其中鲍曼不动杆菌的覆盖度达到96%，可以判断该菌是主要的病原31 华南理工大学硕士学位论文菌。鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性菌，生长需求简单，在潮湿及干燥表面均可生存，包括医院环境。它是一种条件致病菌，易发感染对象为ICU长期住院病人以及长期使用抗生素后的病人。这个结果将指导医生针对其使用特殊的治疗手段以得到最好的治疗效果。另外可以看出鲍曼不动杆菌噬菌体也存在有一个较高的覆盖度，这可能是在长期治疗的过程中添加的抑菌剂产生的。利用本研究完善的检测流程，对一例在临床上表现为反复头痛，发热以及呕吐10多天的病人的脑脊液样品进行测序检测，其结果如下表所示：表4-15一例脑脊液样本信息分析输出结果覆盖唯一匹配中文名拉丁名深度度/%Reads数痤疮丙酸杆菌Propionibacteriumacnes0.15132藤黄微球菌Micrococcusluteus0.03114酸热脂环酸芽胞杆菌Alicyclobacilluscidocaldarius0.02616洛菲不动杆菌Acinetobacterlwoffii0.0214Methanothermobacterthermaut热自养甲烷嗜热杆菌0.01410otrophicus滑液支原体Mycoplasmasynoviae0.01410木糖醇利夫森菌Leifsoniaxyli0.01312短波单胞菌Brevundimonassubvibrioides0.01212海王生丝单胞菌Hyphomonasneptunium0.01113甲烷短杆菌MethanobrevibacterAbM40.01110针对此例样本，经过与数据库比对得出痤疮丙酸杆菌和藤黄微球菌都属于致病菌。痤疮丙酸杆菌属于革兰氏阳性菌，是人体皮肤、结膜、呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道的常驻菌，是痤疮的主要病因之一，除在痤疮的发病中起重要作用外，作为条件致病菌引起人体多个系统及器官的少见感染，例如心内膜炎。同时，该菌也是临床培养及实验室常见的污染菌。藤黄微球菌属于革兰氏阳性菌，该菌是定植于人体表皮的共生生物，一般不致病，但作为条件致病菌，可引起伤口等局部组织感染，也能引起严重感染，如心内膜炎、脑膜炎等疾病。在国内外越来越多研究，利用测序法检测和鉴定病原微生物。Monstein等用焦磷酸[28]测序技术检测到临床样本中存在幽门杆菌，并对其进行快速鉴定和分型。Unnerstad等成功地利用NGS技术对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏[29]（Listeriamonocyrogenes）进行了分型。Gharizadeh等利用NGS技术对67例人乳头[30]瘤病毒（humanloapillomaviruses，HPV）样本进行了鉴定和分型。Pei‑XiangNi等人通过NGS测序法成功在ICU重症患者中检出EB病毒，同时得出通过基于培养物鉴定32 第四章技术流程确立及方法学验证[31]出病毒链球菌感染属于假阳性。这说明利用高通量测序法检测可以排除一些用传统方法检测出现的假阳性问题。HongzhiGuan等人通过用NGS技术从脑脊液中检出单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV），证明可通过脑脊液（Cerebrospinalfluid，CSF）[32]样本诊断检测CNS病毒感染。MingzhiYe等从一名患有骨髓单核细胞白血病，经过[33]造血干细胞移植后出现术后感染的男孩身上检出痤疮丙酸杆菌。这说明NGS技术在术后感染方面也有应用空间。33 华南理工大学硕士学位论文第五章结论与展望5.1结论本研究基于IonProton半导体测序平台，建立出整套检测流程：1.对痰液样本需要用5%的二硫苏糖醇进行预处理；2.对脑脊液、咽拭子利用超滤管浓缩，浓缩倍数能高达10倍；3.利用过滤法去除宿主核酸提高病原核酸比例最高去除比例能达到36.09%；4.利用天根的微量样品基因组提取试剂盒可以用较低的成本达到较好的提取效果；5.在DNA建库时磁珠纯化量的最佳比例是末端修复后采用1.6倍体积磁珠纯化，接头连接后采用1.2倍体积磁珠纯化；6.利用磁珠对建库后DNA进行片段选择既节约成本又省时间；7.本检测方法对细菌类病原体检测限为50copies/mL，而对DNA病毒的检测限为310copies/mL；8.本方法的稳定性、特异性及准确性均大于99%，能在临床上代替现有的检测病原体的方法。5.2展望在本研究中对于RNA病毒检测技术的开发并没有做深入探讨，其主要原因在于RNA较为不稳定，在操作的过程中稍有不慎就会降解。因此需要对建库过程进行更多的优化。后续的研究中将会考虑对RNA病毒进行RNA提取后将RNA反转录成cDNA，然后再用cDNA进行建库测序。如此即能避免因建库过程中的多步繁琐操作导致的RNA降解，从而可避免影响实验结果，增加实验周期。念珠菌、曲霉菌等真菌是许多感染性疾病的元凶。但由于真菌的细胞壁是以几丁质和葡聚糖为骨架，基质由多糖、甘露聚糖、糖蛋白和脂质等填充的。坚韧厚壁的形成往往需要较为繁琐的破壁手段，这样就使得真菌DNA的提取较细菌或者其他组织和细胞有一定的难度，必须要使细胞壁有一定程度的破坏才能实现。本研究中使用多种物理、化学及酶处理的方法破壁，对提取均未有显著的成效。有研究表明对于较为难处理的真34 第五章结论与展望[34]菌，可先用液氮研磨，再用玻璃珠振荡，同时加入蛋白酶K进行处理后，再用试剂盒提取即可获得一定量的基因组DNA。后续实验中可按照此方法做出进一步的优化，争取将真菌这一块的检测补充完整。综上所述，本项技术具有时效快，准确性强，对未知病原体检测有一定优势，必将成为一项解决疑难杂症，急重症的有效手段。同时随着对各种微生物基因组的深入研究，该技术也有望在病原体耐药方面的研究作出重大的贡献。35 华南理工大学硕士学位论文参考文献[1]ChiuCY.Viralpathogendiscovery[J].CurrOpinMicrobiol,2013,16(4):468-478.[2]GrardG,FairJN,LeeD,etal.AnovelrhabdovirusassociatedwithacutehemorrhagicfeverincentralAfrica[J].PLoSPathog,2012,8(9):e1002924.[3]PalaciosG,DruceJ,DuL,etal.Anewarenavirusinaclusteroffataltransplant-associateddiseases[J].NEnglJMed,2008,358(10):991-998.[4]BrieseT,PaweskaJT,McMullanLK,etal.GeneticdetectionandcharacterizationofLujovirus,anewhemorrhagicfever-associatedarenavirusfromsouthernAfrica[J].PLoSPathog,2009,5(5):e1000455.[5]KurodaM,KatanoH,NakajimaN,etal.Characterizationofquasispeciesofpandemic2009influenzaAvirus(A/H1N1/2009)bydenovosequencingusinganext-generationDNAsequencer[J].PLoSOne,2010,5(4):e10256.[6]WilsonMR,NaccacheSN,SamayoaE,etal.Actionablediagnosisofneuroleptospirosisbynext-generationsequencing[J].NEnglJMed,2014,370(25):2408-2417.[7]YongfengH,FanY,JieD,etal.Directpathogendetectionfromswabsamplesusinganewhigh-throughputsequencingtechnology[J].ClinMicrobiolInfect,2011,17(2):241-244.[8]GreningerAL,ChenEC,SittlerT,etal.AmetagenomicanalysisofpandemicinfluenzaA(2009H1N1)infectioninpatientsfromNorthAmerica[J].PLoSOne,2010,5(10):e13381.[9]SangerF,NicklenS,CoulsonAR.DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.1977[J].Biotechnology,1992,24:104-108.[10]MaxamAM,GilbertW.AnewmethodforsequencingDNA[J].ProcNatlAcadSciUSA,1977,74(2):560-564.[11]NovelliG.Personalizedgenomicmedicine[J].InternEmergMed,2010,5Suppl1:S81-90.[12]MardisER.Next-generationsequencingplatforms[J].AnnuRevAnalChem(PaloAltoCalif),2013,6:287-303.[13]ShendureJ,JiH.Next-generationDNAsequencing[J].NatBiotechnol,2008,26(10):1135-1145.36 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攻读硕士学位期间取得的研究成果攻读硕士学位期间取得的研究成果相当于学被索作者（全体序发表或投稿刊发表的卷期、位论文的引收作者，按顺题目号物名称、级别年月、页码哪一部分录情序排列）（章、节）况39 华南理工大学硕士学位论文致谢在紧张的工作与学习压力下，我顺利地完成了本次论文研究。在此之中，感谢我的导师郑穗平老师从选题指导、论文框架及细节修改都给予了非常细致与耐心的指导，提出了许多非常宝贵的意见和建议，给了我学以致用的机会。在学习中，郑穗平老师以其严谨求实的治学态度、精益求精的工作态度、兢兢业业、孜孜以求的工作作风以及朴实无华、平易近人的人格魅力对我产生重要影响。他渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。同时，校外导师叶明芝老师利用工作闲暇时间，孜孜不倦地对我提供辅导，帮助我快速有效地开展研究工作，为本次论文的顺利完成提供了必不可少的助力。在此，谨向郑穗平老师及叶明芝老师表示崇高的敬意及衷心的感谢。此外，我也要感谢华大基因广州研发团队给我完成这篇论文提供了重要的启发和帮助，给予了我很多有用的素材。谨以此致谢。最后，向各位百忙之中抽时间对审阅文本的各位老师表示衷心的感谢。40 答辩委员会对论文的评定意见41