氢化可的松对体外培养的皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响论文

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1、氢化可的松对体外培养的皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响论文卫俊霞,冯光珍,孙红,于大山,汪培铭,李冬梅【关键词】细胞增殖【Abstract】AIM:Tostudytheeffectsofhydrocortisoneontheproliferationandcollagensynthesisofskinfibroblastsinvitroandtoexplorethemechanismofsteroidinthetreatmentofabnormalscars.METHODS:Humanscarfibr

2、oblastshumanskinbymechanicalseparationmethods.AfterbeingstimulatedbyhydrocortisoneanskinfibroblastsinedbyMTTmethodsand3HProlineincorporationrespectively.RESULTS:Hydrocortisone（0.1g/L）inhibitedtheproliferation(MTT0.523±0.051vs0.347±0.036,P0.05)andcollagen

3、synthesis［3HProline(248±6)Bqvs(181±6)Bq,P0.05］ofhumanskinfibroblastsinvitroinaconcentrationdependencemanner(r=-0.8208).CONCLUSION:Hydrocortisonemaytreatabnormalscarsbyinhibitingtheproliferationandcollagensynthesisofhumanskinfibroblasts.【Keya)，氢化可的松（华美公司）

4、，二甲基亚砜（DMSO，TBD公司），3H脯氨酸（北京原子能研究所）.皮肤组织取自手术患者所取的全厚或中厚瘢痕皮肤，刮除皮下脂肪组织，尽快放入盛有DMEM培养液中备用.1.2方法将取下的标本切取5mm×5mm大小的小块置于含青霉素和链霉素各100ku/L的DMEM溶液中，2h后将组织标本浸于2.5g/Ldispase中，37℃条件下2~4h后，表皮被完整的撕下，余下的真皮组织用PBS反复冲洗后，剪成1~2cm的小块，加入30~50倍体积的1g/LⅠ型胶原酶，37℃条件下继续消化3~5h.当成纤维细胞大部

5、分从胶原纤维中分离出来时，用100目滤网过滤，以去除大的组织残渣.滤液离心去上清液，细胞记数后接种于75cm2培养瓶中，置37℃含50mL/LCO2孵箱中培养，每3~4d换液1次，待细胞融合后，进行细胞传代培养.取第二代人皮肤成纤维细胞，以1×104/孔接种于96孔板，无血清培养孵育24~48h，使细胞同步于休止期.弃上清液，加入培养基和氢化可的松，分别进行成纤维细胞形态、数量及生物合成的检测.氢化可的松浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.3和0.5g/L，设空白对照组.倒置显微镜观察各组成纤维细胞

6、形态与数量变化，同时，细胞用20g/L戊二醛固定后进行扫描电镜观察.MTT比色法测定成纤维细胞增殖［2］:氢化可的松加入20h后加入MTT20μL/孔，置37℃含50mL/LCO2孵箱中孵育4h，再每孔滴加DMSO溶解缓冲液20μL，在微型混合器上振荡15~20min，置37℃孵育4h，倒置显微镜下观察到针状染料结晶溶解，酶标仪波长570nm处读取A值.3H脯氨酸掺入法测定成纤维细胞胶原的合成［3］:氢化可的松加入12h后弃上清100μL，加入3H脯氨酸、VitC及β氨基丙混合液（终浓度皆为10mg/L

7、）100μL，继续培养12h后吸弃上清，加入2.5g/L胰蛋白酶200μL消化细胞，多头细胞收集器收集细胞，液闪测定仪测定细胞3H脯氨酸掺入量（Bq）.统计学处理:所有结果均以x±s表示，应用SPLM统计软件行t检验和卡方检验.2结果2.1氢化可的松对皮肤成纤维细胞增殖的影响对照组细胞生长良好，多贴壁生长，呈梭形或星形，排列成束状或旋涡状（Fig1A）.氢化可的松处理组对皮肤成纤维细胞的增殖有抑制作用，当其浓度为0.1g/L时，细胞增殖受到抑制，表现为细胞收缩变圆，数量明显减少，交织成网状（Fig1B）

8、，当其浓度升至0.5g/L时，细胞不能存活（Fig1C）.扫描电镜观察显示，对照组细胞呈梭形或椭圆形，微绒毛较多，可见足突和分裂相（Fig2A）；而氢化可的松处理组细胞呈圆形，微绒毛明显减少，表面光滑，无足突，较少见分裂相（Fig2B）.MTT比色分析显示，氢化可的松对皮肤成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用（P0.05），且其抑制作用呈明显的剂量依赖性（Tab1）.2.2氢化可的松对皮肤成纤维细胞胶原合成的影响3H脯氨酸掺入法测定成纤维细胞胶