番茄双抗烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的基因工程研究

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ChineseAgriculturalScienceBulletinV01．21No．82005August·28·http：／／znth．chinajournal．net．ca番茄双抗烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的基因工程研究廖俊杰-，李进进，，许继勇：(-广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州510300；2汕头市中蔬花卉有限公司，广东汕头515041)摘要：在烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白(CP)基因的5’和3’端分别合成寡聚核苷酸T5和T3，并分别引入ClaI和BamHI位点。采用PCR技术扩增得到TMVCP基因，用ClaI，BamHI消化后重组到pBluescriptKS+中．并将该基因与黄瓜花叶病毒(CMV)CP基因重组在同一个表达栽体pKYLX7上获得双价CP基因表达栽体pKDTC，并转入根癌农杆茵LBA4404中，通过“叶盘法”转化番茄“丽春”、“京韩一号”，获得了番茄再生植株。通过点杂交、PCR检测和Southem杂交，证实“丽春”的L-2、L一5、“京韩一号”的JH一6号为转TMVCP和CMVCP基因的工程植株。工程植株在室温中表现正常，与对照植株相比，转基因植株表现明显的抗TMV、CMV性能。关键词：番茄；烟草花叶病毒：黄瓜花叶病毒；外壳蛋白基因；抗病毒基因工程StudiesonTmnsgenicTomatoPlantswithResistancetoTobaccoMosaicVirusandCucumberMosaicVirusLiaoJunjie1，LiJinjinl，XuJiyon92(1DepartmentofFoodandBio-technology,G珊mgdD，lgLightIndustryTechnologicCollege，Guangzhou510300；铆啪印z‘Zhon哥shuFlowerCo．，Ltd，ShantouGuangdong515041)Abstract：TheTMVCPgenewassynthesizedwithPolymeraseChainReaction(PCR)YusingthecDNAofitsgenomicRNAasatemplate．AsyntheticC／aIsiteWasincludedinT5primerwhileaBamHIsiteinT3primer．thePCRproductwasdonedintotheClaI／BmHIsiteofpBluescriptKS+．Thenbivalentplantexpressionvector，pKDTC(TMV—CP+CMV-CP)，withdoubleresistancetoTMVandCMV，Wasconstructed，inwhicheachCPgeneWascontrolledbya35SpromotorofCaMV．TransgenictomatoplantswereregeneratedviaAgrobacteriumtransformationsystem，andanalyzedbydotblot，PCRandSouthernblot，theseresultsshowedthatbothgeneswereintegratedintothetransgenicplantlinesL-2，L-5ofLichunandJH一6ofJinghaIlNo1．Thetransgenicplantsgrewnormallyandobviouslyresistedtotheinfectionofcorrespondingvirusesingreenhouse．Keywords：Tomato，Tobaccomosaicvirus，Cucumbermosaicvires，Coatproteingene，Virus—resistantgeneticengineering番茄是主要的蔬菜作物，在生产中，烟草花叶病毒难。植物抗病毒基因工程的发展，为培育抗性品种带(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)是危害番茄的主要病来了希望。自1986年Powell等翻将TMVCP基因在毒病害【l】，致使番茄严重减产，品质变劣。培育抗性品烟草中表达，获得了抗TMV的烟草工程植株以来，种是解决病毒危害的最有效手段。然而，目前可利用又分别获得了抗TMV、CMV的烟草13]和辣椒M抗病的抗源材料还很少，因此给传统育种带来了很大困毒工程植株。徐香玲【6】采用发根农杆菌介导法将抗基金项目：汕头市科技攻关项目“番茄抗n吖和CMV的基因工程育种”(2002A108)。第一作者简介：廖俊杰，男，1965年出生，硕士学历，副研究员。研究方向：植物基因工程。E-mail：junjie33@gdqy．edu．矗．通信地址：510300广州市新港西路152号广东轻工职业技术学院食品与生物工程系．收穗日期：2005-04-03，修回日期：2005-04-05。万方数据 中回霹爹c丕掘第21卷第8期2005年8月http：／／zntb．chinajournal．net．CII·29·TMV和CMV的CP基因导入番茄获得成功。实践证5。GCAGGATCCAAGACACAACC3’为便于克隆，在明，利用病毒外壳蛋白基因在受体植物中的表达可T5和T3引物中分别引入了ClaI和BamHI位点。提以获得抗相应病毒的工程植株[7-121。中国南方地区高取TMV的RNA，以1IJgRNA为模板，T3为引物，在温多湿，TMV与CMV发生严重，解决病毒病的危害反转录酶的作用下合成eDNA的第一条链，然后进是生产上的当务之急。笔者总结前人的经验利用汕行PCR扩增(反应条件为：93℃lmin，55℃头的番茄主栽品种于2002年开展了双抗TMV与lmin，72℃lmin，30个循环反应)，PCR的产物经a口CMV的基因工程研究。在获得CMVCP基因的基础I／BamHI消化后，重组到pBlueseriptKS+中，获得上，利用PCR技术扩增TMVCP基因，构建双价表重组质粒pTM-1。达载体，利用根癌农杆菌转化番茄，获得了双抗1．3双价表达栽体的构建带有CMVCP基因的质TMV、CMV的转基因番茄“工程”植株。粒pHC210t131经XbaI消化后并用XhoI部分酶切，1材料和方法回收全长CP基因片段(1kb)，重组到植物表达载体1．1材料番茄品种“丽春“京韩1号”为基因转化pKYLX7的XbaI／XhoI位点。得到克隆pKYC。的受体材料。含CMVCP基因的pHC210质粒由中pTm．1用ClaI消化后并补平，再用SacI酶解，回收国农业大学植物遗传工程实验室惠赠。反转录酶、0．6kb的TIVIVCP基因片段，克隆到pBl221的SmaTaqDNA聚合酶以及限制性内切酶均为Promega公I／SacI位点，以取代GUS基因，得到克隆pBITm。司产品。a．’．dCTP，购自福瑞公司。分子标记购自北对重组质粒pTm-1进行DNA序列分析证实TMV京天为时代公司。试验在汕头市中蔬花卉有限公司CP基因序列的正确性。pBITm用HindllI屈叔I酶的生物技术基地进行。切，回收含有35S．n小，．CP-NOS终止子的1．6kb片1．2TMVCP基因的克隆根据文献翻报道的TMV段，用Klenow补平：pKYC用C／aI消化并补平，两CP基因序列分别设计PCR的引物：者经T4DNA连接酶连接，即获得了表达T／VWCP1"5：yTrAATCGATGATGATTCGGAGC论3’1"3：和CMVCP基因的双价表达载体pKDTC。在双价表Xb魂I芏图1含TMVCP基因和CMVCP基因载体构建图达载体pKDTC中，TMVCP和CMVCP基因各有一AA0．25，分别附加0、25、50、75、100mg／L的卡那霉个35S启动子控制，3’端各为NOS和rbe转录终止素，以确定卡那霉素在转基因苗筛选培养基中的适子(图1)。利用DNA直接转化法将pKDTC转入根合的筛选压浓度。癌农杆菌LBA4404中。1．5番茄的遗传转化采用叶盘法嗍进行番茄的转1．4番茄抗卡那霉素筛选压的确定将“丽春京韩化。进行转化的材料是“丽春删京韩1号”无菌苗的1号”种子经常规消毒后播种于MS培养基上，发芽予叶。基因供体的菌种为1-3中构建的携带CMVCP后8～9d取展开的子叶作为外植体进行芽再生试验。基因和TMVCP基因的根癌农杆菌LBA4404工程芽分化培养基为MS+BA2．0(单位：mg／L，下同)“一菌。经工程菌侵染的子叶首先经过48h的暗期共培万方数据 ChineseAgriculturalScienceBulletinV01．21No．82005August．30．http：／／zntb．chinajournal．net．ca养，然后在MS+BA2．0(单位：mg／L，下同)+IAA0．25附高，芽的诱导率降低；当卡那霉素为omgCt,时，子叶加适当的卡那霉素筛选压(以1．4中的方法确定筛选外植体芽诱导率为100％，每个外植体发生的平均芽压浓度)和500mg／L头孢霉素的培养基上诱导转基数为10．5个，这说明该配方能形成一个高效的再生因芽的分化。系统；当卡那霉素的浓度大于50mg／L时，不再有芽1．6再生植株的检测用Cn蟠法提取植物DNA【13】。的分化并出现子叶外殖体黄化、白化、褐化直至死亡点杂交、PCR检测和Southern杂交参见《分子克隆手的现象(图2B)。“丽春京韩1号”二个品种均表现册》。PCR反应条件为：94℃lmin，50℃lmin，72℃出同样的结果。因此笔者选择卡那霉素50mg／L作为lmin，反应体积为501Jl，35个循环。番茄转基因芽再生的筛选压。2结果与分析2．2基因转化在采用“叶盘法”进行的基因转化时，2．1抗卡那霉素筛选压的确定在MS+BA2．o+I．20d后在筛选培养基上出现了芽的分化(图2A)。50dAA0．25培养基上附加不同浓度的卡那霉素进行番茄内“丽春”品种共获得了8个转化株系即L．1～L-8，子叶诱导芽的试验，结果表明随卡那霉素浓度的升“京韩1号”品种共获得7个转化株系即JH一1~JH一7。图2基因转化后番茄芽的再生情况(Km=50mg／L)A：基因转化后芽的再生B：对照将转化的芽在1／2MS+IAA0．1生根培养基上生根，生34Kb。对提取的DNA片段首先进行了点杂交试验。根率100％，平均根数5．5条。移栽入土后，保持空气分别用pTm一1的C／aI／BamHI和pHC210的Xho相对湿度85％～90％，移栽全部成活。15d后待有新叶I／SalI片段作探针进行的点杂交结果显示，“丽春”发生时再取老叶进行基因检测。中L．2、L一5、“京韩1号”中的JH一6号均为阳性，其余2．3再生植株的基因检测将“丽春京韩1号”二12个株系的杂交信号非常模糊，难以判断，可能是导个品种转化共获得15个再生植株，提取其DNA，经入的基因拷贝数较少的原故，而空载体及对照无杂电泳检测，采用CTAB法提取的DNA片段大小约为交信号(图3)。然后对阳性植株L．2、L．5和JH．6进一步进行PCR检测。采用人工合成CaMV35S启动子的一段序列(yCCACTGACGTAAGGGAT．GACGc，’)分别与T，引物扩增，以期获得0．6kb的A：CMVCP基因探针B：TMVCP基TMVCP基因：以CMVCP基因的3’端序列(5’因探针GGGAGCTGAGTTGGCAG3’)扩增，以期得到O．8kbl：L一2DNA2：正对照DNA(2A：的CMVCP基因的片段。PCR扩增的结果表明L广2、pHC210，2B：pTm一1)3：负对照(空L．5和JH一6号均有0．6kb和0．8kb的特异性片段，而载体)4：L广5植株DNA．5：JH-6植株DNA．6：负对照(植株DNA)未经转化的空对照则没有(图4A)。最后进行South-图3转化植株的点杂交结果em杂交试验。将扩增得到的电泳带分别进行South-em转移到硝酸纤维素滤膜上，分别用TMV．CP和CMV—CP基因作探针杂交，放射自显影结果表明万方数据 中国摩学通攉第21卷第8期2005年8月http：／／zntb．chinajournal．net．ca·31·A．PCR扩增结果1和7：分子标记，2“别为未转化植株、质粒pKDTC、L2、L5、JH-6号植株DNA进行PCR的扩增结果(显示0．6Kb片段)．8—12分别是未转化植株、L广2、L-5、JH-6号植株DNA、质粒pKDTC进行PCR的扩增结果(显示0．8Kb片段)．B．Southern杂交结果．左：用TMVCP基因作探针的杂交结果右：用CMVCP基因作探针杂交结果．图4转基因番茄植株的DNA检测PCR扩增得到的O．6kb和O．8kb的特异带能够分别观察工程植株对病毒的抗性。40d后发现对照植株出与TMV—CP和CMV．CP基因的探针杂交(图4B)。因现典型的花叶病毒症状，而转基因植株生长良好并此证明L-2、L-5和JH．6号为转删．CP和CMv-CP正常开花没有出现花叶病症(图5)。因此从转基因植双价基因的工程植株。株的表型看出，表达TMV—CP和CMV．CP基因的工2．4工程植株在温室中对病毒的抗性表现将工程程植株能够在温室中抵抗相关病毒的攻击，并正常植株L．2、L一5和JH．6定植到带有TMV和CMV活生长、开花和结果。转基因植株即使表现轻微的病毒体毒原的温室中，利用病毒传播与侵染的自然条件，症状也比对照晚发病约20d，这表明转基因植株具有图5转基因植株抵抗病毒攻击图6转基因植株延缓发病万方数据 ChineseAgriculturalScienceBulletinV01．21No．82005August．32．http：／／zntb．chinajoumal．net．cn延缓发病的机制(图6)。转基因植株的这一特性可大定遗传的抗病毒新品种，目前已经获得“丽春”转基幅度减少病毒病对番茄生产造成的损失。因植株的Fl代杂交种子；而“京韩一号”本身就是F。3讨论代杂交品种，因此，要保证其优良性状不变并获得新3．1栽体的构建与转化在构建CMVCP基因的基的抗病毒性状，采用自交手段必然导致性状分离，只础上【14】，通过PCR扩增技术，获得了TMVCP基因片有通过组织培养生产种苗或者生产人工种子等无性段，并且将CMVCP基因与TMVCP基因构在同一繁殖手段，才能延续转基因品种的性能，并保证能应载体上，形成了双价基因，并且每个基因形成了相互用于生产实践之中。独立的表达框架。能够表达出各自的抗病毒性能。转化后的LBA4404农杆菌“工程”菌株通过叶盘法转化参考文献番茄子叶外植体，能够将TMVCP与CMVCP双价l饶雪琴，蓝翠钰．广州市郊及其临近地区辣椒CMV和TMV的鉴定啊．基因同时整合到番茄细胞，实现双抗性状在转基因江西农业大学学报(自然科学版),2003。250)：558-5612PowellPA．DelayofdiseasedevelopmcotintransgenicplantsthatCXpl'e$8植株中同时表达。thetobaccomosaicviruscoatproteingcne叨．Science，1986，232(6)：3．2转基因植株的筛选与获得在建立有效的番茄738--743转化系统后，利用叶盘法转化番茄，其再生芽经过卡3邱国华，张健民．表达病毒CP基因的转基因南方烟草的攻毒试验[J】．那霉素筛选压进行了初次筛选，可以初步确定再生中山大学学报(自然科学版)，1999，39(S1)：82～854商鸿生，王旭．CP基因转化的线辣椒抗卡那霉素和抗CMV特性的遗芽体具有抗卡那霉素的特性。然后对转化植株进行传田．西北农林大学学报(自然科学版)，2001,29(5)：103-106了PCR基因扩增i点杂交和Southern印迹法等一系5郭亚华。徐香玲．m质粒介导TMV和CMV外壳蛋白的基因转化辣椒列基因检测技术手段，证实了TMVCP与CMVCP研究[J】．北方园艺，2000，6(4)：17-18双价基因已转入植株体中，获得了转基因植株。6徐香玲．利用发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)介导二元载体向番茄导入TMV、CMV外壳蛋白基因的研究【J】．植物研究，1994，14(4)：3．3转基因植株的抗病毒表现通过温室内天然毒源416—422的攻毒试验，证明了转基因植株具有良好的抗病毒性7施曼玲，薛宝娣．关于CMV-CP基因番茄植株的抗病性表现【J】．浙江农能，在试验中具体表现出两种类型。一是不发生病症；业科学，1999，(6)：276--279二是延缓发病。这与程英豪【10】杨荣光【ll】观察到的试验8邓晓东．TMV介导的外源蛋白在植物中的表达叨．生物科学研究,200l，结果是一致的。转入病毒CP基因植株的抗病毒机制(S1)：181-1849鲁润龙，林国平．复制酶基因介导的抗病毒烟草植株的研究m．中国科比较公认的解释是交叉保护机制。转基因植株中的病学技术大学学报，1996，26(2)：191-194毒外壳蛋白会抑制病毒粒子的复制和繁殖。在最近的lO程英豪，吴光．表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病研究中更多的试验结果D，ts]，发现转基因植株在接种病毒的侵染阴．植物学报，1997，39(1)：16毒后表现出抑制病毒粒子复制繁殖的情况，较好地保ll杨荣光．表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄及其对CMV的抗性【J】．江苏农业学报，1995，11(1)：40--44护植株免受病毒粒子的攻击。纪丰民【l叼还采用计算机12RelsonRS．Vimsctolerance，plantgrowthandficldpcrfonnan=ofmu拈-程序模拟了病毒外壳蛋白抵抗病毒繁殖的机制，为转genietobaccoplantsexpressingcoatproteinfromtobaccomosaicVin珥【J】．基因植株抵抗病毒寻找到了更有说服力的理论依据。Bio．Techenology，1988。6(5)：403--4093．4转基因植株的应用试验同时获得双抗TMV与13廖俊杰．利用CTAB法提取植物DNA[J]．天津农业科学，1993，(3)：2614胡天华．黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的eDNA克隆和全序列测定及比CMV的番茄转基因植株为番茄提供了宝贵的遗传较川．科学通报，1989，21(6)：1652-1655育种材料。笔者计划将转基因植株进一步用于田间15徐秉良．黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒在双抗转基因线辣椒内的增殖进行选育，希望研究转基因植株的遗传规律并得到【J】．中国病毒学，2002，17(3)：243-247新的抗性品种。就两个品种特性而言，“丽春”是常规16纪丰民．植物病毒增殖的数值研究与转基因植株的抗病毒机理【J】．内品种，可以将“丽春”的转基因植株通过自交获得稳蒙古大学学报(自然版)，1998，29(5)：632-636万方数据