马齿苋合剂水提液抗单纯疱疹病毒2型的实验研究

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1、马齿苋合剂水提液抗单纯疱疹病毒2型的实验研究作者：刘建国，喻国华，廖燕，曾怡春【摘要】　　目的观察马齿苋合剂水提液对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的抑制作用。方法马齿苋水提液作用于Hep-2、Vero细胞和原代兔肾(PRK)3种细胞上研究其抗病毒作用。结果马齿苋合剂水提液在Hep-2、Vero细胞和PRK细胞上均有明显的抗HSV-2作用，对HSV-2的最小有效浓度(MTC)为0.5mg／ml，而且毒性低，最大无毒浓度(TDO)为12mg／ml，治疗指数(TI)为30.0，并有直接杀灭HSV-2的作用。结论马齿苋合剂水提液具有抗HSV-2

2、作用。【关键词】马齿苋合剂水提液单纯疱疹病毒2型　　Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitiveeffectofPurslanemistureisturePurslanemisturepossesseddistinctanti-HSV-2effect．TheMTCg／ml，TDOg／ml，andTIistureistureplexvirus2(HSV-2);Experimentalstudy　　HSV-2是一种常见的传染性病原体，可引起生殖道疱疹、病毒性脑炎等多种疾病，而且是宫颈癌的协同诱因。马齿苋Por

3、tulaca'oleraceaL．又名马齿草(《雷公炮炙论》)，马苋(《本草经集注》)，长命菜(《中国药用植物图鉴》),为马齿苋科植物马齿苋的全草，生于田野路边及庭院废墟等向阳处，分布于全国大部分地区。国内对马齿苋的研究［1］多集中于马齿苋的化学成分和抗菌作用的研究,但有关马齿苋合剂水提液的抗病毒实验研究很少。本文对马齿苋合剂水提液抗单纯疱疹病毒2型的药效进行了实验研究。现报道如下。　　1材料　　1.1细胞　　Hep-2、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和原代兔肾细胞（PRK）3种细胞引自江西省卫生防疫站，均用Eagle培养基传代培养。P

4、RK取自10d内的乳兔，常规方法制备细胞，用5％乳蛋白水解物培养。　　1.2病毒　　HSV-2333株由南昌大学医学院病毒研究所提供，Vero细胞于RPMI-1640基础培养液中加入10％的新生牛血清，100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素，置5％CO2孵箱中37℃培养，3d传代1次。滴度为TCID50=105，实验用103TCID50／ml。　　1.3药物　　马齿苋(购于江西中医药高等专科学院附属医院中药房)40g，配合黄芪60g，放入500ml三角烧瓶，加入双蒸水200ml浸泡过液，经水连续提取3次，合并3次提取液共400ml

5、，56℃水浴浓缩至100ml，抽滤除菌，分装小瓶放-20℃冰箱保存备用。无环鸟苷滴眼液(ACV)(湖北潜江制药股份有限公司生产，批号H19993456)，用Hank's稀释成不同浓度，放置冰箱保存备用。　　2方法　　2.1细胞毒性实验　　将已长满单层的Hep-2细胞、Vero细胞和PRK去生长液，换成含2％小牛血清的MEM维持液，每瓶细胞分别加入不同浓度的马齿苋合剂水提液(0.5～12mg／m1)0.1ml，每一浓度的药物均重复4瓶，并设未加药物的细胞做正常对照。置37℃培养箱中培养l44h，每天观察细胞的变化情况，并记录结果。　　2.

6、2病毒感染性滴度的测定　　将不同稀释度的HSV-2接种细胞，每管0.1ml，每个稀释度4瓶，37℃吸附1h，弃上清液，加2％小牛血清的MEM培养液1ml，置37℃培养，每日检查病毒生长情况，观察特征性细胞病毒(CPE)，7d后记录结果。CPE记录方法：“-”为无CPE；“±”为可疑；“+”为25％的细胞出现CPE；“++”为50％的细胞出现CPE；“+++”为75％的细胞出现CPE；“++++”为100％的细胞出现CPE。　　2.3药物体外对病毒增殖的抑制作用　　将病毒接种于已长满单层的细胞瓶上，每瓶接种103TCID50／mlHSV-

7、2病毒液0.1ml，37℃吸附1h，弃上清液后，Hank's液洗3次，每一瓶加入含不同浓度的药物0.1ml，加维持液0.9ml，每个浓度药物均重复4瓶，并设置未加药物的病毒对照和细胞对照。然后置37℃培养箱中培养。每日观察CPE，当病毒对照达到“++++”时，判定结果，使病变减少两个“+”为有效。　　2.4药物对病毒的直接杀伤作用　　将不同浓度的药物与103TCID50／ml病毒液等量混合后于37℃培养12，24，48和96h后，将混合液分别接种长满单层的瓶内，每一浓度的药物均重复接种4瓶，每瓶接种0.2ml，放37℃吸附1h，用Han

8、k's液洗3次，加维持液1ml，置37℃培养箱中培养。同时做细胞对照、阴性对照、病毒对照，放37℃培养12，24，48h和96h后观察并记录结果。　　2.5药物对病毒感染的阻断作用　　将不同浓度的药物加入细