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分类号：密级：UDC：学号：416522613528南昌大学专业学位硕士研究生学位论文赣州市恙虫病分子流行病学及临床特征的研究StudyonthemolecularepidemiologyandclinicalfeaturesoftsutsugamushidiseaseinGanzhoucity张桂娟培养单位（院、系）：南昌大学医学院指导教师姓名、职称：赖庆文（教授、主任医师）专业学位种类：临床医学专业领域名称：内科学（呼吸内科）论文答辩日期：2016年6月4日答辩委员会主席：朱清仙评阅人：肖祖克涂红缨2016年6月 学位论文独创性声明一、学位论文独创狸声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表譚撰写过的研巧成果，也不包含为获得南昌大学或其化教育机．构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名．■（手写）乂；多签字曰期：卢年／月Ｊ曰二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部ｎ或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授极南昌大学可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论＇文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕±学位。论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按章程＂规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写导师签名（手写签字曰期；曰签字曰期＞／／年月：Ｊ：如（年６月＾曰￥文题目務束喻病刪權伯確Ｉ护宇哪名±学号么文ｄｒ□５／＾别博硕兰马（甘Ｉ扣夺＿＿Ｉ弓？院／系／所业专）齡等良膀Ｊｒｉ《ｉｎ／等刊邸Ｅｍａ。—：备注＂＂□□保（公开密向校学位办申请获批准为保密，）年＿＿月后公开Ｉ 摘要摘要目的：了解赣州地区恙虫病患者的临床特征及其病原体恙虫病东方体(orientiatsutsugamushi，OT)的基因类型。方法：1、收集2012至2015年赣南医学院第一附属医院（赣医一附院）收治的恙虫病患者临床资料，进行回顾性分析从而总结出赣州地区恙虫病患者临床特征。2、收集2014至2015年赣医一附院临床诊断为恙虫病患者、不明原因发热患者及正常人的的血液，同时行OT特异性抗体检测及巢式PCR检测，并对巢式PCR阳性扩增的恙虫病东方体56kDa型特异性抗原基因(OT-56kDaTSA基因)进行测序，然后进行同源性分析，从而获知赣州地区OT基因类型及其与全球各地区OT的同源关系。结果：1、2012至2015年赣医一附院共收治的临床诊断恙虫病患者310例，以农民为主，男女患病比率为1:2.48；年龄最小的为1岁，最大的为88岁，其中以41-80岁年龄段病例分布最多；全市十八个县市区皆有发病，以散发流行为主；时间上以6-10月为发病高峰。2、310例患者中所有患者均有发热，多为弛张热；有典型的焦痂者305例，焦痂主要位于腋窝、腹股沟、会阴、臀部等隐蔽的部位；并发症多，其中74.2%并发肝功能损害、45.2%并发支气管炎或肺炎、29.4%并发心肌损害；外斐氏实验检测仅有1例阳性；大部分患者可治愈，但死亡率仍高达2.3%，且年龄越大，死亡率越高。3、2014至2015年共收集血液标本82份，OT特异性抗体检测共35份阳性，巢式PCR检测33份阳性。对33份巢式PCR阳性扩增的OT-56kDaTSA基因序列进行分析结果提示30株为Karp型，1株为Gilliam型,另有2株无法判定其基因类型。同源性分析显示赣州地区OT与广州、台湾、越南及泰国等地部分OT同源。4、我们将赣州地区OT基因型为Gilliam型的GZ-cfOT-56kDaTSA基因序列提交至PubMed基因库，其GenBankaccessionnumber为KU215599。II 摘要结论：1、赣州地区恙虫病以散发流行为主，6-10月为发病高峰期，女性患者多见，以41-80岁年龄段多发，且年龄越大，死亡率越高。2、赣州地区OT基因型有Karp型、Gilliam型，且以Karp型为主，其与广州、台湾、越南及泰国等地部分OT同源。关键词：恙虫病东方体；临床特征；基因分型；同源性分析III AbstractABSTRACTObjective:ToanalyzetheclinicalfeaturesofpatientswithtsutsugamushidiseasefromGanzhouandtheGenotypeofitspathogenoforientiatsutsugamushi(OT).Method:1.ClinicaldataofpatientswithtsutsugamushidiseasetreatedintheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversityfrom2012to2015wascollectedandretrospectivelyanalyzedinordertoconcludetheclinicalfeaturesofpatientswithtsutsugamushidiseaseinGanzhouarea.2.BloodsamplesfromclinicalcasesoftsutsugamushidiseaseandfeveroriginunknowncasestreatedintheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversityandnormalhumanwerecollectedduring2014to2015,andsimultaneouslyOTantibodydetectionandNestedPCRassaysareperformedonthebloodsamples.Additionally,DNAsequencingofthe56-kDatype-specificantigen(TSA)genewasconductedwiththesepositivesamplesdetectedbythenestedPCRassay.Furthermore,thenucleotidesequenceswereanalyzedwithMEGAsoftwareversion5.1,andphylogenetictreewasconstructedbyneighbor-joiningmethodtoidentifythegeneticlineageoftheseOrientiatsutsugamushistrains.Results:1.Among310caseswithclinicaldiagnosisoftsutsugamushidiseasetreatedintheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversityfrom2012to2015,mostpatientswerepeasants.Thesecaseswerereportedwithmale-to-femaleratioof1:2.48.Theyoungestpatientisoneyearold,whiletheoldestpatientis88yearsold.Thedistributionofcasesbyageclearlyshowedahigherincidenceoftsutsugamushidiseaseinpeopleat41-80-yearold.Allthe18counties,citiesanddistrictsaffiliatedtotheGanzhoucitywereattackedbythetsutsugamushidisease.Andthetsutsugamushidiseaseoccurredmostlywithprevalenceandsporadiccases.ThenumberofcasesreachedthepeakbetweenJunetoOctober.2.Allofthe310patientssufferedfeverwithremittentfeverinmostoftheIV Abstractpatients.305patientshadtypicalescharmostlydistributedatprivatepositionssuchasaxilla,groin,perineumandhip.Complicationswerecommon.74.2%ofcasessimultaneouslypresentedwithliverfunctiondamage.45.2%ofcasessimultaneouslypresentedwithtrachitisorpneumoniaand29.4%ofcasessimultaneouslypresentedwithcardiacdamage.TherewasonlyonepositiveresultwithWeil-felixtest.Mostpatientsarecurable.However,thedeathrateremainedhighas2.3%,andmortalityrateincreasedwithageincreasing.3.82bloodspecimensfrompatientswithfeverwerecollectedfrom2014to2015.Therewere35positiveresultsOTspecificityantibodydetection.33specimenswerepositiveforNestedPCRassays.Phylogeneticanalysisrevealedthatthereweretwodefinableclustersamongthe33nucleotidesequencesofthe56-kDaTSAgenes:90.9%Karp-type(30/33)and3.0%Gilliam-type(1/33).Whereastheremaining2strains(2/33,6.1%)couldnotbeassignedtoasinglecluster.PhylogeneticanalysisalsorevealedthatOTinGanzhoucityhadthesamecognatethatinGuangzhou,Taiwan,VietnamandThailand.4.WesubmittheGZ-cfOT-56kDaTSAgenesequenceofOTwithGilliamtoPubMedGenBank.TheGenBankaccessionnumberwasKU215599.Conclusion:1.ThetsutsugamushidiseaseoccurredmostlywithprevalenceandsporadiccasesinGanzhouarea.ThenumberofcasesreachedthepeakbetweenJuneandOctober.Thedistributionofcasesbygenderclearlyshowedahigherincidenceinfemalepatients.Therewereasignificantlyhighernumberofinfectionsamongthoseat41-80-yearold.Themortalityrateincreasedwithageincreasing2.Therearetwoorientiatsutsugamushigenotypes:KarpandGilliamprevailedintheGanzhouarea,andKarpgenotypeispredominantamongthesetsutsugamushicases.PhylogeneticanalysisrevealedthatOTinGanzhoucityhadthesamecognatethatinGuangzhou,Taiwan,VietnamandThailand.Keywords:orientiatsutsugamushi,clinicalfeature,genotype;homologyanalysisV 目录目录第1章引言..........................................................................................................11.1概述............................................................................................................11.2世界范围内恙虫病流行趋势......................................................................11.3中国地区恙虫病流行趋势..........................................................................21.4赣州地区恙虫病流行趋势..........................................................................3第2章恙虫病的诊断标准...................................................................................4第3章材料与方法...............................................................................................53.1研究对象.....................................................................................................53.1.1临床数据收集...................................................................................53.1.2血液样本收集...................................................................................53.2仪器和设备.................................................................................................53.3试剂............................................................................................................63.4DNA的提取................................................................................................63.5OT-56kDaTSA基因扩增............................................................................73.6巢式PCR结果的判定................................................................................83.7DNA测序及同源性分析.............................................................................83.8OT抗体检测...............................................................................................93.9统计学分析.................................................................................................9第4章结果........................................................................................................104.1流行特征...................................................................................................104.1.1地区分布.........................................................................................104.1.2时间分布.........................................................................................104.1.3易感人群分布.................................................................................124.2临床特征...................................................................................................134.2.1临床表现.........................................................................................134.2.2外斐氏实验.....................................................................................14VI 目录4.2.3并发症.............................................................................................144.2.4治疗情况.........................................................................................144.3OT特异性抗体检测及巢式PCR检测.....................................................164.4DNA测序及同源性分析...........................................................................17第5章讨论........................................................................................................21第6章结论........................................................................................................25致谢....................................................................................................................26参考文献................................................................................................................27附表....................................................................................................................31综述....................................................................................................................34VII 第1章引言第1章引言1.1概述恙虫病(tsutsugamushidisease)是由恙虫病东方体(orientiatsutsugamushi，OT)[1]引起的自然疫源性疾病，该病以鼠类为主要传染源，经恙螨幼虫叮咬传播。恙螨幼虫叮咬人时，病原体OT即从恙螨幼虫叮咬处侵入人体，首先引起局部皮肤损害，后经淋巴系统进入血液产生立克次体血症及毒血症，致全身小血管炎和血管周围炎。临床以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为特征，严重者可发生死亡。然本病早期无特异性的临床表现，若接诊医师经验不足，对恙虫病[2]了解不深，则极易误诊为伤寒、上感、肝炎、血液病等。OT属于专性细胞内寄生的微生物。在早期，采用经典的补体结合试验首先确定了分离自日本的Kato株、新几内亚Karp株、和缅甸的Gilliam株，并将它们定为OT分类鉴定的三种[3]国际标准株。根据血清学分型，我国OT以Gilliam型为主，其次是Karp型，[3]Kato型很少见。随着分离鉴定技术的进步，特别是随着OT基因序列的发布和聚合酶链反应技术的应用，更多的东方体类型被发现。基因分型主要包括Karp、Kato、Gilliam、TA763、TA678、TA686、TA716、TH1817、Kawasaki、Kuroki、Shimokoshi等病原型。迄今为止，已有超过20多种病原型相继报道，而不同基因型别的OT其毒力和致病力也不同，其中Karp型被认为是毒力较强株，其次[4、5]是Kato型，而Gilliam型是毒力较弱株。中国在1952年将恙虫病定为法定[4、6]报告传染病，在全国监测期间每年都有大约315-1844例患者。然而从1989年后国家不再将其列为法定传染病后，由于缺乏可靠的发病数据，导致低估了该病的流行程度及风险，也使许多医务人员对其缺乏认识了解，从而使许多患者误诊或漏诊，导致严重的并发症，甚至死亡。在过去的十几年里，由于发病数的显著上升及部分地区的爆发流行，中国疾病预防控制中心为提高临床工作人员及疾病预防控制专业人员对该病的认识、诊断、治疗及报告，从2006年开[7、8、9]始重新将其列为法定传染病。1.2世界范围内恙虫病流行趋势恙虫病的世界流行区域较广，主要分布在亚太地区的热带和亚热带国家，1 第1章引言北起日本北部和俄罗斯远东地区，南到澳大利亚北部，西至巴基斯坦和阿富汗，[4]构成一恙虫病流行的三角区域。OT抗原特异性主要决定于OT表面的56kDa型特异性抗原(56kDaTSA)，该抗原是OT的外膜蛋白抗原，含有株特异性抗原决定簇。基于编码OT-56kDaTSA的基因分型,全球不同流行区域的OT流行株[10]亦有差别。Lee于2011年报道韩国地区OT以Boryong型为主，但在西南部地[11]区亦发现Kato型,Neimeng-65型及Kawasaki型的存在，而Jeong于2012年报道在韩国的忠北省亦发现了Kawasaki型，且推测该型别将逐渐变得很普遍。[12]Varghese报道印度南部、北部、东北部三个恙虫病流行区域的OT存在Kato[13]型、Karp型、Gillam型，且以Kato型为主。Yang报道台湾东部不仅存在Karp型、Kato型、Kawasaki型和Gilliam型四种标准型别的OT，同时还存在11种（Taiwan-A,-B,-C,-D,-E,-G,-H,-J,-N,-O,-P）仅在台湾存在的不同型别的OT。既往相关文献报道泰国OT共有Karp、Gilliam、Kato、TA678、TA686、TA716、TA763、TH1817八种基因型，但Wongprompitak于2013年报道在泰国的部分地区发现了2株不明型别的恙虫病，但其同源性分析提示与台湾的OT物种相近，[14、15、16]提示全球恙虫病的基因型别越来越多，同时也越来越复杂。1.3中国地区恙虫病流行趋势我国在20世纪80年代恙虫病主要流行于长江以南的台湾、福建、广东、海南、云南、四川等省份,而80年代以后长江以北的部分地区如河北、河南、山[8、9、17、东、山西、新疆、内蒙古等省份相继有该病的流行，甚至出现疫情的爆发18、19、20、21、22][23]。我国地域辽阔，同样基于OT-56kDaTSA基因分型提示：不同[24]区域流行的OT表现出病原型多样化。比如张海红等报道海南、佛山两地区[25]OT的流行株的基因型别均为Karp型。张志强等对分离自吉林、辽宁地区的6株OT目的基因进行测序分析研究，结果显示吉林、辽宁OT分离株至少存在[3]Karp和Gilliam两种病原型。郭恒彬等报告江苏OT的基因型别为Kawasaki[26]型，但与日本的Kawasaki型OT有遗传差异。陈香蕊等报道山西分离株sxh951[27、28]与韩国的Yonchon株类似。杨丽萍等报道山东地区OT的主要基因型为Kawasaki型。云南大理的恙虫病患者由OTKarp或Kato病原型感染，个别患者可能为Karp+Kato混合型感染，Karp+Kato混合型菌株可能在遗传进化上与某些[29]台湾OT菌株关系密切。粤北山区OT至少存在Gilliam型和Kawasaki型相似2 第1章引言[30]株，鼠类中寄生的OT存在TA686型相似株。北京平谷地区OT流行株属于[31]Kawasaki型。1.4赣州地区恙虫病流行趋势赣州市位于北纬24°29′-27°09′，东经113°54′-116°38′，地处于中亚热带的南缘，属亚热带丘陵山区湿润季风气候，具有春夏降水集中，冬夏季风盛行，气候温和，雨量充足，热量丰富，无霜期长，酷暑和严寒流时间短等气候特征。全市辖内有18个县(市、区)。主要由山区、平原、丘陵构成,为以种植水稻为主的经济欠发达的农业地区。我国改革开放后,该市产业结构开始调整,大力开发果业,如脐橙、甜柚等，农民除种植水稻外还在丘陵、山地垦荒开发果业种植地，致使野鼠的栖环境遭受破坏，且人群暴露机会明显增多,从而导致恙虫病的感染人数增多。2004年赣州市疾病预防控制中心首次接到5例恙虫病临床诊断病例报告，1例来自安远县，4例来自龙南县，对病例进行临床分析及血清学检查后[32]首次证明赣州市有恙虫病的存在。自2006年开始重新将恙虫病列为法定传染病后，根据中国疾病预防控制信息系统-基本信息系统信息提示2006—2012年江西省共报告恙虫病病例510例，其中赣州市405例，其赣州发生病例数占病例[33]总数的79．41％(405／510)。而赣南医学院第一附属医院重症医学科报道11[34]例恙虫病延误诊治并发多脏器功能障碍的患者死亡率为36.4%（4/11）。由上可见赣州地区为恙虫病的高发地区，且因延误诊治所致的死亡率尤其的高。但是关于赣州地区恙虫病的临床特征及OT的基因类型研究尚未见相关报道。基于此，本研究对赣州市的恙虫病临床特征、OT的基因型进行研究并报道如下。3 第2章恙虫病的诊断标准第2章恙虫病的诊断标准[35]参照中国疾病预防控制中心《恙虫病预防控制技术指南（试行）》通知中的恙虫病病例诊断标准如下：(1)疑似病人诊断标准：发病前3周内有野外暴露史、发热、淋巴结肿大或/和皮疹；(2)临床诊断标准：疑似病人加上有溃疡或焦痂，或者同时有发热、溃疡或焦痂及流行期间有野外暴露史；(3)实验室确诊标准：疑似病人或临床诊断病人加上以下一条：①外斐氏实验阳性；②OT特异性抗体IgG或IgM阳性；③PCR检测阳性；④培养分离出病原体。4 第3章材料与方法第3章材料与方法3.1研究对象3.1.1临床数据收集以赣州市为调查地点，筛选2012年1月1日-2015年12月31日这4年赣医一附院收治的临床诊断及确诊的恙虫病患者临床资料（资料收集内容见附表1）为研究对象进行分析进而总结出赣州地区的恙虫病流行特征及临床特征。3.1.2血液样本收集分别用抗凝真空采血管及干燥采血管收集2014年1月-2015年12月赣医一附院临床诊断恙虫病患者入院时的全血各3ml作为实验组，同时收集不明原因发热患者入院时及同期正常人的全血各3ml作为对照组，其中抗凝血直接于-70度冰箱保存留作检测DNA用，非抗凝血进行离心留取血清于-70度冰箱保存留作检测OT抗体用。3.2仪器和设备①-86℃超低温冰箱（设置为-70℃）：产家：美国Thermo公司，型号：Forma702。②可调微量移液器（规格：0.5-10ul、2-20ul、10-100ul、20-200ul、100-1000ul）：产家：法国Gilson公司，型号：pipetman。③小型高速离心机：产家：德国Eppendorf股份公司，型号：5424。④高精度恒温水浴箱：产家：中国上海博迅实业有限公司，型号：SSW-600-2S。⑤电子天平(1/100)：产家：美国丹佛仪器公司，型号：SI-2002。⑥琼脂糖水平电泳槽：产家：中国北京六一生物科技有限公司，型号：DYCP-31E。⑦凝胶成像系统：产家：美国UVP公司，型号：GelDOT-It300。⑧超纯水仪：产家：法国Millipore公司，型号：RiOs5+Milli-QBiocel。⑨颗粒制冰机：产家：日本三洋电机集团，型号：SIM-F140。5 第3章材料与方法⑩PCR仪：产家：德国Biometra公司，型号：T1-96。⑪电磁炉：产家：中国格兰仕集团有限公司。3.3试剂①TIANampBloodDNAKit试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司生产。②2xHOTStartTaqPCRMasterMix试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司生产。③恙虫病东方体抗体检测试剂盒：厦门波生生物技术有限公司生产。④Biowest琼脂糖：由BIOWEST生物公司生产，原装进口。⑤Genecolour染料：北京金博益生物技术有限公司生产。⑥DNAMarker：天根生化科技(北京)有限公司生产⑦巢式PCR引物RTS-6、RTS-7、RTS-8、RTS-9：由上海生工生物技术有限公司合成。3.4DNA的提取使用TIANampBloodDNAKit试剂盒提取DNA，提取步骤如下：使用前参照瓶上标签在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。①处理血液材料：取各全血样品400ul，在各个样品中加入600ul（样品的1.5倍）细胞裂解液CL，颠倒混匀，1000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向离心收集到的细胞核沉淀中加入200ul缓冲液GS，振荡至彻底混匀。②加入20ulProTeinaseK溶液，混匀。③加入200ul缓冲液GB充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，至溶液变清亮。④加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀。⑤将上一步所得的溶液加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。⑥向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。6 第3章材料与方法⑧重复操作步骤⑦。⑨12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。⑩将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加200ul洗脱液TB，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管。⑪为增加基因组DNA的得率，将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管，放置于-70℃冰箱备用。3.5OT-56kDaTSA基因扩增[36]使用巢式PCR方法扩增OT-56kDaTSA基因，参照文献针对OT-56kDaTSA基因设计两对引物。引物的核苷酸序列如表3.1所示：表3.1巢式PCR检测OT-56kDaTSA基因的引物序列引物序列RTS-65'-GTTGGAGGAATGATTACTGG-3'RTS-75'-AGCGCTAGGTTTATTAGCAT-3'RTS-85'-AGGATTAGAGTGTGGTCCTT-3'RTS-95'-ACAGATGCACTATTAGGCAA-3'巢式PCR反应使用2xHOTStartTaqPCRMasterMix（TIANGEN）试剂盒进行，反应体系总体积为25ul。第一轮、第二轮反应体系如表3.2、表3.3所示，两轮的反应条件相同，如表3.4所示。表3.2巢氏PCR第一轮反应体系预先提取的DNA3ulRTS-81ulRTS-91ul2xHOTStartTaqPCRMasterMix12.5ulddH2O7.5ul7 第3章材料与方法表3.3巢氏PCR第二轮反应体系第一轮巢氏PCR产物1.5ulRTS-61ulRTS-71ul2xHOTStartTaqPCRMasterMix12.5ulddH2O9ul表3.4巢氏PCR反应条件Pre-denaturation94℃3minDenaturation94℃30secAnnealing55℃30sec×40cyclesElongation72℃1minLastelongation72℃5min3.6巢式PCR结果的判定用1XTBE缓冲液配制含1ug/mlGenecolour染料的1.5％琼脂糖凝胶，放入琼脂糖水平电泳槽后，在凝胶的第一个孔加入5ulDNAMarker，余孔各加入5ul巢式PCR产物，在TBE缓冲液中以120V恒压电泳60min，然后在凝胶成像系统仪上观察，以在629bp处有扩增条带者为阳性结果。3.7DNA测序及同源性分析将阳性的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序，然后将所得到的序列通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心（www.ncbi.nlm.nih.gov）站点后，利用BLAST工具将所得到的基因序列与基因库中的基因序列进行对比，然后从GenBank检索出10株全球不同地区的OT-56kDaTSA基因序列作为参考株。运用Clustalx1.83对所有序列进行比对，再用MEGA5.1软件对比对序列进行分析，使用邻结法绘制系统发生树，进而得出其基因类型，同时分析出赣州地区OT与全球不同地区的OT同源关系。8 第3章材料与方法3.8OT抗体检测留取的患者血清使用厦门波生生物技术有限公司生产的恙虫病东方体抗体检测试剂盒（胶体金法）检测OT特异性抗体IgG及IgM，根据试剂盒使用说明书在检测卡的两个加样孔上分别滴加血清2ul及缓冲液100ul，20min后读取结果，在IgG检测线及对照线位置出现紫红线则为IgG阳性，在IgM检测线及对照线位置出现紫红线则为IgM阳性，在IgG检测线、IgM检测线和对照线位置出现紫红线则为IgG、IgM同时阳性，只在对照线位置出现一条紫红线则为阴性，对照线未出现紫红线则为无效。3.9统计学分析采用SPSS18.0软件和Excel软件进行统计学处理。回顾性分析资料的数据如天数、年龄等以X±S表示；死亡率等采用卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。9 第4章结果第4章结果4.1流行特征根据中国疾病预防控制中心《恙虫病预防控制技术指南（试行）》通知中的恙虫病病例诊断标准对赣医一附院2012年1月1日-2015年12月31日这4年出院诊断为恙虫病患者进行筛选后共310例患者符合条件，其中实验室确诊患者36例。4.1.1地区分布本研究的310恙虫病患者均在赣州地区内患病，各县市的发病人数分别为：南康58例，于都34例，龙南33例，安远26例，赣县25例，赣州市19例，宁都17例，瑞金15例，全南14例，会昌14例，大余12，信丰12例，兴国11例，崇义7例，上犹5例，寻乌5例，石城2例，定南1例（见图4.1）。结果提示在赣州地区恙虫病以散发流行为主，其中以南康发病人数最多。图4.1310例恙虫病患者地区分布图（例）4.1.2时间分布对310例患者进行分析（见表4.1），2012年、2013年、2014年、2015年10 第4章结果的收治患者数分别为74例、88例、86例、62例（见图4.2）。不同月份病例分布数有所不同，这四年中1、2、3月份均未见病例分布，而4月份至12月份病例数各有不同，以6-10月份病例分布最多，占91.3%。（见图4.3）。表4.1310例恙虫病患者发病时间分布表月份/年份2012年2013年2014年2015年共计1月000002月000003月000004月010015月031046月1319258657月23182012738月61379359月191411186210月10161484811月14361412月20518共计74888662310图4.22012-2015年赣医一附院年收治恙虫病患者分布图11 第4章结果图4.32012-2014年各月份恙虫病发病数4.1.3易感人群分布（1）性别分布在这310例患者中，男性患者89例，占28.7%，女性患者221，占71.3%，男女患病比率为1:2.48。（2）年龄分布：在310例患者中，年龄最小的为1岁，最大的为88岁，以20岁为一年龄段，将1-100岁划分为5个年龄段（见表4.2）。结果显示以41-80岁年龄段病例分布最多，占86.3%。（3）职业分布：对310例患者进行职业分析，结果显示（见表4.3）：农民的病例分布最多，占83.2%，提示发病以农民为主。表4.2310例恙虫病患者年龄分布及构成比年龄段数量构成比（%）0-20岁144.621-40岁237.541-60岁16553.261-80岁10333.181-100岁51.6合计31010012 第4章结果表4.3310例恙虫病患者职业分布及构成比职业数量构成比（%）农民25883.2工人103.2退休41.3家庭主妇30.9婴幼儿及学生144.5军人20.7公务员20.7其他175.5合计3101004.2临床特征4.2.1临床表现入选的310例患者中，所有患者均有发热，多为弛张热，最高体温为39.30±1.31℃，其他并发症的症状有乏力、头晕、头痛、咳嗽、恶心、呕吐、腹胀、腹泻等。310例患者中，有典型的焦痂者305例（98.4%），其中有7例有两处焦痂，其中焦痂位于腋窝、腹股沟、会阴、臀部等隐蔽部位的占36.8%，位于前胸、后背、腹部等躯干部位的占有35.9%，位于四肢的占有23.8%，其中前胸以乳房部位为主、上肢以上肢内侧为主、下肢又以大腿内侧为主（焦痂的具体部位分布见表4.4）；有淋巴结肿大者70例（22.6%），有皮疹者22例（7.1%），脾肿大者63例（20.3%），肝肿大者15例（4.8%）；其他并发症所致的体征则有肺部干湿性啰音、腹部压痛、双下肢水肿等。表4.4焦痂部位分布及构成比部位数量构成比（%）头面部10.3颈部103.2腋窝3812.2前胸3912.5后背154.813 第4章结果续表部位数量构成比（%）腰腹部5818.6腹股沟299.3会阴175.4臀部319.9上肢3210.3下肢4213.5共计3121004.2.2外斐氏实验目前赣南医学院针对恙虫病的实验检测方法有外斐氏实验，其中在所分析的310例患者中有252例行外斐氏实验检测，仅有1例为阳性。4.2.3并发症310例患者中并发肝功能损害230例（74.2%）、支气管炎或肺炎140例（45.2%）、心肌损害91例（29.4%）、血液系统受累65例（21.0%）、胃肠道功能紊乱61（19.7%）、肾功能损害52例（16.8%）、凝血功能异常3例（1.0%）、脑膜炎2例（0.7%）（见表4.5），其中同时有2个及2个以上系统受累者有136例（43.9%）。表4.5310例恙虫病患者并发症情况表并发症数量百分比（%）肝功能损害23074.2支气管炎或肺炎14045.2心肌损害9129.4血液系统受累6521.0胃肠道功能紊乱6119.7肾功能损害5216.8凝血功能异常31.0脑膜炎20.74.2.4治疗情况14 第4章结果310例恙虫病患者中，入院科室分别为呼吸内科165例、消化内科57例、急诊科42例、ICU13例、儿科（包括PICU）12例、肾内科8例、全科医学科6例、神经内科3例、肿瘤内科2例、心血管内科1例、风湿免疫科1例（见表4.6）。310例恙虫病患者中有249例（80.3%）在住院48小时内即被临床诊断为恙虫病。成人的治疗方案主要以多西环素联合广谱抗生素及对症支持治疗为主，而未成年人的治疗方案以阿奇霉素或氯霉素及对症支持治疗为主。针对性用药后体温在2.33±1.03天开始下降，而3.26±1.47天可恢复正常。住院天数为8.10±3.61天。治疗结果为285例（91.9%）治愈，7例（2.3%）死亡，另有18例（5.8%）因病情需要而转院或因家庭因素放弃住院治疗（见表4.7）。分析年龄与死亡的关系，将310例患者以60岁为界分为≤60岁组及＞60岁组两个年龄组，使用卡方检验分析两个年龄组的死亡率提示两个年龄组死亡率差异有统计学意义（P<0.05）（见表4.8），分析得出年龄越大，死亡率越高。表4.6310恙虫病患者入院科室分布表入院科室数量构成比（%）呼吸内科16553.2消化内科5718.4急诊科4213.5ICU134.2儿科（包括PICU）123.9肾内科82.6神经内科31.0心血管内科10.3风湿免疫科10.3全科医学科61.9肿瘤内科20.7合计31015 第4章结果表4.7310恙虫病患者治疗结果治疗结果数量构成比（%）治愈28591.9死亡72.3转院或放弃住院185.8备注：治愈：体温恢复正常3天以上，实验室异常指标恢复正常或接近正常；死亡：生命体征消失；转院或放弃住院：体温未恢复正常或实验室异常指标未恢复常或疗程未到时转院或放弃住院治疗。表4.8两个年龄组死亡率的卡方检验2≤60岁组＞60岁年龄组χ值P值n=202（%）n=108（%）死亡组0（0）7（6.5%）*非死亡组202（100%）101（93.5%）13.3950.001*Fisher精确检验4.3OT特异性抗体检测及巢式PCR检测从2014年1月-2015年12月期间共收集到42例临床诊断恙虫病患者的血液标本，30例不明原因发热患者的血液标本，10例同期正常人的血液标本，共82份血液标本。参照天根生化科技有限公司生产的BloodDNAKit试剂盒说明书提取82份全血样本的DNA，DNA提取物使用巢式PCR扩增OT-56kDaTSA基因，再制做琼脂糖凝胶，上样后在TBE缓冲液中电泳后，使用凝胶成像系统观察结果，其中临床诊断恙虫病组有31例在629bp间出现扩增条带，不明原因发热组有2例在629bp间出现扩增条带，正常人组0例在629bp间出现扩增条带，共有33份样本呈现阳性结果，即33例检测出OT（见表4.8及图4.4）。对这82份血浆样本使用OT抗体检测试剂盒（胶体金法）检测OT特异性抗体IgG及IgM，其中临床诊断恙虫病组有30例呈阳性结果，不明原因发热组有5例呈阳性结果，正常人组0例呈阳性结果，共35份样本呈现阳性结果。这35份阳性结果中，其中22例示IgM阳性，5例示IgG阳性，8例示IgM及IgG同时阳性（见表4.8及图4.5）。根据实验结果提示，若以临床诊断标准为金标准，则巢式PCR检测方法及OT抗体检测方法的敏感度分别为73.8%（31/42）、71.4%（30/42）。16 第4章结果表4.8巢氏PCR、OT抗体检测结果组别PCR阳性数（例）OT抗体检测阳性数（例）临床诊断恙虫病组3130不明原因发热组25正常人对照组00图4.4部分患者巢式PCR结果凝胶成像图阴性IgM阳性IgG阳性IgM、IgG同时阳性图4.5部分患者OT抗体检测结果4.4DNA测序及同源性分析将33份巢式PCR阳性的扩增产物送上海生工生物技术有限公司进行测序17 第4章结果（部分测序结果见图4.6、图4.7）。将所得到的33份基因序列通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心站点后，利用BLAST工具与基因库中的已知基因型别的OT基因序列进行对比，然后从GenBank检索出10株全球不同地区的OT-56kDaTSA基因序列作为参考株（见表4.9）。运用Clustalx1.83对所得的33份基因序列及10株参考株序列进行比对，再用MEGA5.1软件对比对序列进行分析，使用邻结法绘制系统发生树（见图4.8），结果提示本实验所分离的33株OT中有30株基因型为Karp型，1株基因型为Gilliam型。另有2株无法判定其基因型。同源性分析提示赣州地区的OT分离株与广州、台湾、越南及泰国等地区的部分OT同源。我们将赣州地区OT基因型为Gilliam型的GZ-cfOT-56kDaTSA基因序列提交至PubMed基因库，其GenBankaccessionnumber为KU215599（具体参数见附表2）。图4.6Gilliam型OT-56kDaTSA基因部分序列图图4.7Karp型OT-56kDaTSA基因部分序列图18 第4章结果表4.910株参考株信息分离样品分离GenBank基因编号参考文献时间来源地点登录号型别KM022002恙螨台湾GU120147Gilliam37KM0503/2008恙螨台湾GU120150Karprelated37TW-105/2006人台湾GQ332742Karprelated38Taitung-2--台湾AY335819JG-related4UT31610/2004人泰国EF213078TA76339CDCKarp2002人新几内亚AY956315Karp13GDqy1305208/2013人广州KJ188197Gilliam5GDfk1301706/2013人广州KJ188185Karp507QN-VN05/2009人越南HQ718454Karp40S122707212/2008人柬埔寨HQ718430JG-v4019 第4章结果GZ-zlxGZ-hqsGZ-ztfGZ-xsyGZ-wsl61GZ-lwsGZ-sdfGZ-zfzGZ-cwsGZ-lzh76GZ-lsmGZ-lwdGZ-trqGZ-zjfGZ-zjjGZ-yyxGZ-xlh72GZ-fldGZ-zgj61GZ-wcl73GZ-zyxGZ-clbgi|588283879|gb|KJ188185.1|gi|296396903|gb|GQ332742.1|gi|320129281|gb|HQ718454.1|gi|124294997|gb|EF213078.1|GZ-lxfGZ-rgy67GZ-lhpGZ-llyGZ-lmtGZ-lmy98GZ-wyx99GZ-llfgi|265385897|gb|GU120150.1|gi|63079111|gb|AY956315.1|8474gi|265385891|gb|GU120147.1|68GZ-cf100gi|588283903|gb|KJ188197.1|gi|37703870|gb|AY335819.1|8099gi|320129233|gb|HQ718430.1|GZ-lrdGZ-lml图4.8赣州地区33株OT分离株及10株全球考株的56kDaTSA基因序列使用邻结法绘制的系统树20 第5章讨论第5章讨论赣州市是恙虫病流行地区，以夏秋季节流行为主，其中6-10月为发病高峰，以农民发病为主，其主要是因为5、6月份气温开始上升，且雨水较多有利于媒介恙螨的生存、发育、传播，6-7月份开始即为早稻收割及晚稻播种期，而9-10月是脐橙、柚子等水果的采摘期，农民野外劳作时间长，野外暴露机会多，使感染几率显著升高。易感人群以女性及中老年为主，考虑原因之一为女性及老年人抵抗力更弱，被恙螨叮咬后更易发病，而男性抵抗力更强，被恙螨叮咬后发病机率更低；另一原因为现赣州地区仍是个欠发达地区，很多年轻人，尤其是男性选择外出工作，而女性及中老年人则留家务农，野外暴露机会多，更易患病。[41]根据廖勇等报道赣州地区2008-2012年有恙虫病报道的县市由9个上升至[42]17个，而本研究所调查的病例提示赣州18个县区市均有发病，而邓海智等报道恙虫病在赣州市最早发病为3月份，最晚为10月份，本研究中2012年-2015年11月份及12月份仍有发病，提示赣州地区近年发病范围再次扩大，流行区域已覆盖整个赣州市，且全年发病时间延长。考虑与以下因素有关：①自1989年我国不再把恙虫病列入法定报告传染病之后，临床医务工作者及防疫部门对该病的重视程序有所下降，对其防治有所放松，以致疫区发病数有所上升；②越来越多的山地被开发于种植果树，生态环境遭到严重破坏，原始植被破坏后出现的次生植被，逐渐形成恙虫病疫源地，造成疫源地的扩散；③恙虫病疫源地的扩散可能与气温、湿度、地理环境变化等有关，从而造成了具有传播恙虫病能力的传染源大量繁殖，同时也适应了恙虫病病原体的孽生，使恙虫病新的疫[43]区不断出现，但也不排除病原体本身的变异。其中18个县区市又以南康发病人数最多，考虑有以下因素：①南康近年大力发展果业，如甜柚产业、脐橙产业等，导致鼠类的栖息环境遭到破坏，人群暴露机会增多；②南康家具产业的迅速发展，更多家具产地发展至乡村的山间，使更多的人暴露于野外；③南康人口数是赣州地区除于都县外最多的；④南康接近赣州市，南康人民患病后更多的患者能及时就诊于赣医一附院。据本研究显示：310例恙虫病患者有249例（80.3%）在住院48小时内即被临床诊断为恙虫病，成人予以多西环素联合广谱抗生素及对症支持治疗后，体21 第5章讨论温在2.33±1.03天开始下降，而3.26±1.47天可恢复正常。现住院天数为8.10±3.61天。其中91.9%治愈。近两年恙虫病患者较过去的十多年更快的被发现、诊断，且治疗水平有所提高，主要是由于过去的十多年里赣州地区恙虫病患病数持续较高，且由于漏诊或误诊使患者死亡的报道明显增多，从而使赣州地区医务人[34]员对恙虫病的意识显著提高，治疗水平也相应的有所提高。但仍有2.3%的患者死亡，该部分死亡患者皆为农民、老年、女性，查体皆有典型的焦痂体征，全部在入院48小时内即被临床诊断为恙虫病，且在入院当天即给予多西环素抗恙虫病及对症处理，但患者最终仍然死亡，分析其原因主要是①患者年龄大，达71.57±5.29岁；②居住地皆为偏远贫困的山区，由于经济及地理位置等原因导致就诊时间晚；③并发症多，入院时肝功能、肾功能、血液系统及呼吸系统皆已受累，另71.4%还同时有胃肠功能紊乱，57.1%同时有心肌损害，28.6%同时有凝血功能异常。而有5.8%患者转院或放弃住院治疗，这部分患者主要以儿童为主，基于儿童抵抗力低下、全身各系统功能尚不完善，若未及时控制病情[44]预后差，根据张小玲报道的赣州市儿童恙虫病误诊疗高达60%，延误诊治导致的死亡率更高达10%。目前赣州地区儿童被诊断为恙虫病即建议转专科医院治疗，这提示赣州地区儿童恙虫病患者的治疗水平有待进一步提高。本研究310患者中有典型的焦痂者305例，焦痂分布于腋窝、腹股沟、会阴、臀部等隐蔽的部位的占36.8%，这主要与媒介恙螨喜温热潮湿环境有关。由于大部分医师都了解恙螨的这一特性，所以在考虑患者可能患恙虫病时会尤其的关注这些部位，也常常因此而忽略其他部位，尤其是双侧上肢的近心端，而据本研究数据显示躯干部及四肢焦痂分布各有35.9%、23.8%，这提示临床医师在怀疑患者患恙虫病时不仅需查找身体隐蔽部位是否存在焦痂，更不能忽略了那些浅显易见的部位，即使在天气寒冷时也需要对患者全身进行详细的检查。目前赣州地区针对恙虫病的特异性实验室诊断检查仅有外斐氏实验，而在本研究中的310例患者中有252例患者进行了外斐氏实验，但仅有1一例外斐氏实验阳性，阳性非常率低，考虑原因为：①外斐氏实验是利用恙虫病东方体与变形杆菌的交叉免疫原性建立的变形杆菌凝集反应，所以灵敏性和特异性不高；②因血清成分复杂，抗体出现较晚，早期不易测得；③与赣南医学院检验科所选实验试剂或存在一定关系。目前赣州地区临床医师主要通过患者的临床表现来诊断恙虫病，其中最具有诊断价值的临床表现为患者有特征性的焦痂或[45、46]溃疡，但遗憾的是并不是每位恙虫病患者都具有典型的焦痂或溃疡。在本22 第5章讨论研究中有一位中期妊娠孕妇，由于发热在当地医院住院治疗，经积极抗感染治疗后仍持续发热，遂转入赣医一附院呼吸内科治疗，转入后开始亦考虑为感染性疾病发热，遂积极予以抗感染治疗，同时考虑高热导致胎儿缺氧及抗生素对胎儿的影响遂予以引产，后体温仍波动在38℃左右，后经全院扩大会诊，考虑患者同时患有成人Still疾病，遂予以糖皮质激素治疗，但仍有间断发热，后建议转上级医院进一步诊治。本研究在对所有收集的血液检测OT抗体及巢PCR检测OT-56kDaTSA基因时该患者检测结果提示OT抗体IgM阳性，巢式PCR亦为阳性，现回顾性诊断该患者应为一不典型恙虫病患者，但由于患者全身未见典型焦痂或溃疡，而外斐氏实验为阴性，同时由于缺乏其他可靠、简便的实验室检查导致该患者误诊，从而使患者不仅花费大量财力，且精神、身体遭受巨大伤害。因此患者若缺乏典型焦痂或溃疡，而又缺乏可靠的实验室检查时临床极易误诊或漏诊。本研究实验组的42例恙虫病患者的血标本行巢式PCR、OT抗体检测，其敏感度分别为73.8%（31/42）、71.4%（30/42）、0%，巢式PCR及OT抗体检测的敏感性接近。随着分子生物学技术的快速发展，越来越多分子生物学技术被应用于恙虫病的早期诊断中，除本实验使用到的巢式PCR，还有非常多的研究报道显示实时荧光定量PCR、环介导恒温扩增技术等亦可用于早期诊断恙虫病，虽本实验数据提示巢式PCR在恙虫病的早期诊断中要明显优于目前常用的外斐氏实验，但由于样本量少,因此巢式PCR、实时荧光定量PCR、环介导恒温扩增技术等分子学技术在恙虫病的早期诊断中的价值还有待于进一步研究验证。本研究基于OT-56kDaTSA基因对赣州地区OT分离株进行基因分型，发现赣州地区OT基因型以强毒的Karp型（30/33）为主，同时也存在弱毒的Gilliam型（1/33）和不明基因型（2/33）。在回顾性分析310例恙虫病患者资料时有136例（43.9%）同时有2个或2个以上系统受累，提示赣州地区的OT毒性较强，这与实验的结果也是相符的，同时与相关文献报道的我国总体上南方以强毒的[17、18、47、48、49、50]Karp型为主，北方以弱毒的Gilliam/Kawasaki型为主亦相符。由于本实验样本量有限，且仅检测患者血液中的OT，未对媒介昆虫及啮齿动物等进行检测，赣州地区是否还同时存在其它OT类型还有待进一步研究分析。同源性分析结果显示：所分离的33株OT中的1株Gilliam株与台湾的分离株KM02同源，而Karp株中有28株与广州分离株GDfk1、台湾分离株TW-1、越南分离株07QN-VN及泰国分离株UT316同源，有2株仅与台湾的分离株23 第5章讨论KM05同源，而有2株与所选的全球10株参考株皆不同源。推测赣州地区的OT与广州、台湾、越南、泰国等地的部分OT同源。赣州地处南岭、武夷山、诸广三大山脉交接地区，地势四周高，中间低。地貌以丘陵、山地为主，占全市土地面积的83%。全年气温较高，降雨量较大，适合传播媒介恙螨及宿主鼠类等的生长，有利于恙虫病的传播，若疫情控制不好，将会对居民的生命安全及生活质量构成严重的威胁。因此，从分子水平加强对OT的监测，有助于及时发现传染源及传播媒介，从而更有效的控制恙虫病的疫情发展。而简单、快速、有效、灵敏的恙虫病检测方法亦是目前急需研究解决的问题。24 第6章结论第6章结论1、赣州地区恙虫病以散发流行为主，6-10月为发病高峰期，女性患者多见，以41-80岁年龄段多发，且年龄越大，死亡率越高。2、赣州地区OT基因型有Karp型、Gilliam型，且以Karp型为主，其与广州、台湾、越南及泰国等地部分OT同源。25 致谢致谢三年研究生生活转瞬即逝，入学时的情境仿佛就在眼前。回首走过的岁月，心中充满感激！感谢我的导师赖庆文教授在我学习和工作上的指导和鼓励，通过导师的言传身教，我感受到了导师深厚的学术造诣、精湛的专业技术、精益求精的工作作风及宽容待人的为人处世。也正是导师平时精益求精的工作作风激励着我努力的学习，希望通过自己努力的学习工作，将来能成为老师那样优秀的临床医师。能成为赖庆文教授的学生一直是我的荣幸和骄傲！在此，特向我的导师赖庆文教授致以衷心的感谢和崇高的敬意！由衷感谢袁小亮博士在科研思路、实验设计、实验方法、结果分析、论文撰写、修改、完善等方面给予的精心指导和帮助，正是您的指导和帮忙才使本论文的顺利完成。由衷的感谢刘惟优主任、丁彦老师对我临床实践及临床技能的指导和启发，正是您们对患者悉心、认真、负责的态度让我明白了如何去做一名有爱心的医师，也是您们精湛的医技让我明白了如何才能成为一名优秀的医师。由衷感谢李杰老师、吴国斌老师对我在电子支气管镜检查技术方面的指导，感谢您们给予我实践的机会，让我现在能很好的完成电子支气管镜检查。由衷的感谢赣医一附院科研中心的罗耀玲老师、杨建琼老师、张敏鸿老师在实验方面的鼎力帮助和指导。感谢我的父母，是您们从小给予我无私的爱和培养，使我现在有一个健康的身体、健全的人格；是您们努力、辛苦的工作，使我能有条件接受好的教育。谢谢您们为我付出的一切，我也会如您们所期盼的那样成为一名优秀的医师的。感谢我的公公、婆婆、爱人和小孩，正是你们默默地支持和支撑起整个家庭，使我在三年读书期间，没有后顾之忧，从而顺利完成学业。毕业，意味着人生道路一个阶段的终止，更是新征程的开始。在这三年的学习和工作中，我接触了校内外、院内外以及科室的许多优秀人才，与他们相比，我感受到了很大的差距和多方面的不足，这些都激励和鞭策着我不断努力。在即将投入临床工作中，我将努力的去成为一名有耐心、认真、负责的临床医师！最后，感谢在百忙之中评审我硕士学位论文的各位专家和老师！张桂娟2016年5月26 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附表附表2GZ-cfOT-56kDaTSA基因序列在PubMed基因库里的具体参数LOCUSSeq1562bpDNAlinearBCT29-NOV-2015DEFINITIONOrientiatsutsugamushistrainGZ-cf56kDatype-specificantigengene,partialcds.ACCESSIONSeq1VERSIONKEYWORDS.SOURCEOrientiatsutsugamushiORGANISMOrientiatsutsugamushiBacteria;Proteobacteria;Alphaproteobacteria;Rickettsiales;Rickettsiaceae;Rickettsieae;Orientia.REFERENCE1(bases1to562)AUTHORSYuan,X.,Zhang,G.,Liu,W.andLai,Q.TITLEMolecularEpidemiologicSurveyofOrientiatsutsugamushiInfectionAmongPopulationinSomeAreasofGanzhouCity,ChinaJOURNALUnpublishedREFERENCE2(bases1to562)AUTHORSYuan,X.,Zhang,G.,Liu,W.andLai,Q.TITLEDirectSubmissionJOURNALSubmitted(29-NOV-2015)DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,23qingnianRoad,Ganzhou,Jiangxi341000,ChinaCOMMENTBankitComment:ALTEMAIL:404425277@qq.com.BankitComment:TOTAL#OFSEQS:1.##Assembly-Data-START##SequencingTechnology::Sangerdideoxysequencing##Assembly-Data-END##FEATURESLocation/Qualifierssource1..562/organism="Orientiatsutsugamushi"32 附表续表/mol_type="genomicDNA"/host="Human"/db_xref="tax-on:784"/collection_date="10-May-2015"/note="[uncultured(withspecies-specificprimers)]"gene<1..>562/gene="TSA"CDS<1..561/gene="TSA"/codon_start=1/transl_table=11/product="56kDatype-specificantigen"/translation="EHLSLTTGIPFGGTLAAGMTIAPGFRAELGVMYLRNISAEVEVGKGKVDSGGEIKADSEGGTDAPIRKRFKLTPPQPTVMPISIADRDVGVDTDILAQAGAGQPQLTVEERAAHRIAWLKNYAGIDYMVPDPQNPHARVINPVLVNITQGPPNVQPRPRQNLDILDHGQWRHLVVGVTALSHANKPS"BASECOUNT155a104c146g157tORIGIN1gaacacttgtcattaacaactgggataccatttggtggtacattagctgcgggtatgaca61attgcaccaggatttagagcagagctaggtgttatgtaccttagaaatataagcgctgag121gttgaagtaggtaaaggcaaggtagattctggaggtgagataaaggcagattctgaaggt181gggacagatgctcctatacgtaagcggtttaaacttacaccacctcagcctactgtaatg241cctataagtatagctgatcgtgatgtgggggttgatactgatattcttgctcaggctggt301gctgggcaaccacagcttactgttgaggagcgggctgcacataggattgcttggttgaag361aattatgctggtattgactatatggtcccagatcctcagaatcctcatgctagagttata421aatcctgtgttggtaaatattactcaagggccacctaacgtacagcctagacctcggcaa481aatcttgacatacttgaccatggtcagtggagacatttggtagttggtgttactgcattg541tcacatgctaataaacctagcg33 综述综述分子生物学技术在恙虫病东方体检测与研究的应用现状【摘要】恙虫病是由病原体恙虫病东方体（orientiatsutsugamushi，OT）引起的一种自然疫源性疾病。过去多应用血清抗体检测的方法对其进行检测，随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学技术被应用于OT的检测中。本文对近年应用于OT检测的分子生物学技术进行综述。【关键词】恙虫病；恙虫病东方体；分子生物学技术；实时荧光定量PCR；巢式PCR；环介导恒温扩增技术。ThestatusofapplicationofmolecularbiologicaltechniquetothedetectionandstudyonorientiatsutsugamushiAbstract:Tsutsugamushidiseaseisanaturalfocaldiseasecausedbythepathogeneoforientiatsutsugamushi.Inthepast,theserumantibodydetectionwasusuallyusedtodetectit,withthedevelopmentofmolecularbiologicaltechnique,moreandmoremolecularbiologicaltechniquesareappliedtodetectorientiatsutsugamushi.Thispaperconductedareviewonthemolecularbiologicaltechniquesbeingappliedtodetectorientiatsutsugamushiinrecentyears.Keywords:tsutsugamushidisease;orientiatsutsugamushi;molecularbiologicaltechnique;real-timefluorescenequantificationPCR;NestPCR;loop-mediatedisOThermalamplificationtechnique.恙虫病（Tsutsugamushidisease）又名丛林斑疹伤寒，是由病原体恙虫病东方体（Orentiatsutsugamushi,OT）引起的一种自然疫源性疾病，患者的临床特征以高热、焦痂、皮疹和淋巴结肿大为主,6月-10月份为高发季节，发病以农民[1]为主。病原体OT从恙螨幼虫叮咬处侵入人体后先引起局部皮肤损害，后经淋巴系统进入血液产生立克次体血症及毒血症，致全身小血管炎和血管周围炎，甚至出现多脏器损害。OT最早发现于日本，属于专性细胞内寄生的微生物。不同地区、不同株间其抗原性差异较大，毒力亦不同。基因分型主要包括Karp、Kato、Gilliam、TA763、TA678、TA686、TA716、TH1817、Kawasaki、Kuroki、34 综述[2]Shimokoshi等病原型。至今为止，已有超过20多种病原型相继报道。目前国内外对恙虫病的诊断检测方法有：（1）病原体直接培养；（2）血清学方法：如外斐氏反应、间接免疫荧光试验；（3）分子生物学方法：常规PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR、环介导恒温扩增技术等。不同的检测方法，其优缺点各不相同，病原体直接培养法耗时,实验技术和实验条件要求高，且检出率低，该方法适合用于病原体实验研究。血清学方法是在20世纪90年代发展起来的检测技术，其敏感性和特异性较高，但血清中的特异性抗体一般在发病1～2周后出现，且由于血清中的成份很复杂,同时很容易出现交叉反应，无法[3-5]满足临床上早期、快速、准确的诊断要求。分子生物学对恙虫病的诊断方法是随着核酸提取技术的提高、OT相关抗原基因序列的发表而逐渐发展起来的，该方法由于不需要病原体的纯培养,检测时间大为缩短，使用试剂盒提取核酸方法具有较好的稳定性，适合实验室对大批量样品的诊断。目前国内外常用的分子生物学方法主要有实时荧光定量PCR(Real-timePCR)、巢式PCR(nest-PCR)、环介导恒温扩增技术(LAMP)等。现本文主要对近年针对OT检测的分子生物学技术的发展概况进行综述。1.实时荧光定量PCR自1983年美国的KaryMullis创建出聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）后，该项技术已成为DNA分析最常用的技术，且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。它的敏感性、特异性及重现性皆显著高于传统PCR，已经开始应[6][7]用于多种细菌、病毒等的检测，且近年该技术亦广泛应用于OT的检测。Kim对一组恙虫病病人发病4周内的血液同时使用传统的PCR及荧光定量PCR进行检测，其敏感性分别为7.3%、82.9%，提示荧光定量PCR对OT检测的敏感性明显优于传统的PCR。目前OT检测的金标准为间接免疫荧光实验（IFA），而Watthanaworawit研究显示荧光定量PCR在OT的检测中的灵敏度是IFA的两倍[8][9]。周海燕等利用实时荧光定量PCR检测患者血标本、鼠类脾脏的OT-56kDaTSA基因片段，从分子水平证实粤北山区域是恙虫病的自然疫源地，且该地OT35 综述存在Gilliam型及Kawasaki型。根据所使用的技术不同，实时荧光定量PCR技术可分为SYBRGreenI荧光染料及TaqMan探针两种，而目前该两种技术皆使用于OT检测的研究中。耿美[10]玲等使用其课题组建立的SYBRI染料法实时荧光定量PCR检测国内多地恙虫[11]病多种样本，阳性率高达96.6%，检测的灵敏度为传统PCR的100倍。谈忠鸣等通过以OT序列上相对保守的GroEL基因为目的基因，设计引物及探针而建立的探针荧光定量PCR，对OT进行检测，检测的最低浓度为21.8拷贝/ul，提[12]示TaqMan探针荧光定量PCR技术的敏感性较高。而付秀萍等则以编码OT表面膜蛋白，具有组及株的抗原决定簇的OT-56kDaTSA基因序列设计引物及探针建立的探针荧光定量PCR，该技术检测OT基因的最低浓度为2拷贝/ul，提示其灵敏度要比谈忠鸣等以GroEL基因序列设计的探针荧光定量PCR还要更上一个台阶。2.巢式PCR巢式PCR（nest-PCR，NPCR）是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和传统PCR相似。第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成[13][14]的非特异性扩增的污染。早在1993年Furuya等即通过OT-56kDaTSA基因构建巢式PCR的群和型的特异性引物，证明部分患者在起病后的1天即可快[15]速的诊断恙虫病。而Manosroi等应用巢式PCR技术对泰国部分地区恙虫病患者血液进行检测，结果提示在恙虫病患者发热第3天可检测出阳性。[16]目前巢式PCR已经被广泛的应用于OT基因型别的判定中，陶霞利用巢式PCR发现广州市OT存在Karp型、Kato型、Gilliam型、TA763型等，且以强毒的Karp型占优势，提示广州市OT流行型别具多样性，来源复杂，在该地[17]流行时间长。杨杜鹃用巢式PCR首次证实勐海县存在恙虫病流行，且该地流36 综述[18]行株可能属Karp或Kato型。Lee利用巢式PCR检测韩国地区OT，证实韩国地区OT基因型以Boryong型为主，同时存在Kato型,Neimeng-65型及Kawasaki[19]型。Varghese报道利用巢式PCR检测印度南部、北部、东北部三个恙虫病流行区域的OT，证实此三个流行区域OT存在Kato型、Karp型、Gillam型基因型。[20]同时巢式PCR亦被应用于流行病学调查中，操敏等利用巢式PCR对安徽三界的黑线姬鼠、褐家鼠、东方田鼠及鼩鼱的脏器进行OT-56kDaTSA基因检测，证实安徽三界地区存在鼠类OT自然感染，且黑线姬鼠为其主要宿主，而[21]OT属Kawasaki基因型。何凤屏利用巢式PCR对粤北山区东方立克次体感染的患者和鼠类标本OT-56kDaTSA基因检测，对阳性标本进行基因分型和测序，[22]证实粤北山区人、鼠均存在OT自然感染，已成为恙虫病自然疫源地。程鹏等通过随机捕捉山东的济南、济宁、泰安、枣庄、菏泽5地市的黑线姬鼠、褐家鼠、东方田鼠、小家鼠和大仓鼠体，取其脾脏为标本，利用巢式PCR对OT-56kDaTSA基因进行检测，仅从黑线姬鼠分离出恙虫病立东方体，故推测黑线姬鼠可能是山东恙虫病的主要传播媒介，同源性分析表明，泰安地区部分鼠类感染的OT核苷酸序列与Gilliam型的核苷酸序列同源性最高，推测Gilliam型是泰安地[23]区恙虫病流行型。雷永良应用巢式PCR对丽水市莲都区多种鼠肝脾组织进行OT-56kDaTSA基因检测，研究结果证实该区恙虫病主要宿主为黑线姬鼠，同时在小家鼠中扩增出恙虫病DNA，可见该区恙虫病的流行可能存在多样性，提示应做好该区恙虫病疫区室内的防鼠、灭鼠工作。3.环介导恒温扩增技术环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30~60分钟，即可完成核酸扩增反应。环介导恒温扩增法与传统PCR相比，它不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术灵敏度高，可从极微量的标本中扩增出目的基因，其检测下限可达0.01fg病毒RNA，而传统反转录PCR的检测下限[24]为1ng,说明LAMP敏感性远远高于传统反转录PCR。37 综述[25]目前越来越多的研究者将LAMP方法用于OT的检测当中。任立松以利用巢式PCR方法检测出新疆部分地区的OT片段，再使用新建立的LAMP方法对这些阳性标本进行检测，结果提示检出率与巢式PCR接近，但LAMP方法实[26]验步骤更简单，检测时间更短，且实验仪器要求更低。耿美玲等以OT-56kDaTSA基因序列为目的基因建立LAMP方法可快速的检测Karp、Gilliam、Kate三种标准株及Pt、HF、SJ地方株等多株OT，提示LAMP检测体系具有较广的[3、27]检测普，且灵敏度及特异度皆高于普通PCR。Paris等报道目的基因GroEL建立的LAMP方法可用于OT的检测，且其准确性与巢式PCR及荧光定量PCR[4]方法相似。Blacksell等报道以目的基因GroEL建立的LAMP方法对恙虫病的检测的灵敏性及特异性要明显高于血清学抗体快速检测方法。总结由于分子生物学技术的敏感性高，特异性强，使其在恙虫东方体检测和研究中得到广泛的使用。分子生物学技术能早期和快速对恙虫病做出诊断，同时由于其是对基因进行检测，特异性高，结果更准确可信。不同地区、不同株间其抗原性差异较大，毒力亦不同，通过分子生物学技术如实时荧光定量PCR、巢式PCR等测定某地区的OT基因型别，有助于了解该地区OT的毒力，以便更好、更准确的做出预防。但同时实时荧光定量PCR、巢式PCR技术亦存在一定的缺陷，如样品、试剂易受到污染，从而出现假阳性，进而导致误诊；且其对实验人员、实验条件、实验设备要求高，在基层医院尚难以施行。多个研究证实LAMP方法对OT检测的准确性与荧光定量PCR、巢式PCR方法相似，灵敏度与特异性比血清抗体检测方法更高，而实验时间短，在1个小时左右即可出结果，并且实验设备要求低，只需要水浴锅等简单设备，同时读取结果方便，即只需向扩增液中加入适当染料通过颜色变化即可以判定结果。但目前该方法还处于研究阶段，尚不能应用于大样本的临床诊断。总体而言，巢式PCR、荧光定量PCR、LAMP等方法对恙虫病的诊断及对OT基因型的研究起着巨大的作用，在疾病早期即可做出诊断，进而有利于临床医师进行诊断性治疗，以便减轻患者诊疗费用及改善患者预后。同时可利用巢式PCR、荧光定量PCR、LAMP等方法对某地区的宿主、媒介进行监测，从而预测某地区恙虫病的流行情况，以便及时准确的做出预防措施，如灭鼠、灭螨、38 综述提醒市民减少野外游玩、农民下田劳作时穿长衣长裤或涂避蚊油、避蚊胺，并且野外工作后及时洗澡换衣等，这对有效控制恙虫病的流行及其重要。而快速、简便、经济、灵敏的LAMP检测方法有待进一步验证，若LAMP技术成熟，可广泛的用于基层医疗单位协助早期诊断恙虫病。参考文献[1]KurupA,IssacA,LohJP,etal.Scrubtyphuswithsepsisandacuterespiratorydistresssyndrome[J].JClinMicrobiol,2013,51(8):2787～2790.[2]KellyDJ,FuerstPA,ChingWM,etal.Scrubtyphus:thegeographicdistributionofphenotypicandgenotypicvariantsofOrientiatsutsugamushi[J].ClinInfectDis,2009,48Suppl3:S203～230.[3]ParisDH,BlacksellSD,NawtaisongP,etal.Diagnosticaccuracyofaloop-mediatedisothermalPCRassayfordetectionofOrientiatsutsugamushiduringacuteScrubTyphusinfection[J].PLoSNeglTropDis,2011,5(9):e1307.[4]BlacksellSD,ParisDH,ChierakulW,etal.Prospectiveevaluationofcommercialantibody-basedrapidtestsincombinationwithaloop-mediatedisothermalamplificationPCRassayfordetectionofOrientiatsutsugamushiduringtheacutephaseofscrubtyphusinfection[J].ClinVaccineImmunol,2012,19(3):391～395.[5]KohGC,MaudeRJ,ParisDH,etal.Diagnosisofscrubtyphus[J].AmJTropMedHyg,2010,82(3):368～70.[6]ParisDH,AukkanitN,JenjaroenK,etal.Ahighlysensitivequantitativereal-timePCRassaybasedonthegroELgeneofcontemporaryThaistrainsofOrientiatsutsugamushi[J].ClinMicrobiolInfect,2009May,15(5):488～95.[7]KimDM,ParkG,KimHS,etal.Comparisonofconventional,nested,andreal-timequantitativePCRfordiagnosisofscrubtyphus[J].JClinMicrobiol,2011Feb;49(2):607～612.[8]WatthanaworawitW,TurnerP,TurnerC,etal.Aprospectiveevaluationofreal-timePCRassaysforthedetectionofOrientiatsutsugamushiandRickettsiaspp.forearlydiagnosisofrickettsialinfectionsduringtheacutephaseofundifferentiatedfebrileillness[J].AmJTropMedHyg,2013,89(2):308～310.[9]周海燕，何凤屏，罗君，等.粤北山区域恙虫病自然疫源地的研究[J].分子诊断与治疗杂志，2011，3（6）：398～401.[10]耿美玲，操敏，张锦海，等.建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体[J].中华卫生杀虫药械，2014，20（1）：45～49.[11]谈忠鸣，李志峰，吴斌，等.基于GroEL基因的实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立及评价[J].中国人兽共患病学报，2014，30（11）：1121～1124.[12]付秀萍，贺金荣，张景山，等.TaqMan—MGB探针实时荧光定量PCR检测恙虫病东39 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