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时间:2018-11-20
《hv单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白1a8 scfv-cκ-p的构建和表达论文》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、HV单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1A8ScFv/Cκ/P的构建和表达论文陈锐,杨洁,张芳琳,秦炜炜,王涛,张瑞,孟艳玲,胡刚.freeline,P)是一种碱性蛋白,截短至22个(8~29)富含碱性氨基酸片段仍然保留着核酸结合功能.单链抗体(singlechain,scFv),分子小,穿透力强,免疫原性低,有导向载体功能.我们构建和表达一种由汉坦病毒(Hantavirus,HV)核蛋白的单链抗体(1A8scFv)和鱼精蛋白片段组成的融合蛋白1A8ScFv/Cκ/P,以期获得具有抗原结合活性和核酸结合活性的1A8ScFv/Cκ/P融合蛋白.1材料和方法1.1材料1A
2、8VHLGL/EM培养液,37℃,50mL/LCO2培养箱中培养7d.待细胞长满孔板,去培养液,用2.5mL/L戊二醛固定10min.在孔中分别加入100μL不同稀释梯度的蛋白样品,37℃孵育1h.加入鼠抗6HismAb(1∶10000稀释),37℃孵育1h.加入底物液100μL/孔,37℃,10min显色,终止反应后测定各孔A492nm值.1.2.6融合蛋白的核酸结合活性检测采用凝胶迁移阻滞实验.将1μg线性化质粒DNA分别与不同量的1A8ScFv/Cκ/P融合蛋白于0.2mol/LNaCl溶液中室温孵育30min,10g/L琼脂糖凝胶电泳分离,观察结果.2结
3、果2.1重组表达载体的构建及鉴定PCR分别扩增出长度为750bp的HV1A8ScFv基因片段、1068bp的1A8ScFvCκ片段和1134bp的1A8ScFv/Cκ/P片段,片段的大小均与预期长度一致(图1A).1A8ScFv/Cκ/P基因克隆入PET32a载体,克隆的酶切鉴定正确(图1B).核苷酸序列测定结果正确.A1:DL2000marker;2:1A8ScFv基因的PCR产物;3:1A8ScFv/Cκ基因的PCR产物;4:1A8ScFv/Cκ/P基因的PCR产物.B1:DL2000marker;2:pET32a1A8ScFv;3:pET32a1A8S
4、cFv/Cκ;4:pET32a1A8ScFv/Cκ/P(EcoRI,SalI).图11A8ScFv/Cκ/P基因的PCR扩增产物和其重组质粒的酶切鉴定2.21A8ScFv/Cκ/P融合蛋白的诱导表达及鉴定与空载体相比,经0.2mmol/LIPTG诱导后细菌裂解上清及沉淀中均出现Mr约为60000的新生蛋白带,与预期的1A8ScFv/Cκ/P融合蛋白的大小相符.光度扫描显示,1A8ScFv/Cκ/P融合蛋白的可溶性表达量占上清蛋白的30.9%(图2A).经ed,2003,9(3):347-351.[2]SuzukiM,TakayanagiA,ShimizuN.Ta
5、rgetedgenedeliveryusinghumanizedsinglechainantibodyediatedsmallinterferingRNAdelivery[J].Hepatology,2007,46(1):84-94.[4],KreuterJ,ZimmerA.Antisensedeliveryusingprotamineoligonucleotideparticles[J].NucleicAcidRes,2000,28(10):e45.[6]LiX,StuckertP,BoschI,etal.Singlechainantibodymedia
6、tedgenedeliveryintoErbB2positivehumanbreastcancercells[J].CancerGeneTherapy,2001,8(8):555-565.
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