马齿苋合剂水提液抗单纯疱疹病毒2型的实验研究论文

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1、马齿苋合剂水提液抗单纯疱疹病毒2型的实验研究论文刘建国，喻国华，廖燕，曾怡春【摘要】目的观察马齿苋合剂水提液对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的抑制作用。方法马齿苋水提液作用于Hep-2、Vero细胞和原代兔肾(PRK)3种细胞上研究其抗病毒作用。结果马齿苋合剂水提液在Hep-2、Vero细胞和PRK细胞上均有明显的抗HSV-2作用，对HSV-2的最小有效浓度(MTC)为0.5mg／ml，而且毒性低，最大无毒浓度(TDO)为12mg／ml，治疗指数(TI)为30.0.freelistureisturePur

2、slanemisturepossesseddistinctanti-HSV-2effect．TheMTCg／ml，TDOg／ml，andTIistureistureplexvirus2(HSV-2);ExperimentalstudyHSV-2是一种常见的传染性病原体，可引起生殖道疱疹、病毒性脑炎等多种疾病，而且是宫颈癌的协同诱因。马齿苋Portulaca'oleraceaL．又名马齿草(《雷公炮炙论》)，马苋(《本草经集注》)，长命菜(《中国药用植物图鉴》),.freell青霉素，100μg／ml链霉素

3、，置5％CO2孵箱中37℃培养，3d传代1次。滴度为TCID50=105，实验用103TCID50／ml。1.3药物马齿苋(购于江西中医药高等专科学院附属医院中药房)40g，配合黄芪60g，放入500ml三角烧瓶，加入双蒸水200ml浸泡过液，经水连续提取3次，合并3次提取液共400ml，56℃水浴浓缩至100ml，抽滤除菌，分装小瓶放-20℃冰箱保存备用。无环鸟苷滴眼液(ACV)(湖北潜江制药股份有限公司生产，批号H19993456)，用Hank's稀释成不同浓度，放置冰箱保存备用。2方法2.1细胞毒性

4、实验将已长满单层的Hep-2细胞、Vero细胞和PRK去生长液，换成含2％小牛血清的MEM维持液，每瓶细胞分别加入不同浓度的马齿苋合剂水提液(0.5～12mg／m1)0.1ml，每一浓度的药物均重复4瓶，并设未加药物的细胞做正常对照。置37℃培养箱中培养l44h，每天观察细胞的变化情况，并记录结果。2.2病毒感染性滴度的测定将不同稀释度的HSV-2接种细胞，每管0.1ml，每个稀释度4瓶，37℃吸附1h，弃上清液，加2％小牛血清的MEM培养液1ml，置37℃培养，每日检查病毒生长情况，观察特征性细胞病毒(

5、CPE)，7d后记录结果。CPE记录方法：“-”为无CPE；“±”为可疑；“+”为25％的细胞出现CPE；“++”为50％的细胞出现CPE；“+++”为75％的细胞出现CPE；“++++”为100％的细胞出现CPE。2.3药物体外对病毒增殖的抑制作用将病毒接种于已长满单层的细胞瓶上，每瓶接种103TCID50／mlHSV-2病毒液0.1ml，37℃吸附1h，弃上清液后，Hank's液洗3次，每一瓶加入含不同浓度的药物0.1ml，加维持液0.9ml，每个浓度药物均重复4瓶，并设置未加药物的病毒对照和细胞对照

6、。然后置37℃培养箱中培养。每日观察CPE，当病毒对照达到“++++”时，判定结果，使病变减少两个“+”为有效。2.4药物对病毒的直接杀伤作用将不同浓度的药物与103TCID50／ml病毒液等量混合后于37℃培养12，24，48和96h后，将混合液分别接种长满单层的瓶内，每一浓度的药物均重复接种4瓶，每瓶接种0.2ml，放37℃吸附1h，用Hank's液洗3次，加维持液1ml，置37℃培养箱中培养。同时做细胞对照、阴性对照、病毒对照，放37℃培养12，24，48h和96h后观察并记录结果。2.5药物对病毒

7、感染的阻断作用将不同浓度的药物加入细胞瓶内，置37℃作用48h和72h，弃上清液，用Hank's液洗3次，然后接种103TCID50／ml病毒0.1ml，37℃吸附1h，用Hank's液洗3次，加2％小牛血清的维持液1ml，置37℃培养箱中培养96h观察结果。每一实验均设细胞对照、病毒对照、药物对照及阳性对照。结果判定：如果细胞对照生长良好，加药物的细胞不出现细胞病变(CPE)，说明药物能抑制病毒增殖，即药物有抗病毒作用；否则，无抗病毒作用；当病毒对照达到“++++”判定结果，以能抑制50％细胞产生病变的

8、药物浓度为有效抑制病毒浓度。3结果3.1药物毒性实验用Hank's液将马齿苋合剂水提液稀释为0.50，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0，10.0，12.0mg／ml，分别加入Hep-2细胞、Vero细胞和PRK中，培养144h后，细胞形态规则，排列紧密有序，每一浓度组对每种细胞均无毒性作用，最大无毒剂量12mg／ml。结果见表1。表1马齿苋水提液的细胞毒性和CPE的抑制作用（略）3.2马齿苋合剂水提液对病毒所致的