突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解

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分类号：密级Ｚ：爭十寒意支綮ＨＵＡＺＨＯＮＧＡＧＲＩＶＥＲＳＩＴＹＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮ硕士学位论文ＭＡＳＴＥＲ’ＳＤＥＧＲＥＥＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ突触结合蛋白－Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解ＳＹＮＡＰＴＯＴＡＧＭＩＮＩⅠＩＳＩＮＶＯＬＶＥＤＩＮＥＬＥＣＴＲＯ－ＡＣＵＰＵＮＣＴＵＲＥＭＥＤＩＡＴＥＤＡＬＬＥＶＩＡＴＩＯＮＯＦＮＥＵＲＯＰＡＴＨＩＣＰＡＩＮ研究生：刘京京ＣＡＮＤＩＤＡＴＥ：ＬＩＵＪＩＮＧＪＩＮＧ２０１５３０２１１０１９８，ＳＴＵＤＥＮＴＮ学号：专业：临床兽医学ＭＡＪＯＲ：ｃ：ＣＬＩＮＩＣＡＬＶＥＴＥＲＩＮＡＲＹＭＥＤＩＣＩＮＥ：导师：丁明星教授ＳＵＰＥＲＶＩＳＯＲ：ＰＲＯＦＥＳＳＯＲＤＩＮＧＭＩＮＧＸＩＮＧ中国武汉ＷＵＨＡＮ，ＣＨＩＮＡ二〇一八年六月ＪＵＮＥ２０１８， 华中农业大学硕士学位论文突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解SynaptotagminⅠisinvolvedinelectroacupuncture-mediatedalleviationofneuropathicpain硕士研究生:刘京京学号:2015302110198指导教师:丁明星教授指导小组：丁一副教授胡长敏副教授陈建国副教授韩丽副教授刘东明讲师专业：临床兽医学研究方向：兽医外科学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2018年6月华中农业大学动物医学院二○一八年六月 国家自然科学基金NationalNatureScientificFoundationofChina(NO.31672615) 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书＾如需保密，解密时间年月口独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经犮表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一，指导教师对此进行了审定。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。＞研究生签名：：日ｉ＇ｔ＾时间吆年６月丨ｆｌ学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文（即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文）在解密后适用于本授权书。学位论文作者签名：：糾ｔ言导师签名、）签名曰期：＞皮年彡月曰签名曰期：年＜月之＿日Ｖ＾＾７占注：诺将本表ｆｔ接装订在学位论文的扉页和目录之间 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解目录摘要..................................................................................................................................iAbstract...............................................................................................................................iii缩略词表............................................................................................................................vi1前言.................................................................................................................................11.1神经病理性疼痛的研究进展...................................................................................11.1.1神经病理性疼痛的研究现状............................................................................11.1.2神经病理性疼痛模型的建立............................................................................21.1.3神经病理性疼痛的发生机制............................................................................31.2神经病理性疼痛的治疗...........................................................................................51.3电针镇痛的研究进展...............................................................................................71.4电针治疗神经病理性疼痛的机制...........................................................................81.5突触结合蛋白-Ⅰ的研究进展...............................................................................101.6研究思路.................................................................................................................121.7研究内容.................................................................................................................131.7.1突触结合蛋白-Ⅰ对神经病理性疼痛大鼠的作用.........................................131.7.2电针对神经病理性疼痛大鼠机械痛阈的影响..............................................131.7.3脊髓SytⅠ在电针缓解神经病理性疼痛大鼠中的作用................................131.8研究目的及意义.....................................................................................................132材料与方法...................................................................................................................152.1主要仪器与设备.....................................................................................................152.2主要药品试剂.........................................................................................................162.3主要溶液及试剂的配制.........................................................................................172.4试验动物的准备及试验设计.................................................................................182.4.1试验动物的准备..............................................................................................182.4.2试验设计..........................................................................................................182.5动物模型制备.........................................................................................................192.6鞘内置管及注射.....................................................................................................202.7电针方法.................................................................................................................212.8大鼠足底机械痛阈的测定.....................................................................................21I 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.9SytⅠ基因表达水平测定.........................................................................................222.9.1总RNA提取与浓度测定................................................................................222.9.2引物设计与合成...............................................................................................232.9.3cDNA样品制备................................................................................................232.9.4引物验证...........................................................................................................242.9.5荧光定量PCR..................................................................................................252.10SytⅠ蛋白水平测定...............................................................................................252.10.1蛋白印迹.........................................................................................................252.10.2免疫组织化学.................................................................................................272.11统计学分析............................................................................................................303结果与分析....................................................................................................................313.1鞘内注射SytⅠ抗体对神经病理痛大鼠机械痛阈的影响...................................313.2电针对神经病理性疼痛大鼠机械痛阈的影响.....................................................323.3荧光定量PCR.........................................................................................................333.3.1引物验证...........................................................................................................333.3.2电针对大鼠脊髓SytⅠ基因表达水平的影响.................................................333.4电针对大鼠脊髓SytⅠ蛋白表达水平的影响.......................................................343.5免疫组织化学.........................................................................................................354讨论................................................................................................................................364.1疼痛模型的选择与建立.........................................................................................364.2突触结合蛋白-Ⅰ对SNI模型大鼠痛阈的影响....................................................374.3电针穴位的选择.....................................................................................................384.4电针参数的选择.....................................................................................................384.5电针对大鼠脊髓突触结合蛋白-Ⅰ表达水平的影响............................................405结论................................................................................................................................426研究创新点....................................................................................................................42参考文献............................................................................................................................43附录补充材料....................................................................................................................53附录发表论文..................................................................................................................55致谢................................................................................................................................56II 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解摘要神经病理性疼痛是由中枢或外周神经损伤，或疾病引起的一种慢性疼痛，包括痛觉超敏、痛觉过敏以及自发性疼痛等综合症状。长时间的疼痛对于动物和人的健康具有极大的影响。药物治疗是目前缓解神经病理性疼痛的主要方法，但是药物治疗效果不佳且存在副作用。电针镇痛是在传统手针刺激特定穴位的基础上结合电刺激的一种现代疗法。电针镇痛具有副作用小、镇痛效果明显、操作简单且可控性强等优点，在兽医和人医临床上得到了广泛应用。研究表明电针刺激对神经病理性疼痛方面有较好的镇痛效果，但是电针治疗神经病理性疼痛的机制研究尚不十分清楚。研究表明外周神经损伤后，兴奋性神经递质，尤其是谷氨酸（glutamate，Glu）在脊髓背角释放增多，通过作用于突触后膜相应受体加强突触后神经元的兴奋性，进而形成脊髓背角中枢敏化，最终导致异常性疼痛的神经病理性疼痛现象。突触结合蛋白-Ⅰ（SynaptotagminⅠ，SytⅠ）是一种突触前囊泡膜蛋白，作为Ca2+感受器蛋白，其主要作用是促进神经递质的释放，参与突触可塑性的调控。有研究表明突触结合蛋白-Ⅰ可以调节谷氨酸的释放。本实验室通过高通量测序技术发现SytⅠ基因在针刺山羊中枢中存在差异表达。因此，我们推测SytⅠ可能参与神经病理性疼痛的形成以及电针可能通过调节SytⅠ的表达来缓解神经病理性疼痛。为探究SytⅠ在神经病理性疼痛中的作用，本试验通过坐骨神经分支选择性损伤手术建立神经病理性疼痛模型（sparednerveinjury，SNI）大鼠，鞘内注射不同剂量SytⅠ抗体，检测各组大鼠足底机械痛阈（pawwithdrawalthreshold，PWT）的变化。试验将30只SD大鼠随机分成5组：假手术组（Sham）、神经损伤组（SNI）和神经损伤+不同剂量SytⅠ抗体组（1µg，SNI+anti-Syt-1µg；4µg，SNI+anti-Syt-4µg；8µg，SNI+anti-Syt-8µg）。神经损伤组及神经损伤+不同剂量SytⅠ抗体组均做坐骨神经分支选择性损伤手术和鞘内置管，假手术组按照相同方法只做假手术处理不损伤神经。SNI大鼠术后8d开始，鞘内注射不同剂量SytⅠ抗体，每两天一次，共7次，采用足底触觉测定仪测定术前（0d）、术后7d、8d、14d和20d各组大鼠手术肢足底机械痛阈，观察不同剂量SytⅠ抗体对大鼠神经病理性疼痛的影响。为探究电针对SNI大鼠脊髓SytⅠ表达变化的影响，另取54只SD大鼠随机分成3组：假手术组（Sham组）、神经损伤组（SNI组）和神经损伤+电针组（SNI+i 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文EA组）。SNI组和SNI+EA组均做坐骨神经分支选择性损伤手术建立神经病理性疼痛模型，Sham组按照相同方法做假手术处理不损伤神经。于术前（0d）、术后7d、8d、14d和20d，通过足底触觉测痛仪测定各组大鼠手术肢足底机械痛阈。术后第8天，采用电针（2Hz，1~3mA）刺激SNI+EA组大鼠两侧“足三里”和“三阴交”穴，30min/次，每两天一次，共7次。术后8d、14d和20d足底机械痛阈测定后，立即采集大鼠脊髓L4~L6段样品，采用qPCR、蛋白免疫印迹（WesternBlot）和免疫组织化学（IHC）方法检测各组大鼠脊髓SytⅠ表达水平的变化。鞘内注射SytⅠ抗体试验结果显示，SNI组大鼠在7d机械痛阈开始显著下降并且持续至20d，而注射4µg或者8µgSytⅠ抗体组在8d、14d和20d大鼠机械痛阈显著高于SNI组和注射1µgSytⅠ抗体组（p<0.05），且注射8µgSytⅠ抗体组的大鼠痛阈升高最明显，但显著低于Sham组（p<0.05）。表明坐骨神经分支选择性损伤大鼠术后出现机械痛觉超敏，而注射SytⅠ抗体剂量依赖性地缓解了SNI模型大鼠痛觉超敏现象。电针处理试验结果显示，在术后14d和20d，SNI+EA组大鼠的机械痛阈显著高于SNI组（p<0.05），并与Sham组无显著差异（p>0.05），在20d机械痛阈升高最显著，表明电针能够显著逆转神经损伤引起的大鼠机械痛阈降低的现象，且出现镇痛累加效应。qPCR结果显示，在8d、14d和20d，同时段各组之间SytⅠ的mRNA水平表达没有显著差异（p>0.05）。WesternBlot结果显示，SNI组大鼠脊髓中SytⅠ的蛋白表达量在术后8d、14d和20d显著高于Sham组（p<0.05）。而SNI+EA组大鼠脊髓中SytⅠ的蛋白表达量在14d和20d显著低于SNI组（p<0.05），与Sham组之间差异不显著（p>0.05）。显示电针能够显著降低SNI模型大鼠脊髓中SytⅠ蛋白表达。免疫组织化学结果显示SytⅠ蛋白主要在脊髓背角Ⅰ和Ⅱ层中表达有差异，且与WesternBlot结果变化趋势相符。本研究通过建立SNI神经病理性疼痛模型大鼠，鞘内注射SytⅠ抗体探讨大鼠脊髓SytⅠ在神经病理性疼痛形成中的作用，以及电针对SNI模型大鼠足底机械痛阈和脊髓SytⅠ表达变化的影响。结果表明SytⅠ参与了神经病理性疼痛的形成，电针可以通过下调SytⅠ蛋白表达进而缓解神经病理性疼痛，本研究有助于阐明电针治疗神经病理疼痛的中枢机制。关键词：神经病理性疼痛；SytⅠ；电针；SytⅠ抗体；痛觉超敏；大鼠ii 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解AbstractNeuropathicpain,asoneofchronicpains,iscausedbycentralorperipheralnervedamageordisease,includingsomesyndromessuchasallodynia,hyperalgesiaandspontaneouspain.Andthehealthofanimalsandpeoplearestronglyaffectdbythelong-termpain.Atpresent,drugadministrationisprincipallyappliedtorelieveneuropathicpain,butitisnoteffectiveandhassideeffects.Electroacupuncture(EA)analgesia,combinedwithelectricstimulationonthebasisoftraditionalhand-needlestimulationofspecificacupoints,hastheadvantagesoflesssideeffects,obviousanalgesiceffect,simpleoperationandstrongcontrollability.EAiswidelyusedinveterinaryclinicandhumanmedicalasamoderntherapy.ResearcheshaveshownthatEAanalgesiahasagoodanalgesiceffectonneuropathicpain,buttheunderlyingmechanismofEAstimulationinneuropathicpainisstillunclear.Researcheshaveindicatedthatthecentralsensitizationofthedorsalhornofthespinalcordisduetotheexcitatoryneurotransmitters,especiallyglutamate(Glu),areincreasedthereleaseafterperipheralnerveinjury,whichenhancestheexcitabilityofpostsynapticneuronsthroughactingonthecorrespondingreceptor,eventuallyleadstothedevelopmentofabnormalpaininneuropathicpain.SynaptotagminⅠ(SytⅠ)isapresynapticvesiclemembraneproteininmammal,asoneofCa2+receptorproteins,itsmainfunctionistopromotethereleaseofneurotransmittersandparticipateintheregulationofsynapticplasticity.Furthermore,studieshavedemonstratedthatSytⅠcanregulatethereleaseofglutamate.Aswellas,thedifferentialexpressionofSytⅠgenewasobservedinthenervecenterofgoatswithEAstimulationbyhigh-throughputsequencingtechnologyinourlaboratory.Therefore,wespeculatethatSytⅠmaybeinvolvedintheformationofneuropathicpainandEAmayrelieveneuropathicpainbyregulatingtheexpressionofSytⅠ.InordertoinvestigatetheroleofSytⅠonneuropathicpain,weestablishedthemodelofneuropathicpainbyasurgeryofthesparednerveinjury(SNImodel)inratsandthendetectedthechangesofthepawwithdrawalthreshold(PWT)afterintrathecalinjectionofdifferentdosesofSytⅠantibody.ThirtySDratswererandomlydividedintofivegroups:Shamgroup(shamsurgerygroup),SNIgroup(nerveinjurygroup),SNI+differentdosesofanti-SytⅠgroup(1μg,SNI+anti-Syt-1μg;4μg,SNI+anti-Syt-4μg;8μg,SNI+anti-Syt-8μg).TheShamgroupkeptnerveintactwithshamsurgery,whileiii 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文otherfourgroupswereperformedwithasurgeryoftheSNIandintrathecalcannulation.Atday8aftersurgery,allratsweregivenintrathecalinjectionofdifferentdosesofSytⅠantibodyonceeverytwodaysand7timesintotal.ThePWTwasmeasuredbypawtactileapparatusatday0(beforesurgery)andatday7,day8,day14andday20aftersurgery,respectively;andtheeffectsonneuropathicpainratswithdifferentdosesofSytⅠantibodyweresimultaneouslyobserved.ToinvestigatetheeffectofEAonSytⅠexpressioninspinalcordintheSNIrats,anotherfifityfourSDratswererandomlydividedintothreegroups:Shamgroup,SNIgroup,andSNI+EAgroup(nerveinjury+EAgroup).TheSNIgroupandSNI+EAgroupwereestablishedbyasurgeryoftheSNI,whereastheShamgroupwasperformedwiththesameprocedurebutretainedtheintactsciaticnerve.ThePWTofallratsweremeasuredatday0(beforesurgery)andatday7,day8,day20aftersurgery,respectively.Atday8aftersurgery,EAstimulationwasperformedfor30minonbilateral“Zusanli”and“Sanyinjiao”acupointsintheSNI+EAgroup(2Hz,1~3mA)onceeverytwodaysand7timesintotal.ThespinalL4~6segmentsinratswereimmediatelycollectedaftermeasuringthePWTinallgroupsatday8,14and20afterthesurgery,respectively.Meanwhile,theexpressionslevelsofSytⅠweredetectedwiththemethodsoftheReal-timequantitativePCR,WesternBlotandimmunohistochemistry(IHC)inthespinalcord.AttheexperimentofusingintrathecalinjectionofSytⅠantibody,theresultsdisplayedthatthePWToftheSNIratscontinuouslyreducefromday7today20,ontheotherhand,thePWToftheinjectionof4μgor8μgSytⅠantibodygroupwassignificantlyhigherthanthoseoftheSNIgroupandSNI+anti-Syt-1μggroup(p<0.05)atday8,14and20afterthesurgery.Meanwhile,thePWToftheSNI+anti-Syt-8μggroupshowedthemostsignificantincreaseinallgroups,whichwasdramaticallylowerthanthatinShamgroup(p<0.05).TheseresultsindicatedthattheSNIratmodelcouldinduceallodynia,whichcanbedose-dependentlyrelievedbySytⅠantibody.TheresultsofEAstimulationshowedthatthePWTinSNI+EAgroupwassignificantlyhigherthanthatinSNIgroupatday14and20(p<0.05),whereastherewasnodifferencewiththeShamgroup(p>0.05),andthestrongestanalgesiceffectwasobservedatday20.ThoseresultsindicatedthattheEAstimulationcouldremarkablyreversethePWTcausedbynerveinjuryinrat,andleadingtoananalgesicaccumulativeeffect.TheresultsofqPCRshowedthatthemRNAexpressionlevelsofSytⅠhadnoiv 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解significantdifferenceatday8,14and20(p>0.05).AndtheresultsofWesternBlotshowedthattheproteinexpressionlevelsofSytⅠintheSNIgroupwassignificantlyhigherthanthatintheShamgroupatday8,14and20aftersurgery(p<0.05).However,theexpressionlevelsofSytⅠproteininspinalcordwassignificantlylowerthanthatinSNIratsatday14and20(p<0.05)inSNI+EArats,andtherewasnodifferencewiththeShamgroup(p>0.05),indicatingEAstimulationsignificantlyreduceSytⅠproteinexpressionlevelsinspinalcordofSNIrats.Atthesametime,theresultsofIHCshowedthattheSytⅠproteinhaddifferentlyexpressedlevelsinthedorsalhornⅠandⅡlayersofthespinalcord,whichwashighlyconsistentwiththeresultsoftheWesternBlot.TheSNIratmodelsweresuccessfullyestablishedinthepresentresearch.IntrathecalinjectionofSytⅠantibodytoinvestigatetheroleofSytⅠinneuropathicpainofrats,andtheeffectofEAstimulationonPWTandSytⅠexpressionlevelschangesinspinalcordofSNIratsafterEAstimulation.TheresultsshowedthatSytⅠwasinvolvedintheformationofneuropathicpain,andEAstimulationbydown-regulatingtheexpressionlevelsofSytⅠproteinrelievedtheneuropathicpain.ThisresearchcanhelptoelucidatethecentralmechanismofEAtreatmentforneuropathicpaininthefuture.Keywords：neuropathicpain;SytⅠ;electroacupuncture;SytⅠantibody;allodynia;ratv 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文缩略词表缩略词英文全称中文全称GluGlumate谷氨酸SytⅠSynaptotagminⅠ突触结合蛋白-ⅠSNISparednerveinjury坐骨神经分支选择性损伤模型PWTPawwithdrawalthreshold足底痛阈值EAElectroacupuncture电针EAAsExcitatoryaminoacids兴奋性氨基酸NMDAN-methyl-D-asparticacidN-甲基-D-天冬氨酸CCIChronicconstrictioninjury坐骨神经慢性压迫性损伤模型SNLSpinalnerveligation脊神经结扎DRGDorsalrootganglia背根神经节SCDHSpinalcorddorsalhorn脊髓背角LTPLongtermpotentiation长时程增强效应GABAγ-aminobutyricacidγ-氨基丁酸AAVAdeno-associatedvirus腺相关病毒HSVHerpessimplexvirus单纯疱疹病毒GTsGlutamatetransporters谷氨酸转运体GLASTGlutamate/aspartatetransporter谷氨酸/天冬氨酸转运体GLT-1Glutamatetransporter-1谷氨酸转运体-1PKCProteinkinaseC蛋白激酶CCFAcompleteFreund’sadjuvant完全弗氏佐剂SNAP-25Synaptosomal-associated突触小体相关蛋白-25protein-25cGMPCyclicguanosinemonophosphate环磷酸鸟苷EAAC1Excitatoryaminoacidcarrier1兴奋性谷氨酸转运体1vi 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解1前言神经病理性疼痛是一种难治性神经疼痛，对动物和人的躯体产生严重的影响。常规药物使用对神经病理性疼痛的缓解效果不佳，且存在严重的不良反应、长期药物使用会出现耐受等现象，使药物治疗在临床应用上受到了限制。因此，临床上对无副作用及非药物疗法在神经病理性疼痛上的应用受到关注。针刺在治疗疾病和缓解疼痛方面具有悠久的历史。电针是在传统手针的基础上采用特定的参数进行电刺激的一种可控性疗法且镇痛效果佳，在治疗神经病理性疼痛方面引起研究者们的注意。神经病理疼性疼痛是由神经、体液等多种机制共同作用形成的，其发病机制与外周传入纤维信号传导、神经递质释放以及中枢敏化等有密切的关系。目前认为，神经病理性疼痛诱发的中枢敏化是因为外周神经损伤后大量的兴奋性氨基酸（excitatoryaminoacids，EAAs），尤其是谷氨酸（glutamate，Glu）的释放增加，增强了突触后神经元的兴奋性，最终导致了脊髓背角中枢敏化（Ulteniusetal2006）。研究表明，坐骨神经分支选择性损伤模型（sparednerveinjury，SNI）大鼠，脊髓背角Glu含量增加，大鼠机械痛敏形成；电针处理后，脊髓背角中Glu含量减少，机械痛阈升高，提示电针可以通过减少脊髓背角Glu含量来缓解神经病理性疼痛（Maetal2008）。但是电针是如何调节脊髓背角兴奋性神经递质释放的尚不清楚，因此，深入对电针治疗神经病理性疼痛的研究，有利于阐明电针缓解神经病理性疼痛的中枢机制。1.1神经病理性疼痛的研究进展1.1.1神经病理性疼痛的研究现状疼痛在动物和人身上是一种复杂的感觉，其形成主要涉及情感动机、感觉辨别和认识评价等，长期性的慢性疼痛会影响动物和人的精神及躯体健康。神经病理性疼痛是是由创伤导致的外周神经、脑和脊髓损伤或疾病等引起的一种慢性疼痛。患者主要会表现出痛觉超敏（正常无伤害性刺激引起的疼痛）、痛觉过敏（对伤害性刺激疼痛敏感性增加）和自发性疼痛（自发性、随机性和持久性的异常感觉）等症状（KajanderandBennett1992;WoolfandMannion1999）。全球越来越多的患者受到神经病理1 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文性疼痛的迫害，而且发病率高，巨额的医药费给家庭和社会带来巨大的经济负担（Butera2007;vanHeckeetal2014）。患有神经病理性疼痛的动物和人会出现睡眠质量差、焦虑和抑郁等心理情绪的改变。现在对神经病理性疼痛的缓解主要是通过药物干预，如抗抑郁药、镇痛药以及NMDA受体撷抗剂等药物（Yangetal2013)，但是会出现治疗效果不明显、疼痛减轻不充分且不良反应发生率高等现象。至今神经病理性疼痛的发病机制还不清楚，临床上也缺乏有效的治疗手段，因此，对于神经病理性疼痛的机制和治疗措施的研究仍然是研究者们关注的重点。1.1.2神经病理性疼痛模型的建立神经病理性疼痛的形成主要是由神经夹伤、截肢、挤压伤、脊髓损伤等引起的外周或者中枢神经系统损伤；代谢性疾病引起的神经病变；病毒感染引起的神经痛；恶性肿瘤、脉管综合征等非病毒性疾病。研究者们为了更好的研究神经病理性疼痛的发病机理及治疗手段，选择适合的动物模型是必须的。因此，研究者通过不断地改良试验方法已经建立了多种神经病理性疼痛动物模型。目前在研究中应用的模型有（1）坐骨神经慢性压迫性损伤模型（CCI模型）：该方法是在1988年由Bennett和Xie对坐骨神经进行松结扎建立的（BennettandXie1988）。在大鼠一侧大腿二头肌作切口，找到坐骨神经用羊肠线进行松结扎，共4次，每次结扎线之间间隔约1mm，在40倍镜下，可以观察到神经收缩迟钝，但未被完全阻滞，周围肌肉会出现轻微的抽搐。该模型大鼠术后第二天对伤害性辐射热的痛觉过敏反应明显且超过2个月，能够较好的模拟临床上的神经病理性疼痛现象，但结扎线松紧度把握不好，可能影响手术的成功率，从而使手术的重复性差。（2）部分坐骨神经结扎模型（PNL模型）：Seltzer等在1990年通过对大鼠一侧约一半处的坐骨神经纤维进行结扎建立的PNL模型（Seltzeretal1990）。此模型在术后的几个小时和之后的几个月内出现了机械性异常性疼痛和热痛觉过敏的现象，缺点是神经损伤程度不易控制。（3）脊神经结扎模型（SNL模型）：手术步骤是将大鼠一侧L5段脊神经或L5和L6段脊神经结扎，受伤侧足部对热伤害刺激过敏（至少5周）、机械异常性疼痛（至少10周）和自发性疼痛（KimandChung1992）。该模型特点是机械性异常疼痛明显、模型持续周期长以及可重复性强，但是缺点是用于研究的范围比较狭窄、对手术要求比较严格、不易成功。（4）坐骨神经分支选择性损伤模型（SNI模型）：2000年Decosterd2 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解和Woolf首次采用去除部分坐骨神经的方法建立了神经损伤模型（SNI）大鼠（DecosterdandWoolf2000）。打开手术通路，暴露一侧坐骨神经的两个分支即胫神经和腓总神经，将这两个神经在距离坐骨神经2-4mm处用5-0丝线结扎并剪断，注意不要碰到另一个分支即腓肠神经，使腓肠神经完整保留，该模型的优点是在早期即可出现异常性疼痛（机械性痛觉超敏和冷觉过敏）且疼痛维持在时间六个月以上。SNI模型大鼠机械痛觉超敏明显且持续周期长，手术简便，可重复性好，而热伤害刺激不会引起阈值变化。1.1.3神经病理性疼痛的发生机制随着对神经病理性疼痛的研究发现神经病理性疼痛的发生、发展和维持的重要原因是神经和体液等众多因素共同作用的结果，机体调节包括从外周到中枢多级控制的复杂过程。其中外周机制主要包括：外周损伤神经的传入神经纤维的异位放电、交感-感觉神经偶联、炎症反应和相邻损伤神经纤维的兴奋性增加。在正常生理情况下，无外界刺激时传入神经纤维不会自发放电。但是诸如创伤、感染和肿瘤浸润等多种因素导致外周神经损伤后，损伤区域会出现大量的异位放电，如背根神经节（dorsalrootganglia，DRG）以及其它外周神经的轴突不该产生自发电位的部位出现了自发放电的现象。诱发外周神经纤维兴奋性改变，通过传递信号传导引起脊髓及脊髓以上中枢的兴奋性增加进而引起神经性疼痛的症状。研究表明电压门控钠通道和电压门控钙通道在神经损伤区域、胞体膜附近大量聚集使得神经元重塑可能是异位放电产生的原因，产生异位放电后，通过脊髓上传至中枢从而产生痛觉过敏（Nicoletal2015），应用钠离子通道阻断剂会减轻神经病理性自发性疼痛（Tsudaetal2013）。研究发现脊神经结扎大鼠，在DRG以及其附近的Ca2+通道增加，而反义核苷酸抑制其表达会减轻痛觉超敏和自发性疼痛（Valderetal2003）。除了异位放电，损伤神经产生的促炎细胞因子（组胺、白细胞介素及肿瘤坏死因子等）会使伤害性感受器致敏，进而引起强的疼痛反应（HeydendaelandJacobson2010;Vallejoetal2010）。神经损伤引起的外周机制只是通过传入神经纤维进行初步传导，疼痛信息还需要通过脊髓及以上中枢机制进行整合和分析。神经病理性疼痛形成的中枢机制主要包括中枢敏化、Aβ纤维出芽、中枢抑制性中间神经元的功能下降和下行易化系统的激活等（杨冯睿和倪家骧2012）。研究发3 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文现，损伤区域神经纤维出现的异位电活动会持续地增强突触前的效应，持续性的兴奋使脊髓背角形成长时程增强效应（longtermpotentiation，LTP）（RobersonandSweatt1996），从而使脊髓背角伤害性感觉神经元的疼痛信号出现增强、放大和持续，临床上称其为“中枢敏化”。研究认为，中枢敏化的产生及维持与脊髓中兴奋性氨基酸的大量释放有着密切的关系。外周神经损伤后，谷氨酸等兴奋性氨基酸释放的增多，引起突触后谷氨酸受体（N-methyl-D-asparticacid，NMDA）和非NMDA受体的激活，Ca2+通道开放，细胞内Ca2+浓度升高，促使突触前神经细胞的兴奋性氨基酸释放增多，从而使突触后神经元出现持续性的兴奋性增强，这是LTP形成的关键因素；再经过一系列神经元进行信号传递，引起神经元之间的突触活动次数增加，使脊髓背角神经元对痛觉信号的反应增强，阈值下降，原先一些阈下刺激即可引起疼痛反应（痛觉超敏），神经元突触可塑性的变化使得该神经元对同样刺激反应性增强，感受野扩大（牵涉痛）以及自发性冲动增加（自发性疼痛）（Luoetal2014;岳寿伟和吴宗耀2004）。外周刺激作用于躯体皮肤、肌肉和内脏等感受器后，主要是通过有髓鞘的Aβ和Aδ感觉传入纤维以及无髓鞘的C类感觉传入纤维传递至脊髓，激活脊髓背角神经元，并对刺激进行初步整合后投射到相应的大脑核团。研究发现在正常生理状态下，传导伤害性刺激的高阈值C类纤维位于脊髓背角Ⅱ层，而传导非伤害性刺激的低阈值Aβ纤维位于脊髓背角Ⅲ和Ⅳ层，但是当周围神经发生损伤后，Aβ纤维开始向脊髓背角浅层特别是Ⅱ层长芽并支配浅层的C类纤维，导致接收伤害性刺激的高阈值Ⅱ层神经纤维开始接收非伤害性刺激的低阈值痛信号，从而形成神经病理性的中枢性痛觉超敏现象（Matsushitaetal2014;Woolfetal1992）。神经损伤后会引起脊髓背角兴奋性氨基酸的积累，产生细胞毒性，使脊髓背角产生“黑神经元”。这些黑神经元包括抑制性神经元，可以抑制痛觉过敏，但是研究表明在神经损伤模型中，损伤侧抑制性氨基酸γ-氨基丁酸（GABA）合成的关键酶谷氨酸脱羧酶-65含量下降，与假手术侧相比，GABA释放量明显下降，导致中枢抑制性作用减弱，从而产生了痛觉过敏（刘源和徐元2017）。研究表明慢性神经压迫性损伤大鼠模型中脊髓谷氨酸增加，使脊髓兴奋性突触传递增加以及激活NMDA受体来产生和维持脊髓疼痛过敏反应的症状（Al-Ghouletal1993）。但是注射NMDA受体撷抗剂后可以逆转神经损伤引起的疼痛过敏（BasbaumandWoolf1999），提示脊髓4 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解谷氨酸含量的增加诱发了神经病理性疼痛的产生。这些研究表明神经病理性疼痛的中枢作用机理复杂，然而目前对其的研究还不清楚，有待于进一步的研究。1.2神经病理性疼痛的治疗神经病理性疼痛的病程比较长且复杂性的发病机制，使其成为临床医疗领域具有挑战的难题之一。临床上治疗使用的药物主要包括抗抑郁类药、抗惊厥类药物、阿片类药物、NADA受体撷抗剂、以及局部麻醉药等。（1）抗抑郁类药物：研究已证实此类药物在糖尿病神经病变和带状疱疹后顽固性神经痛具有较好的功效（Gilronetal2009;SaartoandWiffen2010）。此类药物缓解疼痛效果的机制包括通过增加抑制性氨基酸GABA的含量、增加中枢神经对5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取抑制作用以及通过降低谷氨酸受体活性起到镇痛的作用（BaastrupandFinnerup2008）。但是长期使用会出现中枢神经系统毒性反应、抗胆碱能不良反应以及心血管系统毒性反应等副作用。（2）抗惊厥类药物：此类药物主要是通过和电压门控钙通道的α2δ亚基配体结合，抑制神经元细胞谷氨酸和P物质等兴奋性递质的释放（Zinetal2008），降低中枢神经系统兴奋，从而减轻感觉和意识，最后起到镇痛的效果。也有研究认为，该类药物增加了神经末梢释放γ-氨基丁酸的概率，通过γ-氨基丁酸能的抑制作用，减少神经元兴奋性。杨建军等（2010）用抗惊厥类药物对L5脊神经损伤大鼠进行灌胃处理，有效缓解了痛觉过敏的现象，长期服用会有头晕、嗜睡和水中毒等副作用出现。（3）阿片类镇痛药：此类药物能够有效缓解神经病理性疼痛的产生。常用的药物包括羟考酮、美沙酮、吗啡和左啡诺。长期使用会出现呼吸抑制、神经系统毒性、尿潴留及药物依赖和耐受等副作用。阿片类药物很难在临床上作为常用药物，首先是因为阿片类药物比抗抑郁和抗痉挛药物更容易产生副作用并且伴随整个治疗过程，其次是阿片类药物会使人产生依赖性，容易作为毒品在社会上滥用且长期使用会出现耐受现象。（4）NADA受体撷抗剂：NADA受体参与慢性神经病理性疼痛中枢敏化的形成。氯胺酮是NADA受体的一种撷抗剂，已被证明可以非竞争性地撷抗NADA受体；也被认为可以通过阻断钠和钾电压门控电流来抑制脊髓背角浅层神经元的兴奋性，进而起到治疗神经病理性疼痛的作用（Kieferetal2008）。但是全身给药会导致不可接受的副作用，例如行为障碍和神经毒性。（5）局部麻醉药：主要有利多卡因、普鲁卡因等。其作用机制是抑制损伤纤维处神经细胞膜的钠5 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文离子通道，减少钠离子内流，阻断动作电位的产生和冲动传递，抑制神经元的兴奋性，从而产生镇痛作用。研究发现5%利多卡因贴剂治疗带疱疹病毒和外周神经病理痛综合征具有明显的效果（GammaitoniandDavis2002）。局部麻醉药出现的副作用就是轻度皮肤反应，如红斑和局部皮疹，使用前需要作皮试。综合上面所述，药物使用虽然可以很好地缓解神经病理性疼痛，但长期的药物使用，会出现药物依赖、剂量递增、耐受性等一系列副作用。因此需要继续开发出新的镇痛效果好且副作用少的药物或者改进长期治疗慢性疼痛的治疗方法。神经介入疗法是采用微创手术在影像学技术靶向目标的基础上，在神经干、丛、节的周围运用物理或化学药物损毁术，准确阻滞损伤部位的神经，中断神经的传导。药物疗法在神经病理性疼痛方面取得的作用不是很好，例如使用强阿片类镇痛药物治疗癌症、带状疱疹病毒后遗神经性疼痛已经不能使疼痛得到有效的缓解，对于这种使用单纯药物治疗已经不能取得好的镇痛效果时，可以采用介入疗法。常用的介入疗法主要包括硬膜外阻滞、选择性神经根阻滞、背根神经节脉冲射频、热凝射频和化学药物损毁、鞘内药物输注神经系统植入术和脊髓电刺激术等方法（王家双2010）。与常规药物治疗效果相比，介入疗法可以获得更有效的镇痛效果，并且副作用小，但是对于施术者要求较严格，微创手术安全性及药量等方面存在不确定性，因此对于此种方法还需要谨慎使用。随着生物工程技术的发展，基因治疗开始成为研究人员们的热点。采用失活或增补相关基因的科学技术，抑制疼痛基因或激活抗痛基因的表达，进而起到镇痛的效果。基因失活是将导致疼痛基因的反义寡核苷酸导入细胞，抑制疼痛基因表达，起到镇痛效应。神经损伤会引起钙离子通道α2δ亚基配体的上调，而鞘内注射钙离子通道α2δ亚基配体反义核苷酸可以减少神经元的钙离子通道α2δ亚基配体的形成，并且在一定程度减轻疼痛过敏的产生（Wangetal2015）。基因增补是把目的基因导入到相应细胞内，通过表达产物来增强细胞的功能或者增强细胞原有的功能。现在比较热门的技术是采用病毒载体的方法，将目的基因导入细胞内进行扩增，进而在损伤机体内表达，最终达到缓解疼痛的效果。研究表明通过将腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）介导的谷氨酸脱羧酶注入DRG神经元或坐骨神经后，脊髓中的γ-氨基丁酸的浓度显著增加，抑制了脊髓神经元的兴奋性，从而显著性地缓解神经病理性疼痛症状，并且效果可以长达3个月（Kimetal2009）。目前，6 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解在临床试验中，AAV作为载体应用于研究已经很常见，但在神经病理性疼痛方面还没有用于临床试验。单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）可以容纳大基因片段的插入，能在临床上应用于治疗。最早报道用HSV作为病毒载体，与对照组相比，感染了含有脑啡肽原病毒载体的动物，由C纤维或Aδ纤维介导的缩足反应的敏感性减弱甚至消失了，镇痛效果可以维持在感染病毒后7周，表明通过脊髓阿片肽表达来减轻疼痛症状，而应用阿片肽撷抗剂纳洛酮可以逆转此类镇痛效果（Wilsonetal1999）。干细胞疗法是目前治疗神经病理性疼痛的另一种新型的治疗方法，具有较好的镇痛效果。研究发现将来源于同一个体骨髓的单核细胞，通过静脉注射应用于慢性压迫性神经损伤（CCI）大鼠，可以显著性降低大鼠热痛觉过敏和机械超敏反应，具有显著性的镇痛效果（Klassetal2007）。也有研究发现在进行SNI手术后4d，将人的间充质细胞植入小鼠侧脑室，注射后第6天发现前额叶皮层中促炎性白细胞介素-1β的基因水平下降了，机械性疼痛超敏和热痛觉过敏减弱（Siniscalcoetal2010）。这些新的治疗手段对神经病理性疼痛的研究方面都具有一定的效果，但是在临床应用方面考虑到生物安全性等问题，还需要进行深入的研究。1.3电针镇痛的研究进展传统中国医学（traditionalChinesemedicine，TCM）包括中医、中药和针灸3个分支。针灸作为传统医学其中的一部分，拥有3000多年的历史，包括针法（acupuncture）和灸法（moxibustion）。中医经络学说认为，经络是运行气血、沟通脏腑和体表及全身各部位的通道。经络上表面的针刺点又称为穴位，机体中的这些点可以平衡和储存流动的气。传统中医认为，各种原因引起的脏腑经络气血运行不畅，或瘀滞不前、或气机升降失常等气血运行障碍最终导致疼痛症状，即“不通则痛”的病机。针灸通过对穴位的刺激可以起到疏通经脉，行气活血的作用，从而改善了病痛处的气血运行状态，恢复了正常的生理功能。针灸操作中的针法讲究“得气”即针感，将针灸针刺入穴位产生经气感应的一种手法，语出《灵枢·九针十二原》。在针刺相应穴位后，病人会出现酸、麻、胀、重等“得气”感觉，这样才能对疾病达到很好的治疗，尤其是镇痛效果的好坏。20世纪50年代，麻醉师刚开始是用针刺疗法代替一定量的药物进行“麻醉”，因此被称为“针刺麻醉”。而医学者们更侧7 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文重于称其为“针刺镇痛”，因为在某些外科手术过程中，针刺只是使患者的痛觉变得迟钝，意识并没有丧失。由于当时研究条件的限制，医学者们对于针刺是如何减轻疼痛症状还没有很好的解释，为深入了解针刺镇痛的机制，开始了对针刺镇痛机制的研究。1971年新华社向全世界公布针刺麻醉成功的消息，吸引了全球研究者对针刺镇痛的兴趣。之后的30年间，随着研究的进展，初步肯定了针刺镇痛的疗效。1997年，美国国立卫生研究院（NIH）举办了“针刺疗法听证会”，大会通过展示发表论文的数据明确针刺在治疗疼痛和呕吐等疾病方面具有较好的作用（韩济生1998），这次会议的内容直接导致全球加大了对针刺镇痛研究的投入。在对针刺镇痛的深入研究过程中，2007年，我们国家研究者们采用电针刺激特定穴位来达到镇痛效果，代替了传统手捻针法形成了一种新的电针疗法。相比于传统的手针疗法，电针疗法操作方便、安全有效、节省人力物力等优点，研究人员对针刺基础机理研究的兴趣也日益增加。电针镇痛的作用机理比较复杂，涉及神经和体液等多种因素的共同调节作用，但是对于其作用机理还尚不清楚。1.4电针治疗神经病理性疼痛的机制慢性神经病理性疼痛持续周期长，外源性药物的作用通常是暂时的。此外长期使用药物期间慢性疼痛会得到持续的缓解，但是会出现药物剂量递增、耐受和全身副作用等。神经介入疗法、基因疗法以及干细胞疗法由于生物安全问题还不能在临床上得到应用。已有大量的研究证实，电针在治疗神经病理性疼痛方面具有显著的镇痛效果。冯克辉（2010）通过观察电针对SNI模型大鼠脊髓背角突触传递长时程增强效应的影响，发现电针干预组感觉传入C纤维的电位变化率显著低于SNI模型组，表明电针通过抑制C纤维引起的电位变化，降低神经元的长时程增强效应，从而缓解神经病理性疼痛。也有研究发现电针可以通过调节一些神经递质的释放以及炎性因子来治疗神经神经病理性疼痛（蔡振华等2013;马骋等2010;孙涛等2006）。目前研究认为电针镇痛的主要包括内源性阿片肽机制和非阿片肽机制。针刺镇痛的阿片肽物质作用于μ受体、δ受体和κ受体起到镇痛作用。但是电针对神经病理性疼痛缓解的中枢机制研究尚不明确。为了证明电针治疗神经病理性疼痛是否通过内源性阿片肽进行调节的，Hwang等（2002）通过建立神经病理性模型大鼠，形成机械痛觉超敏现象，在术后21d后，通过低频电针处理后溪穴或腹腔注射吗啡可以显8 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解著减轻大鼠机械痛觉超敏现象，然而在电针处理前通过腹腔注射内源性阿片肽受体撷抗剂纳洛酮后，电针镇痛效果被部分逆转。有研究通过建立L5/L6脊神经结扎（SNL）大鼠模型，采用2Hz电针对神经结扎大鼠进行刺激发现可以缓解神经损伤大鼠的机械性异常疼痛，而注射纳洛酮后电针的镇痛作用减弱（Sunetal2004）。这些结果证实内源性阿片肽参与了电针治疗神经病理性疼痛。此外，Ko等（2002）通过cDNA微阵列分析和酶联免疫吸附法发现阿片受体在电针缓解神经病理性疼痛中起着重要作用。Kim等（2004）人为了证明是哪种阿片受体参与EA缓解神经病理性疼痛引起的机械性痛觉超敏，电针大鼠足三里10min内分别鞘内注射选择性μ受体撷抗剂（beta-FNA）、δ受体撷抗剂（naltrindole）和κ受体撷抗剂（nor-BNI），结果发现2Hz电针对神经病理性疼痛的镇痛效应被μ受体和δ受体选择性撷抗剂阻断，而不是κ受体撷抗剂，可能是因为采用低频电针处理的结果。除了内源性阿片肽类物质，还有一些非阿片肽的神经递质参与电针对神经病理性疼痛缓解的过程中。研究表明，神经病理性疼痛的中枢敏化的形成主要是由于脊髓中兴奋性神经递质增加引起的，尤其是谷氨酸含量的积累（KawamataandOmote1996）。Al-Ghoul等（1993）在CCI模型大鼠试验中发现脊髓中谷氨酸释放增加，通过激活相应的受体，形成和维持神经病理性疼痛。选取“环跳”和“委中”穴，采用电针处理SNI模型大鼠，可以有效改善大鼠机械痛阈超敏现象，缓解了神经病理性疼痛；通过脊髓微透析技术检测谷氨酸和天冬氨酸，结果显示电针组这两种氨基酸的含量与模型组相比显著降低，表明电针可能通过减少脊髓中兴奋性氨基酸的含量来治疗神经病理性疼痛（李翠贤等2008）。有研究发现，神经末梢释放的谷氨酸的转运主要是通过位于突触前模上的谷氨酸转运体（Glutamatetranspoters，GTs）的来转运的。坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠和脊神经结扎模型大鼠，会出现痛觉过敏，通过对大鼠的脊髓背角进行微透析检测，发现脊髓中累积大量的谷氨酸。给坐骨神经结扎大鼠进行腹腔注射GTs的激动剂利鲁唑后，可以剂量依赖性地减少神经病理性疼痛痛觉过敏的发展和维持，表明脊髓GTs增强了对谷氨酸的转运，减少了脊髓中谷氨酸含量（Coderreetal2007;Sungetal2002）。Zeng等（2016）通过电针刺激神经病理性SNI模型，发现电针后脊髓中GLAST和GLT-1的蛋白表达水平显著高于未电针的SNI模型组，针刺后痛阈显著提高，有效减轻了神经病理性疼痛，验证试验中，对SNI+EA组大鼠鞘内注射谷氨酸转运体抑制剂PDC，发现PDC可9 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文以逆转电针的镇痛效果，证实了电针可以上调SNI脊髓GLAST和GLT-1的表达治疗神经病理性疼痛。除此之外，还有5-羟色胺、去甲肾上腺素等活性物质已被证实参与了电针对神经病理性疼痛的调节（Kimetal2005;Songetal2011）。然而，电针通过减少神经病理性疼痛大鼠脊髓谷氨酸的含量来缓解神经病理性疼痛的机制还不清楚，有待于进一步研究。1.5突触结合蛋白-Ⅰ的研究进展神经元在功能上的联系是通过突触实现的，同时突触也是信号传导的重要部位（ZagrebelskyandKorte2014）。中枢神经系统实现正常生理功能主要是通过神经末梢突触所释放的神经递质来介导的。突触前神经递质的释放是一个复杂的过程，其释放的多少直接影响到其作用的效果。研究发现突触囊泡内神经递质的胞吐过程是神经末梢突触前活性区内Ca2+含量增加来介导的（Sudhof2004）。囊泡的周期特点是Ca2+触发囊泡与突触前模融合、胞吐以及随着胞吞过程形成囊泡的循环再利用，这些过程涉及多种蛋白质共同作用。突触结合蛋白家族（Synaptotagmin，Syt）是在脊椎动物中发现的位于突触小体的一类突触前囊泡蛋白，被认为是调节神经递质释放和脑的学习记忆等生理功能的主要蛋白之一。1981年，Matthew等（1981）提取大鼠脑突触膜成分用来免疫BALB/c小鼠，制备出了两种单克隆抗体，再用这两种单克隆抗体在突触囊泡膜上检测到了一种分子量大小为65kDa的抗原。之后Perin等（1991）对其结构进行分析，确定了此蛋白并命名为突触结合蛋白，该蛋白是由一个位于囊泡内的N-末端、一条单链跨膜区域（TMR）、含有多个蛋白激酶磷酸化位点的可变的连接区、位于胞质区域高度保守的两个串联的C2结构域（靠近囊泡膜端的称为C2A，远离的称为C2B）以及末端保守的C-末端组成。C2结构域最初是以蛋白激酶C（PKC）中同型序列命名的，后来发现C2结构域和PKC中同型序列是同源性片段，并且该同源片段与Ca2+和脂质相互作用，暗示它们可以形成钙离子/脂质结合结构域（Nishizuka1988）。目前已经发现Synaptotagmin有17种亚型，其中含量最丰富、研究最详细的一种亚型是SynaptotagminⅠ（SytⅠ），分子量大小为65kD，由426个氨基酸组成，占总囊泡蛋白数量的7%（TuckerandChapman2002），由于其在神经元中胞吐和胞吞过程中具有重要功能，因而引起了研究者们对于SynaptotagminⅠ的注意。10 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解随着深入的科学研究发现SytⅠ主要存在于脑、脊髓等中枢神经中，是一种Ca2+感受器蛋白，通过参与突触囊泡的锚定、融合等过程调节突触囊泡的胞吐过程。另外，这些过程都需要依赖于Ca2+的参与。在突触囊泡锚定的过程中，突触囊泡首先与质膜形成紧密的结合。通过生理及生化试验研究发现SytⅠ的C2结构域通过与磷脂结合插入质膜上，进而使其与Ca2+的亲和力增加100~10000倍（BaiandChapman2004）。囊泡与质膜紧密贴近后，下一步是与质膜合成一体。SytⅠ与SNAREs蛋白复合物形成的复合体是膜融合需要的分子结构。该复合物是由位于质膜的t-SNARE、突触小体相关蛋白25（SNAP-25）和位于突触囊泡的v-SNARE组成（Sudhof2002;Tuckeretal2004）。v-SNARE与t-SNARE相互作用和SNAP-25形成紧密的四股螺旋束结构，而SytⅠ的C2区两侧都有一个由八条紧凑的β片层结构形成的柱状立体结构，可以完好的与SNAREs复合体的四股螺旋束结合，从而在囊泡融合时可以使囊泡膜与突触前细胞质模融合进而促进神经递质的释放（Gerst2003;Rothman1994）。大量研究发现已证实SytⅠ的C2A能够与3个Ca2+结合，C2B能够与2个Ca2+结合，并且SytⅠ可以在几毫秒内对Ca2+浓度升高的区域触发突触囊泡的胞外分泌，进而影响胞吐和神经递质的释放（Fernandezetal2001;Fusonetal2009;贺雨虹和隋森芳2003），所以，SytⅠ和SNAREs形成的复合物与细胞膜结合来促进Ca2+诱导的神经递质的释放。由Ca2+所诱导的神经递质释放有两种方式：一种是快速同步释放形式；另一种是缓慢非同步释放形式。SytⅠ基因突变型缺陷小鼠，海马神经元突触快速Ca2+依赖性神经递质释放丧失，而神经递质释放的慢时相并无改变（Geppertetal1994）。同样，YoshiharaandLittleton（2002）用果蝇SytⅠ基因全突变也是观察到Ca2+诱导的快速同步释放缺乏。也有研究发现，SytⅠ的突变与Ca2+引起的神经递质释放的快慢相平行（RizoandRosenmund2008）。因此，这些研究表明SytⅠ对Ca2+引起的快速神经递质的释放非常重要。这不仅使SytⅠ在神经生理学方面得到广泛的关注，也吸引了大量研究者对其在难治性神经疾病发病机制方面的研究。突触作为神经系统的重要结构，整合和分散来自突触前末端信息的传递。中枢系统的神经递质释放的多少直接影响突触功能可塑性。SytⅠ蛋白通过增加神经递质释放影响突触功能可塑性在改善学习记忆方面的功能已经有大量的研究，但是在不同研究中，学习记忆过程中SytⅠ蛋白在脑中的表达不同，可能是与研究的脑部位及学习记忆动物模型不同有关。对BALB/c雄性小鼠分别进行适度的平板式跑步运动11 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文或自主轮转运动4周训练后，它们的空间记忆和厌恶记忆分别通过Morris水迷宫和一次性被动回避试验进行评估，检测海马及杏仁核中SytⅠ的含量，发现尽管平板式跑步运动或自主轮转运动均可以增加Morris水迷宫的成绩，而只有平板式跑步运动能改善一次性被动回避实验的表现；同时蛋白检测发现平板式跑步运动或自主轮转运动均上调海马中SytⅠ，但只有前一种训练上调了杏仁核中SytⅠ的表达水平，这些结果表明可能是海马、杏仁核分别与空间记忆和厌恶记忆有关（Liuetal2009）。有研究发现阿尔兹海默病患者海马和嗅球皮层的SytⅠ含量减少（Masliahetal2001;Szeetal2000）；但是对于正常衰老动物脑的SytⅠ含量却不一样，用免疫蛋白印迹发现SAMP8小鼠背侧海马SytⅠ的含量与年龄成正相关，年龄越大含量越多且空间学习记忆功能减退（Chenetal2007），这些结果提示正常衰老海马中SytⅠ的表达水平与学习记忆减退海马中SytⅠ的表达水平不一致可能是与代偿机制对老龄化病理学上的反应有关。在SytⅠ基因敲除鼠研究中发现海马神经元中谷氨酸快速同步释放显著减少了（NishikiandAugustine2004）。研究发现通过SytⅠ基因敲除能够几乎完全预防癫痫引起的海马神经元的损伤（Kobayashietal2002）。此外，突触结合蛋白-Ⅰ在甲状腺功能减退症、帕金森等研究中也存在异常改变（Huynhetal2011;徐永霞等2009）。本实验室最新研究也发现，通过对电针一次处理山羊的脑组织进行高通量核酸测序技术，发现SytⅠ基因具有差异性变化（Huetal2018）。这些结果表明SytⅠ可能在一些神经疾病方面具有重要作用，探究SytⅠ在神经疾病中的作用，对于阐明神经性疾病的机制具有重要的意义。1.6研究思路神经病理性疼痛的发病机制与脊髓背角神经元的中枢敏化有着密切关系。针刺治疗神经病理性疼痛的中枢机制主要是阿片肽机制，但是研究发现电针镇痛效果可以被阿片肽撷抗剂纳洛酮部分逆转，提示除了阿片肽机制还有其它的机制存在。本实验室采用高通量测序发现针刺山羊中枢SytⅠ基因存在差异表达。SytⅠ作为Ca2+依赖性调节蛋白来促进神经递质的释放。已有研究发现谷氨酸的释放与SytⅠ的表达有关。神经病理性疼痛中枢敏化的形成主要是由于谷氨酸的释放增多导致的，而研究显示电针可以通过降低神经病理性疼痛大鼠脊髓背角中谷氨酸的含量来缓解神经病理性疼痛。电针是否通过调节SytⅠ的表达来缓解神经病理性疼痛尚不清楚。因此，12 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解本试验选择坐骨神经分支选择性损伤手术建立SNI模型大鼠，结合SytⅠ抗体，以探究电针对神经病理性疼痛作用的中枢机制。1.7研究内容1.7.1突触结合蛋白-Ⅰ对神经病理性疼痛大鼠的作用术后8d开始，对SNI大鼠给予鞘内注射不痛剂量SytⅠ抗体（0µg、1µg、4µg和8µg），每两天一次，共7次，采用足底触觉测定仪在注射第1次（术后8d）、注射第4次（术后14d）和注射第7次（术后20d）测定大鼠足底触痛阈，探究撷抗SytⅠ的表达对大鼠神经病理性疼痛的影响。1.7.2电针对神经病理性疼痛大鼠机械痛阈的影响术后8d，给SNI大鼠施予电针刺激，每两天一次，30min/次，共7次。在电针第1次（术后8d）、电针第4次（术后14d）和电针第7次（术后20d）测定大鼠的痛阈，通过比较各组大鼠的痛阈，来评估电针治疗神经病理性疼痛大鼠的作用。1.7.3脊髓SytⅠ在电针缓解神经病理性疼痛大鼠中的作用术后8d开始，对SNI大鼠给予电针处理，每两天一次，30min/次，共7次。术后8d、14d和20d，足底痛阈测定后，立即采集大鼠脊髓L4~L6段，采用qPCR、WesternBlot和免疫组织化学方法检测脊髓中SytⅠ基因和蛋白的表达水平，探究电针是否通过调节大鼠脊髓SytⅠ的表达来缓解神经病理性疼痛。1.8研究目的及意义目前电针镇痛的研究主要是急性镇痛和阿片肽机制，但对慢性镇痛和非阿片肽机制研究还不够完善。有大量研究发现电针可以调节兴奋性氨基酸和其受体治疗神经病理性疼痛，但是作为调节神经递质释放的突触结合蛋白-Ⅰ在电针治疗神经病理性疼痛方面的研究未见报道。本试验通过建立神经病理性疼痛模型大鼠，观察鞘内注射SytⅠ抗体对神经病理性疼痛的影响以及电针治疗神经病理性疼痛后脊髓中SytⅠ基因、蛋白水平和SytⅠ13 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文蛋白在脊髓背角中分布的位置，以探究SytⅠ蛋白是否参与神经病理性疼痛的形成以及电针是否通过调节大鼠脊髓SytⅠ的表达进而缓解神经病理性疼痛，阐明电针治疗神经病理性疼痛的作用机制，促进神经科学和疼痛学的发展。14 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解2材料与方法2.1主要仪器与设备XH型触痛换能器北京众实迪创科技发展有限责任公司大鼠固定筒北京众实迪创科技发展有限责任公司85-2型恒温磁力搅拌器上海司乐仪器-20°C冰箱伊莱克斯有限公司-80°C冰箱中国海尔StepOne荧光定量PCR仪美国AppliedBiosystems公司ImageQuantLAS4000minCCD成像仪美国GEHealthcare公司SIGMA2-16K高速冷冻离心机德国SIGMA公司AuthorizedThermalCycler梯度PCR仪德国Eppendorf公司超净工作台哈尔滨东联电子技术有限公司DYY-12型电脑三恒多用电泳仪北京六一仪器厂DYCP-31DN型琼脂糖水平电泳槽北京六一仪器厂Mini-PROTEANTetra电泳槽及转印槽美国BIO-RAD公司凝胶成像仪2000型美国BIO-RAD公司NanoDrop2000超微量分光光度计美国Thermo公司RM2016型石蜡组织切片机徕卡显微系统（上海）有限公司SKY-200B摇床上海苏坤实业有限公司电子天平梅特勒•托利多仪器（上海）有限公司光学显微镜德国徕卡仪器有限公司SDZ-1型兽用电疗针灸针麻仪中国科学院武汉物理研究所华佗牌针灸针（0.30×25mm）苏州医疗用品厂移液器德国Eppendorf公司SDZ-1型兽用电疗针灸针麻仪中国科学院武汉物理研究所微量注射器上海高鸽工贸有限公司微波炉中国格兰仕集团YDS-6型液氮生物容器成都金凤液氮容器有限公司15 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.2主要药品试剂戊巴比妥钠广州捷倍斯生物科技有限公司无水乙醇（分析纯）国药集团化学试剂有限公司TRIzolReagent美国LifeTechnologies公司First-StrandcDNASynthesisKit东洋纺（上海）生物科技有限公司PremixTaqTM大连TaKaRa公司SYBRPremixExTaqII大连TaKaRa公司大鼠内参引物上海生工生物有限公司DNAMarker大连TaKaRa公司E.Z.N.A.胶回收试剂盒美国OMEGA公司甘氨酸合肥biosharp公司30%Acry-Bis广州捷倍斯生物科技有限公司1.5MTris-HCl（pH8.8）广州捷倍斯生物科技有限公司1.0MTris-HCl（pH6.8）广州捷倍斯生物科技有限公司Tris（三羟甲基氨基甲烷）合肥biosharp公司TEMED（四甲基乙二酸）广州捷倍斯生物科技有限公司SDS（十二烷基硫酸钠）广州捷倍斯生物科技有限公司过硫酸铵广州捷倍斯生物科技有限公司5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液江苏碧云天PageRulerPrestainedProteinLadder美国Thermo公司PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜美国GEHeaLthcare二甲苯（分析纯）国药集团化学试剂有限公司鼠源SytⅠ一抗美国R&D公司羊抗鼠β-actin一抗武汉谷歌生物公司ECL发光试剂盒美国Millipore公司RIPA裂解液江苏碧云天PMSF（苯甲基磺酰氟）江苏碧云天BCA蛋白定量试剂盒武汉博士德生物技术有限公司一水合柠檬酸国药集团化学试剂有限公司16 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解二水合柠檬酸三钠国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钠国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限公司SABC免疫组化染色试剂盒（SA1022）武汉博士德生物技术有限公司2.3主要溶液及试剂的配制2%戊巴比妥钠：取40mg戊巴比妥钠，用0.9%生理盐水溶解，定容至2mL。10%中性甲醛固定液：取24gNa2HPO4及4.5gNaH2PO4溶解于880mL双蒸水中，再加入37%~40%的120mL中性甲醛，搅拌均匀，室温放置备用。醇苯：乙醇和二甲苯等体积混合，室温保存。10×磷酸盐缓冲液（10×PBS,0.1M,pH7.4）：取90gNaCl，30gNa2HPO4和1.5gNaH2PO4溶解于1000mL双蒸水中，pH调至7.4，室温保存。用时稀释至1×。10×TrisBufferedSaline(10×TBS)：取24.2gTrizma-base(C4H11NO3)，80gNaCl溶于1000mLddH2O中，调pH值为7.4~7.6，室温保存。使用时稀释至1×。0.1%Tween-20(1×TBST)：取上述100mL10×TBS和1mLTween-20，加双蒸水定容至1000mL，混合均匀，室温放置，现配现用。枸橼酸盐溶液（抗原修复液）：取1.5gC6H5Na3O7•2H2O及0.2gC6H8O7•H2O，溶解于500mLddH2O中，搅拌均匀，现配现用。3%H2O2溶液：取40mL30%H2O2和360mLddH2O混匀，避光保存，现配现用。TAEBuffer（50×）：将242gTris碱溶解于750mL双蒸水、再加入57.1mL乙酸、100mL的0.5mol/L的EDTA（pH8.0），用ddH2O定容至1000mL，室温保存，使用时稀释至1×。10%SDS：取SDS10g，加入ddH2O于68°C充分溶解，定容至100mL，室温保存。10%过硫酸铵：取0.5g过硫酸铵，加入ddH2O充分溶解，定容至5mL，4°C保存。保质期两周。10%SDS-PAGE分离胶（5mL）：1.5MTris-HCl（pH8.8）1.3mL，30%Acry-Bis1.7mL，10%SDS0.05mL，10%过硫酸铵0.05mL，TEMED0.002mL，ddH2O1.9mL。17 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文5%SDS-PAGE分离胶（2mL）：1.0MTris-HCl（pH8.8）0.25mL，30%Acry-Bis0.33mL，10%SDS0.02mL，10%过硫酸铵0.02mL，TEMED0.002mL，ddH2O1.4mL。5×SDS-PAGE电泳缓冲液：取15.1gTris、94g甘氨酸、5.0gSDS溶解于1LddH2O中，室温保存。使用时稀释五倍。10×转膜液：将30.3gTris、151.1gGlycine，加入ddH2O中定容到1000mL。使用前取10×转膜液120mL，加入ddH2O840mL和甲醇240mL，混匀后4°C预冷30min。5%脱脂奶粉（封闭液）：脱脂奶粉5g，加1×TBST100mL混匀。2.4试验动物的准备及试验设计2.4.1试验动物的准备SPF级成年雌性Sprague-Dawley大鼠，6周龄，体重200±20g，购于湖北省疾病预防与控制中心【动物合格证号：42000600022998】。试验前进行分笼饲养，每笼6只。适应环境7d后对大鼠进行筛选，足底机械痛阈小于20g或大于50g者（测定方法见2.8）表示动物反应过敏或者迟钝，将其淘汰，不作为试验对象。试验期间大鼠自由采食饮水，室温22±2°C，湿度60%~70%。2.4.2试验设计鞘内注射SytⅠ抗体试验将筛选后大鼠随机分为5组：Sham组（n=6）、SNI组（n=6，0µganti-SytⅠ溶于20µLPBS中），SNI+anti-Syt-1µg组（n=6，1µganti-SytⅠ溶于20µLPBS中），SNI+anti-Syt-4µg组（n=6，4µganti-SytⅠ溶于20µLPBS中）和SNI+anti-Syt-8µg组（n=6，8µganti-SytⅠ溶于20µLPBS中）。如图2-1所示，测定所有大鼠基础机械痛阈后，对SNI组和SNI+不同剂量（1μg、4μg或8μg）SytⅠ抗体组大鼠进行坐骨神经分支选择性损伤手术和鞘内置管，Sham组大鼠进行假手术（不损伤坐骨神经）。恢复7d后再次测定机械痛阈，术后8d进行鞘内注射，用微量注射器通过PE-10导管注射0μg、1μg、4μg或8μg的SytⅠ抗体，每两天一次，共七次。分别在注射第1次（术后8d）、第4次（术后14d）和第7次（术后20d）测定机械痛阈（注射后30min测定）18 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解图2-1鞘内注射SytⅠ抗体试验Fig.2-1ExperimentofintrathecalinjectionSytⅠantibody电针处理试验将筛选后大鼠随机分为3组：Sham组（n=18）、SNI组（n=18）和SNI+EA组（n=18）。如图2-2所示，测定所有大鼠基础痛阈值后，对SNI组和SNI+EA组大鼠进行坐骨神经分支选择性损伤手术，Sham组大鼠进行假手术（不损伤坐骨神经）。恢复7d后再次测定痛阈，术后8d开始电针，每两天一次，共七次，每次电针30min，分别在电针第1次（术后8d）、第4次（术后14d）和第7次（术后20d）后测定痛阈值，痛阈测定后各组取6只大鼠断颈处死，取腰髓4~6段（L4~L6）分为两段，前段用于石蜡包埋，后段放入液氮冻存备用。图2-2电针处理试验Fig.2-2ExperimentofEAstimulation2.5动物模型制备依据Decosterd和Woof的方法（DecosterdandWoolf2000）建立坐骨神经分支选择性损伤神经病理痛大鼠模型（SNI模型）。SD大鼠称重后，腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉后，俯卧固定于手术台。右侧大腿备皮、碘伏消毒、铺创巾后，在大腿后外侧做约1cm长纵行切口，钝性分离股二头肌，根据图2-3（A）所示的坐骨神经解剖结构，找一条白色长索、直径约1mm，刺激其可引起大鼠嘶叫以及后肢激烈收缩即为坐骨神经。沿坐骨神经找到其三个分支，腓总神经、腓肠神经和胫神19 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文经。如图2-3（B）所示，用5-0丝线结扎胫神经和腓总神经（即图2-3B中a和b两条神经）并在远心端2-4mm处结扎剪断，保留腓肠神经，操作时避免牵拉或损伤腓肠神经。依次缝合肌肉和皮肤。假手术组按相同操作仅暴露坐骨神经及分支，但不进行结扎和剪断。术后腹腔注射青霉素三天防止感染，并分笼喂养。术后出现严重啃咬患肢、自残现象的大鼠弃用。图2-3坐骨神经分支选择性结扎剪断模型的制备Fig.2-3OperationalprocedureofSNIsurgery2.6鞘内置管及注射截取数段长度为8cm的PE-10导管，然后将其放在80~100°C热水中均匀拉长约至1.3倍。一端置于20G穿刺针内，之后自然冷却，酒精消毒备用。术前大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，俯卧固定于手术台。背部剃毛、碘伏消毒、铺创巾后，腰骶部垫高，于L6~S1间皮肤做切纵向口，分离皮下筋膜，用20G穿刺针（直径0.90mm，针长35mm）从L6~S1椎间隙垂直穿刺，直到阻力消失时，有瞬间刺破纸的感觉，此时大鼠出现甩尾，且针管中有脑脊液回流，表明刺入蛛网膜下腔。将针尖倾斜30°，将制备好的导管沿穿刺针向前深入约3cm，即到达腰髓膨大部。小心移除穿刺针后，将导管固定于皮下，并经皮下将导管另一端至颈部引出，外露3-4cm再次固定。闭合皮肤切口前检查导管，确保无折叠，无血液淤积（若有血液淤积，则用20μL生理盐水冲洗）。术后分笼饲养，肌肉注射青霉素三天抗感染。术后7d内，出现后肢瘫痪等活动障碍的大鼠排除。将0µg、1µg、4µg和8µgSytⅠ抗体分别溶解于20µLPBS中，采用微量注射器通过PE-10导管鞘内注射，之后用15μL生理盐水冲洗。注射速率为10μL/min。20 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解2.7电针方法为了避免大鼠出现应激，在电针前将SNI+EA组大鼠在鼠筒内适应30min,每天一次，共3d。将大鼠装入鼠筒，露出双侧后肢，75%酒精消毒针灸针、穴位及周围皮肤。根据《大鼠穴位图谱的研制》（华兴邦和周浩良1991），“足三里（ST36）”和“三阴交（SP6）”穴均位于左右后肢，“足三里”穴位于膝关节后外侧、腓骨小头下约5mm处，直刺7mm深度；“三阴交”穴位于后肢内踝尖直上10mm处，直刺4mm深度。0.3mm针灸针刺入大鼠双侧后肢“足三里”、“三阴交”穴后，通过导线连接电针仪输出端，频率为2Hz，输出电压2~3V，电流强度以引起大鼠双侧后肢轻度抖动为宜（1~3mA），每次电针持续30min。将Sham组和SNI组的大鼠只装入鼠筒，不电针。图2-4大鼠“足三里”及“三阴交”穴Fig.2-4The“Zusanli”and“Sanyinjiao”inrats2.8大鼠足底机械痛阈的测定首先将透明有机观察格置于顶部有网格的金属架上，大鼠置于透明有机玻璃观察格中适应5min。先用30g标准砝码对张力传感器（连接触觉测量套件）进行校正。用触觉测量套件头端的VonFrey纤维丝透过金属架的网眼，力度由轻至重缓缓地垂直刺激大鼠右后肢足底趾面，边刺激边观察大鼠反应。当大鼠有舔足或有缩回反射等现象出现时，停止机械刺激，此时触觉测量仪的力度会通过张力传感器传输到电脑上的生物信号处理系统中，便会显示出机械痛阈值（pawwithdrawalthreshold，PWT）。筛选时用0~50g之间的力度垂直刺激大鼠右后肢足底趾面，刺激时间在20s内，淘汰20s内无反应的大鼠，最终保留痛阈值在20~50g的大鼠作为正式试验大鼠。21 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文由于大鼠自行活动而引起的足移动，不算在内，需重新测。每次测试3次，每次间隔5min，计算平均值即为机械痛阈值。2.9SytⅠ基因表达水平测定2.9.1总RNA提取与浓度测定总RNA提取将冻存于液氮的脊髓组织放入预冷的研钵中，向研钵中加入适量的液氮，组织研磨成粉末状，将其平均分为两部分，一部分放进有1mLTrizol裂解液的1.5mL无酶离心管中用于总RNA提取，一部分放进有8μLPMSF+800μLRIPA裂解液的离心管用于总蛋白提取。总RNA提取步骤如下：（1）样品加入Trizol裂解液后剧烈震荡30s，室温静置5min，于4°C冷冻离心机中13000g离心10min，将无色上清液转入另一个新的无酶离心管中。（2）加入氯仿200μL，振荡15~20s后，室温静置5min，于4°C冷冻离心机中12000g离心15min，将无色上清液（约400~500μL）转入另一个新的无酶离心管中，加入等体积异丙醇，轻柔颠倒，4°C静置10min。（3）于4°C冷冻离心机中12000g离心10min，小心弃上清。（4）加入现配75%乙醇1mL，清洗管壁，轻柔颠倒后，于4°C冷冻离心机中13000g离心5min，弃上清。重复一次。（5）室温干燥3~5min，加入15μLRNasefreeddH2O溶解，所得液体即为总RNA，置于-80°C保存用于后续试验。RNA浓度测定采用NanoDrop2000超微量分光光度计测定RNA浓度和光密度值，OD260/OD280=1.9~2.1，说明RNA纯度良好，无污染，无降解。再用1%的琼脂糖凝胶电泳对样品总RNA进行电泳检测，经凝胶成像系统检验RNA条带，发现28S与18S条带清晰可见，而且前者是后者的两倍，则表明所提取的RNA完整性良好。22 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解2.9.2引物设计与合成根据NCBI中大鼠突触结合蛋白-Ⅰ（SytⅠ）的核苷酸序列，利用引物设计软件PrimerExpress5.0自行设计。内参GAPDH购买自生工公司。引物由擎科创新生物科技有限公司合成。引物序列见表2-1。表2-1SytⅠ引物序列Table2-1PrimersequencesofSytⅠNameAccessionNumberSequenceSytⅠNM_25716F:5’-AACACACTCAACCCCTACTACAA-3’R:5’-GGCATCAACCTCCTCCTCTA-3’2.9.3cDNA样品制备总RNA浓度调整为500ng，按试剂盒操作步骤，冰上配制20μL反转（RT）体系：Step1（RNA热变性）：OligodT1μL（10μM）RandomPrimer1μL（10μM）TotalRNAn（500ng）H2O10-n65°C，5min后，立即置于冰上。Step2（配置反应体系）：第一步变性后的RNA溶液12μL5×RTBuffer4μLdNTPMix（各10mM）2μLRnaseInhibitor（10U/μL）1μLReverTraAce1μLStep3：逆转录反应。条件设置：30°C，10min；42°C，20min；99°C，5min；4°C，5min；瞬间离心。cDNA样品保存于-20°C备用。23 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.9.4引物验证普通PCR扩增：根据PremixTaq说明书，采用50μL体系，在冰上进行溶液配制：PremixTaq（Version2.0plusdye）25μLcDNA4μLForwardPrimer2μLReversePrimer2μLH2O17μLPCR反应条件设置94°C，30s；58°C，30s；72°C，15s；以上条件设置33个循环。72°C，5min；PCR产物4°C保存。PCR产物回收：用PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳试验，验证扩增片段的正确性。扩增目的片段与DNAMarker比对，如初步判定结果准确，则用手术刀片切下目的DNA胶，按照OmegaE.Z.N.ATMGelExtractionKit操作说明回收目的DNA：（1）将切下的DNA胶块转移至新1.5mLEP管中，剪碎；按每100mg凝胶加100μLBindingBuffer的比例溶解凝胶，50~55°C温浴2~3min，定时摇晃使其溶解；加700μLHiBindBuffer混匀。（2）回收柱置于收集管内，并将溶解的凝胶转移至回收柱中，室温10,000g离心1min，弃滤液。（3）加300μLBindingBuffer于回收柱，室温10,000g离心1min，弃滤液。（4）加700μLSPWWashingBuffer，室温10,000g离心1min，弃滤液；重复1次。（5）室温13,000g离心2min，以干燥收集管；回收柱置于另一新的1.5mLEP管，加10~30μLElutionBuffer于回收柱纤维膜中央，室温静置1min，13,000g离心1min，回收目的DNA，-20°C保存。序列比对：将回收目的DNA送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。测序结果，运用美国国立生物技术信息中心（NCBI）Blast软件（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）与已知目的基因序列比较，判定扩增目的片段的准确性。24 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解2.9.5荧光定量PCR采用SYBRⅡ荧光定量Real-timePCR。按试剂盒操作步骤，冰上配制20μL扩增体系：SYBRPremixExTaq（2×）10μLROXReferenceDyeⅠ（50×）0.4μLForwardPrimer（10pM）0.8μLReversePrimer（10pM）0.8μLcDNA模板2.0μLDEPCH2O6.0μLPCR扩增条件按SYBRPremixExTaqⅡ说明书设定：95°C，5s变性；60°C，30s退火；72°C，30s延伸；40个循环，在退火阶段收集荧光信号，用GAPDH作为内参，进行Ct值分析。用2-∆∆Ct法来统计荧光定量PCR的数据结果，其中∆Ct=Mean（Ct目的基因）-Mean（Ct内参基因），∆∆Ct=∆Ct试验组-∆Ct对照组，分析不同组SytⅠ的相对基因水平在相同时间不同组之间的差异。2.10SytⅠ蛋白水平测定2.10.1蛋白印迹总蛋白提取（1）将液氮研磨后的脊髓样品加入装有1mLRIPA细胞裂解液、10uLPMSF和1uL的磷酸酶抑制剂的2mLEP管中进行裂解，剧烈震荡30s，冰上静置30min；（2）于4°C冷冻离心机中13000g离心5min，取上清到新离心管，即总蛋白。置于-80°C保存用于后续实验。蛋白浓度测定BCA法测蛋白浓度：（1）根据用量，按50:1将试剂A与试剂B充分混匀；（2）标准品稀释：用PBS溶解标准品，稀释成2000µg·mL-1的储存液，再将储存液稀释至25~2000µg·mL-1，见表2-2；（3）上样：将25µL标准品和样品分别加入微孔；25 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文（4）每孔加200µLBCA工作液，混匀。盖好96孔板盖，37°C孵育30min；（5）冷却至室温后，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算蛋白浓度。表2-2BCA标准品稀释方法Table2-2DilutionofBCAstandardpreparation管号稀释液体积标准品体积终浓度TubenumberVolumnofdiluentVolumnofstandardsfinalconcentrationsA0µL600µL2000µg·mL-1B100µL300µL1500µg·mL-1C300µL300µL（从A管取）1000µg·mL-1D200µL200µL（从B管取）750µg·mL-1E300µL300µL（从C管取）500µg·mL-1F300µL300µL（从E管取）250µg·mL-1G300µL300µL（从F管取）125µg·mL-1H400µL100µL（从G管取）25µg·mL-1I300µL0µL0µg·mL-1（空白）样品变性将已提好的蛋白上清液按1:4体积比，加上样缓冲液，100°C沸水浴10min，使蛋白变性。13000g，4°C离心5min，分装于200µLEP管，-80°C储存备用。SDS-丙烯酰胺凝胶电泳配制10%分离胶和5%浓缩胶。将制胶玻璃板洗净、干燥组装好，配置10%分离胶5mL倒入制胶板内，表面用移液器加2mLddH2O覆盖防止空气氧化，室温放置30min等待分离胶凝固后，倒掉ddH2O，并用吸水纸吸干胶顶部残留液体。配置5%浓缩胶2mL倒入分离胶上的间隙内，避免气泡，插入干净的梳子，等待浓缩胶凝固，慢慢取出梳子，将胶放入电泳槽内，倒入1×SDS电泳缓冲液。每个样品上样量按30µg总蛋白计算。浓缩胶阶段设定电压80V，约30min；分离胶时，调整电压为120V，约60min，直到预染蛋白标准Marker到达分离胶底部。对照预染蛋白标准Marker，切割胶条，移入转膜缓冲液。转印裁剪PVDF膜，其大小略大于切割的胶条。使用前将PVDF浸于甲醇中活化。取滤纸6张，在转膜缓冲液中充分浸透。转膜装置自下至上依次按照转膜夹（黑色）、海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫的顺序放好，精确对齐，每层均用玻璃棒来回滚动赶出气泡。将固定好的夹子移入转印槽，对准正负极，倒入预冷的1×转膜缓冲液，接通电源，100V转2h。26 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解免疫反应（1）封闭将转印后的膜完全浸入5%BSA封闭液中，室温摇动2.5h；（2）一抗孵育β-actin、SytⅠ抗体稀释度分别为1:1000，1:200。保证抗体稀释液将膜完全覆盖，4°C静置过夜，第二天室温孵育30min。（3）洗膜TBST洗膜，5min×6次；（4）二抗孵育按1:3000稀释二抗，保证膜充分浸润，室温孵育1h；（5）洗膜TBST洗膜，5min×4次；TBS洗膜，5min×1次。发光及条带分析发光：用滤纸吸去膜上多余液体；将MiLLiporeECL化学发光底物试剂盒中的A与B等体积混合，暗室条件下均匀滴于膜上；将膜置于ImageQuantLAS4000minCCD相机下，选择“自动”模式拍照，保存为tif格式。条带分析：用QuantityOne软件分析照片中蛋白条带光密度，目的条带和β-actin条带OD值的比值表示目的蛋白的相对表达量。2.10.2免疫组织化学组织固定：将修整好的L4~L6段脊髓放入脱水框，浸入10%中性甲醛溶液，12h后更换一次10%中性甲醛溶液，固定24h后自来水冲洗6h即可用于免疫组织化学试验。组织脱水透明：75%酒精过夜80%酒精2.5h90%酒精2h95%酒精I1h95%酒精II1h100%酒精I40min100%酒精II30min100%酒精III30min醇苯20min二甲苯10min27 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文组织浸蜡：54~56°C石蜡I45min56~58°C石蜡II45min56~58°C石蜡III45min包埋：将组织从脱水框里面拿出，以横断面前端朝下，端正放入包埋框正中央，倒入石蜡，待石蜡室温冷凝后，敲出包埋好的石蜡组织块，作好标记，备用。载玻片的制备：按照以下流程处理载玻片：新的载玻片泡酸缸→清水冲洗→洗衣粉水清洗→清水冲洗→双蒸水洗3次；60°C烘箱烘干→载玻片涂1:9的多聚赖氨酸，共涂3次，每次涂完后置37°C烘箱烘干；3次涂完烘干后放入片盒备用，室温保存待用。免疫组织化学操作流程：切片、展片、漂片和⠨即将包埋好的组织石蜡切片5μm厚，毛笔轻轻卷好后，首先在30%酒精预展，待肉眼见切片无皱褶时，将切片放入40°C的双蒸水，待其完全展开后贴附于事先备好的载玻片上，保证组织切片无破损、无皱褶，无气泡；捞片后甩干水分，60°C烘片1h，60°C烤片2h，最后60°C烘箱3h保证完全烘干，即可开始免疫组化试验流程。（1）脱蜡至水：二甲苯I3min二甲苯II3min二甲苯III3min100%乙醇I3min100%乙醇II3min95%乙醇I3min95%乙醇II3min90%乙醇3min80%乙醇3min75%乙醇3min双蒸水I5min双蒸水II5min28 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解（2）将切片浸入400mL3%H2O2浸泡20min，消除内源性过氧化物酶，双蒸水洗涤5min，2次；（3）抗原修复：首先将枸盐酸缓冲液在微波炉中加热至沸腾，然后放入切片，保持20min。之后将玻片取出，待其自然冷却后PBS洗涤2min，重复3次；（4）滴加5%BSA，37°C封闭30min；（5）一抗孵育：甩去封闭液，直接滴加稀释好的SytⅠ一抗，4°C孵育过夜。阴性对照滴加PBS替代一抗；次日37°C继续一抗孵育30min；PBS洗涤3min，重复4次；（6）二抗孵育：滴加羊抗小鼠IgG，37°C孵育30min；PBS洗涤3min，重复4次；（7）滴加SABC复合物，37°C孵育30min；PBS洗涤3min，重复3次；（8）DAB显色，在显微镜下观察阳性颗粒的出现及颜色变化，显色结束用双蒸水终止显色；水洗，双蒸水洗涤2min，重复3次；（9）苏木素轻度复染（10~30s），水洗20min；（10）封片：75%乙醇1min80%乙醇1min90%乙醇1min95%乙醇I1min95%乙醇II1min100%乙醇I1min100%乙醇II1min二甲苯I1min二甲苯II1min中性树胶中性树脂封片SytⅠ免疫活性细胞的观测：本试验选择每只大鼠的脊髓组织连续切3张片子以完成免疫组织化学试验，检测SytⅠ阳性细胞数目，其中1张用PBS代替一抗作为阴性对照。显微镜观察，阳性反应可见明显的棕黄色颗粒，阴性反应则不见阳性颗。用NikonDigitalSight图像分析系统进行采图。29 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.11统计学分析大鼠痛阈变化以及SytⅠ的基因和蛋白相对量均用均数±标准差（Mean±SD）表示，并用SPSS17.0统计学软件（SPSSInc.,Chicago，USA）对这些参数进行单因素方差（ANOVA）统计学分析，采用邦弗罗尼（Bonferroni）检验分析法分析不同组间的数据显著性。p<0.05表示差异显著；p>0.05表示差异不显著。30 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解3结果与分析3.1鞘内注射SytⅠ抗体对神经病理痛大鼠机械痛阈的影响大鼠足底痛觉通过测定足底机械痛阈来表示，鞘内注射不同剂量SytⅠ抗体对SNI模型大鼠痛阈影响的结果如图3-1所示：SNI组在7d足底机械痛阈显著低于Sham组（p<0.05），并持续到20d。鞘内注射1μgSytⅠ抗体组和SNI组之间机械痛阈无显著差异。而鞘内注射4μg和8μgSytⅠ抗体组，在8d、14d和20d大鼠痛阈显著高于SNI组和SNI+anti-Syt-1μg组（p<0.05），以SNI+anti-Syt-8μg组机械痛阈升高最显著，但是均显著低于（p<0.05）Sham组。图3-1不同剂量SytⅠ抗体对大鼠机械痛阈的影响（均值±标准差，g，n=6）注：不同字母代表在同一天不同组之间差异显著（p<0.05），相同字母代表差异不显著（p>0.05）。Fig.3-1Theeffectofdifferentdoseanti-SytⅠonpawwithdrawalthresholdofrats(Mean±SD,g,n=6)Note：Thevalueswithdifferentlettersrepresentsignificantdifference(p<0.05)atthesameday，thesamelettersindicatenosignificantdifference(p>0.05).31 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3.2电针对神经病理性疼痛大鼠机械痛阈的影响术后第8天，采用2Hz频率对神经病理痛模型大鼠进行电针处理，电针的镇痛效应如图3-2所示。结果显示Sham组、SNI组和SNI+EA组在造模前（第0天）痛阈无显著差异（p>0.05）。造模后第7天，SNI组和SNI+EA组痛阈显著下降，与Sham组间存在显著差异（p<0.05）。SNI+EA组在电针干预后，大鼠机械痛阈逐渐升高，在14d和20d显著高于SNI组（p<0.05），与Sham组间相比差异不显著（p>0.05），在20d痛阈升高最明显。图3-2大鼠术侧后肢足底机械痛阈的变化（均值+标准差，g，n=6）注：不同字母代表同一天不同组之间差异显著（p<0.05），相同字母代表差异不显著（p>0.05）。Fig.3-2Thepawwithdrawalthresholdoftheratsonhindpawofsurgeryside(Mean±SD,g,n=6）Note:Thevalueswithdifferentlettersrepresentsignificantdifference(p<0.05)atthesameday,thesamelettersindicatenosignificantdifference(p>0.05).32 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解3.3荧光定量PCR3.3.1引物验证提取L4~L6脊髓总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳呈现清晰的3条带，即28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA，表明总RNA质量较好。将总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行普通PCR特异性扩增，用2%琼脂糖凝胶将PCR产物进行电泳试验。结果显示如图3-3，退火温度在55~60°C梯度下都具有特异性条带，并且PCR产物条带大小位置与预期产物大小一致，表明PCR引物的特异性较好。胶回收测序结果用美国国立生物技术信息中心（NCBI）Blast软件和基因库中SytⅠ基因进行比对验证是正确的，见附录论文补充材料。图3-355~60°C之间PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。左侧：DNAMarker；1：ddH2O；2、3和4：SytⅠFig.3-3TheresultsofagarosegelelectrophoresisofPCRproductsatthetemperaturefrom55°Cto60°C.Left:DNAMarker;1:ddH2O;2,3and4:SytⅠ3.3.2电针对大鼠脊髓SytⅠ基因表达水平的影响根据起始于L4~L6段脊髓的坐骨神经支配大鼠后肢的感觉和运动的原理，本试验对各组大鼠脊髓L4~L6段的SytⅠ基因检测，结果如图3-4。SNI组SytⅠ基因表达在8d、14d和20d高于Sham组但无显著差异（p>0.05）。SNI+EA组在8d、14d和20dSytⅠ基因与SNI组和Sham组均无显著差异（p>0.05）。33 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图3-4大鼠脊髓SytⅠ的基因水平变化（均值±标准差，n=6）Fig.3-4ThemRNAexpressionlevelsofSytⅠinspinalofrats(Mean±SD,n=6)3.4电针对大鼠脊髓SytⅠ蛋白表达水平的影响电针干预神经病理性疼痛模型大鼠脊髓SytⅠ蛋白表达水平如图3-5所示。与Sham组相比，SNI组大鼠脊髓SytⅠ蛋白在8d、14d和20d显著升高（p<0.05）。SNI+EA组大鼠脊髓SytⅠ蛋白在14d和20d显著低于SNI组（p<0.05），且与Sham组相比差异不显著（p>0.05）。图3-5大鼠脊髓SytⅠ的蛋白水平变化（均值±标准差，n=6）注：不同字母代表同一天不同组之间差异显著（p<0.05）。Fig.3-5TheproteinlevelsofSytⅠinthespinalofrats(Mean±SD,n=6)Note：Thevalueswithdifferentlettersrepresentsignificantdifference(p<0.05)atthesameday.34 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解3.5免疫组织化学免疫组织化学结果显示SytⅠ主要在脊髓背角Ⅰ和Ⅱ层表达，如图3-6所示，其阳性表达趋势与蛋白免疫印迹结果一致。SNI组在8d、14d和20d大鼠脊髓SytⅠ阳性表达量高于Sham组。电针干预后，与SNI组相比，SNI+EA组的大鼠脊髓SytⅠ阳性表达量逐渐减少，并且在14d和20d减少最明显。图3-6同时段各组大鼠脊髓背角SytⅠ免疫活性细胞变化Fig.3-6TheSytⅠimmunopositivecellsinspinalofratsindifferentgroupsatthesametime35 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文4讨论4.1疼痛模型的选择与建立疼痛是机体在受到伤害性刺激为防止进一步损伤而产生的一种不愉快的感觉。根据疼痛周期的长短分为急性疼痛和慢性疼痛，目前临床上常见的慢性疼痛主要包括炎性疼痛和神经病理性疼痛。其中神经病理性疼痛的发生机理复杂，缺乏有效的治疗手段，影响动物和人的躯体健康及精神健康。通过神经损伤手术建立神经病理性疼痛动物模型模仿临床上神经疼痛疾病，有利于探究神经病理痛的发病机理并为临床治疗手段指引新的方向。目前应用于研究的神经病理性疼痛大鼠模型主要包括：坐骨神经慢性压迫性损伤模型（CCI模型）（BennettandXie1988），脊神经结扎模型（SNL模型）（KimandChung1992）以及坐骨神经分支选择性损伤模型（SNI模型）（DecosterdandWoolf2000）。和CCI及SNL模型性比较，SNI模型是最新建立的，该手术方法操作简单，模型建立成功后痛觉过敏和痛觉超敏时间可以持续超过6个月，可重复性高，和临床上神经损伤引起的痛觉超敏很相似（沈立姿等2013）。因此本试验选择通过结扎剪断坐骨神经分支中的胫神经和腓总神经来建立神经病理性疼痛模型大鼠（SNI模型）。神经病理疼痛模型大鼠足底痛阈值的测定方法有多种，目前主要是通过对热缩足潜伏期（Hargreavesetal1988）、冷刺激触诱发痛（Choietal1994）和机械缩足痛阈（TalandBennett1994）的测定来确定的。Decosterd和Woof（2000）通过对热源反应的热缩足潜伏期、丙酮诱导的冷刺激诱发痛及VonFrey纤维丝刺激引起的机械缩足痛阈等方法来确定SNI模型大鼠痛觉行为，发现SNI模型大鼠对机械性刺激敏感，而对温度刺激引起的反应不敏感。Erichen和Blackburn-Munro（2002）的研究结果与此类似。因此，本试验采用了足底触觉测定来反应SNI模型大鼠机械痛觉超敏的现象。将大鼠放在有机透明玻璃隔板内，待大鼠安静后，采用大鼠足底触觉测定仪的VonFrey纤维丝，用适宜力度均匀垂直向术侧足底施加压力，以引起大鼠术侧肢抬脚或舔足的力度为痛阈值。该方法可控性好，并且对大鼠的伤害性刺激小。本试验结果显示，术前各组大鼠之间的基础机械痛阈无显著差异。术后第7天，SNI组大鼠足底痛阈显著下降，从基础值30.23±1.63g下降到12.68±0.35g，并且机械36 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解超敏现象持续到20d，与Zeng等（2016）的研究结果一致，该结果提示SNI造模成功，且模型可重复性高。4.2突触结合蛋白-Ⅰ对SNI模型大鼠痛阈的影响目前认为神经病理性疼痛大鼠脊髓背角的中枢敏化现象的产生与兴奋性氨基酸的释放，尤其是谷氨酸的释放有关。谷氨酸是兴奋性神经递质之一，当外周神经损伤后，脊髓谷氨酸释放增加，作用于突触后相应受体，促使神经元兴奋性增加，最终导致中枢敏化现象从而形成机械痛敏（KawamataandOmote1996）。SytⅠ广泛分布于中枢神经元的突触前囊泡膜上，通过与SNAREs复合体结合参与突触囊泡膜与质膜的融合过程进而影响突触前囊泡神经递质的释放过程（Bhallaetal2006;Daietal2007;TuckerandChapman2002）。目前发现SytⅠ的表达变化主要与学习记忆和突触功能可塑性有关。然而，SytⅠ在其他神经源性疾病的作用很少报道。体外研究发现，SytⅠ可以促进神经突生长，使突触发生可塑性变化（FukudaandMikoshiba2000;Kabayamaetal1999;Mikoshibaetal1999）。果蝇SytⅠ基因敲除试验表明突触囊泡的总数量下降，导致与细胞膜锚定的囊泡数量显著下降（Reistetal1998）。Nishiki和Augustine（2004）在SytⅠ基因敲除鼠中发现海马神经元中谷氨酸快速同步释放显著减少了。研究表明非顽固性癫痫组和空白对照组病人相比，SytⅠ在顽固性癫痫病人的颞叶中表达量显著升高；而谷氨酸在癫痫活动的形成和维持起到非常重要的作用，基于SytⅠ在神经元中胞吞作用和胞吐作用的基础上，作者根据其结果推断出SytⅠ的高表达可能是通过促进脑中谷氨酸的释放进而来维持和发展癫痫活动（Properetal2002;Xiaoetal2009）。另外，有大量的研究证实脊髓中谷氨酸含量增加是引起神经病理性疼痛痛觉超敏的主要原因（Brann1995;Liawetal2005;Yanetal2011）。提示SytⅠ蛋白表达变化可能与大鼠神经病理性疼痛痛觉超敏的形成有关。在本试验中，SNI模型建立后，足底机械痛阈显著下降。由于注射抗体浓度未见有报道，所以鞘内注射不同剂量（1µg、4µg和8µg）的SytⅠ抗体，发现可以剂量依赖性的增加SNI模型大鼠的机械痛阈，显示SytⅠ抗体通过撷抗SytⅠ的表达来缓解神经损伤引起的机械痛觉超敏现象，表明SytⅠ的表达变化与大鼠神经病理性疼痛的形成有关。37 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文4.3电针穴位的选择根据传统中医理论，穴位针灸的主治作用之一体现在“经络所通，主治所及”。“足三里”和“三阴交”是临床上常用针刺治疗疾病的穴位。“足三里”是足阳明胃经穴位，按照其所在经脉走向，足三里从头走足交足三阴经，再通过三阴交穴从足走腹胸到手最后到头，形成一个循行路线，而两者均有理气止痛的功效，是针刺镇痛选用的经典穴位。通过HIS诱导内脏超敏模型大鼠，采用2Hz/100Hz不同频率交替刺激“膏肓”穴或“足三里”穴30min，结果发现电针处理大鼠“足三里”能够显著减轻内脏超敏现象，而作用于大鼠“膏肓”穴却无显著镇痛效果（Zhouetal2012）。Kim（2012）等报道2Hz电针干预弗氏完全佐剂（CFA）诱导的炎性痛模型大鼠的“足三里”和“三阴交”，30min/次，与对照组相比，电针能够逆转CFA诱导形成的痛觉过敏，从而产生良好的镇痛效果。电针刺激SNL模型大鼠双侧“足三里”和“三阴交”，可以显著降低神经病理性痛觉超敏的现象并且具有持续的镇痛效果（Lauetal2010）。这些结果表明电针“足三里”和“三阴交”可以减轻包括神经病理痛在内的不同类型的疼痛，因此，本试验选择双侧“足三里”和“三阴交”作为电针治疗SNI大鼠的穴位。4.4电针参数的选择电针是在传统手针的基础上进行改良的一种新的针刺疗法，其优点在于电针参数（频率、强度和时间）的设置可被量化和控制，在临床应用上操作方便，镇痛效果明显。研究表明电针镇痛不仅与针刺穴位的选择有关，还与电针参数的选择有紧密的关系。频率：电针脉冲频率是指每秒钟发出的脉冲波数。大量研究发现不同频率电针刺激对不同性质疼痛的治疗效果不同。蒋袁絮等（2001）在选择不同频率电刺激CFA模型的基础上，发现100Hz电针刺激的镇痛效果要优于2Hz电针刺激的镇痛效果。杜俊英等（2015）分别用2Hz、100Hz及2Hz/100Hz电针处理Wallker256建立的骨癌痛大鼠，结果表明这三种频率刺激镇痛效果之间无差异。而周杰等（2016）术后4d开始，对SNL大鼠分别进行2Hz、15Hz、50Hz、100Hz和120Hz电刺激干预，隔天一次，连续治疗五次，结果表明电针施予2次时，与2Hz、15Hz和50Hz电针镇痛效果相比，100Hz及120Hz电针的镇痛效果较好，说明高频电针具有即时38 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解镇痛效应；电针施予5次时，2Hz电针镇痛作用较其它几种频率的镇痛作用好，提示多次2Hz低频电针刺激可以显著降低大鼠痛觉超敏现象，并且具有累加作用。Sun等（2002）通过建立SNL模型大鼠，也表明2Hz低频电针缓解神经源性大鼠痛觉超敏的效果较100Hz高频镇痛效果好。这些结果提示电针在治疗炎性痛方面，高频（100Hz）电针效果好于低频（2Hz）电针；在治疗骨癌痛方面低频和高频的效果之间差异无显著；而在神经病理性疼痛方面，2Hz电针刺激比100Hz的镇痛效果好，且易出现镇痛累加效应，有助于慢性疼痛的长期治疗。因此，本试验采用2Hz低频电针处理SNI大鼠，结果表明2Hz低频电针处理SNI大鼠能够显著提高神经病理性疼痛大鼠机械痛阈。强度：中医针刺特定穴位时，讲究“得气感”即能使被刺者产生酸、麻、胀、重等感觉，针刺部位的肌肉会出现节律性的收缩。临床上应用电针刺激强度的范围是有一定限制的，强度过大会引起试验动物不适的感觉不易被接受，而强度过低镇痛效果不佳。因此，理论上电针适宜的刺激强度应该是介于“感觉阈”和“痛阈”之间。韩济生（1994）指出电针刺激强度的变化在3mA以下、波宽在0.1~1.0ms之间、频率在1~100Hz之间为宜。刘俊岭等（2006）通过在CCI模型神经病理性疼痛大鼠上分别采用1mA和5mA电针刺激强度进行干预，结果表明1mA低强度电针的镇痛效果较5mA高强度电针的镇痛效果好。庄晟坚等（2015）也在对近十几年以来电针治疗疼痛性疾病的综述中指出对于慢性类疼痛如炎性痛、骨癌痛及神经病理性疼痛，以中低（1~3mA）强度刺激为佳。因此本试验采用1~3mA进行电针刺激。时间：目前认为电针镇痛的时效与单次电针时长、间隔时间和疗程等因数有关。叶建红等（2002）通过观察持续不同时间电针刺激大鼠中枢的cGMP含量的影响，发现单次电针15~45min后，大鼠痛阈升高，以30min最为显著，提示电针的镇痛效应以30min左右最佳。罗非和韩济生（1994）利用4%白陶土混悬液和2%鹿角菜胶溶液注射大鼠足底诱导的单发性关节炎疼痛模型，给予单发性疼痛模型大鼠电针2/15Hz电针30min，间隔1h，连续三次，镇痛效果逐渐增加，而间隔4h，连续3次，镇痛的累加效应消失。王贺春等（2002）采用不同频次电针治疗CCI模型神经病理性疼痛大鼠，发现给予其1次/d针刺刺激无镇痛累加效应，给予其1次/2d刺激、1次/3d刺激及1次/4d刺激均具有显著的累加效果，而且对机械疼痛的镇痛后效应39 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文可以持续1d。刘长宁等（1997）在电针治疗坐骨神经夹伤引起的痛觉过敏模型大鼠的研究中，给予隔一天电针一次、隔两天电针一次，持续一个月，也发现隔一天一次电针能减弱痛敏，而隔两天一次电针不能降低痛敏。这些结果表明电针治疗神经病理性疼痛的间隔时间以间隔一天为最佳。另外，也有研究发现连续电针不仅不能起到较好的镇痛效果，反而效果会减弱，即出现电针耐受。本实验室Cui等（2017；2016）采用2Hz电针，每天一次，30min/次，连续8d，发现在第6天开始，EA组鼠尾痛阈变化率与假针组相比显著不差异，针刺耐受形成，表明连续几天电针会使电针镇痛效果降低。因此，本试验从术后8d开始，电针处理SNI大鼠，30min/次，每两天一次，共7次。结果显示电针的镇痛效果随着电针次数的增加逐渐加强，术后第8天开始，SNI+EA组大鼠机械痛阈从14.16±1.78g逐渐升高至31.37±2.19g，并且基本恢复至基础痛阈值。结果表明电针能够显著提高SNI大鼠的足底机械痛阈，进而缓解神经病理痛，且具有累加效应。4.5电针对大鼠脊髓突触结合蛋白-Ⅰ表达水平的影响中枢神经系统中，脊髓作为疼痛信息传导和整合的初级中枢，它通过感觉传入纤维Aβ、Aδ以及C类将外周伤害性信息和脑的中枢神经系统进行联系，形成上行传导通路。研究发现如果把大鼠脊髓胸椎上部（T3水平）切断，然后在“足三里”穴位给予电针干预，却不能引起甩尾阈值的升高，即使加强电针的频率和电压，也不能引起甩尾阈值的升高（韩济生1984），说明脊髓及脊髓以上的各级中枢在电针镇痛中具有重要作用。当周围神经发生损伤后，传导非伤害性刺激的低阈值Aβ纤维开始向传导伤害性刺激的高阈值脊髓背角Ⅱ层长芽并支配该浅层的C类纤维，并且Aβ纤维开始合成兴奋性的神经递质如谷氨酸和P物质等，导致接收伤害性刺激的高阈值Ⅱ层神经纤维开始接收非伤害性刺激的低阈值痛信号，从而形成中枢性痛觉超敏。有研究发现炎性痛大鼠脊髓中谷氨酸和P物质大量分布于脊髓背角Ⅰ，Ⅱ及Ⅴ层（Ohtorietal2002），能够促进痛觉过敏的形成和发展。突触间隙中谷氨酸的正常水平对维持正常兴奋性突触传递是必需的，但是谷氨酸浓度过高，会使突触传递异常并且对突触后神经元也会带来不良后果。研究表明细胞外持续高浓度谷氨酸会导致兴奋性毒性细胞死亡（LiptonandRosenberg1994）。近年来有研究表明，EA可以通过减少SNI模型大鼠脊髓突触间隙中的谷氨酸含量来减轻痛觉超敏和异40 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解常性疼痛。Ma等（2008）报道与对照组相比，SNI模型大鼠脊髓背角微透析液中谷氨酸含量显著增加，痛敏显著增高，而电针处理SNI模型大鼠后显著抑制了脊髓背角中谷氨酸的释放，且机械痛阈显著提高。表明电针通过抑制谷氨酸的表达缓解了神经病理性疼痛。Jia等（2010）报道产前应激后子代大鼠海马中椎体神经元树突会萎缩，结果提示出现这一现象是因为子代大鼠海马中SytⅠ表达量升高促进谷氨酸释放增加，从而使神经元过度兴奋最终导致树突萎缩的形成。SytⅠ基因敲除鼠试验发现中枢神经元中谷氨酸释放减少了（NishikiandAugustine2004），这些研究结果表明谷氨酸的释放与SytⅠ的表达有关。而且Hu等（2018）通过急性电针山羊后，采用高通量核酸测序发现SytⅠ基因有差异变化。基于以上的研究结果推测电针降低SNI模型大鼠脊髓中谷氨酸的含量起到镇痛作用可能与SytⅠ的表达量有密切关系。在本试验中，利用鞘内注射SytⅠ抗体撷抗SytⅠ表达证实SytⅠ参与了神经病理性疼痛的形成。利用蛋白免疫印迹方法检测SytⅠ发现，术后8d、14d和20d，SNI组大鼠脊髓SytⅠ的表达量显著高于Sham组（p<0.05）；而电针干预SNI大鼠在14d和20d能够显著降低脊髓中SytⅠ的表达，与Sham组之间差异不显著（p>0.05），且机械痛阈显著升高。结果表明电针可能是通过抑制SytⅠ的表达来减少谷氨酸的释放，最终达到减轻神经病理性疼痛的作用，且发现SNI大鼠SytⅠ免疫活性细胞主要在脊髓背角Ⅰ和Ⅱ层增加，电针后SNI大鼠脊髓背角Ⅰ和Ⅱ层SytⅠ的表达量下降。另外在本试验的结果中发现，在基因水平上，整个试验过程中，同时段各组SytⅠ基因无显著变化，SytⅠ基因与蛋白表达趋势不一致。Cui等（2016）报道指出单次电针处理大鼠后，与0h同组进行比较，整个试验过程中脊髓GLAST和GLT-1的mRNA没有变化，但是蛋白水平却在2~8h都显著升高且在4h达到峰值；EAAC1的mRNA水平在1~8h显著升高且在2h达到峰值，而EAAC1蛋白水平在2~4h显著升高。因此，基因与蛋白不一致的这种差异可能与基因和蛋白的表达时程规律不一致及转录后调控有关。慢性神经病理性疼痛的形成和维持是由于损伤神经处兴奋性神经递质释放增多引起的。目前电针对神经病理性疼痛缓解的非阿片肽机制主要是通过对脊髓谷氨酸、P物质、谷氨酸受体以及谷氨酸转运体等的调节来实现的。而电针是如何调节这些兴奋性递质来缓解神经病理痛的还有待于进一步的研究。本研究发现脊髓突触结合41 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文蛋白-Ⅰ参与大鼠神经病理性疼痛的形成而电针可以下调大鼠脊髓突触结合蛋白-Ⅰ的表达进而缓解神经病理性疼痛的现象，为电针缓解神经病理性疼痛的机制研究提供了一个新的方向，期待以后更进一步的研究突触结合蛋白-Ⅰ在电针对神经病理性疼痛的脊髓及脊髓以上水平的中枢机制。5结论本研究通过坐骨神经分支选择性损伤手术建立神经病理性疼痛（SNI模型）大鼠，探究脊髓SytⅠ在大鼠神经病理性疼痛中的作用，以及电针对SNI大鼠足底痛阈和脊髓SytⅠ表达变化的影响，得出以下结论：对SNI模型大鼠给予鞘内注射0µg、1µg、4µg和8µgSytⅠ抗体，发现注射4µg和8µgSytⅠ抗体撷抗SytⅠ的表达减轻了神经病理性疼痛大鼠机械痛觉超敏现象且呈剂量依赖性，说明SytⅠ参与神经病理性疼痛的形成。SNI+EA组大鼠在14d和20d足底痛阈显著高于SNI组，与Sham组无显著差异，在20d足底痛阈升高最明显，表明电针可以缓解神经病理性痛觉超敏的现象，且呈现一定的累加效应。SNI组大鼠脊髓SytⅠ的蛋白表达量在8d、14d和20d显著升高，而SNI+EA组大鼠脊髓SytⅠ的蛋白表达量在14d和20d显著低于SNI组，与Sham组无显著差异，表明电针可能通过抑制SNI大鼠脊髓SytⅠ的表达来缓解神经损伤引起的中枢敏化，从而起到镇痛效果。6研究创新点本研究基于电针是否通过调节SytⅠ的表达来缓解神经病理性疼痛而设计的。通过对神经病理性疼痛模型大鼠鞘内注射SytⅠ抗体撷抗SytⅠ表达，首次发现SytⅠ参与神经病理性疼痛的形成。通过qPCR、WesternBlot以及免疫组织化学等方法检测电针处理神经病理性疼痛模型大鼠脊髓SytⅠ的表达变化，首次揭示了电针通过抑制神经病理痛大鼠脊髓SytⅠ的表达缓解了神经病理性疼痛，阐明电针缓解神经病理性疼痛的中枢机制。42 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突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解附录补充材料附录1SytⅠ引物PCR产物测序结果Appendix1ThesequencingresultsofPCRproductoftheSytⅠprimerSytⅠForwardprimerPCR产物序列:GGTACTGCTTGAGTTCGTTCGAGCAATCCAGAAAGTGCAAGTGGTGGTAACTGTTTTGGACTATGACAAGATTGGCAAGAACGACGCCATCGGCAAAGTCTTCGTTGGTTACAACAGCACTGGGGCGGAGCTGCGACACTGGTCAGACATGCTGGCCAACCCCCGGCGACCCATCGCACAGTGGCACACTCTGCAGGTAGAGGAGGAGGTTGATGCCAAAAGTGGGAGSytⅠReverseprimerPCR产物序列:CACGAGGATCGCGAGGGTCGCCGGGGGTTGGCCAGCATGTCTGACCAGTGTCGCAGCTCCGCCCCAGTGCTGTTGTAACCAACGAAGACTTTGCCGATGGCGTCGTTCTTGCCAATCTTGTCATAGTCCAAAACAGTTACCACCACTTGCACTTTCTGGATTTGCTCGAACGGAACTTCAAAGCTGAAGGACTCGTTGTAGTAGGGGTTGAGTGTGTTAAAAGGAGGGTGG附录2PCR产物NCBI比对结果Appendix2TheNCBIBlastresultsofPCRproductSytⅠ上下游引物PCR产物序列NCBI比对结果如图1和图2所示:图1上游引物PCR产物比对结果NCBI比对结果Fig.1TheNCBIBlastresultsoftheforwardprimerPCRproduct53 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图2下游引物PCR产物NCBI比对结果Fig.2TheNCBIBlastresultsofthereverseforwardprimerPCRproduct54 突触结合蛋白-Ⅰ参与电针对大鼠神经病理痛的缓解附录发表论文1.HuM-L,ZhouF-Y,LiuJ-J,DingY,ZhongJ-M,DingM-X.ElectroacupunctureInhibitstheActivationofp38MAPKintheCentralDescendingFacilitatoryPathwayinRatswithInflammatoryPain.Evid.-basedComplementAltern.Med,2017:1-10.55 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文致谢三年前，我怀着对兽医临床的热爱，来到华中农业大学兽医外产科实验室学习。在这期间，有过困难，有过挫折，但正是因为这些磨炼让我学到了很多东西，提升了自己的学习和解决问题的能力。在此要特别感谢老师、同学和家人们这三年来对我的关心和帮助。首先要特别感谢我的导师丁明星教授在学习和生活上的关心。从论文课题的选题、方案设计、试验实施、结果分析到文章撰写，丁老师都给予了悉心的指导。丁老师科研经验丰富，思维缜密，科学态度严谨，知识范围广泛，英语写作能力强，兽医外科技术尤其精湛，在课题完成期间，给了我们实质性的建议和帮助，让我们充满了对学习的渴望，是大家学习的榜样。在即将圆满完成研究生生涯之前，感谢丁老师的悉心培养。感谢外产科课题组丁一副教授、胡长敏副教授、陈建国副教授、韩丽老师副教授和刘东明讲师在学习和生活上的关心和帮助，感谢邓干臻教授、李家奎教授、周东海副教授、沈瑶琴副教授和邱昌伟副教授等老师在专业课程上的指导及课题研究上的帮助。感谢陈荣师兄、胡曼丽师姐、万娟师姐、朱红梅师姐、冯艳师姐、李小静师姐、娄同岱师兄、陈舒怀、李蒙、宋鸽、董俊、王周祥、田杭宇、索传广、孙晋睿、明洁、张秋林、南沙、杨力果等同学在试验和生活上的帮助，感谢大家在科研生活中陪伴。感谢我的家人多年来对我的支持，感谢你们无怨无悔地给我提供物质基础和精神支持，帮助我克服困难，是你们的支持和鼓励使我顺利完成了学业。感谢周围的朋友，谢谢你们一直以来的陪伴和照顾。最后感谢评阅老师，谢谢各位老师在百忙之中提供的宝贵意见和建议。刘京京2018年6月56