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分类号：Ｓ６５１学校代码：１０４１０密级：公开学号：０２０２０１５１５６硕士学位论文茼蒿中抑制西瓜枯萎病菌活性物质分离纯化及作用机制研究ＳｔｕｄｙｏｎｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅａｒａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｐｐａｎｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｏｉｎｈｉｂｉｔＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｉｎＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ申请人：李珊珊指导教师：范淑英教授学科专业：蔬菜学所在院：农学院（所）论文提交日期：２０１８年６月 分类号：S651学校代码：10410密级：公开学号：0202015156硕士学位论文茼蒿中抑制西瓜枯萎病菌活性物质分离纯化及作用机制研究StudyonprificationandseparationofactivesubstancesanditsmechanismtoinhibitFusariumoxysporuminChrysanthemum申请人：李珊珊指导教师:范淑英教授学科专业：蔬菜学所在院（所）：农学院论文提交日期：2018年6月 独创性声明，本人声明，所呈交的学位论文是在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果ｆ并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在江西农业大学或其它教育机构一获得学位或证书而使用过的材料，＾与我同对本研究做出贡献的同志都在论文中作了。明确的说明并表示了谢意如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位论文作者亲笔签名：嫌Ａ：４利ｒ狱ｐ日期论文使用授权的说明本人完全了解江西农业大学有关保护知识产权的规定，既：研宄生在读期间论文工作的知识产权属江西农业大学，毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时属名单位为江西农业大学，署名作者顺序须征得导师同意。学校有保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁带，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容（保密内容除外），可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在＿年后解密可适用本授权书。口不保密，本学位论文属于不保密。□“”（请在方框内打Ｖ）学位论文作者亲笔签名日期：邊“彳指导教师亲缡签名－＾１＞＾＾：日ｍ：％ 目录摘要..........................................................................................................IAbstract....................................................................................................II第1章文献综述.....................................................................................11.1西瓜枯萎病综合防治研究进展..........................................................................11.1.1抗性育种.........................................................................................................11.1.2农业防治.........................................................................................................11.1.3生物防治.........................................................................................................21.1.4化学防治.........................................................................................................21.2茼蒿化学成分及生物活性研究进展..................................................................21.2.1抑菌活性成分.................................................................................................21.2.2生物活性研究.................................................................................................41.3植物源抑菌剂抑菌机理研究方法进展...............................................................51.3.1显微镜观察微生物的形态结构.......................................................................51.3.2研究抑菌剂对细胞壁作用的方法....................................................................61.3.3研究抑菌剂对细胞膜作用的方法...................................................................61.3.4研究抑菌剂对微生物呼吸代谢影响的方法....................................................71.3.5研究抑菌剂对遗传物质影响的方法...............................................................81.4课题介绍..........................................................................................................91.4.1课题来源.........................................................................................................91.4.2课题的提出及研究意义..................................................................................91.4.3主要研究内容.................................................................................................91.4.4技术路线.......................................................................................................10第2章茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用研究..........112.1前言.................................................................................................................112.2材料与方法......................................................................................................112.2.1试验材料.......................................................................................................112.2.2试验方法.......................................................................................................112.3数据分析..........................................................................................................122.4结果与分析......................................................................................................122.4.1茼蒿茎叶浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用..............................................122.4.2茼蒿根浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用..................................................132.4.3茼蒿根际区土壤浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用...................................14i 2.4.4茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用强度比较........................152.4.5茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定...............................152.5结论与讨论......................................................................................................16第3章茼蒿中抑菌活性物质的分离纯化与结构鉴定.........................173.1前言..................................................................................................................173.2材料与方法......................................................................................................173.2.1试验材料.......................................................................................................173.2.2试验方法.......................................................................................................173.3数据分析..........................................................................................................193.4结果与分析......................................................................................................193.5结论与讨论......................................................................................................22第4章绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑菌活性研究.................................244.1材料与方法......................................................................................................244.1.1试验材料.......................................................................................................244.1.2试验方法.......................................................................................................244.2数据分析..........................................................................................................254.3结果与分析......................................................................................................254.3.1绿原酸对西瓜枯萎病菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)........254.3.2绿原酸对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定......................................................254.3.3绿原酸对西瓜枯萎病菌孢子萌发的影响......................................................264.3.4绿原酸对西瓜枯萎病菌菌丝生物量的影响..................................................274.4结论与讨论......................................................................................................28第5章绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑菌机制研究.................................295.1材料与方法......................................................................................................295.1.1试验材料.......................................................................................................295.1.2试验方法.......................................................................................................295.2数据分析..........................................................................................................305.3结果与分析......................................................................................................315.3.1绿原酸对西瓜尖镰孢菌超微结构的影响......................................................315.3.2绿原酸对西瓜枯萎病菌细胞膜渗透性的影响...............................................325.3.3绿原酸对西瓜尖镰孢菌物质外渗的影响......................................................325.3.4绿原酸对西瓜尖镰孢菌琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活力的影响.............335.4结论与讨论......................................................................................................34第6章全文结论...................................................................................36ii 6.1文章结论..........................................................................................................366.1.1茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌作用效果的比较...............................366.1.2茼蒿中抑制西瓜枯萎病菌活性成分的分离纯化...........................................366.1.3茼蒿中绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑菌活性研究...........................................366.1.4茼蒿中绿原酸对西瓜枯萎病菌的作用机制初探...........................................366.2课题展望..........................................................................................................37参考文献................................................................................................38致谢........................................................................................................46个人简介................................................................................................47iii 摘要我国是世界上西瓜生产与消费第一大国，江西省也是西瓜生产大省，西瓜在江西省的农业结构调整与农民增收中发挥着重要的作用。近年来，国内外的科技工作者都非常重视对安全无毒、经济环保的西瓜枯萎病杀菌技术的研究，然而至今都没有理想的成果投产。本研究旨在开发利用植物体内产生的抑菌物质，从而代替化学杀菌剂，开发适合西瓜枯萎病的植物源杀菌剂，主要结果如下：1、以西瓜枯萎病菌为研究对象，采用生长速率法，研究了茼蒿茎叶、根、根际区土壤3个部位浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用。结果表明：3个部位的水浸提液对西瓜枯萎病菌的生长均有一定的抑制作用，在100mg·mL-1的浓度下抑菌率分别为53%、49%、45%，经邓肯氏差异分析，3个部位间抑菌率差异不显著。随着浸提液浓度的降低，抑菌率呈现出降低的趋势。经室内毒力测定，3个部位的EC-150分别为86.26、84.65、106.88mg·mL。综合比较，茎叶浸提液的抑菌效果较强。2、采用生物活性追踪的方法，对茼蒿中的抑菌活性物质进行了分离纯化，最终得到具有很强抑菌活性的单体物质。得到的化合物以NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS的方法进行了结构鉴定，被确定为3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸。3、以西瓜枯萎病菌为指示菌株，对从茼蒿茎叶组织中分离纯化并鉴定出的3-O-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)的离体抑菌活性进行了研究。结果表明，绿原酸对西瓜枯萎病菌的MIC和MFC分别为31.25和125mg·mL-1，经室内毒力测定，其对西瓜枯萎病菌的EC-1。在绿原酸浓度分别为31.25、125、50为53.048mg·mL53.048mg·mL-1时，西瓜枯萎病菌的孢子萌发率分别为64%、33%、12%，而绿原酸浓度为0时的孢子萌发率则达到92%，经邓肯氏差异分析，各处理间孢子萌发率差异均显著。随着绿原酸浓度的增大，西瓜枯萎病菌的菌丝干、鲜重均呈现出下降的趋势，此外，绿原酸处理能使细胞膜通透性增加，从而导致菌体细胞内电解质外渗速度加快。4、以西瓜尖镰孢菌为指示菌株，研究了不同浓度的绿原酸溶液对（MIC、EC50、MFC）西瓜尖镰孢菌的作用。结果表明，在经过EC50的绿原酸溶液处理之后，西瓜尖镰孢菌的菌丝体和细胞呈现出不同程度受损情况，菌丝粗细不一，局部出现四陷，甚至干瘪，有严重的裂纹形成，菌丝生长点退化，菌丝体细胞壁增厚，原生质体收缩，出现质壁分离，有液泡化现象，部分菌丝体细胞出现空腔，细胞器解体，原生质电子密度降低；随着绿原酸浓度的升高，西瓜尖镰孢菌的琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活力都显著降低，且各处理间差异显著，表绿原酸处理可能影响了菌体的多条代谢途径，从而抑制其正常生长；此外，绿原酸处理能够使菌体内的大分子物质—蛋白质和核酸大量外渗。关键词：茼蒿；西瓜枯萎病菌；分离纯化；抑菌机制I AbstractChinaisthelargestcountryintheproductionandconsumptionofwatermelonsintheworld,andJiangxiprovinceisalsoamajorprovinceofwatermelonproduction.Watermelonplaysanimportantroleintheadjustmentofagriculturalstructureandtheincreaseoffarmers'incomeinJiangxiprovince.Inrecentyears,bothdomesticandforeignscientistsandtechnicianshavepaidgreatattentiontotheresearchonthesterilizingtechnologyofWatermelonFusariumwilt,whichissafeandnon-toxicandeconomicandenvironmental.However,noidealresultshavebeenputintoproduction.Theaimofthisstudyistoexploitthebacteriostatproducedinplantsandreplacechemicalfungicides,andtodevelopplantsourcefungicidessuitableforwatermelonwilt.Themainresultsareasfollows:1、Fusariumoxysporumf.sp.wasusedasresearchobject,andgrowthratemethodwasadoptedtostudytheallelopathyonwatermelonFusariumwiltofextractsfromdifferentpartsofChrysanthemum,inordertoprovidereferencefortheseparationandpurificationofantibacterialactivecomponentsinChrysanthemum.TheresultsshowedthatthethreeextractsofwaterextracthadcertainallelopathiceffectonthegrowthofFusariumoxysporumf.sp.,andtheinhibitionrateswere53%,49%and45%at100mg·mL-1treatment,respectively.TherewasnosignificantdifferencebetweenthethreepartsaccordingtoDuncan'svarianceanalysis.Withthedecreaseoftheconcentrationoftheextract,theinhibitionrateshowedadecreasingtrend.TheEC50ofthethreepartswas86.26,84.65and106.88mg·mL-1byindoorvirulencetest.Theresultsshowedthattheinhibitoryeffectsoftheextractofstemsandleaveswerehigher.2、TheantibacterialsubstancesinChrysanthemummorifoliumwereseparatedandpurifiedbythemethodofbiologicalactivitytracking,andthemonomersubstanceswithstrongantibacterialactivitywerefinallyobtained.TheobtainedcompoundswerestructurallyidentifiedbyNMR,13C-NMRandHR-ESI-MSmethodsandidentifiedas3-o-caffeoylquinicacid,5-o-caffeoylquinicacid,4-o-caffeoylquinicacid,3,4-dicaffeoylquinicacid,1,5-dicaffeoylquinicacid,3,5-dicaffeoylquinicacid,4,5-dicaffeoylquinicacid.3、InordertodeterminetheantibioticsonF.oxysporumf.sp.fromChrysanthemumcoronarium,westudiedthebacteriostaticactivityof3-O-caffeoylquinicacid(chlorogenicacid)whichisolatedfromthestemandleaftissuesofChrysanthemum.TheMICandMFCofFusariumoxysporumf.sp.were31.25mg·ml-1and125mg·ml-1respectively.TheEC50ofchlorogenicacidtoF.oxysporumf.sp.was53.048mg·ml-1byindoorvirulence.ThesporegerminationII ratesofwatermelonF.oxysporumf.sp.were64%,33%and12%attheconcentrationsofMIC,EC50andMFC,whilethesporegerminationratereached92%ofCK,thedifferenceofsporegerminationratebetweentreatmentswassignificantbyDuncan'sdifferenceanalysis.Withtheincreaseofpharmacyconcentration,thehyphaeandfreshweightofF.oxysporumf.sp.showedadecreasingtrend.Inaddition,thetreatmentoftheagentacceleratedtherateofinfiltrationoftheinnerelectrolyteandincreasedthecellmembranepermeability,andlayatheoreticalfoundationfortheresearchanddevelopmentofnewnaturalplantfungicides,andprovidescientificforthedevelopmentandutilizationofchrysanthemumBasis,hasimportantacademicvalueandapplicationprospects.ThisresearchcanprovidescientificbasisforfurtherdevelopmentandutilizationofChrysanthemum，andprovideafeasibleexperimentalmethodandtheoreticalbasisforthescreeningofothernaturalantibacterialactiveingredientsandthestudyofthemechanismofbacteriostasis，whichhasimportantacademicvalueandapplicationprospectforresearchanddevelopmentofnewnaturalplantsourcefungicides.4、Theinhibitorymechanismofchlorogenicacidsolution(MIC,EC50,MFC)onFusariumoxysporumwasstudiedusingWatermelonFusariumoxysporumasindicatorstrain.Theresultsshowedthatafterchlorogenicacid,EC50,WatermelonFusariumoxysporummyceliumandcellsshoweddifferentdegreesofdamage,myceliumthicknessvaries,theemergenceoflocalfourdepression,evendrysores,severecrackformation,themycelialgrowthofmyceliumdegeneration,cellwallthickening,protoplastshrinkage,plasmolysis,vacuolesphenomenon,somemyceliacellcavity,organelledisintegration,plasmaelectrondensitydecreasedwithincreasing;chlorogenicacidconcentration,theenzymeactivityofsuccinatedehydrogenaseandmalatedehydrogenaseofWatermelonFusariumoxysporumweresignificantlydecreased,andthesignificantdifferencesbetweentreatmentandtreatmenteffectshowedthatchlorogenicacidthemetabolicpathwaysofthecell,inhibitthenormalgrowth;intheconcentrationofMIC,EC50,MFC,catalaseactivitywassignificantlyreduced;inaddition,chlorogenicacidtreatmentcanmakeLargemoleculesofbacteria-proteinsandnucleicacids-arelargelyextravasation.Keywords:Chrysanthemum;Fusariumwiltofwatermelon;Separationandpurification;BacteriostaticmechanismIII 第1章文献综述1.1西瓜枯萎病综合防治研究进展西瓜(Citrulluslanatus)属葫芦科(Cucurbitaceae)一年生藤本植物，原产于非洲，在世界各地广泛栽培[1-2]。西瓜在我国农业结构调整与农民增收中发挥着重要作用，据统计，2015年我国西瓜播种面积为185.42万hm，总产量为7625.04万t[3]。随着西瓜栽培面积的不断扩大，导致重茬西瓜面积增多，西瓜枯萎病的发生日趋普遍和严重。西瓜枯萎病是由半知菌亚门真菌—西瓜尖镰孢菌侵染造成的，会造成西瓜产量下降30%～40%，重病地块减产80%以上，甚至绝产，给西瓜生产带来了巨大的经济损失和资源浪费[4-5]。西瓜枯萎病的传统防治方法主要有抗性育种、农业防治、生物防治及化学防治等。1.1.1抗性育种抗性育种是防治西瓜枯萎病的重要方法，也是最经济有效的防治措施之一。美国是最早开展西瓜枯萎病抗性育种的国家，于1902年育成第一个抗病品种“Conqueror”，之后又选育出10多种抗西瓜枯萎病品种[6]。我国西瓜枯萎病抗性育种工作起步较晚，但也育成了像“郑抗”、“京抗”系列的抗西瓜枯萎病品种[7]。近年来，我国科研工作者在分子育种方面也取得了新的突破。然而由于抗性育种所需时间长、西瓜枯萎病菌分化类型多等原因，给抗性育种带来了一定难度，导致其在生产上推广应用面积较少。1.1.2农业防治农业防治措施有嫁接技术、土壤消毒及轮作等[8]。生产上采用瓠瓜、葫芦、南瓜等抗病力强的品种作为西瓜砧木，能够显著降低西瓜枯萎病的发病率和病情指数。土壤消毒法包括物理消毒法和化学消毒法，物理消毒法主要有太阳能消毒法、蒸汽消毒法、热水消毒法和土壤循环消毒法。Martyn等在1986年报道，使西瓜连作土壤在日光下暴晒30～60d可显著降低西瓜枯萎病的发生率。蒸汽消毒法是利用高压密集的水蒸汽杀死土壤中的病原物、害虫以及杂草种子的方法。热水消毒是指将过滤的70～95℃的热水按照200～250L·m-2的量用喷孔或热水管施于土壤表面，具有绿色、环保、不使用药物的特点。土壤循环消毒是指通过对土壤进行旋转翻耕，让土壤和高温洁净干燥的空气进行混合从而达到消毒目的的方法。化学消毒指利用熏蒸剂防治土传病害，具有生物活性高、受外界环境影响小等特点[9-10]。生产上采用合理的轮作制度，比如实行水旱轮作，或者让西瓜和非葫芦科作物进行轮作，能有效地减轻西瓜枯萎病的发生。杨瑞平的研究结果表明，连作西瓜在与大蒜轮作后，产量增加了67%，枯萎病的发生率也显著降低，这可能是通过轮作，连作土壤的根际生态环境得到了改善[11]。1 1.1.3生物防治生物防治是指利用寄生性真菌、放线菌和细菌等对西瓜枯萎病菌有拮抗作用的有益微生物的作用，降低尖镰孢菌繁殖体在土壤中的存活能力，从而降低西瓜枯萎病发病率的方法。王小慧等通过筛选出对西瓜枯萎病菌有拮抗作用的细菌菌株，用其和已腐熟的有机肥制成生物有机肥BIO5，对西瓜枯萎病的防治率达到了75%[12]。张丽萍等的研究表明，由T42木霉和枯草芽孢杆菌Bs-6组成的生物制剂能显著促进西瓜的生长并提高其产量[13]。李欢等的研究表明，在被接种放线菌制剂以后，西瓜植株枯萎病的发生率显著降低，接种效果最好的时期为育苗期[4]。1.1.4化学防治化学防治也被叫做药剂防治，是指利用化学农药对病虫害进行防治的方法，具有见效快、操作简单等优点，但其对环境危害大、易使病虫产生抗性，且对人畜不安全。生产上常用来防治西瓜枯萎病的化学药剂有菌毒清、甲霜灵锰锌、KT乳剂、40%瓜枯宁以及恶霉灵等，施用方法主要有土壤熏蒸、消毒、喷雾、灌根和种子处理等。王汉荣等通过研究发现，25%咪鲜胺乳油、70%恶霉灵可湿性粉剂、50%多霉威可湿性粉剂和50%异菌脲可湿性粉剂等药剂对西瓜枯萎病的防治均有一定的效果[15]。1.2茼蒿化学成分及生物活性研究进展茼蒿(ChrysanthemumcoronariumL.)是菊科(Compositae)茼蒿属(Chrysanthemum)的一种草本植物，具有药食两用功效[16-17]。近年来，有关茼蒿中活性物质的研究报道很多，茼蒿中主要含有酚酸、黄酮、倍半萜内酯、二萜、单萜烯、甘油二酯糖苷、植物甾醇、生物碱以及挥发油等多种类型化合物，其中，黄酮和酚酸是茼蒿中的主要活性物质。茼蒿中的多种活性成分都具有药用价值，并在植物的化感效应、抗氧化、抗菌、抗肿瘤、清除自由基、昆虫拒食等方面有显著效果，同时也具有清痰、养胃、利肠和护肝等功效[18]。茼蒿中不同活性成分的作用不同，其中，对植物起化感作用和抗氧化作用的主要物质为黄酮、酚酸类，产生抗菌与昆虫拒食效应的是聚乙炔类化合物和挥发油，具有抗肿瘤和抑菌活性的是倍半萜内酯等萜类化合物。1.2.1抑菌活性成分1.2.1.1黄酮类黄酮是茼蒿的重要活性成分，茼蒿中黄酮类成分的主要提取方法有微波辅助法、回流法以及超声波辅助法，茼蒿中的黄酮含量受提取方法的影响较大。王丽芳等优化了茼蒿中黄酮的回流提取工艺，结果发现对黄酮得率影响较大的是提取温度和乙醇浓度，并得出在提取温度95℃，乙醇浓度55%，固液比1:8，萃取时间2h，固液比1:8的条件下黄酮得率最高的结论[19]。张金凤等采用响应2 面法优化了茼蒿中黄酮的超声波辅助提取工艺，得出的最佳提取工艺为乙醇体积分数63%、料液比1:31、提取温度53℃、提取时间60min；此后，他们又优化了茼蒿中黄酮的微波辅助提取工艺，得出在乙醇体积分数60%、提取时间2min、中低档微波功率的条件下提取效果最好[20-21]。Tom等在1960年在茼蒿的花序中发现了槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、quercetagetin以及山奈酚糖苷[22]；Lamyaa等在2007年从茼蒿的地上部位中分离鉴定出了九个黄酮类成分，分别是槲皮苷、槲皮素、山奈酚、木犀草素、阿福豆苷、芹菜素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、柚皮素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷[23]。1.2.1.2酚酸类酚酸也是茼蒿中的重要活性成分。Mahahiro等在1984年从茼蒿中发现了对羟基苯甲酸甲酯和异阿魏酸，除此之外阿魏酸甲酯也存在于茼蒿之中[24-25]；Chuda等发现茼蒿中的绿原酸、3,5-二咖啡酰，4-琥珀酰奎宁酸和异绿原酸具有抗氧化功能[26-27]。1.2.1.3萜类化合物茼蒿中的萜类化合物主要包括三种，分别为二萜、倍半萜内酯和单萜烯，目前已经在茼蒿中分离鉴定出了十多种萜类。茼蒿中的倍半萜内酯主要有桉烷内酯型、愈创木内脂型、Dihydrochrysanolide型和除虫菊内酯型四种[28]。Sawsan等和Sanz等在1984年从茼蒿花序中发现了DihydrocumambrinA，Zuurbergenin和CumambrinA三个愈创木内脂型倍半萜内酯[29-30]；Kyung等又在2003年分离出了CumambrinA，DihydrocumambrinA，8α-angeloyloxy-10α-hydroxy-slov-3-en-6，12-olide和TigloylcumambrinB以及Pyrethrosin，Tulirinol和1，10-epipyrethrosin[31]。Kyung等在2001年从茼蒿花序中分离出了Reynosin和Douglanine两个桉烷内酯型倍半萜内酯[32]；Kyung等则在2002年分离出了1-epiDihydrochrysanolide，1α-Hydroxy-desoxotamirin和Dihydrochrysanolide[33]；Song等从茼蒿中分离鉴定出了8-hydroxylinalol8-O-β-Dglucopyranoside这个单萜烯成分[34]；Consolacion等早于1998年就分离鉴定出了16β-diol和kaurane-3β这两个具有抗菌活性的二萜成分[35]。1.2.1.4甘油二酯糖苷甘油二酯糖苷是一类具有很好抗炎活性的化合物。Song等在2009年从茼蒿的地上部位中分离鉴定出了1,2-二亚麻酰-3-半乳糖糖甘油酯和1-棕榈酰-2-亚麻酰-3-葡萄糖甘油酯这两个甘油二酯糖苷类物质[36]。1.2.1.5生物碱生物碱是一类有广泛生理活性的含氮碱性有机化合物。张冬冬等的研究表明，甾体类、喹啉类、吲哚类都是广泛存在于茼蒿中的生物碱；其中的喹啉生物碱具有抗癌、抗白细胞减少以及抗心动过速等多种活性；而吲哚类生物碱则具有发汗、催吐、祛痰的作用，甾体类生物碱更具有降压、强心等疗效[37]。Song等在2008年从茼蒿中分离鉴定出了Prunasin，Pterolactam，Sambunigrin和腺苷酸四个生物碱成分，这是一类具有很好降胆固醇作用的生物碱类化合物。3 1.2.1.6植物甾醇植物甾醇具有抗肿瘤以及减少心血管疾病风险的生物活性。Choi等的研究发现，菜油甾醇是存在于茼蒿地上部位的一种植物兹醇，而且具有抗血管生成的作用[38]；除此之外，β-谷甾醇、豆甾醇、胡萝卜苷、Stigmast-4-en-6α-ol-3-one以及Stigmast-4-en-6β-o1-3-one也是存在于茼蒿中的植物甾醇[39-40]。1.2.1.7杂环化合物杂环化合物是指在其分子结构中具有杂环的有机化合物。日本学者Mahahiro等从茼蒿中分离鉴定出的杂环化合物Chrycorin和Chrycolide有抑制植物生长的作用；Song等在2008年从茼蒿地上部位分离鉴定出了5,5'-Dibuthoxy-2,2'-bifuran这种新的杂环化合物。1.2.1.8聚乙炔类化合物Ferdinand等在1979年最先从茼蒿中发现了新的含硫乙炔类化合物[41]；Mahahiro等则在1984年分离出了trans-spivoenolether和cis-spiroenolether这两种聚乙炔类化合物；Sanz等则又在后来分离得到了类似于Spiroacetals的11个乙炔类化合物。1.2.1.9挥发油类化合物挥发油又被叫做精油，是大量存在于中的一类挥发性油状成分。李阳等通过对茼蒿中挥发性成分的提取和分析，发现茼蒿中的挥发性成分多达46种[42]。其中烯烃类和萜类的含量较高。陈宇等研究了茼蒿中挥发油的主要成分，发现二丁基羟基甲苯、2-乙氧基-3-氯代丁烷、正十八烷二苯胺、四十烷、溴二十二烷、正二十烷、3,7-二甲基-1-辛醇、1-氯十四烷、3-甲基十七烷、正十五烷的含量比较高[43]。1.2.2生物活性研究1.2.2.1镇咳祛痰据中国古代医学典籍记载，茼蒿有“消痰饮、利肠胃”的功能，且对咳嗽、痰多等症状有较好疗效。据记载，经常饮用用茼蒿煮的茶水，咳嗽痰多的症状能够明显缓解。而且现代的动物实验研究也表明，茼蒿提取液能够延长氨水诱导的小鼠咳嗽潜伏期，从而减少小鼠的咳嗽次数[44]。1.2.2.2植物化感作用茼蒿中含有对多种植物起化感作用的物质。课题组前期的研究表明，茼蒿的水浸提液能够抑制西瓜种子的萌发，而且能够提高西瓜幼苗的多种抗氧化酶活性[45-46]。通过HPLC-MS测定发现茼蒿水提物中的主要化感物质为绿原酸，杨梅素-3-O-半乳糖苷，二咖啡酰奎宁酸，木犀草素，芦丁，麦黄酮以及木犀草素-7-O-葡萄糖苷等[47]。1.2.2.3杀线虫茼蒿的水提取物和甲醇提取物都对南方根结线虫有不同的杀虫活性，其中4 小白菊内酯和金丝桃甙是两个具有杀虫活性的活性物质[48-49]。Meira等的研究发现茎叶水提物的杀菌活性较花强[50]。1.2.2.4抗肿瘤茼蒿提取物对肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用，其中的小白菊内酯可以抑制肿瘤细胞增殖[51-52]。活性成分愈创木内脂型倍半萜内酯-TigloylcumambrinB以及CumambrinA，除虫菊内酯型倍半萜-Tulirinol、Pyrethrosin以及1,10-epi-pyrethrosin对肺肿瘤细胞系和结肠肿瘤细胞系都有抑制作用，菜油兹醇具有抑制人脐静脉内皮细胞增殖的作用。1.2.2.5抗氧化和清除自由基茼蒿中的总黄酮具有清除羟基自由基的活性，甲醇提取物具有清除NO自由基和超氧化物歧化酶的活性，在清除NO自由基方面，氯仿萃取物的活性较强，而氯仿萃取物中具有活性的单体物质为胡萝卜苷[53]。1.2.2.6昆虫拒食茼蒿精油对小菜粉蝶幼虫有拒食活住，聚乙炔类化合物trans-spivoenolether和cis-spiroenolether对家蚕有拒食作用[54]。茼蒿精油中的主要活性成分有芳樟醇，苯酚，丁香酚，对-甲苯酚。1.2.2.7护肝和抗菌等活性茼蒿中的新杂环化合物具有抑制胆固醇酰基转移酶活性的作用，阿魏酸甲酯具有抑制低密度脂蛋白氧化的作用。茼蒿中的二萜成分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和须毛癣菌等多种微生物有抑制作用[55]。茼蒿花序精油中的主要活性成分有α-蒎烯、β-蒎烯以及莰酮[56]。除此之外，多种倍半萜内酯都有抗微生物的活性。而据Karim等的分析，茼蒿花序精油中的主要活性成分为trans-chrysanthenylacetate、cis-chrysanthenylacetate、大根香叶烯-D、(E)-β-金合欢烯以及莰酮。导致这些活性成分差异的原因可能是产地、部位、时期。1.3植物源抑菌剂抑菌机理研究方法进展植物源活性成分作为抑菌剂使用，具有天然安全的优点，在食品保鲜以及化妆品领域被广泛使用。植物源抑菌剂可以通过抑制病原微生物的生长从而延长产品保质期，它不仅来源广泛，而且可以清除自由基。除此之外，植物源杀菌剂对人体没有刺激、安全性好，开发潜能巨大。植物源抑菌剂可以通过改变细胞壁和细胞膜的通透性、病原微生物形态、遗传物质的正常传递以及物质和能量的正常代谢而发挥作用[57]。1.3.1显微镜观察微生物的形态结构电子显微镜具有展现微生物形态的功能，从而可以确定植物源抑菌剂对病原微生物的作用位点。通常我们使用的电镜主要有扫描电镜以及透射电镜，近年来随着科技的进步，激光共聚焦显微镜和原子力显微镜也出现在大众的视野[58-60]。其中扫描电镜能观察到微生物细胞的表面形态，透射电镜则可对细胞质、5 细胞膜等内部结构进行分析，而原子力显微镜具有纳米级分辨率，激光共聚焦显微镜不仅可以测量细胞的形态，而且可以长时间对活细胞进行动态观察。Booyens等利用电镜技术观察了了双歧杆菌在经过大蒜提取物处理之后的形态变化，结果发现大蒜菌体出现了伸长、扭曲，甚至球形的现象；除此之外，大蒜菌体的细胞质出现了固缩，细胞膜完整性也遭到了破坏[61]。Yoonkyung等通过激光共聚焦显微镜研究发现某种抗菌肽的作用位点在微生物质膜上[62]。原子力显微镜不仅可以观察到微生物的三维图像，而且其样品可以在大气环境中测试；而扫描电镜和透射电镜不仅需要高真空的工作环境，而且只能观察到样品的二维图像。激光共聚焦显微镜除了观察微生物的形态，还可以定量分析细胞内的生化成分、测量细胞的形态以及进行细胞的光密度统计。1.3.2研究抑菌剂对细胞壁作用的方法1.3.2.1细胞壁的成分分析细胞壁在微生物的生命活动中起着维持细胞形态、阻挡有害物质、保持菌体物质交换正常进行的作用，其主要由肽聚糖、脂质、磷壁酸、以及脂质组成，植物源抑菌剂可以通过破坏细胞壁的成分对菌体产生抑制作用。脂多糖是组成革兰氏阴性菌细胞壁的重要成分，在阻止疏水性抗生素和胆碱进入细胞方面发挥着重要作用，可以对处在不利环境中的细胞起保护作用[63]。研究发现酚类物质和花青素会使脂多糖遭到破坏，从而影响细胞壁的渗透功能。也有研究表明萜烯类和酚类化合物会通过对细胞壁产生作用而增大其通透性。单宁的存在会使细胞壁脂质层中的两类脂肪酸比例发生显著改变，进而导致细胞的代谢失去平衡、最终凋亡[64]。1.3.2.2碱性磷酸酶的变化碱性磷酸酶在细胞壁和细胞膜之间广泛存在，一般情况下，细胞外没有碱性磷酸酶的活性，然而当细胞壁被破坏时，碱性磷酸酶会被细胞壁泄露到胞外，因此细胞的完整性可以通过测定细胞培养液中碱性磷酸酶的含量来判断。刘梦茵等通过测定芽孢杆菌经乌梅提取物处理之后胞外碱性磷酸酶含量的变化，揭示了乌梅提取物对芽孢杆菌的破坏机制[65]。1.3.3研究抑菌剂对细胞膜作用的方法细胞膜不仅起着维持细胞完整性的功能，而且是物质代谢和能量代谢的重要场所；有研究表明，在经过植物源防腐剂处理之后，微生物细胞膜体系的选择透过性遭到了破坏，导致依赖于此的能量代谢和物质交换无法正常进行，从而抑制了微生物的正常生长[66]。Yyalusamy等利用圆二色性、差示扫描量热以及核磁共振技术研究了2类抗菌肽（蜂毒素和蟾毒素）对微生物细胞膜的作用机制[67]；Ahmad等通过傅里叶远红外光谱及差示扫描量热技术的运用，发现生物膜脂质混合物在抗菌肽的诱导下出现了分层现象[68]。李小芳等通过循环伏安和差热—热重法的运用，对壳聚糖作用下细胞间的作用进行了模拟，结果发现6 壳聚糖中的质子化-NH3+会与细胞膜中的P=O发生静电作用，在这种静电作用下，细胞膜的结构和功能遭到了破坏，进而破坏其完整性和渗透性[69]。1.3.4研究抑菌剂对微生物呼吸代谢影响的方法呼吸作用在微生物的正常生命活动中必不可少，它可以为微生物的生命活动提供重要的能量、碳架以及还原力支持，一旦微生物的呼吸代谢遭到破坏，其正常生命活动就无法进行。研究菌体呼吸代谢的方法主要有氧电极法、关键酶活测试和呼吸代谢抑制试验等。1.3.4.1呼吸代谢抑制试验呼吸代谢抑制试验的采用，可以判断出供试物质对哪一个具体呼吸代谢途径产生效果，供试物质通过与典型抑制剂的叠加，可以反映出两者之间的增效作用，叠加率越大，则增效作用就越强，说明两者抑制的代谢途径可能相同。生物体内主要有三羧酸循环、糖酵解和磷酸戊糖途径这三种能量代谢途径，而丙二酸、碘乙酸和磷酸钠分别是三羧酸循环、糖酵解和磷酸戊糖途径的典型抑制剂。董周勇等利用呼吸代谢抑制试验研究了石榴皮提取物对金黄色葡萄球菌的作用机制，试验结果表明石榴皮与磷酸钠的叠加率比较大，说明石榴皮提取物可能通过抑制金黄色葡萄球菌的磷酸戊糖途径途径从而影响菌体的正常呼吸作用[70]。1.3.4.2Clark氧电极法Clark氧电极是一种常用来测定水中溶解氧的极谱电极[71]。氧电极不仅反应速度非常快、灵敏度比较高，而且具有可持续测量的功能，除此之外还能够捕捉反应的动态变化过程，因此氧电极在植物光合作用以及菌体呼吸作用的测定上发挥着重要作用，通过对菌体呼吸代谢过程中氧气消耗量和变化速率的实时监测，可以清楚阐明菌体的呼吸代谢过程。李雪琦等采用Clark氧电极以及Chlorolab-2型液相氧电极等技术，对中草药制剂下腐朽菌的呼吸代谢情况进行了测定，通过其呼吸速率的前后变化阐明了中草药制剂对木材腐朽菌的作用机制[72]。1.3.4.3测定呼吸和能量代谢关键酶的活性呼吸代谢是指由多数酶、辅酶以及其他一些有机、无机因素参与的一系列的酶反应过程，因此可以通过测定呼吸代谢过程中的关键酶活而了解抑菌剂的作用机制，例如苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、Na+，K+-ATP酶、三磷酸腺苷酶以及细胞色素氧化酶[73]。Fan等测定了没食子酸中酯作用后青枯病菌的多种酶活，结果发现在没食子酸中酯作用2h后菌体的琥珀酸脱氢酶活性显著降低，而Na+，K+-ATP酶的活性却出现增加的现象；Na+、K+-ATP酶可以保证Na+、K+在膜内外的正常穿梭，说明在受到没食子酸的作用后，菌体产生了应激反应从而抵御不良环境的影响。7 1.3.5研究抑菌剂对遗传物质影响的方法植物源抑菌剂会通过对菌体的功能蛋白及遗传物质产生影响而发挥抑菌效果，其会使菌体的蛋白质出现凝固、变形等现象，除此之外还会影响某些关键酶的含量。研究发现，鹿蹄草素会对金黄色葡萄球菌菌内转肽酶femB基因的转录、翻译过程产生影响，从而使肽聚糖的合成过程受到阻碍，进而使菌体细胞的细胞壁不能正常合成[74]。植物源抑菌剂和DNA之间的相互作用方式主要包括扦插作用、静电结合以及沟槽结合。而研究植物源抑菌剂与DNA相互作用的方法主要有光谱学分析法以及电化学方法等[75-77]。1.3.5.1光谱学分析法光谱学分析法主要有荧光光谱法、紫外吸收光谱法、红外光谱法、圆二色谱法以及激光拉曼法等。抑菌物质在与DNA相互作用后会使整个体系的光学系数发生改变，光谱学分析法就是依据这个原理来推测抑菌物质和DNA之间的相互作用方式。欧植择等利用荧光光谱、紫外—可见吸收光谱和圆二色谱等技术研究了色胺修饰竹红菌素和小牛胸腺DNA之间的作用方式，结果发现色胺基团采用外部堆积的方式与小牛胸腺DNA相结合，但竹红菌素基团却是通过非特异性的方式与糖—磷酸骨架或是碱基相结合[78]。1.3.5.2电化学方法电化学方法通常包括点位分析、电导分析、极谱分析、库伦分析以及伏安法等，它的原理是依据电能和化学能相互作用时或者电能和化学能相互转化中产生的规律来获取某些相互作用的信息。在小分子与核酸相互作用时，电化学方法通常会受到分子活性的影响，但是对于那些不能利用光谱方法来研究的分子，例如吸收光谱很微弱或者那些在与DNA作用前后光谱没有显著变化的分子，伏安法却可以发挥作用；而且，生物无机化学的研究中循环伏安法采用比较广泛，当供试物质和核酸分子之间产生键合效果时，循环伏安的图像会发生显著变化。Lin等通过循环伏安法研究发现，大肠杆菌的DNA分子会在铜聚合物的作用下发生强裂解的现象，从而解释了两者之间的作用机制[79]。1.3.5.3核磁共振分析法核磁共振分析法具有定量确定抑菌物质和DNA分子之间结合位点化学变化的特点，而且在长距离弛豫效应的应用中更为精准[80]。席小莉通过二维核磁共振法的使用，发现了钴配合物与DNA的结合方式[81]；Zhou等通过核磁共振分析法研究发现寡聚核苷酸和抗癌药物之间以嵌插方式相互作用[82]。随着软电离技术的进一步应用，质谱法在分析小分子和DNA的相互作用中发挥着越来越重要的作用，而且软电离技术可以灵敏快速获得小分子物质与DNA相互作用的结合位点数、结合区域、非共价键的结合方式、亲和力等信息[83]。1.3.5.4计算机模拟技术利用分子图形软件以及分子模拟技术，能够清楚的观察到抑菌物质DNA在分子级别上的相互作用。李涛等通过Hyperchem软件的应用，模拟了药物与8 DNA在理想状态下的相互作用[84]；Erika等通过建立分子模型和MM-GBSA方法的使用研究了BuforinII与DNA的结合方式[85]。1.4课题介绍1.4.1课题来源本课题得到以下项目的资助：国家自然科学基金项目——茼蒿抑制西瓜枯萎病菌的物质基础及机理研究，项目编号为31360487；江西省自然科学基金项目：茼蒿抑制西瓜枯萎病菌的物质基础及机理研究，项目编号为20132BAB204016。1.4.2课题的提出及研究意义课题组前期开展了茼蒿浸提液对西瓜化感作用的研究，结果发现不同浓度的茼蒿水浸提液对西瓜种子发芽均有影响，且茼蒿不同器官的水浸提液对西瓜幼苗生长均有促进作用。随后课题组又开展了不同浓度的茼蒿水浸提液对西瓜尖镰孢菌抑制效果的研究，发现茼蒿水浸提液对西瓜尖镰孢菌有较好的离体抑制作用。本项目拟以西瓜尖镰孢菌为生物活性导向分离指示菌株，采用硅胶、葡聚糖凝胶、制备色谱等现代分离技术，从茼蒿茎叶组织中分离纯化出抑菌活性物质，并对其进行结构鉴定；通过电镜观察、生化试验等方法，从细胞生物学和生物化学的角度，对抑菌活性物质作用后的西瓜尖镰孢菌超微结构、细胞膜透性、物质代谢等进行系统研究，探索其抑菌机理。此研究可以为其他天然抑菌活性成分的筛选及抑菌机理研究提供可行的实验方法和理论依据，为研究和开发新的天然植物源杀菌剂奠定理论基础，为茼蒿的深度开发和利用提供科学依据，具有重要的学术价值和应用前景。项目的开展和完成对于农业生产使用天然植物源杀菌剂进行安全控制具有深远影响。1.4.3主要研究内容（1）以西瓜尖镰孢菌为指示菌株，从茼蒿茎叶中分离纯化出了单体抑菌活性物质，并对其结构进行了鉴定。对活性成分的抑菌效果进行了验证。（2）通过电镜观察的方法了解了功效成分在细胞内的作用靶点，再通过生物化学的方法探索了其抑菌机制。从细胞生物学和生物化学的角度，对抑菌活性物质作用后的西瓜尖镰孢菌菌丝及孢子超微形态、细胞膜透性、物质代谢进行了系统研究，探索了其抑菌机理。9 1.4.4技术路线图1.1本文技术路线Fig1.1Technicalrouteofthearticle10 第2章茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用研究2.1前言西瓜枯萎病是由半知菌亚门真菌—西瓜尖镰孢菌侵染所致的一种土传性病害，会造成西瓜产量下降30%～40%，重病地块达80%以上，甚至绝产。据统计，2015年我国西瓜栽培面积为185.42万hm，总产量达7625.04万t，西瓜在我国农业调整与农民增收中发挥着重要作用[86]。然而连年来随着西瓜栽培面积的不断扩大，西瓜枯萎病的发生日趋严重，给西瓜生产造成了巨大的经济损失和资源浪费。因此，如何科学有效的防治西瓜枯萎病的发生，越来越受到西瓜生产者和科研工作者的重视。茼蒿是我国传统的菊科绿叶类蔬菜，在南北各地均有栽培。课题组前期研究发现，在前茬种植茼蒿，后茬再种西瓜的西瓜连作地块，西瓜长势良好，没有发生枯萎病。经查阅文献发现，菊科植物万寿菊根提取物对西瓜枯萎病菌有显著的抑制作用[87]，为此课题组推测菊科植物茼蒿中可能也含有可以抑制西瓜枯萎病菌的活性物质。该研究以西瓜枯萎病菌为指示菌株，研究了茼蒿茎叶、根及根际区土壤3个部位的水浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用，以期为茼蒿中抑菌活性物质的分离纯化提供参考依据。2.2材料与方法2.2.1试验材料采用种植于江西农业大学蔬菜基地的大叶茼蒿，江西农业大学生物科学与工程学院生物工程教研室提供的尖孢镰刀菌—西瓜专化型，PDA培养基。2.2.2试验方法2.2.2.1茼蒿不同部位浸提液的制备茼蒿于2016年9月在江西农业大学蔬菜基地播种，12月进行收获。将待收货的茼蒿连根拔起，然后用剪刀将其茎叶和根剪断分开放置。随机选取20处茼蒿穴内土壤（每处50g）混合均匀。将洗净的茼蒿根系、茎叶、根际区土壤自然风干。用中药材粉碎机对风干的茎叶和根进行粉碎，将粉碎的茼蒿茎叶、根与茼蒿根际区土壤分别过40目筛。准确称取10g茼蒿茎叶、根以及根际区土壤按1:10的比例与无菌水混合，之后用超声波辅助提取2h。将静置后的提取液抽滤定容至100mL。将试验母液稀释至50.00、25.00、12.50、6.25mg·mL-1，4℃冰箱保存备用。2.2.2.2菌种活化将保存于斜面培养基的西瓜枯萎病菌菌种转接于PDA培养基上，放置于28℃的恒温培养箱培养4d，4℃冰箱保存备用。11 2.2.2.3体外抑菌试验在无菌条件下，将不同浓度的绿原酸溶液以1:9的比例与炼熔态的灭菌培养基混合制成含药平板。用直径8mm的打孔器打取活化好的菌块边缘，用接种环将其接种到含药培养基中央，用封口膜封好培养基并将其放置于28℃的恒温培养箱中培养。以培养基中加入和浸提液相同量的无菌水为阴性对照(CK1)，以不做任何处理为空白对照(CK2)。48h后，用十字交叉法测量菌落直径，计算相对抑制率。相对抑制率(%)=(对照菌丝生长直径-处理菌丝生长直径)/(对照菌丝生长直径-菌饼直径)×100。2.3数据分析采用SPSS20.0对试验数据进行邓肯氏(Duncan)多重差异分析，ANOVA检测(P=0.05)。采用Excel2007进行数据处理及图形制作。2.4结果与分析2.4.1茼蒿茎叶浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用不同浓度的茼蒿茎叶水浸提液对西瓜枯萎病菌菌落生长的影响不同。由表2.1可知，浓度为6.25～100.00mg·mL-1的茼蒿茎叶水浸提液下的菌落直径均比空白对照CK2的菌落直径小，且差异显著，说明茼蒿茎叶浸提液对西瓜枯萎病菌的菌落生长有一定的抑制作用。随着浓度的增大，其对西瓜枯萎病菌菌落生长的抑制作用增强。25.00、50.00、100.00mg·mL-1的浓度处理与CK1、CK2间差异显著，与6.25、12.50mg·mL-1的浓度处理间差异也显著。CK1的菌落直径小于CK2的菌落直径，说明培养基加入水后会对西瓜枯萎病菌的生长产生影响，这可能是因为加入水后培养基单位面积上的营养成分降低所致。表2.1茎叶水浸提液对西瓜枯萎病菌菌落生长的影响Table2.1EffectofwaterextractofstemandleafonthegrowthofFusariumoxysporumf.sp浓度/(mg·mL-1)部位100.0050.0025.0012.506.25CK1CK2茎2.05±0.21c2.33±0.20c2.45±0.41c2.50±0.84b2.52±0.26b3.43±0.16a3.47±0.13a叶注：不同小写字母表示各处理在a=0.05水平差异显著。下同。Note:Differentlowercaselettersindicatessignificantdifferenceat0.05level.Thesamebelow.不同浓度的茼蒿茎叶浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用也不同。由图2.1可知，100.00mg·mL-1浓度的茼蒿浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用最强，且与其它处理间差异均显著，其抑制率为53%，而6.25mg·mL-1下的抑制率仅为36%。12 12.5～50.0mg·mL-13个浓度间的抑制率无明显差异，但与6.25mg·mL-1的处理间差异显著。图2.1茎叶水浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用Fig2.1InhibitoryeffectofwaterextractfromstemandleafonFusariumoxysporumf.sp2.4.2茼蒿根浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用由表2.2可知，不同浓度的茼蒿根水浸提液对西瓜枯萎病菌菌落生长的影响也不同，浸提液浓度越高，对菌落生长的抑制效果越明显。25.00～-1的浓度处理下的菌落直径与空白对照间(CK100.00mg·mL2)差异显著，而这三个浓度间对西瓜枯萎病菌菌落生长的作用效果无明显差异。6.25、12.50mg·mL-1的处理菌落下的菌落直径与空白对照间(CK2)无显著差异。表2.2根水浸提液对西瓜枯萎病菌菌落生长的影响Table2.2EffectsofrootwaterextractonthegrowthofFusariumoxysporumf.sp浓度/(mg·mL-1)部位100.0050.0025.0012.506.25CK1CK2根2.16±0.36b2.26±0.45b2.47±0.48b3.17±0.16a3.43±0.15a3.43±0.16a3.47±0.13a不同浓度的茼蒿根部浸提液均对西瓜枯萎病菌的生长表现出化感抑制作用，随着浓度的降低，抑菌率逐渐下降。由图2.2可知，25.00、50、100.00mg·mL-1的处理浓度对西瓜枯萎病菌的抑制作用较强，抑菌率分别为49%、44%、37%，与6.25、12.50mg·mL-1的处理间差异显著，但三者间抑菌率差异不显著。6.25、12.50mg·mL-1的处理浓度对西瓜枯萎病菌的抑菌率较低，6.25mg·mL-1浓度下的抑菌率仅为1%。13 图2.2根水浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用Fig2.2InhibitoryeffectofrootwaterextractonFusariumoxysporumf.sp2.4.3茼蒿根际区土壤浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用西瓜枯萎病菌在含有不同浓度的茼蒿根际区土壤浸提液的培养基上长势较对照减弱，说明土壤浸提液对西瓜枯萎病菌表现出化感抑制作用。由表2.3可知，12.50、25.00、50.00、100.00mg·mL-1的处理浓度下的菌落直径与空白对照间有差异显著，而6.25mg·mL-1的处理浓度下的菌落直径与对照间没有显著差异。表2.3根际区土壤水浸提液对西瓜枯萎病菌菌落生长的影响Table2.3EffectofrhizospheresoilwaterextractongrowthofFusariumoxysporumf.sp浓度/(mg·mL-1)部位100.0050.0025.0012.506.25CK1CK2根际区2.27±0.14c2.37±0.22c2.41±0.16c2.77±0.20b2.87±0.23a3.43±0.16a3.47±0.13a土壤茼蒿根际区土壤浸提液对西瓜枯萎病菌表现出的化感抑制作用，由图2.3可知，25.00、50.00、100.00mg·mL-1的处理浓度抑制作用较强，抑菌率分别为45%、41%、40%，且与6.25、12.50mg·mL-1处理浓度间差异显著，但三者间抑菌率没有显著差异。6.25、12.50mg·mL-1的处理浓度对西瓜枯萎病菌的抑制作用较弱，且二者间没有显著差异。14 图2.3根际区土壤水浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用Fig2.3InhibitoryeffectsofsoilwaterextractsfromrhizospheresoilonFusariumoxysporumf.sp2.4.4茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用强度比较茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌均表现出一定的化感抑制作用。在100mg·mL-1的浓度下，茎叶浸提液的抑制作用最强，抑菌率为53%，在50mg·mL-1的处理浓度下，根浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用较强，而在25mg·mL-1的处理浓度下，根际区土壤的抑菌率则较高。随着浓度的降低，茎叶的抑制效果较其他两个部位强。综合比较，茼蒿茎叶水浸提液对西瓜枯萎病菌的化感抑制作用较好。表2.4不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用强度比较Table2.4ComparisonofallelopathiceffectsofextractsfromdifferentpartsonFusariumoxysporumf.sp浓度/(mg·mL-1)部位100.0050.0025.0012.506.25茎叶52.81±3.86a42.78±3.05a38.39±5.67a36.14±1.72a35.51±4.32a根49.25±5.24a44.28±7.66a37.12±8.02a11.14±2.68c1.28±3.67c根际区土壤44.92±2.17a41.38±2.62a39.70±2.01a26.07±3.70b22.35±3.89b2.4.5茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定利用SPSS20.0进行Probit回归分析，求得毒力回归方程(Y)，相关系数(r)及EC50（EC50即能引起50%最大效应的浓度）。由表2.5可知，茼蒿茎叶、根、根际区土壤3个部位对西瓜枯萎病菌的的EC50分别为86.256、84.648、15 106.876mg·mL-1。表2.5不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定Table2.5IndoortoxicitymeasurementofextractsfromdifferentpartsonFusariumoxysporumf.sp部位毒力回归方程/Y相关系数/rEC-1)置信区间50/(mg·mL茎叶Y=-0.412+0.005x0.99986.25659.258~194.451根Y=-1.145+0.014x0.74684.648-根际区土壤Y=-0.620+0.006x0.815106.876-2.5结论与讨论廖静静等通过测定大蒜各部位挥发物和浸提液对辣椒疫霉菌的抑菌活性，发现蒜瓣的抑菌活性最强，并用GC-MS分析了大蒜浸提液中的抑菌活性成分，结果发现大蒜3种组织浸提液中均含有多种含硫化合物[88]。于建光等发现，小麦秸秆浸提液和腐解液均对水稻有化感效应，且不同部位的化感作用不同[89]。这与本试验的结果相似。蓝蔚青等的研究表明，长裙竹荪水浸提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌4中食源性病原菌均存在体外抑制效果[90]。贾俊英等研究了西芹种子的水浸提液、乙醇浸提液及丙酮浸提液对黄瓜枯萎病菌的化感作用，其中丙酮浸提液对供试菌种的抑制作用较强[91]。杨玉锋等的试验结果表明，西芹根水浸提液在较高浓度下对西瓜枯萎病菌的生长有化感抑制作用，而在较低浓度下则表现对其有化感促进作用[92]。董红云等的研究结果显示，野茼蒿和牛膝菊水浸提液对小麦和玉米均表现出化感抑制作用[93]。本试验也显示浸提液的化感作用表现出一定的浓度效应。本试验结果表明，茼蒿茎叶浸提液对西瓜枯萎病菌表现出了较强的离体抑制效果，为下一步茼蒿中抑菌活性物质的分离纯化提供了理论依据。后期可以把西瓜尖镰孢菌作为生物活性导向分离指示菌株，利用硅胶柱层析、SephadexLH-20、葡聚糖凝胶柱层析、制备色谱等现代分离技术，采用抑菌活性追踪的方法，从茼蒿茎叶中分离纯化出具体的抑菌活性物质。此研究可以为植物源杀菌剂的研究和开发提供理论基础，为茼蒿的深度开发和利用提供科学依据，具有重要的学术价值和应用前景。16 第3章茼蒿中抑菌活性物质的分离纯化与结构鉴定3.1前言随着光谱和色谱技术的应用，活性物质的定性、定量分析变得越来越简便，而提取方法对活性物质的最终获取起着至关重要的作用。影响提取效果的最常见因素有选取的植物部位、溶剂、温度、压力和时间等。传统的提取方法主要包括蒸汽蒸馏法，水蒸馏法，同时蒸馏—萃取法，溶剂萃取法，油脂吸收法，压榨法。虽然传统的提取方法应用已经比较成熟，但存在的问题也比较多，随着生物化学、物理化学等交叉学科的不断形成与发展，极大地促进了提取技术的进步，产生了许多新式的提取方法，例如微波辅助萃取，超声辅助萃取法，超临界流体萃取，亚临界水萃取，固相微萃取法等。和传统的提取技术相比较，新式提取方法不仅更具针对性，而且提取效率比较高、不易使活性物质遭到破坏、能够极大地减少有机溶剂的使用、对环境污染小，但是也存在自己的局限性，比如其对仪器设备的要求比较高，对操作人员的技术要求也比较高，从而导致高成本，最终难以规模化生产的问题。植物中活性物质的分离方法通常包括：分馏法、冷冻析晶法、层析分离法、化学分离法等。在实际的操作中，判断特定化合物的结构并不需要把一个化合物的波普数据全部测定完，对于已知的植物活性物质，在其结构类型被初步判断的基础上，再结合文献参考，通过与标准品进行对照比较，即可做出判断[94-96]。3.2材料与方法3.2.1试验材料同2.2.1。3.2.2试验方法称取20kg自然风干后的茼蒿茎叶于50℃鼓风干燥机中进行干燥，干燥时间为12h；称取2.0kg干燥后的茼蒿茎叶在中药粉碎机中进行粉碎，然后过40目筛；加入50L95%的乙醇超声辅助提取3次，每次2h，之后合并滤液减压浓缩至膏状；将得到的118.5g浸膏溶于1.2L的蒸馏水中，将过滤所得的上清液上于4.0×25cm的大孔树脂中，然后依次用蒸馏水、10%、30%、50%、70%和90%的甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱溶剂为2L；减压回收溶剂后得到六个流分（THA-THF）。17 图3.1茼蒿乙醇提取物（TH）和MCI组分（THA-THE）的HPLC色谱图Fig3.1HPLCchromatogramofethanolextract(TH)andMCIfractions(THA-THE)ofC.coronariumL.THA部分(13.2g)经C18中压色谱(MPLC)分离(3.0×25cm)，甲醇：水梯度洗脱(5:95→50:50，v/v)，依次用5%、15%、25%、35%和50%的甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱溶剂为1L。HPLC检测合并相同馏分，得到5个馏分(THA-1～THA-5)。THA-3部分(3.3g)经SephadexLH-20凝胶柱(2.0×100cm)层析分离，甲醇洗脱，HPLC检测合并相同馏分，得到4个馏分(THA-3A～THA-3D)。THA-3C部分经半制备液相(10µm，10×250mm)分离，甲醇水梯度洗脱(0-23min:18:82→45:55，v/v，流速3.0mL·min-1)得到化合物1(12.5mg)，2(26.8mg)和3(14.5mg)。THC部分(6.57g)经硅胶柱层析(4.0×26cm)分离，氯仿—甲醇梯度洗脱(100:1→2:1，v/v)，TLC检测合并相同馏分，得到6个馏分(THC-1～THC-6)。THC-6部分(1.2g)经SephadexLH-20凝胶柱(2.0×100cm)层析分离，甲醇洗脱，HPLC检测合并相同馏分，得到7个馏分(THC-6A～THC-6G)。THC-6部分经半制备液相(10µm，10×250mm)分离，甲醇水等度洗脱(34:66；v/v，流速3.0mL·min-1)得到化合物4(8.5mg)和6(9.8mg)。THC-6F部分经半制备液相(10µm，1.0×250mm)分离，甲醇水等度洗脱(35:65；v/v，流速3.0mL·min-1)得到化合物5(13.5mg)和7(14.6mg)。18 茼蒿（2.0kg）加入95%乙醇乙醇浸膏（118.5g）MCI大孔树脂柱THATHBTHCTHDTHETHFC18中压液相色谱硅胶柱层析THA1THA2THA3THA4THA5THC1THC2THC3THC4THC5THC6葡聚糖凝胶LH-20柱层析葡聚糖凝胶LH-20柱层析THA-3ATHA-3BTHA-3CTHA-3DTHC-6ATHC-6BTHC-6CTHC-6DTHC-6ETHC-6FTHC-6G半制备高效液相色谱半制备高效液相色谱半制备高效液相色谱化合物1，2，3化合物4，6化合物5，7图3.2茼蒿中咖啡酰奎宁酸的分离纯化流程图Fig3.2SeparationandpurificationprocessofcaffeoylquinicacidfromchrysanthemumL.3.3数据分析NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS数据均以自配软件进行处理。19 3.4结果与分析表3.1咖啡酰奎宁酸1–7的1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)数据Table3.11H-NMR(400MHz,MeOH-d4)characteristicsofthecaffeoylquinicacidderivatives1–7isolatedfromaerialpartsofC.coronariumL.1234567NoδH(JHz)δH(JHz)δH(JHz)δH(JHz)δH(JHz)δH(JHz)δH(JHz)2.07–2.35(2H,2.54(1H,dd,3.5,10.2)2.12–2.32(2H21.93–2.22(2H,m)2.04–2.25(2H,m)1.98–2.23(2H,m)2.14–2.30(2H,m)m)2.43(1H,m),m)5.36(1H,brd,5.61(1H,brd,5.36(1H,brd,34.18(1H,brd,2.9)4.29(1H,brs)4.28(1H,brd,3.5)4.40(1H,brs)2.9)3.4)5.6)3.65(1H,dd,2.8,3.75(1H,dd,2.3,4.80(1H,dd,2.3,4.96(1H,dd,3.1,3.96(1H,dd,43.76(1H,dd,3.0,8.1)5.10(1H,d,8.5)8.5)8.0)9.0)9.4)3.2,7.3)4.14(1H,ddd,5.35(1H,ddd,3.5,4.27(1H,ddd,9.0,4.35(1H,ddd,5.375.42(1H,ddd,5.6353.6,8.5,8.5)8.0,8.0)9.0,4.5)4.2,9.4,9.4)(1H,ddd,3.7,8.1,8.1)3.2,7.3,7.3)(1H,ddd,4.2,8.5,8.5)2.07–2.352.05(1H,dd,11.1,2.12–2.3261.93–2.22(2H,m)2.04–2.25(2H,m)1.98–2.23(2H,m)2.14–2.30(2H,m)(2H,m)13.8)2.43(1H,m)(2H,m)2'/2'7.02/7.007.04(1H,d,1.4)7.05(1H,brs)7.06(1H,d,1.4)7.04(2H,brs)7.05(2H,s)7.00/6.97(2H,s)'(2H,d,1.8)5'/5'6.76/6.72(2H,d,6.77/6.75(2H,6.78(1H,d,8.0)6.78(1H,d,8.0)6.78(1H,d,8.0)6.78/6.76(2H,d,8.1)6.73/6.71(2H,d,8.1)'7.9)d,8.1)6'/6'6.94(1H,dd,1.4,6.97(1H,dd,1.4,6.90/6.85(2H,6.96/6.946.95(1H,d,8.0)6.96/6.94(2H,d,8.1)6.89/6.87(2H,d,8.1)'8.0)8.0)dd,1.8,7.9)(2H,m)7'/7'7.57/7.52(2H,d,17.60/7.567.58(1H,d,15.9)7.56(1H,d,15.9)7.63(1H,d,15.9)7.58/7.55(2H,d,15.9)7.57/7.49(2H,d,15.9)'5.9)(2H,d,15.9)8'/8'6.27/6.23(2H,d,6.33/6.26.30(1H,d,15.9)6.27(1H,d,15.9)6.37(1H,d,15.9)6.27/6.24(2H,d,15.9)6.26/6.17(2H,d,15.9)'15.9)4(2H,d,15.9)20 表3.2咖啡酰奎宁酸2,5−6的13C-NMR(100MHz,MeOH-d4)数据Table3.213C-NMR(100MHz,MeOH-d4)dataofcoffeeacylquinineCompoundsNo.256174.780.973.3236.835.734.6369.969.471.1472.172.869.2570.571.670.6637.436.936.27175.6174.8175.91'126.4127.8/127.8126.5/126.42'113.8115.3/115.3114.2/113.93'145.3147.6/147.4145.3/145.34'148.1149.7/149.7148.1/148.05'115.1116.5/116.5115.1/115.16'121.6123.1/123.1121.6/121.67'145.7147.4/146.9145.9/145.68'113.8115.2/115.1113.7/113.79'167.3168.7/168.0167.4/167.0化合物1～3为白色粉末。根据HR-ESI-MS产生的准离子峰[M-H]-m/z353.08，紫外光谱显示λmax为328，298和246nm，这表明化合物1～3为单咖啡酰取代的奎宁酸衍生物。化合物1～3的1H-NMR谱(400MHz，MeOH-d4)显示了1个咖啡酰信号在δ7.56，7.58，7.63(1H，d，J=15.9Hz，H-7')，6.27，6.30，6.37(1H，d，J=15.9，H-8')，7.04，7.05，7.06(1H，H-2')，6.94，6.95，6.97(1H，H-6')，6.78，6.78，6.78(1H，H-5')，而另一个咖啡酰信号在[1：δ5.36(1H，brd，J=2.9，H-3)，3.65(1H，dd，J=8.5，2.8，H-4)，4.14(1H，ddd，J=8.5，8.5，3.6，H-5)，1.93-2.22(4H，m，H-2，H-6)；2：δ4.18(1H，brd，J=2.9，H-3)，3.75(1H，dd，J=8.0，2.3，H-4)，5.35(1H，ddd，J=8.0，8.0，3.5，H-5)，2.04-2.25(4H，m，H-2，H-6)；3：δ4.29(1H，brs，H-3)，4.80(1H，dd，J=9.0，2.3，H-4)，4.27(1H，ddd，J=9.0，9.0，4.5，H-5)，1.98-2.23(4H，m，H-2，H-6)]。咖啡酰取代的位21 置可以通过奎宁酸核的氧化次甲基质子的化学位移和偶合常数的分析来确定。然后，前场转移质子的耦合常数应用到酰化位置。通常情况下，H-3的信号具有小的偶合常数，表现出brd或brs型的峰，H-4的信号显示出dd型的峰，偶合常数在8.0-9.0Hz和2.0-3.0Hz，而H-5的信号显示ddd型的峰，耦合常数在8.0-9.0Hz，8.0-9.0Hz和3.0-5.0Hz。基于这个规则，化合物1～3的结构如图3.3所示确定。化合物4～7为白色粉末。根据ESI-MS产生的准离子峰[M-H]-m/z515.11，紫外光谱显示λmax为327，298和245nm，表明化合物4-7为双咖啡酰取代的奎宁酸化合物。1H-NMR谱显示了与化合物1-3相似的信号模式，但是多了一个咖啡酰信号。化合物4-7的1H-NMR谱显示了两组咖啡酰信号[7.49−7.60(2H，d，J=15.9Hz，H-7')，6.97−7.05(2H，H-2')，6.85−6.96(2H，H-6')，6.71−6.78(2H，H-5')，6.17−6.33(2H，d，J=15.9Hz，H-8')]，一个奎宁酸信号（见图6）。与化合物1～3相似，咖啡酰取代的位置可以通过奎宁酸核的氧化次甲基质子的化学位移和偶合常数的分析来确定。由于在低场位移时只观察到化合物5的H-5信号，因此另一个取代位置暂定为奎宁酸的C-1。基于这个规则，化合物4～7的结构如图3.3所示确定。6OR3O51COOH7'caffeoyl=HO3'1'4OR49'8'2R2OHOOR5'11R1=caffeoyl,R2=R3=R4=H2R3=caffeoyl,R1=R2=R4=H3R2=caffeoyl,R1=R3=R4=H4R1=R2=caffeoyl,R3=R4=H5R1=R2=H,R3=R4=caffeoyl6R1=R3=caffeoyl,R2=R4=H7R2=R3=caffeoyl,R1=R4=H图3.3茼蒿中咖啡酰奎宁酸类衍生物1-7的化学结构Fig3.3Thechemicalstructuresofthecompounds1–7isolatedfromC.coronariumL.3.5结论与讨论近年来，有关茼蒿中活性物质的报道较多，茼蒿中主要含有酚酸、黄酮、倍半萜内酯、二萜、单萜烯、生物碱、甘油二酯糖苷、杂环化合物、植物甾醇、挥发油以及聚乙炔类化合物等多种类型化合物。黄酮和酚酸为茼蒿中的主要活性物质。茼蒿中的多种活性成分都具有药用价值，在植物的化感效应、抗菌、抗氧化、清除自由基、昆虫拒食、抗肿瘤等方面都有显著效果，同时也具有清痰、养胃、利肠和护肝之功效。茼蒿中不同活性成分的作用不同，其中对植物起化感作用以及抗氧化作用的主要物质为黄酮和酚酸类，产生抗菌与昆虫拒食22 效应的是聚乙炔类化合物和挥发油，具有抗肿瘤和抑菌活性的是倍半萜内酯等萜类化合物。咖啡酰奎宁酸类化合物，是一类由奎宁酸与数目不等的咖啡酸通过酯键连接而成的酚酸类天然成分，广泛存在于植物界[97]。该类成分具有抗氧化、抗炎、抗菌抗病毒、细胞保护、免疫调节、抗高血糖高血脂和抗癌等药理活性[98]。Lou等研究发现，绿原酸对革兰氏细菌、大肠杆菌等多种细菌具有抑菌活性[99]。陈一强的研究也表明绿原酸对铜绿假单胞菌具有抑制作用[100]。通过分析HR-ESI-MS，1D-NMR数据，并与文献进行比较，阐明了分离的咖啡酰奎宁酸衍生物的结构。化合物1～7被确定为3-O-咖啡酰奎宁酸，5-O-咖啡酰奎宁酸，4-O-咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸，1,5-二咖啡酰奎宁酸，3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸。其中，化合物1，3～5，7首次从这个物种中分离鉴定出来。此外，化合物3～5，7都从菊花属首次报道。23 第4章绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑菌活性研究绿原酸是由肉桂酸（主要是咖啡酸、香豆酸、阿魏酸）和奎宁酸酯化形成的酚酸类化合物，目前有70多种类型。其在咖啡、金银花、杜仲等植物中广泛纯在。大量的研究表明，绿原酸具有抗菌消炎、抗氧化、抗高血压等多种活性[101]。Sato的研究发现，绿原酸和咖啡酸都具有抗氧化活性[102]。Zhao等的研究发现，绿原酸可以显著降低机体血压[103]。课题组前期以西瓜尖镰孢菌为生物活性导向分离指示菌株，利用硅胶柱层析、SephadexLH-20、葡聚糖凝胶柱层析、制备色谱等现代分离技术，采用抑菌活性追踪的方法，从茼蒿茎叶粗提物抑菌活性部位分离纯化出了七个咖啡酰奎宁酸类衍生物；本研究对其含量较高的一个成分—绿原酸（3-O-咖啡酰奎宁酸）的离体抑菌活性进行了研究，以期阐明茼蒿抑制西瓜枯萎病菌的物质基础及其作用机制。4.1材料与方法4.1.1试验材料试验茼蒿采用江西农业大学蔬菜基地种植的大叶茼蒿；PDA培养基，PDB培养基（即不加琼脂的PDA培养基）；尖孢镰刀菌西瓜专化型即西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)，由江西农业大学生物工程与科学学院提供。4.1.2试验方法4.1.2.1绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑菌活性测定无菌条件下，用无菌水将绿原酸配制成250～1.95mg·ml-1的梯度溶液，4℃冰箱保存备用。在无菌条件下，将不同浓度的绿原酸溶液以1:9的比例与炼熔态的灭菌培养基混合制成含药平板。用直径8mm的打孔器打取活化好的菌块边缘，用接种环将其接种到含药培养基中央，用封口膜封好培养基并将其放置于28℃的恒温培养箱中培养。2d后观察，以不长菌的培养皿的最低含药浓度为最小抑菌浓度(MIC)；7d后观察，以不长菌的培养皿的最低含药浓度为最小杀菌浓度(MFC)。4.1.2.2绿原酸对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定采用生长速率法测定毒立方程，无菌条件下，将绿原酸配制成100、50、25、12.5、6.25mg·ml-1的溶液。在无菌条件下，将不同浓度的绿原酸溶液以1:9的比例与炼熔态的灭菌培养基混合制成含药平板。用直径8mm的打孔器打取活化好的菌块边缘，用接种环将其接种到含药培养基中央，用封口膜封好培养基并将其放置于28℃的恒温培养箱中培养。3d后，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。校正菌落直径(mm)=菌落直径-打孔器直径抑菌率(%)=(对照校正菌落直径-处理校正菌落直径)/对照校正菌落直径×10024 4.1.2.3绿原酸对西瓜枯萎病菌孢子萌发的影响无菌条件下，将配制好的西瓜枯萎病菌孢子悬浮液与MIC、EC50、MFC浓度的绿原酸溶液（对照为相同比例的无菌水）按9:1的比例加入凹玻片中，将其放置于28℃的恒温培养箱中培养。24h之后，在显微镜下进行观察，计算各浓度下西瓜枯萎病菌孢子的萌发率和抑制率。萌发率(%)=萌发个数/总孢子个数×100抑制率(%)=(对照组萌发率-处理组萌发率)/对照组萌发率×1004.1.2.4绿原酸对西瓜枯萎病菌菌丝生物量的影响无菌条件下将1ml的菌悬液接种于40ml的不同浓度含药PDB培养基中，置于28℃恒温摇床(180r·min-1)中培养3d，于4000r·min-1下离心10min，弃上清液，称量沉淀的质量，即为菌丝鲜重。称量后，将菌丝放入75℃烘箱，24h后称量，即为菌丝干重，每个处理3次重复。4.2数据分析采用SPSS20.0对试验数据进行邓肯氏(Duncan)多重差异分析，ANOVA检测(P=0.05)。采用Excel2007进行数据处理及图形制作。4.3结果与分析4.3.1绿原酸对西瓜枯萎病菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)如表4.1所示，绿原酸对西瓜枯萎病菌有良好的离体抑制效果，其对西瓜枯萎病菌的MIC和MFC分别为31.25和125mg·ml-1，这可以为进一步研究绿原酸抑制西瓜枯萎病菌的抑菌机制提供一定的数据参考。表4.1绿原酸对西瓜枯萎病菌的MIC和MFCTable4.1TheMICandMFCofchlorogenicacidonFusariumoxysporum浓度/(mg·ml-1)时间/d25012562.531.2515.6257.81253.906251.953152----++++7--++++++注：其中“+”代表菌落有明显生长，“-”代表菌落没有明显生长。Note:The"+"onbehalfofthecolonieshaveobviousgrowth,"-"onbehalfofthecoloniesdidnotgrowsignificantly.4.3.2绿原酸对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定利用SPSS20.0进行Probit回归分析，求得毒力回归方程(Y)，相关系数(r)和EC50（EC50即能引起50%最大效应的浓度），从表4.2可知，绿原酸对西瓜枯萎病菌的EC-150为53.048mg·ml。25 表4.2绿原酸对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定Table4.2TheindoortoxicitymeasurementofchlorogenicacidonFusariumoxysporum植物病原菌毒力回归方程/Y相关系数/rEC-1)50/(mg·ml西瓜枯萎病菌Y=-1.281+0.024x0.94853.048由图4.1可知，不同浓度的绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑制效果不同，随着浓度的增大，绿原酸的抑菌效果逐渐增强，各浓度间抑菌率差异显著。在100mg·ml-1的浓度下，绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑制率为83%，而6.25mg·ml-1的绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑制率仅为4%。图4.1不同浓度绿原酸溶液对西瓜枯萎病菌的抑制作用Fig4.1EffectsofdifferentconcentrationsofchlorogenicacidonFusariumoxysporum4.3.3绿原酸对西瓜枯萎病菌孢子萌发的影响由图4.2可知，绿原酸对西瓜枯萎病菌的孢子萌发明显的抑制作用，图4.2(a)中随着绿原酸浓度的增大，西瓜枯萎病菌的孢子萌发率不断降低，在MIC、EC50、MFC的浓度下，西瓜枯萎病菌的孢子萌发率分别为64%、33%、12%，而对照的孢子萌发率则达到92%。从图4.2(b)可知随着药剂浓度的增大其对孢子萌发的抑制作用逐渐增强，在MIC、EC50、MFC的浓度下分别为31%、65%、87%。经邓肯氏差异分析，各处理间孢子萌发率和抑制率均具有显著性差异。从图9可以直观的看出，随着处理浓度的增大，孢子萌发数逐渐减少。26 图4.2绿原酸对西瓜枯萎病菌孢子萌发率和抑制率的影响Fig4.2EffectofchlorogenicacidongerminationrateandinhibitionrateofFusariumoxysporum注：上图为显微镜下不同浓度处理的孢子萌发情况。Note:Aboveisthesporegerminationofdifferentconcentrationsundermicroscope.图4.3绿原酸对西瓜枯萎病菌孢子萌发的影响Fig4.3EffectofchlorogenicacidonsporegerminationofFusariumoxysporum4.3.4绿原酸对西瓜枯萎病菌菌丝生物量的影响由图4.4可知，随着药剂浓度的增大，西瓜枯萎病菌的菌丝干、鲜重均呈现出下降的趋势。由图4.4(a)可知，各处理的鲜重与对照间差异显著，而各处27 理间没有显著性差异；由图4.4(b)可知，各处理的干重与对照间差异显著，且各处理间也存在显著性差异。MFC的浓度处理对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用最强，其干、鲜重分别为0.01g、0.28g，而对照的干、鲜重则为0.07､0.89g。图4.4绿原酸对西瓜枯萎病菌菌丝生物量的影响Fig4.4EffectofchlorogenicacidonmyceliumbiomassofFusariumoxysporum4.4结论与讨论刘琼等的研究表明，不同有机溶剂萃取后茼蒿粗提物的抑菌效果不同，正丁醇效果最佳，在MFC浓度下孢子萌发率最低[104-105]。本研究对从茼蒿中分离鉴定出的绿原酸进行了抑菌活性测定，发现绿原酸对西瓜枯萎病菌有良好的离体抑制作用，这与刘琼等采用粗提物进行研究的结果一致。陈玉环等研究了意大利青霉菌对肉桂醛、肉桂酸的抑菌机制，发现桂枝主要抑菌活性成分肉桂醛和肉桂酸能够抑制孢子萌发，阻碍菌丝生长[106-107]。本试验中从茼蒿粗提物中分离纯化出的绿原酸对西瓜枯萎病菌的孢子萌发有较强的抑制作用，这与桂枝抑制柑橘青霉菌的作用机制相似。茼蒿粗提物对西瓜枯萎病菌抑制效果研究表明，随着处理浓度的增加，西瓜枯萎菌的菌丝生物量呈现出下降的趋势[108]，这与本研究中绿原酸的效果相同。绿原酸（3-O-咖啡酰奎宁酸）的抑菌活性试验表明，其对西瓜枯萎病菌有较强的离体抑制作用，且随着浓度的升高，其抑菌活性呈现出增强的趋势，从而揭示了绿原酸是茼蒿中抑制西瓜枯萎病菌的活性成分。绿原酸可通过抑制西瓜枯萎病菌的孢子萌发从而发挥其对西瓜枯萎病菌的抑制效果，通过菌丝生物量测定表明，绿原酸在一定程度上减少了西瓜枯萎病菌菌丝的生长。本研究可以为其他活性物质的分离纯化以及植物源杀菌剂的研制提供一定的理论依据，然而对其分子机制和田间防治效果尚不清楚，此后，可以通过其他有效手段对绿原酸的作用机制进行系统研究，同时开展田间试验。28 第5章绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑菌机制研究绿原酸(Chlorogenicacid)，又名咖啡单宁酸，化学名为3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinicacid)。绿原酸具有心血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外和抗辐射作用、抗诱变及抗癌作用、抗菌及抗病毒作用等多种药理活性[109-110]。绿原酸是金银花等传统中药材的主要药理成分，其对多种致病细菌和真菌有抑制作用。据报道，抗真菌药物的作用机制主要有：（1）影响细胞壁合成。（2）影响细胞膜合成。如某些抗菌药物可以抑制麦角固醇的生物合成从而破坏膜结构，起到抑菌的效果。（3）影响蛋白质及氨基酸的合成。（4）影响核酸的合成。（5）影响某些关键代谢酶的活性[111-113]。课题组前期研究发现，从茼蒿中分离鉴定出的绿原酸对西瓜尖镰孢菌有一定的抑制作用，本试验以西瓜尖镰孢菌为指示菌株，对绿原酸作用后的菌体超微结构、生理代谢、细胞膜的完整性进行了研究，旨在探讨其对西瓜尖镰孢菌的抑菌机制。5.1材料与方法5.1.1试验材料西瓜尖镰孢菌由江西农业大学生物科学与工程学院提供，绿原酸购于宝鸡市辰光生物科技有限公司。5.1.2试验方法5.1.2.1西瓜尖镰孢菌超微结构的观察在无菌条件下，将绿原酸溶液按1:9的比例与炼熔态的培养基混匀制备平板，对照为相同比例的蒸馏水，用直径8mm的打孔器在活化好的菌落边缘打孔，用接种环将西瓜尖镰孢菌块接种于含不同浓度绿原酸溶液的PDA培养基中央，于28℃恒温培养箱中培养。三天后，在菌落边缘取样。SEM样品前处理：用2.5%的戊二醛于4℃下固定样品；PBS缓冲液以每次10分钟的时间冲洗3次，洗去未结合的戊二醛；1%的锇酸于4℃下固定样品2h；PBS缓冲液以每次10分钟的时间冲洗3次，洗去未结合的锇酸；依次用30%、50%、70%、90%、100%、100%的乙醇溶液脱水，每次10分钟；临界点干燥法干燥样品；喷金观察。TEM样品前处：用2.5%的戊二醛于4℃下固定样品；PBS缓冲液以每次10分钟的时间冲洗3次，洗去未结合的戊二醛；1%的锇酸于4℃下固定样品2h；PBS缓冲液以每次10分钟的时间冲洗3次，洗去未结合的锇酸；依次用30%、50%、70%、90%、100%、100%的乙醇溶液脱水，每次10分钟；用Epon812环氧树脂对样品进行包埋，然后依次置于37℃、45℃、65℃的温箱中进行固化，每级温度24小时；UltracutE超薄切片机对样品进行切片；醋酸双氧铀硝酸铅29 对样品进行染色；上机测试。5.1.2.2绿原酸对西瓜枯萎病菌细胞膜渗透性的影响无菌条件下，将1ml的菌悬液接种于90ml的PDB培养基中，置于28℃恒温摇床(180r·min-1)中培养3d之后，分别加入10ml不同浓度的绿原酸溶液，对照加入相同比例的蒸馏水，并在1h、2h、3h、4h及5h之后取5ml菌液在4000r·min-1下离心10min，用电导率仪测定上清液的电导率。5.1.2.3西瓜尖镰孢菌蛋白质和核酸类物质外渗的测定在无菌条件下，将1ml的西瓜尖镰孢菌孢子悬浮液接种于90ml的PDB培养基中，置于28℃、180r·min-1恒温振荡器中培养。五天后，加入10ml不同浓度的绿原酸溶液，对照加入相同比例的无菌水。继续培养三天后，离心取上清液，测定其在280nm和260nm处的吸光值。5.1.2.4西瓜尖镰孢菌琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活力的测定在无菌条件下，将1ml的西瓜尖镰孢菌孢子悬浮液接种于90ml的PDB培养基中，置于28℃､180r·min-1恒温振荡器中培养。五天后，加入10ml不同浓度的绿原酸溶液，对照加入相同比例的无菌水。继续培养三天后，离心收集菌丝体并于组织研磨机中研磨。准确称取0.5g研磨后的菌丝体，按重量(g):体积(ml)=1:9的比例加入9倍体积的生理盐水，4000r·min-1离心10分钟，取上清液待测。按照试剂盒步骤操作，将混匀的样品迅速倒入比色皿中在分光光度计600nm处比色，5秒时读取吸光度值(A1)，在1分5秒时再次测定吸光度值(A2)，求出两次吸光度值(ΔA=A1-A2)｡计算公式：SDH活力(U·mg-1)=[(ΔA值÷0.01)/反应时间(1分钟)]/[(反应时间×取样量(0.1mL)×样本蛋白浓度(mg·mL-1)]按照试剂盒步骤操作，将混匀的样品迅速倒入石英比色皿中在分光光度计340nm处比色，20秒时读取吸光度值(A1)，在1分20秒时再次测定吸光度值(A2)，求出两次吸光度值(ΔA=A1-A2)。计算公式：MDH活力(U·mg-1)=(测定ΔA-空白ΔA)/[6.2*×比色光径(0.5cm)]×[反应液总体积(1.05mL)/取样量(0.05mL)]/待测样本蛋白浓度(mg·mL-1)。5.2数据分析采用SPSS20.0对试验数据进行邓肯氏(Duncan)多重差异分析，ANOVA检测(P=0.05)。采用Excel2007进行数据处理及图形制作。30 5.3结果与分析5.3.1绿原酸对西瓜尖镰孢菌超微结构的影响从图5.1可以看出，对照西瓜尖镰孢菌的菌丝生长粗细均匀，表面光滑，圆润饱满，生长点表面光滑无异常。而经绿原酸溶液处理之后的菌丝生长粗细不一，局部出现四陷，甚至干瘪，有严重的裂纹形成，菌丝生长点退化。结果表明，对照尖镰孢菌的菌丝体细胞形态规则，结构完整，细胞壁质地均勻，光滑均一，原生质稠密均匀。经绿原酸处理之后的西瓜尖镰孢菌菌丝体细胞壁增厚，不规则波纹状，原生质体收缩，出现质壁分离，有液泡化现象；部分菌丝体细胞出现空腔，细胞器解体，原生质电子密度降低。图5.1绿原酸对西瓜枯萎病菌超微结构的影响Fig5.1Theeffectofchlorogenicacidontheultrastructureofwatermelonblight图5.2绿原酸对西瓜枯萎病菌超微结构的影响Fig5.2Theeffectofchlorogenicacidontheultrastructureofwatermelonblight31 5.3.2绿原酸对西瓜枯萎病菌细胞膜渗透性的影响由图5.3(a)可知，不同浓度处理组的电导率随时间大致呈现先增后降趋势，在前两个小时内，随着时间的延长，各浓度处理的胞外电导率呈现出上升的趋势，而后随着时间的进一步延长，电导率则有所下降，且MFC组和CK组的电导率均在2h与5h时存在显著性差异。由图5.3(b)可知，同一时间上各浓度处理组电导率按MFC，EC50，MIC，CK顺序依次降低，MFC处理组均大于其他组，CK组最低，二者存在显著性差异。由此可知，不同浓度的处理都增加了细胞膜的通透性，从而抑制了西瓜枯萎病菌的生长。图5.3绿原酸对西瓜枯萎病菌细胞膜渗透性影响Fig5.3EffectofchlorogenicacidonthecellmembranepermeabilityofFusariumoxysporum5.3.3绿原酸对西瓜尖镰孢菌物质外渗的影响大分子物质蛋白质和核酸在260nm、280nm处有最大吸光值，通过测定经不同浓度药剂处理之后菌液的吸光值，可以了解西瓜尖镰孢菌胞内物质外渗情况。从下图5.4可以看出，经过绿原酸溶液处理之后，各浓度的吸光值都显著上升，与对照间差异显著，说明绿原酸影响了菌体的细胞膜渗透性，从而导致物质外渗。32 图5.4绿原酸对西瓜枯萎病菌物质外渗的影响Fig5.4Theeffectofchlorogenicacidontheinfiltrationofblightofwatermelonblight5.3.4绿原酸对西瓜尖镰孢菌琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活力的影响琥珀酸脱氢酶(SDH)是属于细胞色素氧化酶的黄素酶，是唯一一个在三羧酸循环中整合与膜上的多亚基酶；其是氧化磷酸化及电子传递的枢纽，可以为生物体内需氧和产能的呼吸链提供电子支持，是线粒体的标志性酶。从图5.5可以看出，在经不同浓度的绿原酸溶液处理之后，各处理的琥珀酸脱氢酶活力都显著降低，在MIC、EC50、MFC的处理浓度下，琥珀酸脱氢酶的活力分别为23.34、15.39、11.25U·mg-1，而CK的活力则为25.67U·mg-1，各处理与对照间差异显著，各处理之间也有显著性差异。此结果说明绿原酸破坏了能量代谢的途径-TCA循环，从而抑制西瓜尖镰孢菌的生长。苹果酸脱氢酶(MDH)在生物的多条代谢途径起着运转物质和能量的重要作用。从下图看出，随着绿原酸溶液浓度的升高，西瓜尖镰孢菌的苹果酸脱氢酶活力逐渐降低，与对照0.58U·mg-1的酶活力相比，各处理的酶活力与其差异显著，说明经绿原酸处理之后，西瓜尖镰孢菌的多条代谢途径被破坏，从而影响了机体的正常生长发育。图5.5绿原酸对西瓜枯萎病菌SDH和MDH活性的影响Fig5.5EffectsofchlorogenicacidonSDHandMDHactivityofwatermelonblight33 5.4结论与讨论利用电镜观察菌体被药物处理之后的超微结构，是研究抑菌机理的常用方法。曾荣研究发现意大利青霉菌在经过MeONQ处理之后，意大利青霄菌丝形态异常，顶端细胞明显萎缩和對塌，细胞出现严重的质壁分离，细胞内部结构紊乱，分区消失，电子密度增大，并有大量物质外渗，从而造成细胞死亡。刘晓漫发现紫茎泽兰叶油可以破坏卵菌细胞壁和细胞膜的完整性，导致细胞破裂，细胞质外泄，细胞器解体，细胞内含物减少，细胞空腔化[114-115]。而姚晓琳在研究中也发现，在经NOB和TAN处理过的假单胞菌体表面变得弯曲有褶皱，菌体形态出现不规则现象，菌体细胞间的界限不再清楚，细胞出现变形、空洞，甚至破裂的现象[116-117]。本试验结果表明，在经过EC50的绿原酸溶液处理之后，西瓜尖镰孢菌的菌丝体和细胞呈现出不同程度受损情况，菌丝粗细不一，局部出现四陷，甚至干瘪，有严重的裂纹形成，菌丝生长点退化，菌丝体细胞壁增厚，原生质体收缩，出现质壁分离，有液泡化现象，部分菌丝体细胞出现空腔，细胞器解体，原生质电子密度降低。细胞膜是许多抗真菌药物的作用位点，在药物的作用下，细胞膜的完整性和功能会受到不同程度的破坏，通常表现为细胞膜通透性增加以及电解质外渗速度加快。通过测定电导率可以了解真菌的细胞膜通透性变化，从而反映细胞受伤害的程度[117-118]。桂枝主要抑菌活性成分肉桂醛和肉桂酸能够破坏菌体细胞膜进而导致细胞膜通透性增加。本研究与前人研究结果相似，31.25、125、53.048mg·mL-1的处理浓度与CK相比，其胞外电导率都有所上升，在前两个小时内，随着时间的延长及浓度的增大，各处理的胞外电导率呈现出上升的趋势，继续延长处理时间，电导率则有所下降，总的来说，不同浓度绿原酸处理均增加了西瓜枯萎病菌细胞膜的通透性，抑制了西瓜枯萎病菌的生长。周志娥等的研究也表明绿原、异绿原酸A(3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸)可破坏细菌细胞壁、膜的结构，导致细胞通透性增加，进而使细胞内容物外泄[119]，这与本试验中从茼蒿中分离鉴定出的活性物质绿原酸对西瓜枯萎病菌的作用效果相近。除此之外，本试验中经过绿原酸处理过的菌体上清液中核酸和蛋白质浓度显著高于对照，超微结构也显示绿原酸使西瓜尖镰孢菌的菌体受到了严重损伤，推测绿原酸可能抑制了细胞壁合成的某条途径，从而使细胞膜体系的完整性受到影响，选择透过性受到破坏，进而导致菌体无法正常生长，甚至死亡。三羧酸循环是发生于需氧生物线粒体内的代谢途径，它既是糖类、脂类和氨基酸的最终代谢途径，又是其代谢联系的枢纽。SDH和MDH是微生物进行TCA的两个重要的氧化还原酶，对三羧酸循环的顺利运转有着直接影响，维持着细胞生化反应的正常进行，它们是微生物生长代谢和繁殖所必需的，对微生物细胞的代谢有重要作用。郑世菊发现柠檬醛可以降低指状青霉琥珀酸脱氢酶活性[120-121]。在经过PMFS处理之后，假单胞菌的琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及三磷酸腺苷酶活性都显著降低[122]。本试验研究发现，在经不同浓度的34 绿原酸溶液处理之后，西瓜尖镰孢菌的MDH和SDH活力显著降低，说明绿原酸影响了病菌重要的代谢途径—三羧酸循环，从而抑制了其正常生长。电镜观察结果表明：绿原酸破坏了西瓜枯萎病菌细胞壁和细胞膜的完整性，导致细胞破裂，细胞质外泄，细胞器解体，细胞内含物减少，细胞空腔化。通过测定西瓜尖镰孢菌的各项生理指标发现，绿原酸能抑制菌体过氧化氢酶、琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性。此外，绿原酸处理能使菌体细胞膜通透性增加和电解质外渗速度加快这与茼蒿粗提物及其他酚酸类物质的抑菌机制类似。同时，绿原酸处理能导致胞内物质大量外渗。35 第6章全文结论6.1文章结论6.1.1茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌作用效果的比较以西瓜枯萎病菌为研究对象，采用生长速率法，研究了茼蒿茎叶、根、根际区土壤3个部位浸提液对西瓜枯萎病菌的化感作用。结果表明茼蒿3个部位的水浸提液对西瓜枯萎病菌的生长均有一定的抑制作，在100mg·mL-1的浓度下抑制率分别为53%、49%、45%。经室内毒力测定3个部位的EC50分别为86.26、84.65、106.88mg·mL-1。综合比较，茎叶浸提液的抑菌效果较强。6.1.2茼蒿中抑制西瓜枯萎病菌活性成分的分离纯化以西瓜尖镰孢菌为生物活性导向分离指示菌株，采用硅胶、葡聚糖凝胶、制备色谱等现代分离技术，从茼蒿茎叶组织中分离纯化出抑菌活性物质，所得到的化合物以NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS的方法进行了结构鉴定，被确定为3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸。6.1.3茼蒿中绿原酸对西瓜枯萎病菌的抑菌活性研究以西瓜枯萎病菌为指示菌株，对从茼蒿茎叶组织中分离纯化并鉴定出的3-O-咖啡酰奎宁酸（绿原酸）的离体抑菌活性进行了研究。结果表明，绿原酸对西瓜枯萎病菌的MIC和MFC分别为31.25和125mg·mL-1，经室内毒力测定，其对西瓜枯萎病菌的EC-1。在绿原酸浓度分别为31.25、125、50为53.048mg·mL53.048mg·mL-1时，西瓜枯萎病菌的孢子萌发率分别为64%、33%、12%，而绿原酸浓度为0时的孢子萌发率则达到92%。随着绿原酸浓度的增大，西瓜枯萎病菌的菌丝干、鲜重均呈现出下降的趋势。6.1.4茼蒿中绿原酸对西瓜枯萎病菌的作用机制初探以西瓜尖镰孢菌为指示菌株，研究了不同浓度的绿原酸溶液(MIC、EC50、MFC)对西瓜尖镰孢菌的抑菌机制。结果表明，在经过EC50的绿原酸溶液处理之后，西瓜尖镰孢菌的菌丝体和细胞呈现出不同程度受损情况，菌丝粗细不一，局部出现四陷，甚至干瘪，有严重的裂纹形成，菌丝生长点退化，菌丝体细胞壁增厚，原生质体收缩，出现质壁分离，有液泡化现象部分菌丝体细胞出现空腔，细胞器解体，原生质电子密度降低；随着绿原酸浓度的升高，西瓜尖镰孢菌的琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活力都显著降低，表明绿原酸处理影响了菌体的多种代谢途径，从而抑制其正常生长；此外，绿原酸处理能够使菌体内的大分子物质—蛋白质和核酸大量外渗，而且，绿原酸处理能使细胞膜通透性增36 加，从而导致菌体细胞内电解质外渗速度加快。6.2课题展望本文利用生物活性追踪的方法对茼蒿中抑制西瓜枯萎病菌的活性成分进行了分离纯化，并对活性成分的抑菌效果及作用机制进行了初步研究，但对其分子作用机制、田间防治效果尚不清楚。后期可以从分子方面对绿原酸抑制西瓜枯萎病菌的作用机制进行研究，从而更深刻而全面地了解和阐述其作用机理。此外，可以开展田间试验，对接种西瓜尖镰孢菌的西瓜植株进行幼苗期、营养生长期、开花结果期试验以验证活性成分的抑菌效果及功效组分的最佳配比。37 参考文献[1]HuAnJie,ShiXuanJie,LingHua,等.Developmentofwatermelonvariety-'Heitong'.[J].ChinaCucurbits&Vegetables,2009:15-17.[2]OrtaAH,ErdemY,ErdemT.Cropwaterstressindexforwatermelon[J].ScientiaHorticulturae,2003,98(2):121-130.[3]李珊珊,刘琳,李猛,等.茼蒿中绿原酸抑制西瓜枯萎病菌活性研究[J].核农学报,2018,32(1):104-111.[4]吕湘江,李清萍,范淑英.西瓜枯萎病综合防治研究进展[J].北方园艺,2015,37(6):187-190.[5]吴学宏,卢志军,王品品,等.西瓜枯萎病综合防治研究进展[J].植物保护,2011,37(4):27-32.[6]NortonJD,BoyhanGE,SmithDA,etal.'AU-SweetScarlet'watermelon.[J].HortscienceAPublicationoftheAmericanSocietyforHorticulturalScience,1995,30(2):393-394.[7]徐暄,王永强,孙其文.西瓜枯萎病防治研究综述[J].安徽农学通报,2016,22(17):94-95.[8]刘广,羊杏平,徐锦华,等.西瓜甜瓜嫁接栽培技术研究进展[J].中国瓜菜,2009,22(1):28-31.[9]曹坳程,郭美霞,王秋霞,等.世界土壤消毒技术进展[J].中国蔬菜,2010,1(21):17-22.[10]王志青,郭玉林,李琳,等.土壤(基质)热水消毒技术在天津市现代农业中的应用[J].农业工程,2013,3(s1):39-40.[11]杨瑞平.西瓜连作障碍缓解技术及其机理研究[D].西北农林科技大学,2016.[12]王小慧,张国漪,李蕊,等.拮抗菌强化的生物有机肥对西瓜枯萎病的防治作用[J].植物营养与肥料学报,2013,19(1):223-231.[13]张丽萍,黄亚丽,程辉彩,等.复合生物制剂防治西瓜连作病害的研究[J].中国土壤与肥料,2006,2006(5):59-61.[14]李欢,刘建辉,冯宁宁,等.放线菌Act1对连作西瓜枯萎病的防治效果[J].北方园艺,2012(15):144-147.[15]王汉荣,方丽,任海英,等.西瓜枯萎病防治药剂筛选[J].植物保护,2011,37(1):150-152.[16]万春鹏,刘琼,张新龙,等.药食两用植物茼蒿化学成分及生物活性研究进展[J].现代食品科技,2014(10):282-288.[17]李珊珊,万春鹏,刘琳,等.茼蒿提取物及其不同柱层析馏分对西瓜枯萎病菌的抑制作用[J].江西农业大学学报,2017,39(3):502-508.[18]刘琼,张新龙,陈楚英,等.响应面法优化茼蒿抑菌物质超声波提取工艺[J].江西农业大学学报,2016,38(4):734-740.38 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45 致谢转眼间，三年的研究生求学之路即将结束，在这三年的求学生涯中，有太多给予我支持、帮助和关心的人们。首先感谢我的导师范淑英教授，无论是在学习还是生活中，她都给了我太多的指引和帮助。本文从选题、试验设计、试验开展到论文撰写都倾注了导师大量的心血，她对试验一丝不苟的精神，对工作认真负责的态度，都对我产生了莫大的影响。在生活上，导师更是给予了我无限的关心和帮助，她那热情待人的生活态度使我受益颇多。于我，这些都是莫大的精神财富，在此对我的导师范淑英教授致以我最诚挚的谢意。感谢万春鹏老师对我试验过程及论文撰写过程中给予的启发和帮助，感谢周庆红副教授对我论文撰写的修改意见，同时感谢吴才君教授以及蔬菜教研室的肖旭峰老师、罗莎老师、杨有新老师等的关心和帮助。感谢我的师妹刘琳、师弟李猛等对我试验进行中的帮助，感谢同窗好友吴超群、陈昱、张福建以及杨子建对我的关心，感谢师兄张新龙等一直以来的关心，感谢室友王思琦和杨霄华的鼓励和陪伴。求学近二十载，家人一直是我最强大的后盾和前行的动力，在此对他们表示我深切的爱意。感谢那些一直在我背后给与我支持、帮助和关爱的人们。46 个人简介李珊珊，女，1993年8月24日出生，河南洛阳人，硕士研究生，毕业于江西农业大学蔬菜学专业。在学期间参加的研究项目：国家自然科学基金项目—茼蒿抑制西瓜枯萎病菌的物质基础及机理研究，项目编号为31360487；江西省自然科学基金项目—茼蒿抑制西瓜枯萎病菌的物质基础及机理研究，项目编号为20132BAB204016。已发表论文：WanC,LiS,LiuL,etal.CaffeoylquinicAcidsfromtheAerialPartsofChrysanthemumcoronariumL.[J].Plants,2017,6(1):10.李珊珊，万春鹏，刘琳，等.茼蒿提取物及其不同柱层析馏分对西瓜枯萎病菌的抑制作用[J].江西农业大学学报，2017,39(3):502-508.李珊珊，刘琳，李猛，范淑英.茼蒿不同部位浸提液对西瓜枯萎病菌的抑制作用[J].北方园艺，2017(23):29-34.李珊珊，刘琳，李猛，万春鹏，范淑英.茼蒿中绿原酸抑制西瓜枯萎病菌活性研究[J].核农学报，2018,32(01):104-111.申请发明专利：一种茼蒿抑菌活性单体及其使用方法，申请号为2017108944791。47
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