klotho蛋白对帕金森病模型小鼠的神经保护作用

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1、Klotho蛋白对帕金森病模型小鼠的神经保护作用【摘要】目的观察Klotho蛋白对1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)诱导所致C57BL/6小鼠黑质神经元损伤的保护作用，并探讨其可能的保护机制。方法C57BL/6小鼠分4组：野生型(PTP(PTP)组，Klotho蛋白高表达型(KO)生理盐水对照组(KO+NS)，Klotho蛋白高表达型MPTP组(KO+MPTP)。PTP组和KO+MPTP组小鼠皮下注射MPTP(20mg/kg)，连用2d制备帕金森病(PD)模型;PTP组黑质致密带(SNc)TH免疫阳性神经元数目较KO+NS组有所减少，但差异不显

2、著;而PTP组SNc区TH免疫阳性神经元数目较PTP组小鼠Str区DA及其代谢产物DOPAC含量较KO+NS减少，但差异不显著，HVA含量的改变差异显著(P<0.05);而PTP组DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量较PTP对小鼠黑质多巴胺能神经元损伤，其机制可能因为Klotho蛋白是成纤维细胞生长因子23(FGF23)信号转导中其受体的基本辅助因子及抗氧化应激作用有关。【关键词】Klotho蛋白;帕金森病;多巴胺能神经元;黑质帕金森病(PD)又称震颤麻痹，是一种多发于65岁以上人群、男性略多于女性的中枢神经系统退行性疾病，其最主要病理特征为中脑黑质致密带(

3、SNc)多巴胺(DA)能神经元进行性变性、脱失及伴发的纹状体轴突末梢DA耗竭，最终造成PD特有的运动功能障碍，其典型症状为静止震颤、肌肉僵硬、运动迟缓及姿势反射异常〔1〕。长期以来，左旋多巴是治疗PD的首选药物〔2〕，但仅能对症处理，且长期应用有明显的不良反应，多数患者服药3～5年后疗效减退，产生症状波动、运动障碍、精神症状等不良反应，使治疗更加困难。因此，研究者一直在试图寻找有效的神经保护剂预防DA能神经元变性，从而延缓PD的发生。Klotho蛋白与人类衰老密切相关〔3〕。该蛋白缺陷鼠可出现一系列与人类衰老相似的多种行为和病理变化：寿命缩短、运动失调、性功能障碍、

4、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、骨质疏松、肺气肿和免疫功能降低等;基因敲除小鼠的步态异常，平均步长明显缩短，类似人类PD患者的步态;使用一定的方法使小鼠重新获得基因，上述各种症状均能缓解〔4〕。1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)具有特异性的神经毒性作用，能导致人类及多种动物出现PD症状〔5〕。本研究以对MPTP最敏感的C57BL/6小鼠为研究对象，用MPTP制备小鼠PD动物模型，观察Klotho蛋白对MPTP导致的黑质DA能神经元损伤的影响，并对其机制进行了初步探讨。　　1材料与方法　　1.1主要试剂与仪器酪氨酸羟化酶(TH)抗体购自美国Proto

5、sBiotech公司;MPTP购自美国Sigma公司;TH免疫组化试剂盒、DAB试剂购自美国VectorLaboratories公司;高效液相色谱仪为美国PTP的急性毒性反应，观察6d内小鼠的行为学改变，包括反应、自发活动、肌肉运动、运动障碍、异常行为等。　　1.3TH免疫组织化学染色　　1.3.1取材及冰冻切片于末次注射7d后将小鼠安乐死，然后断头取脑组织，置于含50mg/ml多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲固定液(PBS)中4℃固定6h，再置入含250g/L蔗糖的PBS溶液内4℃过夜或至脑组织块沉入瓶底。将脑组织块于冠状黑质平面连续冰冻切片，片厚30μm。所切

6、连贯切片按序号保存于PBS液内，每只鼠所得切片中隔5取1共取5张连贯切片进行TH免疫组织化学染色。各组切片选取部位尽量一致。　　1.3.2TH染色切片置入0.1mol/LPBS(pH7.4)冲洗3次每次10min;PBS+H2O2(2∶1)冲洗30min;0.1mol/LPBS冲洗3次每次10min;切片入滴加血清3滴的10mlPBS溶液中孵育30min;加一抗(1∶4000，用抗体稀释液稀释)，于湿盒内4℃过夜;第2天PBS冲洗3次，每次10min;滴加生物素标记的二抗工作液，孵育30min;PBS冲洗3次，每次10min;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液

7、，孵育1h;PBS冲洗3次，每次10min;Acetate缓冲液冲洗10min;DAB显色4～5min;Acetate缓冲液冲洗10min，PBS冲洗3次，每次10min;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察并照相。因DAB显色液中加入Nickel，阳性细胞为细胞质和突起着蓝色。　　1.3.3阳性细胞计数在每只鼠SNc连贯切片中隔5取1，共得5张切片，各组切片选取部位尽量一致。对照图谱，应用StereoInvestigator软件在低倍视野下勾出SNc边界〔4〕，设定计数范围，高倍视野下计数选取框内阳性细胞数,顺序为由左至右,自上而下,不完全位于视野