儿童碳青霉烯类抗菌药物耐药肠杆菌的分子流行病学研究

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分类号：R378.2密级：公开学校代码：11065学号：2015021240专业硕士学位论文儿童碳青霉烯类抗菌药物耐药肠杆菌的分子流行病学研究作者姓名贾楠指导教师朱元祺教授专业领域临床检验诊断学培养单位医学部答辩日期2018年5月14日 儿童碳青霉烯类抗菌药物耐药肠杆菌的分子流行病学研究摘要目的探讨分离自儿科的碳青霉烯类抗菌药物耐药肠杆菌科细菌的耐药表型、基因型及其同源性，为医院感染的预防和控制及抗生素合理使用提供依据。方法收集分离自浙江和天津两家医院患儿的共21株对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肠杆菌科细菌，包括8株阴沟肠杆菌（YG1~8）、10株肺炎克雷伯菌（FK1~10）和3株产酸克雷伯菌（CS1~3）。菌株的鉴定和药敏试验通过法国梅里埃Vitek-2Compact系统重新进行。改良Hodge试验和亚胺培南-EDTA复合E-test条检测是否产碳青霉烯酶和金属酶。聚合酶链式反应（PCR）检测菌株是否携带碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶基因、质粒介导的AmpC基因和喹诺酮类耐药基因及其他耐药相关基因，并通过扩增产物测序确定其基因型。多位点序列分析（MLST）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）检测菌株之间的同源性。质粒液相接合试验，S1核酸酶切的Southern杂交试验和基于PCR的质粒分型检测菌株携带耐药基因的质粒的特性。结果药敏结果显示这21株菌均表现为多重耐药，对临床常用的头孢菌素类、碳青霉烯类及氨基糖苷类抗生素耐药。所有菌株的改良Hodge试验和金属酶（MBL）E-test条试验均阳性，都携带blaNDM-1基因，且每株菌同时携带多个其他耐药基因。8株阴沟肠杆菌各自还携带有多个如blaSHV-12、blaVIM-1、blaCTX-M、blaACC-1、blaTEM-1和blaOXA-1等耐药基因。除了携带blaSHV-12基因外，10株肺炎克雷伯菌与3株产酸克雷伯菌一样，都携带blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4、intI和aac(6')-Ib-cr基因。PFGE结果显示：8株阴沟肠杆菌中有3株（YG5~YG7）条带数目和位置相同，MLST分型都是ST177，属于同一克隆株；10株肺炎克雷伯菌PFGE条带数目及位置相差小于3条，MLST分型均为ST30；3株产酸克雷伯菌MLST分型都是ST2型，且PFGE条带数目和位置完全一样。所有临床菌株的液相接合试验均成功。Southern杂交显示ST177型阴沟肠杆菌，ST30型肺炎克雷伯菌和ST2型产酸克雷伯菌所携带blaNDM-1基因分别位于大小约50kb，275kb和280kb的质粒上。基于复制子的PCR质粒分型显示ST30型肺炎克雷伯菌和ST2型产酸克雷伯菌所携带blaNDM-1基因的质粒类型均是IncHIB型，而未能将ST177型阴沟肠杆菌携带blaNDM-1基因的质粒进行分型。结论浙江和天津两家医院住院患儿中存在携带blaNDM-1基因的肠杆菌科细菌的流行。经检索，携带blaNDM-1基因的ST177型阴沟肠杆菌和携带blaNDM-1、blaOXA-1、blaSHV-12、blaDHA-1、qnrB4、intI和aac(6')-Ib-cr的ST30型肺炎克雷伯菌以及携带blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4、intI和aac(6')-Ib-cr基因的ST2型产酸克雷伯菌引起住院患儿的医院感染暴发均为国内外首次报道。因此，应加强碳青霉烯类抗I 菌药物耐药肠杆菌的监测和抗生素的合理使用。硕士研究生：贾楠（临床检验诊断学）指导教师：朱元祺（教授）关键词：肠杆菌；儿童；碳青霉烯酶；耐药；新德里金属β-内酰胺酶1II TheMolecularEpidemiologyofCarbapenem-ResistantEnterobacteria-ceaeIsolatedfromPediatricUnitsatTwoGeneralHospitalinChinaAbstractObjectiveToinvestigatethedrugresistancephenotype,genotypeandhomologyofcarbapenem-resistantEnterobacteriaceaeisolatedfromchildernorneonatesattwogeneralhospitalinChinasoastopreventnosocomialinfectionandprovidepracticeguidelinesforthereasonableuseofantibiotics.MethodsTotal21non-duplicatecarbapenem-resistantEnterobacteriaceaeisolates,including8Enterobactercloacae(YG1~8),10Klebsiellapneumoniae(FK1~10)and3Klebsiellaoxytoca(CS1~3),werecollected,andtheidentificationandantibioticsusceptibilitytestsoftheseisolatesweredonebyusingVITEK-2Compactsystem(BioMérieux).TheputativecarbapenemaseproducersscreeningweredetectedbymodifiedHodgetest(MHT)andmetallo-beta-lactamasesE-test(MBL,IPM+EDTA).Thedrugresistancegenes,encodingthecarbapenemases,extended-spectrum-β-lactamases,AmpCenzymes,PMQRgenesandothers,wereconfirmedbyusingPCRandproductsequencing.Theclonalrelatednessofthesestrainsweredeterminedbypulsed-fieldgelelectrophoresis(PFGE)andmultilocussequencetyping(MLST).Themobilityofplasmidswasdetectedbyconjugationtestsforinvestigatingthetransfercharacteristicsofplasmid.TheincompatibilitygroupsofmobileplasmidsweredeterminedbythePCR-basedreplicontyping(PBRT)method.AndtheplasmidscarryingblaNDM-1werelocatedbySouthernblothybridization.ResultsTheseisolateswerehighlyresistanttomostofavailableantibioticssuchascephalosporins,aminoglycosidesandcarbapenems.BothHodgetestsandmetallo-beta-la-ctamasestestswerepositiveinallcollectedisolates,andallofthemharboredblaNDM-1.Theantibioticsresistantgenes,includingblaNDM-1,blaSHV-12,blaVIM-1,blaCTX-M,blaACC-1,blaTEM-1andblaOXA-1genes,weredetectedinEnterobactercloacae.BothtenKlebsiellapneumoniaeandthreeKlebsiellaoxytocaharboredblaNDM-1,blaOXA-1,blaDHA-1,qnrB4,intIandaac(6')-Ib-crexceptblaSHV-12.Pulsed-fieldgelelectrophoresis(PFGE)showthatthreeNDM-1producingEnterobactercloacaeisolates(YG5~7)wereclonallyrelated,andbelongtotheclonalgroupST177.ThetenisolatesofNDM-1producingK.pneumoniaeandthethreeNDM-1producingK.oxytocawerecategorizedintothesamePFGEtypes,andbelongtoST30andST2,respectively.ConjugationexperimentIII confirmedthattheplasmidsharboringtheblaNDM-1in21strainsweretransferable.TheS1PFGEandSouthernhybridizationwithaNDM-specificprobeshowedthattheblaNDM-1genewaslocatedonanearly50kbplasmidinEnterobactercloacae,280kbIncHIBplasmidinK.pneumoniae,and275kbIncHIBplasmidinK.oxytoca,respectively.WhilethePCR-basedreplicontypingshowedthattheincompatibilitygroupsofmobileplasmidsinEnterobactercloacaewereuntyped.ConclusionTheresultsindicatedthatthereweretheNDM-1-producingEnterobacteriaceaespreadatthepediatricwardsintwogeneralhospitalinZhejiangprovinceandTianjincity.Toourknowledge,itisthefirstreportinworldwidethattherewasanoutbreakofST30K.pneumoniaeharboringtheblaNDM-1,blaOXA-1,blaDHA-1,qnrB4,intI,aac(6')-Ib-cr,blaSHV-12andST2K.oxytocaharboringtheblaNDM-1,blaOXA-1,blaDHA-1,qnrB4,intIandaac(6')-Ib-crinthesameneonatalunitinTianjincity.AndthattherewasanotheroutbreakofST177EnterobactercloacaeharboringtheblaNDM-1genesatthepediatricwardinZhejiangprovince.Hence,thereisanurgentneedonstrengtheningthesurveillanceofcarbapenem-resistantEnterobacteriaceaeandreasonableuseofantibiotics.Graduatestudent：JiaNan（Clinicallaboratorydiagnostics）DirectedbyProf.ZhuYuan-qiKeywords：Enterobacteriaceae；children；carbapenemase;drug-resistantance;NDM-1(NewDelhimetallo-β-lactamase1)IV 目录引言·······································································································1材料与方法······························································································31实验材料···························································································31.1菌株来源··························································································31.2实验试剂·························································································31.3实验仪器·························································································42实验方法···························································································52.1细菌的保存······················································································52.2细菌的鉴定及药敏·············································································52.3耐药表型筛查···················································································62.3.1碳青霉烯酶筛查·············································································62.3.2金属酶筛查····················································································62.4耐药基因的检测················································································62.4.1基因组的提取·················································································62.4.2耐药基因相关引物信息····································································72.4.3PCR扩增耐药基因···········································································92.5脉冲场凝胶电泳（PFGE）·································································122.5.1实验试剂配制···············································································122.5.2样品胶块的制备············································································132.5.3核酸内切酶酶切············································································142.5.4电泳及显影··················································································142.6多位点序列分型（MLST）································································152.7液相接合实验·················································································172.8质粒分型·······················································································182.9blaNDM-1基因杂交定位·······································································202.9.1实验试剂配制···············································································201 2.9.2DNA探针的制备和浓度检测····························································212.9.3样品胶块的制备············································································222.9.4S1核酸酶酶切及电泳······································································232.9.5DNA杂交转膜···············································································242.9.6DNA杂交·····················································································24结果······································································································261细菌鉴定、药敏试验结果····································································262耐药表型筛查实验结果·······································································263原代菌和接合子特性及耐药基因携带情况···············································274脉冲场凝胶电泳及多位点序列分型结果··················································375Southernblot结果···············································································46讨论······································································································48结论······································································································52参考文献································································································53综述······································································································59综述参考文献··························································································80攻读学位期间的研究成果··········································································91附录······································································································92致谢······································································································93学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明·········································942 引言引言肠杆菌科细菌（以下简称为肠杆菌）是医院感染的重要病原菌。CHINET2016年监测数据显示，尽管医院分离的肠杆菌中大多数菌属的检出率略有下降，但所有标本分离率最高的仍然是大肠埃希菌，其次为克雷伯菌属，仅这两类菌占到了所有菌株分离率的33%。另外，常见的还有肠杆菌属和变形杆菌属[1]。临床上，大约50%的败血症和70%以上的泌尿道感染均由肠杆菌引起。20世纪以来，随着不断研发新型的抗菌药物，使人们的生活质量得以提高。同时，抗菌药物也越来越普遍进入千家万户。由于缺乏对抗菌药物的系统管理，以及抗菌药物的不合理使用，各地分离的对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）也日益增多，使得碳青霉烯类抗生素被认为是对抗细菌感染的最后一道防线而受到威胁。对碳青霉烯类抗菌药物耐药是以产酶为主要机制，并由此衍生出产碳青霉烯酶的肠杆菌（carbapenem-producingEnterobacteriaceae，CPE）。从最初发现自铜绿假单胞菌的金属酶（metallo-beta-lactamases，MBL）IMP[2]和VIM[3]，到现在被熟知的KPC，尤其是产新德里金属β-内酰胺酶1型（NewDelhimetallo-β-lactamase，NDM-1）肺炎克雷伯菌[4]出现以来，因其能够水解除氨曲南以外所有的β-内酰胺类抗生素，不受传统的β内酰酶抑制剂影响，且常同时携带如超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和16sRNA甲基化酶等多种耐药基因[5]，导致细菌对多种抗生素耐药，引起了全球广泛的关注。目前，在全球多处出现携带blaNDM基因的多菌属和种的传播，并不断发现NDM新的亚型[6]。NDM快速传播的原因，起初认为与印度地区的“医疗旅行”有关，随着研究深入，发现很多并没有去过印度或巴尔干地区的人也携带有blaNDM，也有报道印度水样中检测到bla[7][8]NDM-1。YaoX等报道在中国食用肉制品中发现对碳青霉烯类和黏菌素同时耐药且携带blaNDM-1和mcr-1质粒的大肠埃希菌。因为研究发现blaNDM-1基因大多位于质粒上，也有少部分位于染色体，例如鲍曼不动杆菌，所以有人推测bla[9]NDM-1基因源自鲍曼不动杆菌。由于位于质粒上的blaNDM-1基因易于突变，目前已发现18个亚型，其中，blaNDM-9、blaNDM-14和blaNDM-18为中国首次报道[10,11]。CHINET监测网2016年数据显示，肠杆菌均出现对碳青霉烯类耐药的菌株，其中以肺炎克雷伯菌耐药率最高，对亚胺培南和美罗培南的耐药率均大于15%，并且对碳青霉烯类的耐药率呈现逐年增长。同样，尽管国内儿童群体中革兰阴性杆菌分离率下降，但对碳青霉烯类耐药率却呈上升趋势[1]。美国进行了一项针对1999-2012年儿童群体中CRE暴发的研究。结果显示，自2008年之后，CRE的暴发率明显增高，分离菌主要以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主[12]。有人统计了印度1 青岛大学硕士学位论文2007至2011年五年分离自败血症儿童的碳青霉烯类耐药肠杆菌，结果显示在NDM-1出现以前，携带CTX-M基因合并膜孔蛋白丢失是肠杆菌对碳青霉烯类耐药的主要机制。另外一项研究显示，AmpC酶和氨基糖苷类耐药基因随着NDM的流行也出现上升趋势，并可能存在NDM的水平传播[13]。2012年一项收集全球儿童感染CRE的研究显示：CRE主要分离自肠杆菌属、克雷伯菌属和大肠埃希菌；耐药基因以NDM、KPC和VIM最为常见[14]；NDM亚型繁多，出现的菌种和携带blaNDM基因的质粒也多种多样[15]。目前，国内外已有成人群体中关于CRE引起医院感染暴发的报道，主要以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主。Pubmed网站上关于NDM的研究报道也是逐年上升，但是针对儿童医院感染暴发的研究报道比较少。儿童作为免疫系统发育不完善的特殊群体，处于生长发育阶段，限制了喹诺酮类、氨基糖苷类和四环素类等抗生素的使用，这为临床在治疗儿童感染耐碳青霉烯类肠杆菌时带来极大的困难[14,16]。为此，我们收集分离自住院儿童对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肠杆菌进行如下研究：改良Hodge试验（modifiedHodgetest，MHT）和亚胺培南与EDTA复合E-test条初步检测菌株是否产碳青霉烯酶；聚合酶链式反应扩增包括碳青霉烯类耐药基因、超广谱β-内酰胺酶基因、质粒介导的AmpC酶编码基因和喹诺酮类等耐药基因；通过脉冲场凝胶电泳（pulsefieldgelelectrophoresis，PFGE）和多位点序列分型（multilocussequencetyping，MLST）检测菌株间的同源性；对菌株进行接合试验，验证携带耐药基因的质粒能否在菌株间进行传播，并进一步通过Southern杂交和基于复制子的PCR质粒分型等对质粒特性进行分析。最后，结合耐药菌株的临床信息，对儿童碳青霉烯类耐药分离株的耐药特点及流行特性进行汇总分析，以便为医院感染的预防和控制及抗生素的合理使用提供依据。2 材料与方法材料与方法1实验材料1.1菌株来源和病人资料收集浙江和天津两家医院分离自儿童的21株碳青霉烯类耐药肠杆菌。其中包括：浙江嘉兴市某医院2013年8月～2015年6月分离的8株阴沟肠杆菌（YG1~8）；天津市某医院2013年9月～2014年1月分离的10株肺炎克雷伯菌（FK1~10）和3株产酸克雷伯菌（CS1~3）。所有菌株经Vitek-2Compact系统重新鉴定和药敏。细菌耐药性判定标准依据CLSI文件M100-S27[17]（美国临床实验室标准化研究所制定）进行。对病人的病例资料进行回顾性分析，按照2010年1月21日卫生部颁布的《医院感染诊断标准（试行）》判定病人是否属于医院感染。按医院感染判定标准，这21例患儿的感染都属于医院感染。1.2实验试剂表1.1主要实验试剂试剂名称生产厂家（品牌）革兰阴性杆菌鉴定卡法国梅里埃革兰阴性杆菌药敏卡法国梅里埃M-H平板济南百博生物技术有限公司厄他培南药敏纸片OXOID（UK）E-test条AB-BioMérieux,Solna,SwedenTRYPTONEOXOID（UK）YEASTEXTRACTOXOID（UK）氯化钠上海国药集团化学试剂有限公司rTaqTaKaRa（Japan）100bpDNALadderTaKaRa（Japan）AgaroseRegularTaKaRa（Japan）溴化乙锭图赫实业有限公司（上海）TrisSolarbio（Beijing）EDTASolarbio（Beijing）硼酸康德无水乙醇上海国药集团化学试剂有限公司头孢他啶Solarbio（Beijing）叠氮化钠上海生工生物工程有限公司3 青岛大学硕士学位论文蛋白酶KTaKaRa（Japan）SDS上海国药集团化学试剂有限公司XbaI核酸内切酶（15U/µL）TaKaRa（Japan）LambdaPFGLadderNEWENGLANDBIOLABSS1核酸酶（180U/L）TaKaRa（Japan）SeaKemGold凝胶BIO-RADThioureaSIGMA-ALORICH（GER）KLIGLERIRONAGAROXOID（UK）Brij58生工生物（上海）脱氧胆酸盐生工生物（上海）月桂酰肌氨酸生工生物（上海）柠檬酸钠凯信化学工业有限公司（天津）RNaseAQIAEN（GER）溶菌酶QIAEN（GER)氢氧化钠西陇科学股份有限公司（广东）盐酸西陇科学股份有限公司（广东）PMSF生工生物（上海）异丙醇上海国药集团化学试剂有限公司马来酸ThermoFisherScientific（Bejing）吐温-20天津市光复精细化工研究所X-OMATBT医用X射线胶片锐珂（厦门）医疗器材有限公司显影液站街摄影材料厂（河南）定影液站街摄影材料厂（河南）DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionROCHE（GER）StarterKitIIE.Z.N.A.TMGelExtractionKitOMEGA(USA)Whatman滤纸GEHealthcare尼龙膜Solarbio（Beijing）1.3实验仪器表1.2实验主要仪器仪器名称生产厂家全自动微生物分析仪梅里埃VITEK2Compact（法国）超净工作台洁净技术设计所SW-CJ-IFD型（苏州）电热恒温培养箱精宏实验设备有限公司DNP-9272（上海）纯水超纯水系统Millipore（法国）超低温冰箱NewBrunswickU725型（美国）PCR扩增仪BIO-RADMyCycler型（美国）BiometraT-personal和T-gradient型（德国）移液器EppendorfResearchplus（德国）电磁炉苏泊尔4 材料与方法生物制冰机格兰特制冷设备制造有限公司（宁波）台式高速冷冻离心机HettichMikro220R德国手掌型离心机labnetC1301-230EU型（美国）冰箱海信电器有限公司BCD-209BP型（青岛）微波炉格兰仕G70F20MN3XL-A7型（广东）电子天平北京赛多利斯仪器公司BS2202S电泳仪六一仪器厂（北京）凝胶成像系统AlphaInnotechHp3400型（美国）全自动立式灭菌锅申安医疗器械厂（上海）紫外可见分光光度计岛津UV-1800（日本）pH计METTLERTOLEDODELTA320（上海）磁力搅拌器IKARETBasicC（德国）旋转式恒温水浴振荡器洪纪仪器设备有限公司DSHZ-300A（上海）恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司DK-S24型气浴恒温振荡器博讯实业有限公司（上海）脉冲场凝胶电泳仪Bio-RADCHEFMAPPERTMXA型（美国）电泳槽BIO-RAD（美国）电热恒温鼓风干燥箱福玛实验设备有限公司（上海）循环水式真空泵亚荣生化仪器厂（上海）UMAX扫描仪力广科技有限公司Powerlook2100XL-USB（台湾）封口机宁波斯普利电子有限公司（宁波）分子杂交炉新芝生物科技有限公司LF-III（宁波）2实验方法2.1标本的保存（1）配制LB液体培养基（胰蛋白胨1%+酵母粉0.5%+氯化钠1%），磁力搅拌器充分溶解后，分入洗净烤干的玻璃试管中，121℃灭菌15分钟。（2）取菌环挑取平板上分离的单个菌落，打开LB试管培养基，酒精灯消毒试管口，将细菌涂抹在试管壁，倾斜试管使菌落与培养基混匀，酒精灯消毒试管口后盖帽。（3）37℃震荡培养过夜。（4）取高压灭菌后的EP管，加入500µL40%丙三醇+500µL菌悬液，混匀。（5）标记，封口膜封口，-80℃冰箱保存。2.2细菌鉴定及药敏（1）配制浊度0.5麦氏单位的菌悬液，使用革兰阴性杆菌鉴定卡VITEK2Compact系统上机鉴定。5 青岛大学硕士学位论文（2）取135µL0.5麦氏单位的菌悬液加入3ml0.45%的生理盐水，使用革兰阴性杆菌药敏卡VITEK2Compact系统上机行药敏试验。（3）质控菌株为EscherichiacoliATCC35218、EscherichiacoliATCC25922和KlebsiellapneumoniaeATCC700603。（4）药敏结果解读参照CLSI文件M100-S27[17]。2.3耐药表型筛查2.3.1碳青霉烯酶筛查：改良Hodge试验（1）无菌拭子挑取E.coliATCC25922单个菌落，配置浊度0.5麦氏单位的菌悬液，均匀涂布M-H平板。（2）平板静置3~10分钟，取10µgETP药敏纸片贴于平板中央。（3）无菌拭子挑取3~5个生长于血平板过夜的菌落（阳性对照、阴性对照、待测菌），由药敏纸片边缘沿半径方向划向平板边缘。（4）35℃孵箱培养16h。（5）抑菌圈边缘出现切迹者为阳性，结果判读根据CLSI文件M100-S27[17]。2.3.2金属酶筛查：亚胺培南EDTAE-test试剂条法协同试验（1）无菌拭子挑取血平板上生长过夜的待测菌，配置浊度0.5麦氏单位待测菌悬液，均匀涂布M-H平板。（2）平板静置3~10分钟，取亚胺培南EDTAE-test试剂条贴于平板中央。（3）35℃孵箱培养16h。（4）读取试纸条两端MIC值，MICIPM/MICIPM+EDTA≥8为阳性。2.4耐药基因的检测2.4.1基因组的提取：DNA煮沸裂解法（1）1.5ml灭菌EP管内加入100µL灭菌纯水。（2）无菌拭子取M-H平板上生长过夜的5~10个单个菌落，富集后集菌到EP管内，混匀。（3）浮漂固定EP管后，沸水中煮沸裂解5~7分钟。（4）从沸水中取出后立即插入预先准备好的冰中，静置5~7分钟。（5）取出EP管，12000rpm离心5分钟。6 材料与方法（6）移液器小心吸取上清至灭菌的新EP管中，-20℃保存。2.4.2耐药基因相关引物信息对收集到的细菌进行PCR扩增耐药基因，主要包括以下几类：碳青霉烯类耐药基因（NDM、IMP、KPC、SPM、SIM、BIC、DIM、AIM、VIM、OXA-48、GIM）、超广谱β-内酰胺酶基因（SHV、TEM、CTX、OXA-1）、AmpC酶编码基因（EBC、MOX、ACC、CIT、FOX、DHA）、整合子基因（int1、int2）、质粒介导的喹诺酮类耐药（plasmid-mediatedquinoloneresistanc，PMQR）基因（qnrA、qnrB、qnrS、aac-Ib）和质粒介导的磷霉素耐药（plasmid-mediatedfosfomycinresistance，PMFR）基因（fosA3）等相关引物信息，见表1.3~1.8。表1.3PCR扩增碳青霉烯类耐药基因引物引物引物序列（5'-3'）目的基因产物长度（bp）参考文献NDM-FGGTTTGGCGATCTGGTTTTCblaNDM621[18]NDM-RCGGAATGGCTCATCACGATCIMP-FGGAATAGAGTGGCTTAAYTCTCblaIMP232[18]IMP-RGGTTTAAYAAAACAACCACCKPC-FmCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGblaKPC798[18]KPC-RmCTTGTCATCCTTGTTAGGCGSPM-FAAAATCTGGGTACGCAAACGblaSPM271[18]SPM-RACATTATCCGCTGGAACAGGSIM-FTACAAGGGATTCGGCATCGblaSIM570[18]SIM-RTAATGGCCTGTTCCCATGTGDIM-FGCTTGTCTTCGCTTGCTAACGblaDIM699[18]DIM-RCGTTCGGCTGGATTGATTTGBIC-FTATGCAGCTCCTTTAAGGGCblaBIC537[18]BIC-RTCATTGGCGGTGCCGTACACAIM-FCTGAAGGTGTACGGAAACACblaAIM322[18]AIM-RGTTCGGCCACCTCGAATTGVIM-FGATGGTGTTTGGTCGCATAblaVIM390[18]VIM-RCGAATGCGCAGCACCAGOXA-48-FGCGTGGTTAAGGATGAACACblaOXA-48438[18]OXA-48-RCATCAAGTTCAACCCAACCGGIM-FTCGACACACCTTGGTCTGAAblaGIM477[18]GIM-RAACTTCCAACTTTGCCATGC7 青岛大学硕士学位论文表1.4PCR扩增ESBLs耐药基因引物引物引物序列（5'-3'）目的基因产物长度（bp）参考文献OXA-1-FATATCTCTACTGTTGCATCTCCblaOXA-1619[19]OXA-1-RAAACCCTTCAAACCATCCSHV-FAGGATTGACTGCCTTTTTGblaSHV392[19]SHV-RATTTGCTGATTTCGCTCGTEM-CATCAGCAATAAACCAGCblaTEM516[19]TEM-HCCCCGAAGAACGTTTTCCTX-FCGCTTTGCGATGTGCAGblaCTX551[20]CTX-RACCGCGATATCGTTGGT表1.5PCR扩增AmpC酶耐药基因引物引物引物序列（5'-3'）目的基因产物长度（bp）参考文献EBC-FTCGGTAAAGCCGATGTTGCGGblaMIR-1，302[21]EBC-RCTTCCACTGCGGCTGCCAGTTblaACT-1blaMOX-1，MOX-FGCTGCTCAAGGAGCACAGGATblaMOX-2，520[21]blaCMY-1，MOX-RCACATTGACATAGGTGTGGTGCblaCMY-8~11ACC-FAACAGCCTCAGCAGCCGGTTAblaACC346[21]ACC-RTTCGCCGCAATCATCCCTAGCblaLAT-1~4，CIT-FTGGCCAGAACTGACAGGCAAAblaCMY-2~7，462[21]CIT-RTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCblaBIL-1FOX-FAACATGGGGTATCAGGGAGATGblaFOX-1~blaF190[21]FOX-RCAAAGCGCGTAACCGGATTGGOX-5bDHA-FAACTTTCACAGGTGTGCTGGGTblaDHA-1，405[21]DHA-RCCGTACGCATACTGGCTTTGCblaDHA-2表1.6PCR扩增PMQR基因引物和产物长度引物引物序列（5'-3'）目的基因产物长度（bp）参考文献QnrA-FAGAGGATTTCTCACGCCAGGqnrA580[22]QnrA-RTGCCAGGCACAGATCTTGAC8 材料与方法QnrB-FGGMATHGAAATTCGCCACTGqnrB264[22]QnrB-RTTTGCYGYYCGCCAGTCGAAQnrS-FGCAAGTTCATTGAACAGGGTqnrS428[22]QnrS-RTCTAAACCGTCGAGTTCGGCGaacIb-FTTGCGATGCTCTATGAGTGGCTAaac（6’）-Ib482[23]aacIb-RCTCGAATGCCTGGCGTGTTT表1.7PCR扩增整合酶基因引物和产物长度引物引物序列（5'-3'）目的基因产物长度（bp）参考文献Int1-FCCTCCCGCACGATGATCintI280[24]Int1-RTCCACGCATCGTCAGGCInt2-FTTATTGCTGGGATTAGGCintII233[25]Int2-RACGGCTACCCTCTGTTATC表1.8PCR扩增PMQR（fosA3）基因引物和产物长度引物引物序列(5'-3')目的基因产物长度（bp）参考文献fosA-FATCTGTGGGTCTGCCTGTCGTfosA3271[26]fosA-RATGCCCGCATAGGGCTTCT2.4.3PCR扩增耐药基因（1）设置阴性及阳性对照，根据表1.9~1.16配制PCR反应体系并进行PCR扩增。（2）扩增结束后产物尽早拿出PCR仪，将预先制好的1%BIOWEST电泳凝胶（含0.5µg/mlEB）放入含有1×TAE的电泳槽内没过，取5µL扩增产物与loadingbuffer混匀，沿孔壁点入电泳凝胶，另点入100bpPCRMarker。（注意：EB有毒，接触时需带一次性手套，溶胶微波炉专用，接触EB的物品也需与非EB接触区区分）。（3）连接电泳槽与电泳仪，设置参数，固定电压100~110V，时间30min。（4）电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像仪成像拍照保存。（5）电泳条带位置与目的基因、阳性对照相对比，大小一致者将剩余部分产物送测序，测序结果于http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上进行比对，进一步确定耐药基因亚型。9 青岛大学硕士学位论文表1.9blaNDM、blaKPC、blaBIC和blaOXA-48多重PCR反应体系及条件试剂名称体积(µL)ddH2O13.6510×Buffer3dNTP（2.5mmol/L）2.4模板DNA1.2rTaq（5U/μL）0.15上、下游引物（20µmol/L）1.2总体积30反应条件94℃5min，（94℃30s，52℃40s，72℃50s）35cycle，72℃10min表1.10blaVIM、blaSPM和blaIMP多重PCR反应体系及条件试剂名称体积(µL)ddH2O16.0510×Buffer3dNTP（2.5mmol/L）2.4模板DNA1.2rTaq（5U/μL）0.15上、下游引物（20µmol/L）1.2总体积30反应条件94℃5min，（94℃30s，52℃40s，72℃50s）35cycle，72℃10min表1.11blaAIM、blaGIM、blaSIM和blaDIM多重PCR反应体系及条件试剂名称体积(µL)ddH2O10.0510×Buffer3dNTP（2.5mmol/L）2.4模板DNA1.2rTaq（5U/μL）0.15上、下游引物（20µmol/L）1.2MgCl2（20mmol/L）1.8DMSO1.8总体积30反应条件94℃5min，（94℃30s，52℃40s，72℃50s）35cycle，72℃10min10 材料与方法表1.12ESBL耐药基因多重PCR反应体系及条件试剂名称体积（µL）及反应条件ddH2O14.2510×Buffer3dNTP（2.5mmol/L）2.4模板DNA1.2rTaq（5U/µL）0.15上、下游引物（20µmol/L）SHV各0.75；TEM各1.5；OXA-1各2.25体系30反应条件94℃5min，（94℃30s，54℃30s，72℃1min）35cycle，72℃10min表1.13AmpC耐药基因多重PCR反应体系及条件试剂名称体积（µL）及反应条件ddH2O16.12510×Buffer2.5dNTP（2.5mmol/L）2模板DNA1.25rTaq（5U/µL）0.125上、下游引物（20µmol/L）CIT，MOX，DHA各0.75；ACC，EBC各0.625；FOX各0.5体系30反应条件94℃3min，（94℃30s，64℃30s，72℃1min）35cycle，72℃7min表1.14扩增qnrA、qnrB和qnrS反应体系及条件试剂名称体积（µL）及反应条件ddH2O19.3510×Buffer3dNTP（2.5mmol/L）2.4模板DNA1.5rTaq（5U/µL）0.15上、下游引物（20µmol/L）各0.6体系30反应条件95℃5min，（95℃30s，54℃30s，72℃30s）35cycle，72℃10min11 青岛大学硕士学位论文表1.15扩增aac-Ib、intI1和intI2基因PCR反应体系及条件试剂名称体积（µL）及反应条件ddH2O19.9510×Buffer3dNTP（2.5mmol/L）2.4模板DNA1.5rTaq（5U/µL）0.15上、下游引物（20µmol/L）各1.5总体积30反应条件（aac-Ib）95℃5min，（94℃30s，55℃30s，72℃30s）30cycle，72℃10min反应条件（intI1）95℃5min，（97℃30s，54℃30s，72℃20s）35cycle，72℃10min反应条件（intI2）95℃5min，（97℃30s，48℃30s，72℃20s）35cycle，72℃10min表1.16扩增fosA3反应体系及条件试剂名称体积（µL）及反应条件ddH2O23.2810×Buffer3dNTP（2.5mmol/L）2.4模板DNA1rTaq（5U/µL）0.12上、下游引物（20µmol/L）各0.6体系30反应条件95℃5min，（95℃30s，57.5℃30s，72℃30s）35cycle，72℃10min2.5脉冲场凝胶电泳（PFGE）2.5.1实验试剂配制（1）细胞悬浮液（CSB）：100mmol/LTris+100mmol/LEDTA。超纯水部分溶解后调节pH至8.0，超纯水定容至100ml。（121℃灭菌15min，4℃保存）（2）蛋白酶K（50mg/ml）：2ml灭菌纯水溶解100mgProteinaseK粉末，混匀，分装在1.5ml灭菌EP管中。（-20℃保存）（3）细胞裂解液（CLB）：50mmol/LTris+50mmol/LEDTA+0.1%月桂酰肌氨酸钠。灭菌纯水部分溶解Tris和EDTA后调节pH至8.0，再加入终浓度为0.1%的月桂酰肌氨酸钠，灭菌纯水定容至500ml。滤菌器过滤除菌分装至50ml的灭菌离心12 材料与方法管中。（4℃保存，临用前加入蛋白酶K，使其终浓度为0.1mg/ml）（4）Tris:EDTABuffer，pH8.0（TE缓冲液，pH8.0）：10mmol/LTris+1mmol/LEDTA。超纯水部分溶解后调节pH至8.0，超纯水定容至1000ml。（121℃灭菌15min，常温保存）（5）10×Tris-BorateEDTABuffer（10×TBE缓冲液）：0.9mol/LTris+0.9mol/L硼酸+0.02mol/LEDTA。超纯水部分溶解后调节pH至8.3，超纯水定容至1000ml。（常温保存，使用时稀释至0.5×TBE）（6）RNaseA溶液（10mg/ml）：1mL灭菌纯水中溶解10mgRNaseA粉末，滤菌器过滤除菌。（-20℃保存）（7）溶菌酶溶液（50mg/ml）：1mL灭菌纯水中溶解50mg溶菌酶粉末，滤菌器过滤除菌。（-20˚C保存）（8）Thiourea（硫脲）：50mmol/L。根据用量溶于灭菌纯水。（常温保存）2.5.2样品胶块的制备（1）挑取生长于M-H平板过夜的单个菌落接种于含有头孢他啶（6µg/ml）的LB液体试管培养基，37℃110rpm震荡培养16h。（2）以LB液体培养基为空白对照调节菌液OD至1.0。（3）取400µLOD值为1.0左右的菌液于1.5mlEP管，10000rpm离心5min，弃去上清，必要时可重复。加入400µLCSD，吹打混匀呈菌悬液，56℃水浴箱保温。（4）用TEpH8.0配制2％的SeaPlaque®GTG®凝胶，天平记录总重量，微波炉加热溶解（注意防止溢出），沸腾溶解后补纯水至原重量，简单封口56℃水浴箱保温。（5）向400µLCSD悬浮的菌悬液加入400µL2％的SeaPlaque®GTG®凝胶，再加入8µL50mg/ml的蛋白酶K和16µL50mg/ml的溶菌酶，吹打混匀，注意避免气泡。（6）沿PFGE样品胶块模具边缘缓慢加入混匀的SeaPlaque®GTG®，4℃静置30min。（不同菌之间最好分隔，相互避免污染）（7）菌体裂解：用模具配套小铲将凝固了的SeaPlaque®GTG®凝胶捣入含有5mlCLB的50ml离心管（注意捣不同菌体胶块需消毒），加入10µL50mg/ml的蛋白酶K（保证菌体胶块均位于离心管液面以下），54℃水浴箱80rpm裂解2h（保证离心管液面位于水浴锅液面以下）。（8）弃去细胞裂解液，加入15ml50℃预热的灭菌纯水，50℃水浴箱80rpm洗涤2次，每次10min。（9）弃去水，加入15ml50℃预热的TE（pH8.0），50℃水浴箱80rpm洗涤213 青岛大学硕士学位论文次，每次15min。（10）弃去水，加入5mlTE（pH8.0），保证胶块在液面下，4℃保存。2.5.3核酸内切酶酶切（1）切胶块大小约5×5×2mm于1.5mlEP离心管（注意不同菌株胶块之间消毒）。（2）预切：配制酶切预切液（灭菌纯水160µL+10×M20µL+BSA20µL），取200µL加入1.5mlEP管没过胶块，37℃水浴箱孵育15min。（3）酶切：配制酶切液[灭菌纯水154.67µL+10×M20µL+BSA20µL+XbaI（15U/µL）5.33µL]。（注意XbaI置于冰盒上，防止失活）预切结束后，吸出预切液，加入酶切液，37℃水浴箱孵育4h。（4）配制0.5×TBE（10×TBE110ml+灭菌水2090ml）。（5）酶切结束后，吸出酶切液，加入200µL0.5×TBE终止酶切反应。2.5.4电泳及显影（1）上样：取酶切后的胶块贴于平放的电泳梳齿上，吸弃多余的液体，并于待测菌块两侧贴1mm厚的PFGEMarker，静置15min。（2）配制1%SeaKem®GoldAgarose（粉末1.0g+0.5×TBE100ml），微波炉加热融化，注意补水，56℃水浴箱保温。（3）用融化的1%SeaKem®Gold胶固定梳齿上的胶块，待固定后再将梳齿直立，沿电泳模具一边缓慢倒入剩余的1%SeaKem®Gold胶，静置30min。（4）向电泳槽内倒入剩余的0.5×TBE+硫脲16ml，打开脉冲场凝胶电泳仪，设置循环水速60，打开冷凝机，设置电泳槽内温度14℃。（5）待电泳槽内温度降至14℃后，放入电泳胶（注意清洗碎胶，避免堵塞循环出水口），设置参数电泳片段50~400kb，电泳时间18h30min，转换时间6.75s~35.38s。（6）电泳结束后，关闭冷凝机，再关闭循环水、脉冲场凝胶电泳仪，取出电泳胶，放出电泳液，倒入去离子水，清洗电泳槽。（7）配制染色液（0.5×TBE稀释EB至终浓度0.5μg/mL），放入电泳胶染色30min。（注意保护，EB有毒）（8）倒掉EB染液，加入去离子水漂洗30min。（9）将染色漂洗后的电泳凝胶放入凝胶成像系统，拍照，保存。（10）PFGE成像后，利用BioNumeric7.6软件进行聚类分析构建系统进化树。14 材料与方法2.6多位点序列分型（MLST）选取阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌各自的7个管家基因，管家基因引物序列由各菌种MLST网站提供（阴沟肠杆菌：http://pubmlst.org/ecloacae，肺炎克雷伯菌：http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html，产酸克雷伯菌：https://pubmlst.org/koxytoca），通过PCR扩增7个管家基因，将产物进行测序并于网站比对，可根据各管家基因亚型即可最终得到MLST分型。各菌种管家基因引物序列见表1.17~1.19，PCR反应体系见表1.20，反应条件见图1.1~1.3。表1.17阴沟肠杆菌管家基因引物序列及相关信息管家基因引物序列产物大小（bp）退火温度（℃）dnaA-f2AYAACCCGCTGTTCCTBTATGGCGGCAC74962dnaA-rKGCCAGCGCCATCGCCATCTGACGCGGfusA-f2TCGCGTTCGTTAACAAAATGGACCGTAT90555fusA-r2TCGCCAGACGGCCCAGAGCCAGACCCATgyrB-fTCGACGAAGCGCTCGCGGGTCACTGTAA115362gyrB-rGCAGAACCGCCCGCGGAGTCCCCTTCCAleuS-f2GATCARCTSCCGGTKATCCTGCCGGAAG84555leuS-rATAGCCGCAATTGCGGTATTGAAGGTCTpyrG-fAYCCBGAYGTBATTGCRCAYMAGGCGAT53562pyrG-rGCRCGRATYTCVCCCTSHTCGTCCCAGCrpIB-fGTAAACCGACATCTCCGGGTCGTCGCCA74662rpIB-rACCTTTGGTCTGAACGCCCCACGGAGTTrpoB-fAAAAACGTATTCGTAAGGATTTTGGTAA74962rpoB-r2CCAGCAGATCCAGGCTCAGCTCCATGTT图1.1阴沟肠杆菌MLST管家基因扩增反应图15 青岛大学硕士学位论文表1.18肺炎克雷伯菌管家基因引物序列及相关信息引物名称引物序列产物大小（bp）退火温度（℃）rpoB：F：Vic3GGCGAAATGGCWGAGAACCA1075（501）50rpoB：R：Vic2GAGTCTTCGAAGTTGTAACCgapA：F：173TGAAATATGACTCCACTCACGG662（450）60gapA：R：181CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTTmdh：F：130CCCAACTCGCTTCAGGTTCAG756（477）50mdh：R：867CCGTTTTTCCCCAGCAGCAGpgi：F：1RGAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC566（432）50pgi：R：1FCGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAATphoE：F：604.1ACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG602（420）50phoE：R：604.2TGATCAGAACTGGTAGGTGATinfB：1FCTCGCTGCTGGACTATATTCG462（318）50infB：1RCGCTTTCAGCTCAAGAACTTCtonB：1FCTTTATACCTCGGTACATCAGGTT539（414）45tonB：2RATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG图1.2肺炎克雷伯菌MLST管家基因扩增反应图表1.19产酸克雷伯菌管家基因引物序列及相关信息引物名称引物序列产物大小（bp）退火温度（℃）rpoB-FGGCGAAATGGCGGAAAACCA50154rpoB-RGAGTCTTCGAAGTTGTAACCgapA-FTGAAGTATGACTCCACTCACGG45054gapA-RAACGCCTTTCATTGCGCCTTCGGAA16 材料与方法mdh-FCCCAACTGCCTTCAGGTTCAG47754mdh-RCCTTCCACGTAGGCGCATTCCpgi-FGAGAAAAACCTGCCGGTGCTGCTG43254pgi-RCGGTTAATCAGGCCGTTAGTGGAGCphoE-FACCTGGCGCAACACCGATTTCTTC42054phoE-RTTCAGCTGGTTGATTTTGTAATCCACinfB-FCTCTCTGCTGGACTACATTCG31854infB-RCGCTTTCAGCTCCAGAACTTCtonB-FCTCTATACTTCGGTACATCAGGTT40554tonB-RCCTGTTTGGCGGCCAGCACCTGGT图1.3产酸克雷伯菌MLST管家基因扩增反应图表1.20MLST管家基因PCR反应体系试剂名称体积(μL)ddH2O13.8上、下游引物（20µmol/L）0.6PremixrTaq15模板DNA1总体系302.7液相接合实验（1）准备：4mlLB液体试管培养基（含头孢他啶6µg/ml）、4mlLB液体试管培养基（含叠氮化钠100µg/ml）、20mlLB液体锥形瓶培养基、双糖铁平板筛选培养基（具体浓度见表1.21）。（2）供体菌接种含有头孢他啶6µg/ml的LB液体试管培养基，受体菌大肠埃17 青岛大学硕士学位论文希菌J53接种含叠氮化钠100µg/ml的LB液体试管培养基，37℃震荡培养过夜。（3）取400µL供体菌、受体菌LB菌液，分别接种不含抗生素和叠氮化钠的20mlLB液体锥形瓶培养基（终浓度2%），37℃震荡培养。（4）根据不同细菌生长速度，供体菌培养约2h，受体菌培养约2.5h后，各取1mL菌液测量OD值，尽量调整供体菌与受体菌在同一时间达到目标OD值为1.0。（5）设置阴性对照组：10ml灭菌EP管内加入4.5mlLB液体培养基、0.5ml受体菌（大肠埃希菌J53）菌液。（6）实验组：供体菌与受体菌各取0.5ml加入4mlLB液体培养基。（7）混匀后37℃静置培养过夜，注意不可摇动。（8）接合培养16~24h后，震荡10ml离心管终止反应。（9）稀释菌液：10倍（0.1ml原倍接合菌液+0.9mlLB液体培养基）、100倍（0.1ml10倍稀释菌液+0.9mlLB液体培养基），混匀。（10）原倍接合菌液、10倍稀释菌液、100倍稀释菌、阴性对照各取0.1ml加入不同浓度的筛选培养基（具体见表1.21），刮刀涂布均匀，37℃孵箱培养过夜。（11）确保阴性对照组无生长，记录实验结果。（12）挑取筛选培养基上发酵乳糖的单个菌落，重新分纯培养。（13）VITEK2Compact系统进行菌株鉴定及药敏试验。（14）煮沸裂解法提取接合子基因组，对接合子进行PCR扩增原代菌所携带的耐药基因。表1.21筛选平板成分及菌液涂板筛选平板原倍菌液10倍稀释菌液100倍稀释菌液阴性对照头孢他啶6µg/ml+叠氮化钠100µg/ml√√√√头孢他啶6µg/ml+叠氮化钠200µg/ml√√√头孢他啶6µg/ml+叠氮化钠300µg/ml√2.8质粒分型[27]根据Carattoli等建立的基于PCR的肠杆菌质粒复制子分型方法，对经药敏试验证实的碳青霉烯类耐药的接合子提取基因组，进行质粒分型，具体质粒分型引物序列及反应条件见表1.22。18 材料与方法表1.22质粒分型引物序列及反应条件引物引物序列（5'-3'）片段大小(bp)退火温度（℃）HI1FWGGAGCGATGGATTACTTCAGTAC47160HI1RVTGCCGTTTCACCTCGTGAGTAHI2FWTTTCTCCTGAGTCACCTGTTAACAC64460HI2RVGGCTCACTACCGTTGTCATCCTI1FWCGAAAGCCGGACGGCAGAA13960I1RVTCGTCGTTCCGCCAAGTTCGTXFWAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGAT37660XRVTGAGAGTCAATTTTTATCTCATGTTTTAGCL/MFWGGATGAAAACTATCAGCATCTGAAG78560L/MRVCTGCAGGGGCGATTCTTTAGGNFWGTCTAACGAGCTTACCGAAG55960NRVGTTTCAACTCTGCCAAGTTCFIAFWCCATGCTGGTTCTAGAGAAGGTG46260FIARVGTATATCCTTACTGGCTTCCGCAGFIBFWGGAGTTCTGACACACGATTTTCTG70260FIBRVCTCCCGTCGCTTCAGGGCATTWFWCCTAAGAACAACAAAGCCCCCG24260WRVGGTGCGCGGCATAGAACCGTYFWAATTCAAACAACACTGTGCAGCCTG7660YRVGCGAGAATGGACGATTACAAAACTTTPFWCTATGGCCCTGCAAACGCGCCAGAAA53460PRVTCACGCGCCAGGGCGCAGCCFICFWGTGAACTGGCAGATGAGGAAGG26260FICRVTTCTCCTCGTCGCCAAACTAGATA/CFWGAGAACCAAAGACAAAGACCTGGA46560A/CRVACGACAAACCTGAATTGCCTCCTTTFWTTGGCCTGTTTGTGCCTAAACCAT75060TRVCGTTGATTACACTTAGCTTTGGACFIISFWCTGTCGTAAGCTGATGGC27060FIISRVCTCTGCCACAAACTTCAGC19 青岛大学硕士学位论文K/BFWGCGGTCCGGAAAGCCAGAAAAC16060KRVTCTTTCACGAGCCCGCCAAAB/ORVTCTGCGTTCCGCCAAGTTCGA15960FrepBFWTGATCGTTTAAGGAATTTTG27052FrepBRVGAAGATCAGTCACACCATCC反应条件94℃5min，（94℃1min，52/60℃30s，72℃1min）30cycle，72℃10min2.9blaNDM-1基因杂交定位2.9.1实验试剂配制（1）0.25mol/LHCl：22.5ml浓盐酸缓慢加入1000ml灭菌纯水中。（常温保存）（2）碱变性缓冲液：1.5mol/L氯化钠+0.5mol/L氢氧化钠。超纯水溶解，定容至1L。（121℃灭菌15min，常温保存）（3）中和缓冲液：3mol/L氯化钠+55mmol/LTris。超纯水部分溶解调节pH至7.5，超纯水定容至1L。（121℃灭菌15min，常温保存）（4）MaleticacidBuffer（马来酸缓冲液）：0.1mol/L马来酸+0.15mol/L氯化钠。超纯水部分溶解调节pH至7.5，超纯水定容至1L。（121℃灭菌15min，常温保存）（5）WashingBuffer（洗涤缓冲液）：马来酸缓冲液+终浓度为0.3%的吐温-20。（现用现配）（6）DetectionBuffer（检测缓冲液）：0.1mol/LTris+0.1mol/L氯化钠。超纯水部分溶解调节pH至9.0，超纯水定容至1L。（121℃灭菌15min，常温保存）（7）20×SSC：0.3mol/L柠檬酸钠+3mol/L氯化钠。超纯水部分溶解调节pH至7.0，超纯水定容至1L。（抽滤除菌，常温保存）（8）10×SDS：10gSDS粉末，灭菌纯水部分溶解，调节pH至7.2，于68℃水浴溶解，灭菌纯水定容至100ml。（常温保存）（9）细胞洗涤液：1mol/L氯化钠+10mmol/LTris。灭菌纯水部分溶解后调节pH至7.6，灭菌纯水定容至1000ml。（121℃灭菌15min，常温保存）（10）ECBuffer：1mol/L氯化钠+100mmol/LEDTA+6mmol/LTris+0.5%Brij58+0.2%脱氧胆酸盐+0.5%月桂酰肌氨酸钠。灭菌纯水部分溶解氯化钠、EDTA和Tris后调节pH至7.6，再加入终浓度为0.5%的Brij58、0.2%的脱氧胆酸盐和0.5%的月桂酰肌氨酸钠，灭菌纯水定容至1000ml。滤菌器过滤除菌分装至50ml的灭菌离心管中。（4℃保存）（11）ESBuffer：0.5mol/LEDTA+1%月桂酰肌氨酸钠。灭菌纯水部分溶解EDTA20 材料与方法后调节pH至8.0，再加入终浓度为1%的月桂酰肌氨酸钠，灭菌纯水定容至1000ml。滤菌器过滤除菌分装至50ml的灭菌离心管中。（4℃保存）（12）Tris:EDTABuffer，pH7.5（TE缓冲液，pH7.5）：10mmol/LTris+1mmol/LEDTA。超纯水部分溶解后调节pH至7.5，超纯水定容至1000ml。（121℃灭菌15min，常温保存）（13）50mmol/LPMSF溶液：异丙醇5ml溶解0.0174gPMSF。（现用现配，剧毒，4℃保存）（14）10mmol/LTris：10mmol/LTris超纯水部分溶解调节pH至7.5，定容至100mL。（121℃灭菌15min，常温保存）2.9.2DNA探针的制备和浓度检测（1）已经测序确定的blaNDM-1阳性菌株进行该基因的PCR扩增，扩增条件同前，适当增加扩增数量（50µL体系×4）。（2）电泳纯化扩增产物，电泳条件：60V90mA90min。（3）根据试剂盒说明书进行扩增产物切胶纯化。（4）测定扩增纯化后blaNDM-1浓度，要求模板DNA浓度在10ng~3µg之间。（5）变性模板DNA：取16µL模板DNA（模板浓度过高时也可用灭菌纯水稀释至16µL），沸水浴10min后迅速放入冰水混合物中冷却。（6）地高辛标记模板DNA：取完全混匀的DIG-HighPrimersolution4µL与16µL变性DNA模板混匀后瞬时离心，37℃水浴过夜。（7）65℃水浴10min停止标记反应。（8）梯度稀释标记探针和参照标准浓度DNA，具体见表1.23，注意随时混匀瞬时离心。表1.23标记探针和参照标准DNA梯度稀释管号取样管（标记探DNA(µL)DNA稀释液稀释度标准管稀释针/参照标准浓后终浓度度DNA）1原始管1ng/µL2121981：10010pg/µL3215351：3.33pg/µL425451：101pg/µL535451：100.3pg/µL645451：100.1pg/µL755451：100.03pg/µL865451：100.01pg/µL9（阴性对照）-050-021 青岛大学硕士学位论文（9）裁剪大小适合的尼龙膜，标记正反面，分别取标记探针和参照标准浓度DNA1~8号及9号阴性对照1µL于尼龙膜自然晾干。（10）DNA固定：尼龙膜垫锡箔纸正面朝上于120℃烘箱烘烤30min。（11）镊子夹取烘干后的尼龙膜一角，正面朝上放入20mlMaleticacidBuffer（马来酸缓冲液）室温摇动2min。（12）10×Blockingsolution（封闭液）37℃溶解。（13）马来酸缓冲液稀释封闭液至1倍（Blockingsolution：18ml马来酸缓冲液+2ml10×封闭液）混匀，正面朝上放入尼龙膜后室温摇动孵育30min。（14）anti-digoxigenin-AP10000rpm离心10min（注意从液体表面吸取必须量）。（15）1×封闭液稀释anti-digoxigenin-AP至1:10000（Antibodysolution：18ml马来酸缓冲液+2ml10×封闭液+2µLanti-digoxigenin-AP）混匀，正面朝上放入尼龙膜后室温摇动孵育30min。（16）20mlWashingBuffer（20ml马来酸缓冲液+60µL吐温-20）室温摇动漂洗尼龙膜（正面朝上）2次，每次15min。（17）10mlDetectionBuffer平衡2~5min（正面朝上）。（18）尼龙膜正面朝上放入杂交袋，加入0.1ml底物CSPD，均匀分布排除气泡后封口，15~25℃孵育5min。（19）X光片曝光15~25min，显影、定影，根据参照标准DNA估测标记探针浓度，标记，-20℃保存。2.9.3样品胶块的制备（1）原代菌与接合菌各接种LB液体试管培养基（含头孢他啶6µg/ml），37℃震荡培养过夜。（2）菌液12000rpm离心2min，弃上清。（3）1ml细胞洗涤液重新悬浮菌体，12000rpm离心2min，弃上清，注意吸取干净。（4）ECBuffer配制2％的SeaPlaque®GTG®凝胶，天平记录总重量，微波炉加热溶解（注意防止溢出），沸腾溶解后补纯水至原重量，简单封口50℃水浴箱保温。（5）500µLECBuffer重新悬浮菌体，50℃水浴保温。（6）500µLECBuffer重悬菌液中依次加入2µLRNase（10mg/ml，终浓度20µL/ml）、20µL溶菌酶（50mg/ml，终浓度1mg/ml）、500µL2％的SeaPlaque®GTG®凝胶，吹打混匀，注意避免气泡产生。（7）加入样本胶块模具，4℃静置20min。（8）样品胶块凝固成形后捣入10ml离心管（注意不同菌块之间消毒），依次22 材料与方法加入3mlECBuffer、6µL10mg/ml的RNase（终浓度20µL/ml）、60µL50mg/ml的溶菌酶（终浓度1mg/ml），颠倒混匀，保证样品胶块位于液面以下，37℃水浴1h。（9）弃上清，加入3mlESBuffer+60µL50mg/ml的蛋白酶K（终浓度1mg/ml），混匀，保证样品胶块位于液面以下，50℃水浴孵育过夜。（10）弃上清，加入3mlTE（pH7.5）+6µLPMSF，颠倒混匀，保证样品胶块位于液面以下，37℃水浴孵育2h去除蛋白酶K，重复1次。（注意保护，PMSF剧毒）（11）弃上清，加入3mlTE（pH7.5），保证样品胶块位于液面以下，37℃水浴孵育1h去除PMSF，重复1次。（12）弃上清，加入3mlESBuffer，保证样品胶块位于液面以下，4℃保存。2.9.4S1核酸酶酶切及电泳（1）切胶块大小约5×5×2mm于1.5mlEP离心管（注意不同菌株胶块之间消毒），加入1ml10mmol/LTris浸泡三次，每次15min，可适当摇晃。（2）弃上清，每个胶块加入120µLS1核酸酶酶切液（108µL灭菌纯水+12µL10×S1Buffer+0.1µLS1核酸酶）（3）37℃水浴箱孵育1h。（4）酶切结束后迅速拿出，弃上清，加入200µLESBuffer放入冰水浴停止酶切反应。（5）上样：取酶切后的胶块（原代菌+接合菌）贴于平放的电泳梳齿上，吸弃多余的液体，并于待测菌块两侧贴1mm厚的PFGEMarker，静置15min。（6）配制0.5×TBE（10×TBE110ml+灭菌水2090ml）。（7）配制1%SeaKem®GoldAgarose（粉末1.0g+0.5×TBE100ml），微波炉加热融化，注意补水，简单封口56℃水浴箱保温。（8）用融化的1%SeaKem®Gold胶固定梳齿上的胶块，待固定后再将梳齿直立，沿电泳模具一边缓慢倒入剩余的1%SeaKem®Gold胶，静置30min。（9）向电泳槽内倒入剩余的0.5×TBE+硫脲16ml，打开脉冲场凝胶电泳仪，设置循环水速60，打开冷凝机，设置电泳槽内温度14℃。（10）待电泳槽内温度降至14℃后，放入电泳胶（注意清洗碎胶，避免堵塞循环出水口），设置参数电泳片段5~500kb，电泳时间16h，转换时间0.22s~44.69s。（11）电泳结束后，关闭冷凝机，再关闭循环水、脉冲场凝胶电泳仪，取出电泳胶，放出电泳液，倒入去离子水，清洗电泳槽。（12）配制染色液（0.5×TBE稀释EB至终浓度0.5μg/mL），放入电泳胶染色30min。（注意保护，EB有毒）23 青岛大学硕士学位论文（13）倒掉EB染液，加入去离子水漂洗30min。（14）将染色漂洗后的电泳凝胶放入凝胶成像系统，拍照，保存。2.9.5DNA杂交转膜（1）切取S1PFGE后合适大小的胶块，标记正反面，记录胶块大小。（2）用灭菌纯水漂洗胶块。（3）嘌呤变性：0.25mol/L盐酸漂洗胶块10min，灭菌纯水漂洗。（4）碱变性缓冲液浸泡胶块1h，灭菌纯水漂洗。（5）中性缓冲液浸泡胶块30min。（6）裁纸：普通滤纸比胶块稍大、尼龙膜和2层Whatman滤纸比胶块长宽各多1mm。（7）组建DNA转膜装置，如图1.4。（注意：尼龙膜使用前需用10×SSC浸泡至少5min）（8）无菌容器内加入150ml10×SSC（75ml20×SSC+75ml灭菌纯水），支持物放入普通滤纸，用10×SSC均匀打湿，S1PFGE凝胶正面朝下放在普通滤纸上，再正面朝下放上提前浸泡的尼龙膜以及双层Whatman滤纸，保证每层提前润湿，贴合紧密，避免气泡，再依次放上吸水纸及重物，过夜。（注意避免蒸发）图1.4杂交DNA转膜示意图2.9.6DNA杂交（1）用镊子夹取尼龙膜一角正面朝上放入2×SSC（10ml20×SSC+90ml灭菌纯水）浸泡5min。（2）120℃烘箱烘烤尼龙膜30分钟（垫锡箔纸，正面朝上）。24 材料与方法（3）预杂交：37℃融化预杂交液，根据尼龙膜面积，每100cm2加10mlDIGEasyHybbuffer，杂交炉中42℃杂交4h。（注意尼龙膜正面朝向杂交瓶内，膜与瓶壁贴合紧密，避免气泡，保证尼龙膜不会干燥）（4）DIG标记探针变性：100℃煮沸5min，冰水混合物中迅速冷却，备用。（5）计算正式杂交液量：每100cm2加3.5mlDIGEasyHybbuffer（适当多准备0.2~0.3ml，因为加入探针后过滤除菌会损失一部分杂交液），探针终浓度为20~25ng/ml，混匀后滤菌器过滤除菌。（6）倒掉预杂交液，加入滤菌后的正式杂交液，杂交炉中49℃杂交过夜。（注意尼龙膜正面朝向杂交瓶内，膜与瓶壁贴合紧密，避免气泡，保证尼龙膜不会干燥）（7）倒掉杂交液，用镊子夹住尼龙膜一角小心取出，正面朝上放入100ml含有1%SDS的2×SSC（90ml灭菌纯水+10ml20×SSC+1ml10×SDS）中，室温摇动洗涤2次，每次5min。（8）10×封闭液37℃融化后，室温平衡15~30min。（9）严谨洗涤：取出尼龙膜，正面朝上放入100ml含有1%SDS的0.5×SSC（97.5ml灭菌纯水+2.5ml20×SSC+1ml10×SDS）中，68℃水浴80rpm摇动洗涤2次，每次15min。（10）简单漂洗：取出尼龙膜，正面朝上放入100mlWashingBuffer（100ml马来酸缓冲液+300µL吐温-20）50℃水浴80rpm摇动洗膜5min。（11）取出尼龙膜，正面朝上放入100mlBlockingsolution（90ml马来酸缓冲液+10ml10×封闭液）50℃水浴80rpm摇动孵育1h，封闭膜的非特异性结合位点。（12）anti-digoxigenin-AP10000rpm离心10min（注意从液体表面吸取必须量）。（13）取出尼龙膜，正面朝上放入40mlAntibodysolution（36ml马来酸缓冲液+4ml10×封闭液+4µLanti-digoxigenin-AP）混匀，50℃水浴80rpm摇动孵育30min。（14）取出尼龙膜，正面朝上放入100mlWashingBuffer（100ml马来酸缓冲液+300µL吐温-20）50℃水浴80rpm摇动洗涤2次，每次15min。（17）取出尼龙膜，正面朝上放入40mlDetectionBuffer，50℃水浴80rpm摇动平衡2~5min。（19）尼龙膜正面朝上放入杂交袋，加入1ml底物CSPD，均匀分布排除气泡及多余底物后封口，37℃孵育10min。（19）X光片曝光15~25min，显影、定影，扫描仪拍照保存。25 青岛大学硕士学位论文结果1细菌鉴定、药敏试验结果用法国梅里埃Vitek2Compact系统重新进行药敏试验，依据CLSIM100-S27[17]标准进行结果判读，结果显示：8株阴沟肠杆菌对所测青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类及氨曲南均耐药，其中几株阴沟肠杆菌对氨基糖苷类和喹诺酮类也耐药；10株肺炎克雷伯菌对所测青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类及氨曲南耐药；3株产酸克雷伯菌对所测青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类耐药，但是对氨曲南敏感。具体标本信息见表2.1~2.3，临床株及后述接合子药敏结果见表2.4~2.6。2耐药表型筛查实验结果改良Hodge试验中，抑菌圈沿收集菌和阳性对照划线方向出现切迹。亚胺培南EDTAE-test条试验中，IPM端与IPM+EDTA端MIC比值≥8。根据CLSI结果解释及E-test条说明书，所收集的菌株MHT和MBLE-test试验都是阳性，见图2.1。图2.1改良Hodge试验和金属酶检测（E-test条法）注：(a)阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌改良Hodge试验；(b)产酸克雷伯菌改良Hodge试验；(c)阴26 结果沟肠杆菌金属酶检测；(d)肺炎克雷伯菌金属酶检测；(e)产酸克雷伯菌金属酶检测3原代菌和接合子特性及耐药基因携带情况经PCR扩增，本研究所收集菌株均携带blaNDM-1基因。8株阴沟肠杆菌部分株同时携带blaCTX-M、blaSHV-12、blaTEM-1、blaVIM-1等耐药基因，其中YG5~YG7株仅携带blaNDM-1。除blaNDM-1外，10株肺炎克雷伯菌和3株产酸克雷伯菌还都携带blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4、intI和acc(6')-Ib-cr基因。另外，10株肺炎克雷伯菌还比3株产酸克雷伯菌多携带blaRSHV-12基因。21株菌与大肠埃希菌J53Azi进行液相接合试验，均成功得到接合子。接合子药敏试验结果显示：阴沟肠杆菌接合子（YG1C~YG8C）对厄他培南和亚胺培南MIC值与大肠埃希菌J53AziR相比，分别升高至少8~16倍和16倍；肺炎克雷伯菌接合子（FK1C~FK10C）对厄他培南和亚胺培南MIC值分别升高至少16倍和8~16倍；产酸克雷伯菌接合子（CS1C~CS3C）对厄他培南和亚胺培南的MIC值分别升高至少16倍和8倍。阴沟肠杆菌部分接合子（YG1C，YG2C，YG4C，YG8C）还携带blaCTX-M、blaSHV-12、blaTEM-1基因。肺炎克雷伯和产酸克雷伯的原代菌和接合子携带耐药基因情况相同。基于PCR的质粒复制子分型未能将ST177型阴沟肠杆菌进行分型，而ST30型肺炎克雷伯菌和ST2型产酸克雷伯菌所携带blaNDM-1基因的质粒类型均是IncHIB型。具体耐药基因携带情况和扩增产物测序峰图见表2.4~2.6，图2.2~2.4。27 青岛大学硕士学位论文blaNDM-1blaVIM-1blaOXA-1blaSHV-12blaTEM-1blaCTX-M-3blaCTX-M-9blaCTX-M-14图2.2阴沟肠杆菌耐药基因PCR产物测序部分峰图28 结果blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4图2.3肺炎克雷伯菌耐药基因PCR产物测序部分峰图29 青岛大学硕士学位论文blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1intIaac(6')-Ib-crqnrB4图2.4产酸克雷伯菌耐药基因PCR产物测序部分峰图30 结果表2.1阴沟肠杆菌原代菌与接合子携带耐药基因及特点菌株编号科室分离日期性别年龄标本MHTMBLMLST耐药基因YG1NICU2013/8/9女22天尿液++ST418blaNDM-1blaCTX-M-14YG1C++blaNDM-1blaCTX-M-14YG2NICU2013/9/1女26天尿液++ST190blaNDM-1blaCTX-M-9YG2C++blaNDM-1blaCTX-M-9YG3NICU2014/8/21男22天拭子++ST231blaNDM-1blaVIM-1YG3C++blaNDM-1YG4NICU2014/8/24女3天分泌物++ST231blaNDM-1blaCTX-M-3blaSHV-12blaTEM-1blaVIM-1blaOXA-1YG4C++blaNDM-1blaCTX-M-3blaSHV-12blaTEM-1YG5NICU2014/9/6女27天尿液++ST177blaNDM-1YG5C++blaNDM-1YG6NICU2014/9/7女22天尿液++ST177blaNDM-1YG6C++blaNDM-1YG7NICU2014/9/15女23天痰++ST177blaNDM-1YG7C++blaNDM-1YG8NICU2015/6/11男10天痰++ST592blaNDM-1blaSHV-12blaTEM-1YG8C++blaNDM-1blaSHV-1231 青岛大学硕士学位论文表2.2肺炎克雷伯菌原代菌与接合子携带耐药基因及特点菌株编号科室分离日期性别年龄标本MHTMBLMLST耐药基因FK1儿科2014/1/9男5月痰液++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK1C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK2新生儿2013/9/21男21天胃液++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK2C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK3新生儿2013/10/6男4天咽拭子++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK3C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK4新生儿2013/10/30女9天咽拭子++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK4C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK5新生儿2013/10/29男18天咽拭子++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK5C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK6新生儿2013/10/31女31天咽拭子++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK6C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK7新生儿2013/10/31男2天咽拭子++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK7C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK8新生儿2013/11/28男27天咽拭子++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK8C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK9新生儿2013/9/10男7天咽拭子++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK9C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK10新生儿2013/9/22女9天咽拭子++ST30blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB4FK10C++blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1blaSHV-12intIaac(6')-Ib-crqnrB432 结果表2.3产酸克雷伯菌原代菌与接合子携带耐药基因及特点菌株编号科室分离日期性别年龄标本MBLMLST耐药基因CS1新生儿2013/9/3女5天咽拭子+ST2blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1intIaac(6')-Ib-crqnrB4CS1C+blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1intIaac(6')-Ib-crqnrB4CS2新生儿2013/12/14男8天咽拭子+ST2blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1intIaac(6')-Ib-crqnrB4CS2C+blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1intIaac(6')-Ib-crqnrB4CS3新生儿2013/12/26女2天咽拭子+ST2blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1intIaac(6')-Ib-crqnrB4CS3C+blaNDM-1blaOXA-1blaDHA-1intIaac(6')-Ib-crqnrB4表2.4产酸克雷伯菌供体菌、受体菌及接合子药敏结果菌株号AMPSAMTZPCZCTTCAZCROFEPATMETPIPMAKCNTOBCIPLENITSXTCS1≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64322≥8≥16≤2≤181132≤20CS1C≥32≥3264≥64≥64≥64≥648≤1≥88≤2≤1≤1≤0.250.5≤16≤20CS2≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥642≥8≥16≤2≤181164≤20CS2C≥32≥3264≥6416≥64≥644≤1≥88≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20CS3≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64162≥8≥16≤2≤181132≤20CS3C≥32≥3264≥64≥64≥64≥648≤1≥88≤2≤1≤1≤0.250.5≤16≤20J53AziR84≤4≤4≤4≤1≤1≤1≤1≤0.5≤1≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20注：AMP（氨苄西林），SAM（氨苄西林/舒巴坦），TZP（哌拉西林/他唑巴坦），CZ（头孢唑啉），CTT（头孢替坦），CAZ（头孢他啶），CRO（头孢曲松），FEP（头孢吡肟），ATM（氨曲南），ETP（厄他培南），IPM（亚胺培南），AK（阿米卡星），CN（庆大霉素），TOB（妥布霉素），CIP（环丙沙星），LE（左氧氟沙星），NIT（呋喃妥因），SXT（磺胺甲恶唑/甲氧苄啶）33 青岛大学硕士学位论文表2.5阴沟肠杆菌供体菌、受体菌及接合子药敏结果菌株号AMPSAMTZPCZCTTCAZCROFEPATMETPIPMAKCNTOBCIPLENITSXTYG1≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≥64≥16≥16≥4464≥320YG1C≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20YG2≥32≥3264≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≥64≥16≥160.5132≥320YG2C≥32≥3264≥6432≥64≥648≤14≥16≥64≥16≥16≤0.25≤0.25≤16≥320YG3≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≤18≥4≥8128≥320YG3C≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6416≥64≥4≥16≤2≤1≤1≤0.25≤0.2532≤20YG4≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≥64≥16≥16≥4≥8128≥320YG4C≥32≥3264≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20YG5≥32≥3264≥64≥64≥64≥6416≥64≥8≥16≤2≤18≤0.250.532≤20YG5C≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥8≥16≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20YG6≥32≥3264≥64≥64≥64≥6416≥64≥8≥16≤2≤18≤0.250.532≤20YG6C≥32≥3264≥64≥64≥64≥648≥644≥16≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20YG7≥32≥3264≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≤18≤0.25132≤20YG7C≥32≥3264≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20YG8≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≥168≥4≥864≥320YG8C≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20J53AziR84≤4≤4≤4≤1≤1≤1≤1≤0.5≤1≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20注：AMP（氨苄西林），SAM（氨苄西林/舒巴坦），TZP（哌拉西林/他唑巴坦），CZ（头孢唑啉），CTT（头孢替坦），CAZ（头孢他啶），CRO（头孢曲松），FEP（头孢吡肟），ATM（氨曲南），ETP（厄他培南），IPM（亚胺培南），AK（阿米卡星），CN（庆大霉素），TOB（妥布霉素），CIP（环丙沙星），LE（左氧氟沙星），NIT（呋喃妥因），SXT（磺胺甲恶唑/甲氧苄啶）34 结果表2.6肺炎克雷伯菌供体菌、受体菌及接合子药敏结果菌株号AMPSAMTZPCZCTTCAZCROFEPATMETPIPMAKCNTOBCIPLENITSXTFK1≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≤1411128≤20FK1C≥32≥3264≥64≥64≥64≥648≥64≥88≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20FK2≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥64≥64≥64≥8≥16≤2≤1811128≤20FK2C≥32≥3264≥64≥64≥64≥64816≥88≤2≤1≤1≤0.250.5≤16≤20FK3≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥8≥16≤2≤1411128≤20FK3C≥32≥3264≥64≥64≥64≥6416≥64≥8≥16≤2≤1≤10.50.5≤16≤20FK4≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥88≤2≤1411128≤20FK4C≥32≥3264≥64≥64≥64≥64816≥88≤2≤1≤1≤0.250.532≤20FK5≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥8≥16≤2≤1811128≤20FK5C≥32≥3264≥64≥64≥64≥6432≥64≥88≤2≤1≤1≤0.250.5≤16≤20FK6≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥8≥16≤2≤1411128≤20FK6C≥32≥3264≥64≥64≥64≥64816≥88≤2≤1≤1≤0.250.5≤16≤20FK7≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥8≥16≤2≤1411128≤20FK7C≥32≥3264≥64≥64≥64≥64816≥88≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20FK8≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥88≤2≤1411128≤20FK8C≥32≥3264≥64≥64≥64≥6416≥64≥88≤2≤120.50.5≤16≤20FK9≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥8≥16≤2≤1411128≤20FK9C≥32≥3264≥64≥64≥64≥641632≥8≥16≤2≤120.50.5≤16≤20FK10≥32≥32≥128≥64≥64≥64≥6432≥64≥8≥16≤2≤1411128≤20FK10C≥32≥3264≥64≥64≥64≥64816≥88≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤20J53AziR84≤4≤4≤4≤1≤1≤1≤1≤0.5≤1≤2≤1≤1≤0.25≤0.25≤16≤2035 青岛大学硕士学位论文注：AMP（氨苄西林），SAM（氨苄西林/舒巴坦），TZP（哌拉西林/他唑巴坦），CZ（头孢唑啉），CTT（头孢替坦），CAZ（头孢他啶），CRO（头孢曲松），FEP（头孢吡肟），ATM（氨曲南），ETP（厄他培南），IPM（亚胺培南），AK（阿米卡星），CN（庆大霉素），TOB（妥布霉素），CIP（环丙沙星），LE（左氧氟沙星），NIT（呋喃妥因），SXT（磺胺甲恶唑/甲氧苄啶）36 结果4脉冲场凝胶电泳及多位点序列分型结果根据Tenover规则[28]，PFGE条带数目或位置相差3条以内可以考虑存在同源性。对8株阴沟肠杆菌进行酶切后PFGE发现，存在5种克隆分布：YG5~YG7条带数目及位置相同，属于克隆A；YG3、YG4条带数目及位置相近，属于克隆B，YG1、YG2、YG8分别为克隆C、D、E（图2.5）。MLST结果显示，YG3、YG4为ST231，YG5~YG7为ST177，与PFGE结果相一致。10株肺炎克雷伯菌MLST分型为ST30，3株产酸克雷伯菌MLST分型为ST2，PFGE结果显示肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌各自仅存在一种克隆分布（图2.6）。采用软件（BioNumerics7.6）聚类分析显示肺炎克雷伯菌株间有>90%的相似度，其中FK2~FK7条带数目及位置分布完全一致为A型，FK9、FK10与FK2~FK7均存在1条带的差异，定位A1型，其余与FK2~FK7均存在2条带的差异，定为A2型。CS1~CS3条带数目及位置完全一致，为同一克隆分布。MLST分型比对结果见表2.7~2.9。管家基因扩增产物测序峰图见图2.7~2.9，聚类分析结果见图2.10~2.12。图2.5XbaI酶切阴沟肠杆菌基因组PFGE注：Lane1~8，阴沟肠杆菌(YG1~YG8)；M，lambdaladderPFGmarker37 青岛大学硕士学位论文图2.6XbaI酶切肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌基因组PFGE注：Lane1~10，肺炎克雷伯菌(FK1~FK10)；Lane11~13，产酸克雷伯菌(CS1~CS3)；M，lambdarladderPFGmarker38 结果danAfusAgyrBleuSpyrGrpIBrpoB图2.7阴沟肠杆菌MLST管家基因PCR产物部分峰图39 青岛大学硕士学位论文gapAinfBmdhpgiphoErpoBtonB图2.8肺炎克雷伯菌MLST管家基因PCR产物部分峰图40 结果gapAinfBmdhpgiphoErpoBtonB图2.9产酸克雷伯菌MLST管家基因PCR产物部分峰图41 青岛大学硕士学位论文表2.7阴沟肠杆菌MLST比对结果管家基因菌株编号序列分型（MLST）dnaAfusAgyrBleuSpyrGrpIBrpoBYG15335154444546ST418YG2941563749ST190YG346202096452954ST231YG446202096452954ST231YG59414618949ST177YG69414618949ST177YG79614618949ST177YG812521197444546ST592表2.8肺炎克雷伯菌MLST比对结果管家基因菌株编号序列分型（MLST）gapAinfBmdhpgiphoErpoBtonBFK153119426ST30FK253119426ST30FK353119426ST30FK453119426ST30FK553119426ST30FK653119426ST30FK753119426ST30FK853119426ST30FK953119426ST30FK1053119426ST30表2.9产酸克雷伯菌MLST比对结果管家基因菌株编号序列分型（MLST）gapAinfBmdhpgiphoErpoBtonBCS11221212ST2CS21221212ST2CS31221212ST242 结果图2.10阴沟肠杆菌XbaI酶切PFGE聚类分析图注：利用BioNumerics7.6软件，依据Dice系数和UPGMA聚类构建系统进化树，基因组相似比例见左侧树状图。NO.：菌株编号；PFGE：克隆类型；MLST：多位点序列分型；Collectiondate：收集时间；Ward：分离科室。43 青岛大学硕士学位论文2.11肺炎克雷伯菌XbaI酶切PFGE聚类分析图注：利用BioNumerics7.6软件，依据Dice系数和UPGMA聚类构建系统进化树，基因组相似比例见左侧树状图。NO.：菌株编号；PFGE：克隆类型；MLST：多位点序列分型；Collectiondate：收集时间；Ward：分离科室。44 结果图2.12产酸克雷伯菌XbaI酶切PFGE聚类分析图注：利用BioNumerics7.6软件，依据Dice系数和UPGMA聚类构建系统进化树，基因组相似比例见左侧树状图。NO.：菌株编号；PFGE：克隆类型；MLST：多位点序列分型；Collectiondate：收集时间；Ward：分离科室。45 青岛大学硕士学位论文5Southernblot结果根据PFGE结果，考虑YG5~YG7、FK1~FK10、CS1~CS3分别存在同源性，对其原代菌及接合子进行S1核酸酶切电泳。结果显示：3株阴沟肠杆菌原代菌均携带一个50kb和一个400kb左右的质粒，而其接合子仅携带有大小约50kb的质粒；肺炎克雷伯菌原代菌和其接合子都携带一个大小约280kb左右的质粒；产酸克雷伯菌原代菌携带大小约275kb和100kb两个质粒，而其接合子仅携带有大小约275kb的质粒。经Southern杂交证实，ST177型阴沟肠杆菌，ST30型肺炎克雷伯菌和ST2型产酸克雷伯菌及其接合子所携带blaNDM-1基因分别位于大小约50kb，280kb和275kb的质粒上。YG5~YG7和YG5C~YG7C，FK3、FK8和FK3C、FK8C，CS1和CS1C进行S1核酸酶切PFGE并DNA杂交结果见图2.13~2.14。图2.13S1核酸酶切阴沟肠杆菌及接合子基因组PFGE及blaNDM-1Southern杂交图注：(a)阴沟肠杆菌原代及接合菌S1核酸酶切PFGE：M，lambdaladderPFGmarker；Lane1、3、5，阴沟肠杆菌原代菌（YG5，YG6和YG7）S1核酸酶切PFGE；Lane2、4、6，阴沟肠杆菌接合子（YG5C，YG6C和YG7C）S1核酸酶切PFGE。(b)阴沟肠杆菌原代及接合菌blaNDM-1Southern杂交图：Lane1、3、5，阴沟肠杆菌原代菌（YG5，YG6和YG7）基因46 结果组S1核酸酶切后Southern杂交；Lane2、4、6，阴沟肠杆菌接合子（YG5C，YG6C和YG7C）基因组S1核酸酶切后Southern杂交。图2.14S1核酸酶切肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌及接合子基因组PFGE及其blaNDM-1Southern杂交图注：(a)肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌原代及接合菌S1核酸酶切电泳：M，lambdaladderPFGmarker；Lane1、3，肺炎克雷伯原代菌（FK3和FK8）S1核酸酶切PFGE；Lane2、4，肺炎克雷伯菌接合子（FK3C和FK8C）S1核酸酶切PFGE；Lane5，产酸克雷伯原代菌（CS1）S1核酸酶切PFGE；Lane6，产酸克雷伯菌接合子（CS1C）S1核酸酶切PFGE。(b)肺炎克雷伯菌原代及接合菌blaNDM-1Southern杂交图：Lane1、3，肺炎克雷伯原代菌（FK3和FK8）基因组S1核酸酶切后Southern杂交；Lane2、4，肺炎克雷伯菌接合子（FK3C和FK8C）基因组S1核酸酶切后Southern杂交。(c)产酸克雷伯菌原代及接合菌blaNDM-1Southern杂交图：Lane5，产酸克雷伯原代菌（CS1）基因组S1核酸酶切后Southern杂交；Lane6，产酸克雷伯菌接合子（CS1C）基因组S1核酸酶切后Southern杂交。47 青岛大学硕士学位论文讨论根据本研究综述统计，自印度次大陆发现第一例产NDM-1的肺炎克雷伯菌[2]以来，不仅局限在印度和巴尔干地区，全球碳青霉烯类耐药肠杆菌的报道率也逐年上升。碳青霉烯类抗生素目前仍是临床对抗多重耐药菌的重要抗菌药物，而携带NDM-1的细菌可以水解除氨曲南以外的所有β内酰胺类抗生素，且常合并携带ESBL、AmpC、喹诺酮类及氨基糖苷类等耐药基因，仅对替加环素和黏菌素敏感，这使得临床用药面临困难。并且使形势更加严峻的是可移动的多粘菌素耐药基因mcr-1的出现，在中国已有同时携带bla[29]NDM-1和mcr-1的可移动质粒的报道，随之而来的难题是治疗和控制耐药菌传播。对于儿童，替加环素属四环素类，应用时顾忌儿童牙釉质发育。黏菌素国内暂未上市临床可用的药物且存在肾毒性和神经毒性，喹诺酮类和氨基糖苷类也因影响骨发育和肾毒性等使用受限，这就陷入无药可用的境地。因此CRE在儿童人群中的预防、监测和控制就成为应对医院感染、暴发的重中之重。LataniaK.Logan等[30]报道目前国际上CRE产生机制主要以ESBLs或AmpC合并细菌结构突变和产碳青霉烯酶。碳青霉烯酶主要包括Ambler分类中的A、B、D类。A类最常见的是KPC，代表株是携带blaKPC-2或blaKPC-3的ST258型肺炎克雷伯菌，而中国以携带bla[31]KPC-2的ST11型肺炎克雷伯菌最为常见，相关可移动遗传元件有IncFIIK2、IncF1A、IncI2、Tn4401等。B类以IMP、VIM和NDM为主，IMP主要分布在中国、日本和澳大利亚[32]，其中中国以IMP-4和IMP-8为主[33]，常见的相关可移动遗传元件有IncL/M、IncA/C和I类整合子等；VIM主要分布在意大利和希腊[32]，常见的相关可移动遗传元件有IncN、IncI1和I类整合子等；NDM主要分布于印度大陆、巴尔干半岛和中国，其他地区主要为散发，相关可移动遗传元件有IncA/C、IncF、ISAba125等。NDM流行的基因亚型及菌种ST分型都十分广泛，代表菌是ST11、ST147型肺炎克雷伯菌和ST131、ST101型大肠埃希菌。D类主要流行OXA-48，常见于日本、部分欧洲国家以及北非[34]，代表菌是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，相关可移动遗传元件有IncL/M、Tn1999、IS1999等。根据文献报道，中国同印度、尼泊尔等一样都是NDM的高发地区[35]。目前上海[36]、湖南[37]、浙江[38]、山东[39]、云南[40]等地先后在儿童群体中发现携带blaNDM-1的肠杆科细菌。有研究推测小于10岁的男性儿童及老年人是产NDM的CRE的易感人群[41]。A.Xu等[42]研究显示以往是年老有基础疾病及ICU环境中容易感染CRE菌血症，现发现儿童和新生儿容易感染，尤其是CRKP流行的区域。地区分布上主要集中在沿海及人口流动大的地区。本研究收集的主要是新生儿中携带blaNDM-1的肠杆科细菌，在病人的性别分布上并没有显著差异，可能是由于研究标本数量不足，48 讨论且针对个别地区、个别医院短时间内的感染暴发所致。科室分布上，值得注意的是2012年CHINET对碳青霉烯类耐药肠杆菌的细菌分布进行统计发现，2009年CRE科室分离率占前三的是ICU、神经外和普外科，2012年为ICU、门急诊和儿科病房，并出现儿科病房分离率的升高[43]。本研究收集菌株也是集中于NICU或新生儿科。阴沟肠杆菌均来自NICU，除FK1外分离自儿科外，其余肺炎克雷伯菌与产酸克雷伯菌均来自新生儿科，与国内外的流行科室分布一致[44]。时间分布上，阴沟肠杆菌于2013年8月~2015年6月收集，其中YG3~YG7集中于2014年8~9月，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌收集于2013年9月~2014年1月。标本来源上，成人与儿童差异不大。国外分离自儿童的CRE标本以血液、尿液为主[45]，而国内则主要以呼吸道标本、尿液、血液为主[46]。浙江某医院的阴沟肠杆菌主要分离自尿液，而天津某医院分离的肺炎克雷伯和产酸克雷伯则主要来自咽拭子，这可能与国内外标本送检习惯差异有关。菌株分布上，国外分离自儿童的CRE主要是肠杆菌属、克雷伯菌属和大肠埃希菌[15]，除了肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，阴沟肠杆菌及沙雷氏菌也有过报道，但是携带blaNDM-1的产酸克雷伯鲜有报道[47,48]。国内成人CRE主要分离自肺炎克雷伯菌（73.9%）、大肠埃希菌（16.6%）和阴沟肠杆菌（7.1%）[49]，儿童群体在CRE的菌种分布上，肠杆菌科以肺炎克雷伯菌为首，其次是大肠埃希菌。本研究收集的是8株阴沟肠杆菌、10株肺炎克雷伯菌和3株产酸克雷伯菌。菌株药敏结果显示8株阴沟肠杆菌和10株肺炎克雷伯菌对所测青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类及氨曲南均耐药，个别阴沟肠杆菌对氨基糖苷类和喹诺酮类也耐药，3株产酸克雷伯菌对所测青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类耐药，但是氨曲南敏感。改良Hodge试验和金属酶E-test条试验均阳性，即表型实验也证实产金属酶。PCR扩增耐药基因并测序后证实所测菌株均携带blaNDM-1，其中YG3、YG4同时携带blaVIM-1。另外，还有部分菌株同时携带ESBL、AmpC和PMQR等耐药基因，而肺炎克雷伯和产酸克雷伯菌还携带I类整合子。尽管一直以来，整合子被认为是细菌质粒进化和抗生素抗性传播的重要附加机制，也有研究认为I类整合子与NDM的传播可能没有关系[50,51]。2012年一项收集全球儿童感染CRE的研究显示，CRE主要分离自耐药基因以NDM、KPC和VIM最为常见[45]。印度一项为期5年的研究发现，NDM-1出现以前，CTX-M合并孔蛋白丢失是碳青霉烯类主要耐药机制，另外，AmpC和氨基糖苷类耐药基因也随着NDM的流行出现上升趋势[13]。LataniaK.Logan等[52]研究显示携带金属酶的耐药菌超过50%同时携带ESBL和AmpC基因。关于NDM亚型，目前全球已发现至少18个NDM亚型。经检索，儿童群体中除NDM-1外，也有NDM-4[53]、NDM-5[54]、NDM-6[55]的报道。虽然本研究并未检出KPC相关基因，但其余耐药基因检出结果与目前文献报道基本一致。49 青岛大学硕士学位论文对于细菌携带了耐药基因但并未表现对该种抗菌药物耐药，以及虽然携带了相同的耐药基因但耐药表型不尽相同的情况，如本研究中产酸克雷伯菌携带喹诺酮类和氨基糖苷类耐药基因但对所测抗菌药敏并非耐药，考虑是细菌对耐药基因的表达情况不同或者进行药敏试验存在实验误差导致，因本研究未行基因组测序及耐药基因周围环境研究，不排除细菌基因序列相同存在同源性可能。从携带耐药基因情况上来看，肺炎克雷伯菌与产酸克雷伯菌在同一家医院收集，耐药表型类似，耐药基因也基本一致，考虑可能存在耐药基因的水平传播，国外也有类似的报道[56]。通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）对收集株进行同源性分析，结果显示YG5~YG7条带数目及位置相同，YG3、YG4条带数目及位置基本一致，根据Tenover规则[28]认为分别具有同源性，分属于克隆A、B，并与ST分型结果相一致，分别为ST177和ST231型，可以认为2014年9月，ST177型阴沟肠杆菌在浙江某医院存在医院内感染暴发，并且在该院NICU存在阴沟肠杆菌的多克隆流行。国外有关耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌儿童分离株的暴发研究并不多，主要通过PFGE和二代测序等进行同源性分析[57,58]。国内报道的碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌多携带bla[59,60]IMP。有关ST177型产NDM-1阴沟肠杆菌的暴发研究仅在国内有报道，但是发生在成人的医院感染暴发[27]。肺炎克雷伯菌聚类分析显示各菌株间存在>90%的相似度，认为是同一克隆，且条带数目相差2条以内，根据Tenover规则[28]认为存在仅1个基因位点的突变。目前，无论成人或儿童群体中均检索到携带bla[61]NDM-1的ST30肺炎克雷伯菌的病例，但未见暴发的报道。李斌研究中分离自肝脓肿病人的ST30型肺炎克雷伯菌为敏感菌。产酸克雷伯菌PFGE条带数目位置完全一致，且均为ST2型，认为是同一克隆型。携带blaNDM-1的产酸克雷伯菌以散发案例为主，分布于中国、印度和丹麦，且均分离自成人，标本来源主要为尿液[47,62-65]。AnetteM.Hammerum等[56]的研究发现1株产NDM-1的ST2型产酸克雷伯菌，分离自成人尿液，同时携带blaCMY-6、blaCTX-M-15、blaOXA-1、blaTEM-1、aac(6′)-Ib-cr、aacA4、rmtC等基因，携带blaNDM-1的质粒大小154kb，质粒分型为IncA/C2，并提出由产NDM-1的弗氏柠檬酸杆菌携带IncA/C2的质粒在体内传播到大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌。有研究显示，NDM的传播与细菌的ST分型有关。目前国内关于儿童群体中NDM-1阳性耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌MLST分型报道ST11[66]、ST20[67]、ST54[67]、ST888[68]、ST17[69]、ST433[69]、ST37[36]、ST76[36]、ST105[40]、ST22[39]等。本研究10株肺炎克雷伯菌均为ST30型，且PFGE提示具有同源性，为国内外首次报道。质粒作为独立于细菌基因组外的复制结构，携带耐药基因加速了细菌耐药性的传播，不同质粒分型也有着不同的传播性。目前国内外报道的分离自儿童的携带bla[40][70][58][71][57]NDM-1的质粒分型有IncFI、IncA/C、IncFII、IncHI及未分型等，携带50 讨论bla[72][67]NDM-1的质粒大小在23~336kb不等。本研究中所有菌株液相接合试验均成功得到接合子。质粒分型未能将ST177型阴沟肠杆菌进行分型，而ST30型肺炎克雷伯菌和ST2型产酸克雷伯菌所携带blaNDM-1基因的质粒类型均是IncHIB型。Southern杂交提示阴沟肠杆菌暴发株携带blaNDM-1的质粒大小约50kb，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的约280kb和275kb，与国内外研究结果相符。不排除肺炎克雷伯菌与产酸克雷伯菌之间携带blaNDM-1的质粒存在水平传播，国内外也有类似关于产酸克雷伯菌的报道[56,63,73]。本研究的不足之处在于对临床资料搜集不足，未能分析相关危险因素，由于是回顾性分析，不能及时采集环境标本等进行研究，不能从根源上找到医院感染暴发的原因。未能对质粒进行测序，对耐药基因周围环境进行分析，进一步明确质粒特性和不同菌种间是否存在耐药性传播。经检索，儿童携带blaNDM-1基因的ST177型阴沟肠杆菌引起的医院内感染暴发为首次报道。新生儿科，同时存在携带blaNDM-1、blaOXA-1、blaSHV-12、blaDHA-1、qnrB4、intI和aac(6')-Ib-cr基因的ST30型肺炎克雷伯菌和携带blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4、intI和aac(6')-Ib-cr基因的ST2型产酸克雷伯菌的医院感染暴发同样为国内外首次报道。51 青岛大学硕士学位论文结论（1）浙江某医院新生儿重症监护室存在携带blaNDM-1的ST177型阴沟肠杆菌的医院感染暴发，并存在其他克隆株。（2）天津某医院新生儿科同时存在携带blaNDM-1、blaOXA-1、blaSHV-12、blaDHA-1、qnrB4、intI和aac(6')-Ib-cr基因的ST30型肺炎克雷伯菌和携带blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4、intI和aac(6')-Ib-cr基因的ST2型产酸克雷伯菌的医院感染暴发。（3）浙江和天津两所医院儿童携带blaNDM-1基因的肠杆菌存在多种耐药机制，并呈现多重耐药。因此，要加强抗生素的合理使用，预防医院感染的流行和暴发。52 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综述综述儿童碳青霉烯类耐药肠杆菌的研究概况摘要：碳青霉烯类抗生素（如亚胺培南、美罗培南）作为应对革兰阴性多重耐药菌，尤其是肠杆菌科细菌感染的最后一道防线，2008年于印度分离出“超级细菌”，源自一个病人的尿液中分离出耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌，后证实该菌产碳青霉烯酶，并将这种酶命名为新德里金属β内酰胺酶（NewDelhiMetallo-β-lactamase，NDM）。“超级细菌”出现后成为全球研究的热点，并在各地不断出现其新型的报道，这其中对儿童的研究较少，本文就碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）的耐药机制，儿童分离株的流行现状，分子传播机制，检测方法以及治疗干预作一综述，为指导临床应对儿童感染碳青霉烯类耐药细菌的预防，治疗及控制提供依据。关键词：碳青霉烯类耐药；儿童；肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌感染是造成全球发病率和死亡率升高的重要原因，抗生素的使用也日渐广泛，同时耐药性的产生也成为了全球关注的公共健康问题。尤其是2008年印度“超级细菌”--产NDM的肺炎克雷伯菌（05-506）报道以来，因其能够水解所有的β-内酰胺类（除氨曲南以外）抗生素，引起广泛的关注，并在全球各地不断出现携带blaNDM不同亚型的报道。有研究显示，每年有将近290万新生儿死亡，23%直接死因是感染，败血症占15%[1]。新生儿重症监护室，尤其是早产儿很容易携带多重耐药菌，一项最近的研究显示抗生素耐药导致的败血症死亡占全部的30%[2]。印度的一项研究显示儿童CRE血流感染死亡率更是达到了52%，感染的病原体以肺炎克雷伯最常见，其次大肠埃希菌，耐药基因上blaNDM最常见，其次是blaOXA，并且死亡率与美罗培南的MIC值有密切关系[3]。国内儿科病房内NDM阳性株很常见[4]，血液标本来源的CRKP流行率达5.5%[5]，有针对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌造成儿童血流感染的研究显示死亡率11.5%，产NDM-1的肺炎克雷伯菌主要来自血液科[6]。CRE的出现已严重威胁人类健康，而儿童作为免疫系统发育不完善的特殊群体，处于生长发育阶段，限制了抗生素的使用，为临床在治疗儿童感染耐碳青霉烯类肠杆菌感染时带来极大的困难。一、碳青霉烯类抗生素耐药机制在β-内酰胺类抗生素中，碳青霉烯类抗生素已广泛应用于临床，在面对重症感染休克时，在药敏结果报告前，经常被作为经验用药来对抗革兰阳性或阴性细菌感59 青岛大学硕士学位论文染，并对包括AmpC和ESBLs的大部分β-内酰胺酶有较好的稳定性，而且副作用较少，因此称为应对细菌感染的最后一道防线，而其耐药性的出现无疑成为全球公共卫生的一项重大问题。细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要有以下几种：一种是天然耐药，例如嗜麦芽寡养单胞菌，该非发酵菌存在基因编码并表达金属β内酰胺酶（metallo-beta-lactamase，MBL），而对碳青霉烯类抗生素天然耐药；二是药物作用靶位的改变，革兰阳性菌是通过青霉素结合蛋白PBPs突变介导对青霉素耐药，同样也出现对碳青霉烯类以及β内酰胺类耐药的突变类型，并且该机制在革兰阴性菌中也有报道[7]；三是细菌胞膜通透性的改变及外排泵的形成，如外膜蛋白的缺失或数量的减少伴有质粒或染色体介导高水平β-内酰胺酶的持续产生[8,9]；四是酶介导的耐药性，主要是β内酰胺酶的产生抑制了碳青霉烯类和其他β内酰胺类抗生素的活性，因此在临床中尤为重要，也是肠杆菌最为常见的耐药机制，本文将主要围绕该机制进行研究。所有的β内酰胺酶根据Ambler分类法被分为ABCD四类，其中A类KPC，GES，IMI，SFC-1，SME；B类NDM，SPM，GIM，SIM，AIM，DIM，FIM，POM；D类源自不动杆菌属，个别OXA（如OXA-48）拥有水解碳青霉烯类的能力，C类是Ampc酶，被认为不是碳青霉烯酶，但有较低的水解能力，当其过度表达联合外膜通透性下降和/或外排泵产生时将导致碳青霉烯类耐药[10]。这其中较为高效并引起全球传播的有KPC，IMP，NDM，VIM，OXA-48[11]等。KPC能水解所有的β内酰胺类抗生素，可被克拉维酸、他唑巴坦等β内酰胺酶抑制剂抑制。B类金属β内酰胺酶MBLs能够水解所有β内酰胺类抗生素（除氨曲南以外）并不被上述抑制剂所抑制，因该类碳青霉烯酶有锌离子活性中心，因此应用金属螯合剂例如EDTA在体内与其鳌合来抑制其活性。二、儿童耐碳青霉烯类肠杆菌流行现状从碳青霉烯类耐药肠杆菌总的分布情况上来看，各地区有不同的主要流行碳青霉烯酶类型。金属酶，例如VIM主要在希腊，意大利，土耳其和西班牙有报道[12]。NDM-1发源自印度，其引起的在全球快速传播最初被认为与医疗旅行相关[13]。近年来也有报道显示巴尔干半岛和中东地区为NDM-1的发源地，中东地区NDM-1的播散可能是由于印度与中东地区之间的人口流动，产NDM-1细菌的播散基本都源自印度和巴尔干半岛地区[14]。但是并不是所有感染者均到过这些地区，中国、加拿大等国家的病例证实了这一点，不排除空气或水传播的可能性[15]。在美国，KPC是主要流行的碳青霉烯酶，从1996年第一例KPC在北加利福尼亚报道以来，现已成为美国东北部主要的流行类型，并以ST258型肺炎克雷伯菌为代表。现在,KPC60 综述在欧洲和美洲广泛流行，特别是美国和爱尔兰，另外一个KPC的主要聚集地是中国，并以产KPC-2的ST11型肺炎克雷伯菌为主[16,17]。OXA和IMP型碳青霉烯酶在欧洲和拉丁美洲较多,OXA-48最初认为主要集中在中东和北非地区[18]，但是后来在欧洲[19]，塞内加尔[20]和阿根廷[21]的报道提示了该型酶可能也出现了全球范围的播散。国外一项针对儿童碳青霉烯类耐药肠杆菌的研究统计[22]显示，在2002到2010年间，统计六篇研究中分离自63名儿童的非重复的64株碳青霉烯类耐药肠杆菌，儿童的中位年龄为1岁，在地区分布上，38%来自印度，29%来自以色列，19%来自西班牙，美国和希腊分别占11%和3%。可以看出大部分集中在印度和中东地区，欧洲和美洲也有分布。另外87%的儿童在CRE感染之前住院时间超过了48小时，平均为16天，推测CRE为医院感染可能性大。64例CRE阳性菌株34%为肠杆菌属，31%为克雷伯菌属，28%为大肠埃希菌。分离的标本有30%是血，25%为尿，消化道和呼吸道各占19%和11%。CRE分型上，有36%检测到NDM（包括NDM-1和NDM-6），KPC和VIM分别在34%和23%的细菌中检测到。值得注意的是所有NDM阳性菌株都来自印度，KPC来自美国或以色列，VIM则来自欧洲。与上述总体CRE的全球分布一致[12]。在国内，近年来分离自儿童的肠杆菌耐碳青霉烯类的菌株检出率也呈逐年增长的态势。据CHINET克雷伯菌属细菌耐药性监测[23]显示，综合分析2005到2014年间碳青霉烯类各年龄段耐药率发现，儿童耐药株检出率高于成人，平均为9.7%（998/10248）对9.4%（4798/51158）。分离自儿童的肠杆菌对亚胺培南的耐药率从2005年的1.3%上升至2014年的14.6%，对美罗培南的耐药率则由0上升至15.2%。其中华东（15.7%）和西南地区（10.5%）碳青霉烯类耐药株分离率较高。2013年的一项针对全国208家综合医院关于血标本来源病原菌调查[24]显示，统计个年龄段对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌（CRKP）检出率，新生儿组(≤28d)和儿童组(1~14岁)中较成年组(15~65岁)和老年组（>65岁）高，分别为10.7%、10.6%。地区分布上，新生儿群体组中，华南（24.6%）、华中（18.3%）地区CRKP检出率最高；儿童群体组中，华北（16.3%）和西南（15.9%）地区CRKP检出率较高。可以看出碳青霉烯类耐药肠杆菌的聚集地还是人口相对密集的地区。本文检索在中国知网和Pubmed共搜集的52篇关于儿童或新生儿感染耐碳青霉烯类肠杆菌的报道并进行统计。文献中菌株均为非重复菌株，总共700株，其中国内349株，国外351株。首先来看一下国内的CRE的分布情况（具体见表1、2），检索文献菌株收集于2009年1月至2016年12月，24篇报道中地区分布上，浙江分离株最多，共59株（59/349，16.9%），其次为山东58株（58/349，16.6%），北京55株（55/349，61 青岛大学硕士学位论文15.7%）。主要分布在华东地区，占国内CRE分离株的42.7%（149/349），不排除各地研究重点和报道率存在差异。科室分布上，主要是NICU、PICU和新生儿科。微生物和分子学特点如下，菌种分布上比较单一，大部分为肺炎克雷伯菌（318/349，91.1%），可见CRKP在我国的传播相当广泛。分离标本情况，国内主要为呼吸道标本（124/349，35.5%）和血（86/349，24.6%）。这可能与国内标本送检率及送检习惯有关。CRE耐药机制以产酶为主，自2008年NDM发现以来，国内NDM的检出率也迅速提高，此次统计中NDM阳性率达到了36.4%（127/349），并且多同时携带多种耐药基因，如ESBLs耐药基因blaSHV，blaTEM，blaCTX-M和AmpC类耐药基因blaCMY，blaDHA，blaACT等，另外IMP阳性率27.5%（96/349），主要是IMP-4和IMP-8，KPC阳性率25.6%（90/349），主要是KPC-2。报道的CRKP的ST分型中，有34株ST11，22株ST20，19株ST105，17株ST17，12株ST54，另外还有个别ST705，ST37，ST76，ST1419，ST107，ST307，ST571，ST869等。携带KPC耐药基因的质粒分型有IncFIA、IncA/C[39]，携带NDM-1耐药基因的质粒分型有IncFI[40]，还有1株NDM-5阳性大肠埃希菌，质粒分型为IncX3[28]。携带耐药基因的质粒20kb~336kb大小不等，也有报道考虑NDM-1耐药基因位于染色体或大质粒上[40]。国外2002年至2016年3月统计结果，共统计28篇文献中351株分离自儿童的CRE。地区分布上，出现了几个明显的聚集地：南亚（133/351，37.9%）、南美北部（77/351，21.9%）、地中海沿岸（58/351，16.5%）及美国（25/351，7.1%）。印度依然为CRE分离株的主要聚集地，共有74株，占国外分离株的21.1%（74/351），另外一个值得关注的地区是安哥拉，CRE散发分离株57株（16.2%,57/351），不排除存在资料收集时的偏倚。科室分布情况上，与国内基本一致，CRE主要分布在NICU/PICU。考虑ICU的CRE分离率较高可能与住院时间长、侵入性操作、预防性广谱抗菌药物使用及机体严重疾病等有关[76,77]。菌种分布上，肺炎克雷伯菌依然是主要的CRE分离株，占60.4%（212/351），其次是大肠埃希菌占22.2%（78/351），另外阴沟肠杆菌也发现占到了16.5%（58/351）。国外的分离标本中，气管吸引物或者痰等呼吸道标本较国内少很多（9/351，2.6%），主要是血液标本来源，占统计的33.6%（118/351），其次是院感监控中拭子的采集占22.2%（78/351）。CRE耐药机制也以产酶为主，NDM的阳性率最高，占37.3%（131/351），KPC占25.6%（90/351），IMP阳性率仅1.1%（4/351），但是D类碳青霉烯酶阳性率18.5%（65/351），主要集中在非洲，VIM阳性率也达到了11.7%（41/351），另外也出现了SME[68]、ESBLs或者AmpC合并膜蛋白缺失[49,68]等耐药机制。在搜集的报道中，KPC已在全球出现了广泛的传播，分型以KPC-2和KPC-3为主，产KPC的肺炎克雷伯菌分型也不再局限于ST11和ST258，出现了ST833、ST14、ST36等等。除南极洲和澳大62 综述利亚外，其他各大洲均有儿童携带NDM阳性肠杆菌的报道，与LoganLK.[22]的研究相比，NDM不再局限于印度地区，儿童群体中也出现了NDM的多种亚型，如NDM-4[64]、NDM-5[64]、NDM-6[52]，进一步说明NDM在儿童感染CRE中已经有了广泛的传播，ST分型没有发现明显的流行型。携带耐药基因的质粒大小在23kb~304kb之间，携带NDM的质粒分型有IncF、IncA/C、IncHI、IncN、IncR、IncL/M和未分型等。三、碳青霉烯类耐药肠杆菌传播流行机制细菌耐药性的传播主要通过两种途径：垂直传播与水平传播。垂直传播即凭借突变获得对药物的抗药性并在抗生素存在的情况下，经过筛选传递给后代；水平传播即细菌通过接合、转化、转导等方式由其他细菌处获得抗生素耐药基因。目前这两种方式对细菌耐药性产生的贡献仍未研究透彻，但综合当前资料报导等研究，水平传播对细菌耐药性的产生起了很大作用[78]。目前国内抗生素使用缺少一定限制，在药敏出报告前临床医师面对感染则会尽量选择广谱抗生素来覆盖尽可能多的病原体，抗生素造成的选择压力，使细菌逐渐积累其耐药性。另外细菌本身也很容易突变，造成在抗生素使用过程中，细菌在获得水平转移的基因时不断收集对其生存有利的耐药机制，使其在抗生素选择压力下继续生长繁殖。我们习惯将碳青霉烯类耐药的几种机制简单分为两种，一种是产酶——碳青霉烯酶，可以水解碳青霉烯类抗生素的β内酰胺环，产碳青霉烯酶的肠杆菌即Carbapenem-producingenterobacteriaceae（CPE），另一种为非产酶，包括细菌产ESBL或AmpC酶联合膜通透性改变等。CRE的广泛传播与携带耐药基因的可转移基因元件有关，例如质粒、转座子等。相对比之下，膜通透性的改变经常导致微生物的适应性及可传播性的降低[22,79]。因此，对碳青霉烯类耐药的肠杆菌的流行病学研究，首先区分其是产酶还是非产酶还是很有必要的。目前在全球都有广泛传播且被研究者所熟知的碳青霉烯酶是A类中的KPC，KPC的编码基因blaKPC通常与可移动的转座子Tn4401相关联，并在肺炎克雷伯ST258型中较为常见，这对产KPC的细菌的广泛传播起了重要作用[79]。D类是苯唑西林酶，常见于不动杆菌属，最常见的OXA-48近来在肺炎克雷伯、大肠埃希菌中也有报道，OXA-48最初在中东、日本、北非等地发现，同其他类碳青霉烯酶一样，经过国际间的移民、医疗旅行等已经播散到全球的许多其他地区，包括中国、美国等，相信地区间的这种差异也会逐渐减少[80]。尽管碳青霉烯酶出现已经超过20多年了，它们最初的起源至今仍未可知，1991年在日本检测到第一个MBL，IMP-1[81]，1997年，在意大利发现VIM-1[82]，这两种酶如今在各大洲都有发现，主要见于铜绿假单胞菌。其他金属酶如GIM，SIM，63 青岛大学硕士学位论文AIM，DIM，FIM和POM至今在全球只有零星的散发，而NDM自2008在印度检测到后就迅速在全球进行了播散。产NDM的细菌在印度各地医疗机构和环境中不断被检测到，并通过患者的转移和旅行者的定植很快波及了欧洲，北美，远东和澳洲[83]。对另外一个NDM发源地，巴尔干地区的担忧也不断升温[84]。接下来将主要阐述B类碳青霉烯酶NDM的分子流行机制。PoirelL等[85]对16株全球各地搜集的携带blaNDM-1的多重耐药菌进行研究，发现bla[86]NDM-1的传播不仅仅局限于某一种或几个特殊的克隆、ST分型或质粒分型。例如大肠埃希菌ST410、ST101、ST131等，肺炎克雷伯菌的ST14、ST340型等。blaNDM-1基因环境的研究显示大部分blaNDM-1阳性菌合并表达质粒介导的AmpCs或ESBL基因，也检测到广谱氨基糖苷类耐药基因，质粒介导的喹诺酮耐药基因qnr。这就可能导致在相关疾病的治疗上对碳青霉烯类抗生素的过量使用。与blaCTX-M-15、blaKPC-2不同，blaNDM-1并不局限于固定的克隆分型、质粒或转座子。可能唯一相似的是blaNDM-1基因环境，其上游都有插入序列ISAba125元件或其片段，下游则为博来霉素耐药基因bleMBL，与blaNDM-1相关的基因多样性可能与其广泛传播有关。近来，DattaS等[87]对NICU败血症新生儿中分离到的携带blaNDM-1的15株菌进行了详细的研究，在肠杆菌中，blaNDM-1主要位于50~200kb左右大小可接合的质粒上，可以传播和迅速播散耐药基因。接合试验中，携带blaNDM-1的质粒有时并不是单独转移而需要辅助质粒来帮助其转移，与PoirelL等[85]的研究结果相符。部分接合菌与原代菌质粒大小不一致，可能是因为原代菌中往往不止一个质粒，质粒之间可能发生了重组，有助于质粒的多样性并接纳更多的耐药基因到质粒框架中来。质粒、转座子和整合子在抗生素耐药基因传播中一直扮演着重要的角色。携带blaNDM-1的可接合的质粒复制子类型多为FIB，L/M，N，FIIK，R，HIB-M/FIB-M，FII/FIIS或不可分类。对blaNDM-1基因环境的研究发现存在保守序列，在5’端经常有完整或部分ISAba125序列，而在3’端有bleMBL（编码博来霉素耐药的基因）。另外bleMBL3’-末端有trp，tat，dvt，groES，groEL和ISCR21的不同组合，但是最基本的框架仍是ISA125，blaNDM-1和bleMBL，提示ISA125有关的起始转移机制与blaNDM-1和bleMBL的获得有很大关联。同时这一研究也提出了blaNDM-1在不同菌种之间交叉传播的可能性。四、碳青霉烯酶酶检测方法及其局限性4.1表型筛查根据CLSI2017年更新的药敏执行标准，对肠杆菌科，亚胺培南和美罗培南<1mg/L为敏感，>4mg/L为耐药，厄他培南<0.5mg/L为敏感，>2mg/L为耐药。厄他培南因其较高的敏感性和较低的特异性常被作为碳青霉烯酶包括NDM的筛查标64 综述准。普通的药敏试验并不能区分细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制是产酶还是非产酶，上面流行机制中也提到区分这一机制的重要性，产碳青霉烯酶肠杆菌与非产酶菌相比，感染控制的干预也更为重要。因此产碳青霉烯酶的确证实验对明确肠杆菌耐药机制、抗生素的选择、感染的进一步控制仍然是十分必要的。4.2表型确认目前应用最为广泛的方法为改良Hodge试验（MHT），挑取标准菌株ATCC25922，配制菌悬液，用无菌拭子均匀涂布到M-H平板表面。取厄他培南纸片贴于平板中央，用无菌拭子蘸取可疑产碳青霉烯酶的肠杆菌从平板边缘向药敏纸片划线，培养16~20h，划线与抑菌圈边缘交叉处出现增强性生长为改良Hodge试验阳性，提示可能产生碳青霉烯酶。改良Hodge试验对A类和D类碳青霉烯酶较为敏感，并且该实验经济、方便操作，是CLSI和CDC推荐的确证实验。然而该试验存在一定的假阳性，由产ESBL或AmpC肠杆菌合并孔蛋白突变引起。实验结论均为主观解释，实验周期在72~96小时，并且在验证MBL型碳青霉烯酶方面敏感性较低[88]。另一组表型确证实验是快速显色实验，其中，2015年CLSI引入CarbaNP试验检测碳青霉烯酶的产生，将细菌与亚胺培南共同孵育，如果亚胺培南被水解就会出现颜色变化，同时加入他唑巴坦或EDTA，可以区分是产A类、B类还是D类碳青霉烯酶[89,90]。该试验敏感性在80%~100%，特异性在100%，较低的敏感性主要是由于OXA-48的假阴性及产NDM-1的变形菌属和普罗维登菌属。另外CarbaNP实验操作简便，实验时间短，大约仅需30分钟到2小时[89~92]。相对比改良Hodge实验，CarbaNP实验还可以对非发酵菌中的碳青霉烯酶进行验证，此处不再进行赘述。4.3基因确证多重聚合酶链式反应（PCR）和微阵列技术可以鉴定常见的碳青霉烯酶，如KPC、VIM、IMP、NDM和OXA-48等，相对于其他方法，敏感性和特异性均可达100%[93][94]。优点是可以直接鉴定特定的基因，具有相当的敏感性和特异性，且实验周期短。缺点是该实验方法需要专业的技术人员和昂贵的仪器、试剂，暂时还没有被美国食品药品监督局（FDA）和CLSI所通过。另外本试验方法仅能检测已存在的基因，对未被验证的基因无法检测。新兴的MALDI-TOF技术，全基因组测序技术等仍需进一步优化，在未来几年，可能将被应用到实验室对产碳青霉烯酶的肠杆菌的鉴定中[95]。不管是哪种方法，在保证敏感性和特异性的前提下，节省检测时间、廉价、便捷同样重要，以便于流行病学的监测以及疾病的预防和感染控制。五、儿童感染碳青霉烯类耐药肠杆菌的治疗65 青岛大学硕士学位论文目前临床上关于CRE感染治疗方案的最佳选择尚无定数，因为缺少评估治疗有效性的研究。当前的治疗大都参考一些病例报告、个案、队列研究等，但是这些研究在感染人群、地域及感染菌种上都存在很大的异质性，难以统一参考[96]。现有的证据表明，联合至少两种体外试验表现敏感的药物治疗相对比单一药物治疗，可以显著降低死亡率[97,98]。当然任何一种治疗方案都要考虑感染当地的流行情况、药敏形势及专家建议等。5.1碳青霉烯类有研究表明，相对比单一药物治疗或不包含碳青霉烯类的联合治疗，包含碳青霉烯类的联合治疗对降低死亡率有一定效果[97]。也有模型研究发现对于MICs在8μg/mL–16μg/mL的病原菌，延长美罗培南给药时间或连续用药可以达到目标浓度，然而将这一理论研究应用到临床有一定困难，因为最近的研究发现MICs在2μg/ml~8μg/ml的死亡率要高于MIC≤1μg/mL[99]对儿童感染CRE，延长用药时间或连续给药是否获益方面，目前研究尚少，但基于目前成人治疗方面的经验，碳青霉烯类仍是对抗CRE的中流砥柱[100]。5.2多粘菌素多粘菌素包括粘菌素E（也称粘菌素）和多粘菌素B两类，具有相似的抗菌谱和抗菌活性，再次进入人们的视线是因为多粘菌素成为对抗严重碳青霉烯类耐药细菌感染的重要治疗药物。已经有许多应用于新生儿的案例，但是变形菌属和沙雷菌属对该类药物天然耐药，而且该药物极易产生耐药性，且与β内酰胺类相比有更高的毒性，早些年被人们熟知的肾毒性和神经毒性，近期研究显示，多粘菌素的肾毒性及神经毒性出现率分别为22%和4%[101]。多粘菌素B没有前体药物，直接以药物的活性形式被人体吸收，在成人的研究中认为，多粘菌素从肾中排泄极少，它的肾毒性基本可以忽略[102]。至于多粘菌素在儿童群体中的药代动力学研究尚未实施，已发表的经验性用药成功案例也是极少[103]。当然，多粘菌素类也被推荐与其他药物合用对抗CRE感染，单一应用多粘菌素的死亡率高于包含多黏菌素的联合用药[104,105]。并且今年来发现了位于质粒上可传播的粘菌素耐药基因mcr-1[54,106,107]。GuDX等首次报道了在中国发现携带mcr-1的肠杆菌科细菌，由于在新生儿群体，本身对治疗全耐药的革兰阴性杆菌就十分困难，可传播的mcr-1基因的出现引起了全球极大的担忧，并且此文也是首次发现一例同时感染两种携带mcr-1基因的不同细菌的混合感染，进而提示该基因存在不同菌株间水平传播的可能性[108]。5.3替加环素替加环素分布量大、具有脂溶性、组织渗透广泛，皮肤、胆囊、肠和肺内组织66 综述均可渗透。血液、泌尿系统中相对较低，治疗血液和泌尿系感染难以达到有效的血药浓度。替加环素可以对抗许多革兰阳性和革兰阴性多重耐药菌，但是不能覆盖铜绿假单胞菌，对颅内感染疗效欠佳[109]。同样的尽管很多产碳青霉烯酶的病原菌在体外对替加环素敏感，但这种药物的耐药性增长迅速[110,111]，而且，面对碳青霉烯类耐药细菌感染，暂时没有足够的数据支持的其进行单一治疗，它的耐药与许多外排泵基因的表达有关[96,112]。作为四环素类似物，替加环素同样可以抑制骨生长，影响牙釉质形成，使牙齿染色等，因此，必须权衡利弊，在没有可以选择的药物情况下，才能应用于儿童[100,113]。5.4磷霉素磷霉素是膦酸衍生物，具有广谱的抗菌活性，不仅对耐药的肠杆科细菌，也对抗非发酵菌中常见的耐药菌不动杆菌属和铜绿假单胞菌。它的另外一个优点是较好的组织和体液穿透力，常与其他抗生素联用在体内发挥作用，并且毒性相对较低。值得担忧的是磷霉素单药应用较易产生耐药性，因此通常与其他类抗生素联用来减少耐药菌株产生的可能性。遗憾的是，目前也很少有在儿童或新生儿感染中应用的综合评估[114]。尽管如此，磷霉素已经列入对抗CRE感染的最后手段。随着CRE耐药形势愈演愈烈，一些新药也在不断研发，例如头孢他啶-阿维巴坦，阿维巴坦能够对抗KPC和OXA类的碳青霉烯酶，但对金属酶无效[115,116]，目前已进入临床II期试验，用于治疗儿童严重的尿路感染和腹膜内感染[117,118]。其他还有一些制剂正在研发，如头孢洛林-阿维巴坦、亚胺培南-MK7655、比阿培南-RPX7009、氨基糖苷类的新型抗生素plazomicin、四环素类的新型抗生素eravacycline等，在体外试验中都表现出良好的抗碳青霉烯酶活性[90,100,119]。六、预防儿童CRE感染的干预措施ThackerN等[120]的一项针对印度618名患有血液病或实体瘤的儿童的前瞻性研究显示，社区获得CRE的定植率到达20.2%，这将对后期化疗效果大打折扣，并影响预后。HacerAkturk等[77]对2011年1月至2014年12月在伊斯坦布尔收集的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌进行了病例对照研究，分为了碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌定植组和感染组，单因素分析发现感染组比定植组有更多的尿管插入史、气管切开史及手术史。定植组与感染组的总的抗生素应用时间并无差别，因为无论是感染组还是定植组，实际上几乎所有被收入NICU或PICU的患者之前都应用过抗生素。但是碳青霉烯类抗生素单药应用时间上，感染组要高于定植组。尽管目前大部分研究都支持抗生素的使用是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯出现的独立危险因素[121]，也有部分研究认为二者并没有必然的关联[122]。对于碳青霉烯类耐药的肠杆菌，通常都会采取接触隔离，但产碳青霉烯酶的细67 青岛大学硕士学位论文菌就需要更多的感染控制干预，例如有针对性的积极检测[123]。切断传染途径和尽早发现易感人群是控制CRE播散的关键环节，医院传染仍是病原菌获得的关键途径，尽管部分地区也有可能通过社区感染，例如污染公共水源导致加速病原菌的传播蔓延。现多采取已知有效的多层次感染控制体系来对抗CRE，包括提前预警，正确的手卫生管理，队列护理，点流行率调查，积极的监测培养，长期医疗护理的单独隔离，这些都可以有效减缓病原菌的扩散[124,125]。美国CDC[60]提出几项“核心措施”来预防和控制CRE，包括注意手卫生、建立抗生素管理小组、减少侵入性操作、对CRE定植或感染的病人提前防范。对于没有CRE定植的科室，监管筛查高危因素，例如长期住院患者、从确定有CRE感染或定植的科别转入的患者、在CRE流行地区接受过医疗操作的患者、准予进入ICU的患者等。对于已经确定携带CRE的患者，应该筛查与该患者有流行病学关联的人或区域。对于存在CRE播散的机构，应对高危患者住院期间定期实施严格监控。尽管产碳青霉烯酶的病原体暴发感染一时间可能很难控制，但也有案例及研究显示，经过系统的安排、严格的感染控制，可以阻止这些病原体的进一步传播。结语CRE感染不常见，但对于儿童，有着较高的发病率和死亡率并会延长住院时间，必须严肃对待。需要病例对照研究来评估危险因素和儿童预后。儿童对抗CRE感染比成人有着更为局限的药物治疗选择。直到发现新的替代药物或者找到能有效克服碳青霉烯酶作用的措施之前，无论人还是动物都要合理应用抗生素，建立严格的抗生素管理体制，及时监测碳青霉烯酶基因的出现，在今后都将是重中之重。68 综述表1国内分离自儿童的CRE报道及相关信息省时间数量菌种标本参考文献2011.1-2014.951肺炎克雷伯*血[6]北京2016.12.10-154肺炎克雷伯血液[25]2010.11-2012.1220肺炎克雷伯-[26]山东2011.4-2013.1037肺炎克雷伯痰、血液、脐分泌物[27]20131大肠埃希菌*痰[28]13大肠埃希菌*[29]河南2009.3-2013.39肺炎克雷伯*-[29]9阴沟肠杆菌*[29]安徽2011.7.5-217肺炎克雷伯伤口渗出液、脑脊液[30]2009.7-2011.112肺炎克雷伯痰、伤口、尿液、血液[31]2009.1-2014.140肺炎克雷伯*痰、尿[32]浙江2010.6-93肺炎克雷伯-[33]2010.10-2010.124肺炎克雷伯痰[34]上海2014.3-2014.622肺炎克雷伯痰、气管插管、尿、脓[35]2010.1113肺炎克雷伯气管插管[36]湖南2012.8-2013.38肺炎克雷伯痰、血[37]2012.8-2013.127肺炎克雷伯*血、痰[38]江西2010.6-2010.93肺炎克雷伯*尿、血[39]云南2014.1.2219肺炎克雷伯痰、凳子、血[40]2013.12-2015.128肺炎克雷伯*-[41]广西12肺炎克雷伯*[42]2013.1-2016.3痰、血4黏质沙雷菌*[42]69 青岛大学硕士学位论文3大肠埃希菌*[42]1阴沟肠杆菌*[42]广东2012.12.24-2013.1.204肺炎克雷伯痰[43]2014.3.25-2014.8.207肺炎克雷伯痰、血、尿[44]2015.1-2015.1127肺炎克雷伯痰、血、尿、气管吸管[45]2013.3.261肺炎克雷伯*血[46]注：*为散发报道70 综述表2国内分离自儿童的CRE耐药机制及相关信息菌种省MLST耐药机制质粒大小复制子类型合并携带耐药基因1类整合子参考文献肺炎克雷伯北京NDM-1[6]北京IMP-4[6]北京KPC-2[6]山东ST20ST54ST17NDM-1336kbblaTEM-1blaCTX-MblaDHA-1+[27,75]山东ST20ST54ST705IMP-455kbblaTEM-1blaCTX-MblaDHA-1[27]山东ST54ST17ST705NDM-1IMP-4336kb,55kbblaTEM-1blaCTX-MblaDHA-1-[27,75]山东ST290IMP-8blaTEM-1blaCTX-M-15[27]河南IMP-8blaTEM-1blaCTX-M-3[29]安徽ST11KPC-2[30]blaTEM-1blaCTX-M-15blaSHV-11blaOXA-10blaCTX-M-14浙江KPC-2+[31]blaSHV-12acc(6’)-Ib-cr浙江KPC-2[32]浙江NDM-1[32]aac(6’)-Ib-crblaTEM-1blaCTX-M-14blaCTX-M-15blaSHV-11浙江ST11NDM-163kb+[33]blaSHV-12浙江IMP-4blaSHV-11blaTEM-1blaDHA-1blaCTX-M-14qnrB4+[34]上海ST37ST76ST846NDM-150kb~240kbblaCTX-M-15blaDHA-1+[35]湖南IMP-38[36]湖南KPC-2[36]湖南ST17ST433NDM-1blaTEM-1blaCTX-M-15blaCMY-4blaSHV-1qnrS[37]湖南ST17NDM-1[38]江西ST11KPC-2120kbFIAblaCTX-M-14blaSHV-11blaTEM-1aac(6’)-Ib-crqnrB4[39]71 青岛大学硕士学位论文rmtBblaCTX-M-1blaSHV-12blaTEM-1aac(6’)-Ib-suzhouqnrS1江西ST1137KPC-2IMP-4150kbA/C[39]qnrA1qnrB4aac(6’)-IbrmtBarmA云南ST105NDM-150kbFIblaCTX-M-15blaSHV-1blaTEM-1qnrB4qnrS1aacA4[40]云南ST105NDM-1IMP-4染色体或大质粒blaCTX-M-15blaSHV-1qnrS1aacA4[40]广西IMP-4[41]广西IMP-4blaSHVblaTEM[42]广东ST1419ST101NDM-120kb~78kbblaCTX-M-15blaTEM-1blaSHV-12[44]ST11KPC-2blaCTX-14blaTEM-1[45]ST888ST20NDM-1blaCTX-M-15blaTEM-1blaCTX-M-14[45]ST65OmpK35/36表达减低blaSHV-11blaTEM-53rmpAaerobactinentBmrkD[46]大肠埃希菌山东ST167NDM-5X3aac(6’)-IbblaCTX-M-14blaTEM-1sul1[28]广西IMP-4blaSHVblaTEM[42]阴沟肠杆菌河南IMP-8blaTEM-1blaCTX-M-3[29]广西IMP-4blaSHVblaTEM[42]黏质沙雷菌广西IMP-4blaSHVblaTEM[42]72 综述表3国外分离自儿童的CRE报道及相关信息国家时间数量菌种标本参考文献2009.9-2009.1118大肠埃希菌体表拭子血[47]1肺炎克雷伯菌*[48]2010.4-2010.10血液1阴沟肠杆菌*[48]8大肠埃希菌*[49]2007-201113肺炎克雷伯菌*血液[49]5阴沟肠杆菌*[49]印度6大肠埃希菌[50]2008.12-2011.76肺炎克雷伯菌血液[50]3阴沟肠杆菌[50]20112肺炎克雷伯菌呼吸道标本、血液[51]2012.4.231大肠埃希菌*尿液[52]2012.2-2012.36肺炎克雷伯菌拭子[53]2016.34肺炎克雷伯菌*-[54]31肺炎克雷伯菌[55]2011.8.9-2012.6.30血液脑脊液尼泊尔5大肠埃希菌[55]2012.11.18-2013.2.013阴沟肠杆菌血液[56]1肺炎克雷伯菌*[57]巴基斯坦2011.7-2.12.36大肠埃希菌*-[57]3阴沟肠杆菌*[57]12肺炎克雷伯菌[58]土耳其2013.1-2013.48阴沟肠杆菌尿呼吸道标本体液直肠拭子鼻拭子肺泡灌洗液组织[58]2大肠埃希菌[58]73 青岛大学硕士学位论文爱尔兰2011.111肺炎克雷伯菌*尿液[59]意大利2012.9.18-2012.11.1410肺炎克雷伯菌-[60]摩洛哥2011.6-82肺炎克雷伯菌呼吸道标本、尿液[61]2013.61肺炎克雷伯菌*脑脊液[62]阿尔及利亚2014.6.11肺炎克雷伯菌尿液[63]埃及2014.42肺炎克雷伯菌*呼吸道标本、血液[64]突尼斯2014.1.1-2014.12.3120肺炎克雷伯菌血液、导管、呼吸道标本、脓液[65]29大肠埃希菌*[66]25肺炎克雷伯菌*[66]安哥拉2015.31阴沟肠杆菌*拭子[66]1斯氏普罗维登斯菌*[66]1雷氏普罗维登斯菌*[66]2004.7.1-2004.12.3012肺炎克雷伯菌粪便[67]1粘质沙雷菌[68]2002-20102大肠埃希菌-[68]3肺炎克雷伯菌[68]美国2009.11-2010.63肺炎克雷伯菌尿液[69]2肺炎克雷伯菌*[70]2011.4-2013.3血液、尿液1大肠埃希菌*[70]2014.31肺炎克雷伯菌*直肠拭子[71]委内瑞拉2014.4-719肺炎克雷伯菌血液、呼吸道标本、导管、分泌物[72]2011.8-2012.16肺炎克雷伯菌血液[73]哥伦比亚28肺炎克雷伯菌[74]2012.6-2014.6尿液、呼吸道标本、导管、血液24阴沟肠杆菌[74]74 综述注：*为散发报道75 青岛大学硕士学位论文表4国外分离自儿童的CRE耐药机制及相关信息菌种国家MLST耐药机制质粒大小复制子类型合并携带耐药基因1类整合子参考文献肺炎克雷伯菌印度NDM-1155kbFblaSHV-167blaCTX-M-15armAqnrBaac(6’)-Ib-cr+[48]印度OmpF/Ompk36缺失blaSHV-1blaTEM-1blaOXA-1blaCTXM-15+[49]印度NDM-1blaSHV-167blaCTXM-15armAaac(6’)-Ib-crbleMBL+[49]129kb,155kb,282kb，N，FIIK,R，印度NDM-1236kb,166kb，HIB-M,FIB-M，+[50]194kb,46kbFIIK印度NDM-1blaCTX-M-15blaTEM-1blaOXA-1blaSHV-1[51]印度NDM-150kbA/CblaCTX-M-15[53]印度OXA-48blaSHV-34mcr-1[54]ST336aac(6’)-Ib-craadA2blaCTX-M-15blaOXA-1folPcatA1尼泊尔ST14NDM-1304kbHI1B/FIB[55]dfrA12armAST15巴基斯坦NDM-1blaCTX-M-15[57]ST15ST45土耳其NDM-1150kbUntypableblaCTX-M-15blaCMY-6blaSHV-1blaCTX-M-3blaSHV-27[58]ST278ST1059土耳其ST307KPC-2blaOXA-9blaSHV-1blaTEM-1[58]土耳其ST101OXA-48blaCTX-M-15blaOXA-1blaTEM-1blaSHV-1[58]爱尔兰NDM-198kb[59]意大利ST258KPC-3[60]摩洛哥OXA-48blaCTX-M-15blaTEM-1blaSHV-1aac(6’)-Ib-cr-[61]阿尔及利亚ST512KPC-3blaTEM-1blaSHV-11aac(6’)-IbaadA[62]76 综述阿尔及利亚ST1853OXA-4862kbL/MblaCTX-M-15blaSHV-11[63]埃及ST45NDM-4>93kbL/MblaCTX-M-15blaSHV-142blaTEM-1qnrSaac(6’)-Ib-cr+[64]埃及ST45NDM-5>93kbUntypableblaCTX-M-15blaTEM-1blaSHV-1+[64]突尼斯KPCVIM[65]安哥拉ST15NDM-1120kbblaCTX-M-15[66]ST1301ST34ST231安哥拉ST2093OXA-181＞150kb，30kb，64kbX3blaCTX-M-15qnrS[66]ST2094ST2074ST45美国ST36KPC-3blaSHV-11blaTEM-1[67]ST336Ompk35/Ompk36缺美国blaCTX-M-15blaSHV-12[68]ST327失美国ST258KPC-2[68]美国IMP-4100kb[69]ST258美国KPC-3[70]ST18美国ST37NDM-1blaCTX-M-15blaCMY-4blaSHV-11[70]美国ST14VIM-4188kbA/CblaCMY-4+[71]委内瑞拉ST833KPC-2VIM-2addA2qacΔE+[72]哥伦比亚ST1043NDM-123kbA/CblaSHVqnrA+[73]哥伦比亚KPC-2[74]哥伦比亚ST14KPC-3[74]77 青岛大学硕士学位论文大肠埃希菌印度NDM-183kbblaCTX-M-15blaTEM-1blaCMY-42rmtB+[47]印度OmpF/Ompk36缺失blaTEM-1blaOXA-1blaCTXM-15blaCMY-4blaCTXM-28rmtB+[49]印度NDM-1blaTEM-1blaCTXM-15blaCMY-6rmtCaac(6’)-IbbleMBL+[49]119kb,164kb,113kb，FIB，L/M,FII，印度NDM-1129kb,114kb，untypable，blaTEM-1blaCTX-M-15blaCMY-6rmtCaac(6’)-Ib+[50]88kb,85kbFII/FIIs，R印度NDM-6IMPFblaTEMblaSHVrmtC[52]尼泊尔NDM-1[55]blaVIM-2blaCTX-M-15blaLAT-1~blaLAT-4blaCMY-2~blaCMY-7巴基斯坦NDM-1[57]blaBIL-1土耳其KPC-2[58]土耳其OXA-48blaCTX-M-3blaOXA-1blaTEM-1blaCTX-M-15[58]安哥拉ST5079NDM-1100kbFIAblaCTX-M-15rmtB[66]ST5692ST38ST3258ST361安哥拉OXA-18130kb，64kbX3blaCTX-M-15qnrS[66]ST3268ST167ST5703ST38ST1061美国IMP-4blaCMY-2[68]ST648美国ST101NDM-1blaCTX-M-15blaCMY-42[70]阴沟肠杆菌印度NDM-1119kbFIIblaOXA-1blaCTX-M-15blaACT-16rmtCqnrBaac(6’)-Ib-cr+[48]78 综述印度OmpF/Ompk36缺失blaTEM-1blaOXA-1blaCTXM-15blaACT-7[49]印度NDM-1blaOXA-1,blaCTXM-15,blaACT-16rmtCaac(6’)-IbbleMBL+[49]Untypable,FII/FblaTEM-1blaCTX-M-15blaOXA-1blaACT-16rmtC印度NDM-1119kb，114kb,129kb+[50]IIsaac(6’)-Ib-crqnrB尼泊尔NDM1FII[56]巴基斯坦NDM1[57]土耳其NDM-1150kbUntypableblaCTX-M-15blaOXA-1[58]安哥拉OXA-18164kbX3qnrS[66]哥伦比亚KPC-3[74]雷氏普罗威登斯菌安哥拉NDM-1100kbblaCTX-M-15[66]斯氏普罗维登斯菌安哥拉NDM-1100kbA/CblaCTX-M-15[66]黏质沙雷菌美国SME[68]79 青岛大学硕士学位论文综述参考文献[1]LawnJE,BlencoweH,OzaS,etal.EveryNewborn:progress,priorities,andpotentialbeyondsurvival[J].Lancet,2014,384(9938):189-205.[2]LaxminarayanR,MatsosoP,PantS,etal.Accesstoeffectiveantimicrobials:aworldwidechallenge[J].Lancet,2015,387(10014):168-175.[3]NabarroLE,ShankarC,PrakasamA,etal.ClinicalandBacterialRiskFactorsforMortalityinChildrenwithCarbapenem-ResistantEnterobacteriaceaeBloodstreamInfectionsinIndia[J].PediatricInfectiousDiseaseJournal,2016,36(6).[4]WangSS,SunJZ,Wen-LiSU,etal.EpidemiologicalanalysisofNDM-1-positivebacteriainChina[J].MilitaryMedicalSciences,2015.[5]XuA,ZhengB,XuYC,etal.Nationalepidemiologyofcarbapenem-resistantandextensivelydrug-resistantGram-negativebacteriaisolatedfrombloodsamplesinChinain2013[J].ClinMicrobiolInfect,2016,22:S1-S8.[6]DongF,ZhangY,YaoK,etal.EpidemiologyofCarbapenem-ResistantKlebsiellapneumoniaeBloodstreamInfectionsinaChineseChildren'sHospital:PredominanceofNewDelhiMetallo-β-Lactamase-1[J].MicrobialDrugResistance,2017.[7]NeuwirthC,SiéborE,DuezJM,etal.ImipenemresistanceinclinicalisolatesofProteusmirabilisassociatedwithalterationsinpenicillin-bindingproteins[J].JournalofAntimicrobialChemotherapy,1995,36(2):335-342.[8]SchweizerHP.EffluxasamechanismofresistancetoantimicrobialsinPseudomonasaeruginosaandrelatedbacteria:unansweredquestions[J].GenetMolRes,2003,2(1):48-62.[9]DoménechsánchezA,HernándezallésS,MartínezmartínezL,etal.IdentificationandCharacterizationofaNewPorinGeneofKlebsiellapneumoniae:ItsRoleinβ-LactamAntibioticResistance[J].JournalofBacteriology,1999,181(9):2726.[10]QualeJ,BratuS,GuptaJ,etal.Interplayofeffluxsystem,ampC,andoprDexpressionincarbapenemresistanceofPseudomonasaeruginosaclinicalisolates[J].Antimicrobialagentsandchemotherapy,2006,50(5):1633-1641.[11]PoirelL,PotronA,NordmannP.OXA-48-likecarbapenemases:thephantommenace[J].JournalofAntimicrobialChemotherapy,2012,67(7):1597-1606.[12]CastanheiraM,MendesRE,WoosleyLN,etal.Trendsincarbapenemase-producingEscherichiacoliandKlebsiellaspp.fromEuropeandtheAmericas:reportfromtheSENTRYantimicrobialsurveillanceprogramme(2007–09)[J].Journalofantimicrobialchemotherapy,2011:dkr081.[13]CastanheiraM,DeshpandeLM,MathaiD,etal.EarlydisseminationofNDM-1-and80 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青岛大学硕士学位论文附录缩略词表英文缩写英文全称中文翻译MHTmodifiedHodgetest改良霍奇试验PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应MLSTmultilocussequencetyping多位点序列分型PFGEpulsefieldgelelectrophoresis脉冲场凝胶电泳NDMNewDelhimetallo-β-lactamase新德里金属β-内酰胺酶CREcarbapenem-resistantEnterobacteriaceae碳青霉稀类耐药肠杆菌科细菌CPEcarbapenem-producingEnterobacteriaceae产碳青霉烯酶的肠杆菌CRKPcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌CLSIClinicalandLaboratoryStandardsInstitute美国临床和实验室标准协会AmpCAmpCβ-lactamase头孢菌素酶PMFRplasmid-mediatedfosfomycinresistance质粒介导的磷霉素耐药PMQRplasmid-mediatedquinoloneresistance质粒介导的喹诺酮类耐药ESBLsextended-spectrumbeta-lactamases超广谱β－内酰胺酶ATCCAmericanTypeCultureCollection美国模式菌种收集中心PMSFphenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟E.coliEscherichiacoli大肠埃希菌92 致谢致谢回首似乎还是那个夏天，空气中满是热情的阳光，耳边充盈着聒噪的蝉鸣，博远楼前树下斑驳的影子映着崭新的课本……三年时光如白驹过隙，如今在医院规培三年，走在校园的路上，看着可爱的老师同学，竟是另一番心境，我的步伐带有一股力量，一种坚定，一种幸福，我无悔我的选择，我庆幸我的坚持。临床科室的轮转和课题实验让我更加热爱自己的专业和生活，轮转巩固了课本上学到的知识，加深了对书本的理解，而课题实验锻炼了我的科研能力、团队合作能力、发现问题与解决问题的能力，正是实验中的一次次成功与失败磨炼了我的意志。首先，衷心的感谢我的导师朱元祺教授，生活上给了我无私帮助与热忱鼓励，学习和科研上的严格要求也让我受益匪浅，老师严谨的作风、求实的态度、勤奋的精神，将永远影响着我，支持鼓励我继续前行。感谢石油大学（华东）及生物工程与技术中心提供的科研平台，感谢赵静宜老师对我实验不足的指导和石油大学的同学们的帮助。感谢临床各科室和检验科老师们的指导，真正指引我将临床与课本相结合，体会了临床工作的辛苦与不易，也坚定了自己要成为其中一份子的信念。感谢我的父母，时时刻刻都关心、支持着我，用他们的方式帮助我全身心投入到学习、轮转和实验中去，希望你们身体健康。最后感谢评阅论文和各位答辩委员会的诸位专家和教授，感谢毕业、答辩过程中在背后默默奉献的所有同学、老师和工作人员！93 青岛大学硕士学位论文94