硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究

《硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号Q5学校代码10590UDC570密级公开深圳大学硕士学位论文硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究学位申请人姓名谢永丽专业名称生物学学院（系、所）生命与海洋科学学院指导教师姓名刘琼教授都秀波讲师 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究摘要阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病，其主要特点是记忆缺失和认知损伤。AD的病理特征主要表现为由Aβ沉积形成的老年斑块和由tau蛋白过度磷酸化所形成的神经纤维缠结（NFT）。此外，线粒体动力学异常和功能障碍、自噬损伤和金属离子内稳态紊乱等在AD的发展过程中也起着重要的作用。生物必需微量元素硒对维持中枢神经系统的正常功能具有重要作用，长期缺硒会引起包括AD在内的多种脑疾病。硒甲基硒代半胱氨酸（SMC）是一种广泛存在于植物中的天然有机硒化合物，与无机硒相比，具有毒性低，生物利用度高等特点。SMC具有明显的抗氧化和抗肿瘤作用，但其在神经退行性疾病包括AD中的作用尚无报道。本研究中，我们采用三转基因AD模型小鼠(3×TgAD)，通过水迷宫、旷场实验、Westernblot、ICP-MS、同步辐射X射线荧光（SR-XRF）、Gallys染色、尼氏染色和线粒体延时成像等方法，研究了SMC（3μg/mL）从2月龄开始给药12个月对AD模型小鼠的相关病理指标的干预作用和分子机制。研究发现：1、SMC显著提高AD模型小鼠的空间学习能力和记忆能力，并改善AD模型鼠的焦虑情绪；2、SMC抑制AD模型小鼠脑内Aβ病理和tau病理，改善神经元活性和突触蛋白的表达；3、SMC对AD模型小鼠脑内多种金属离子的含量和分布异常具有一定的调节作用；4、SMC通过调控雷帕霉素靶酶(mTOR)活性促进自噬发生，进而促进自噬体生成自噬溶酶体，以清除错误折叠蛋白。5、SMC通过激活AKT促进线粒体的生物发生并抑制线粒体凋亡；通过调节线粒体能量代谢相关蛋白的表达纠正体内ATP产生障碍；维护线粒体分裂融合的平衡并改善线粒体在神经元轴突内的运输障碍；保护线粒体膜电位和并抑制线粒体膜孔通道的过度开放。基于SMC对AD模型中Aβ病理和Tau病理的干预作用，对金属离子内稳态的调控作用，对自噬受损的改善作用，及对线粒体动力学和功能的保护作用，有望将SMC开发为一种潜在的AD干预药物或保健品。I 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究关键词：阿尔茨海默病；SMC；自噬；线粒体；金属离子II Se-Methylseleno-L-CysteineinterfereswithAlzheimer'sdiseasepathogenesisbytheregulationofauthophagyandmitochondriaAbstractAlzheimer'sdisease(AD)isanage-relatedneurodegenerativedisease,whichischaracterizedbymemorylossandcognitiveimpairment.TheprimarypathologicalfeaturesofADareAβdepositiontoformsenileplaquesandexcessivetauproteinphosphorylationtogenerateneurofibrillarytangles(NFT).Moreover,dyshomeostasisofmetalionsanddysfunctionofmitochondriaandautophagyacceleratedthedevelopmentofADpathology,whichpromotedAβaggregation,tauphosphoylation,andfinallyresultedintheirreversiblesynapticlossandneuronaldamage.Asavitaltraceelement,selenium(Se)isessentialforproperbrainfunctionandmaybebeneficialinreducingAlzheimer’spathology.Se-methylselenocysteine(SMC),anaturallyoccruingorganoseleniumcompoundfoundinmanykindsofplants,haslowertoxicitybutbetterbioavailabilitythaninorganicseleno-compound.StudiesonSMCaremainlyfocusedonitsanti-canceroranti-oxidantactivity,itspotentialinneurodegenerativedisordersincludingADhasremainedelusive.Inthisstudy,weexaminedthepotentialeffectsofSMContripletransgenicAD(3×TgAD)miceusingthemethodsofMorriswatermaze,openfieldtest,westernblotanalysis,ICP-MS,SR-XRF,Gallysstaining,Nissl'sstainingandmitochondriatime-lapseimaging,etc.ADmodelmiceweretreatedwith3μg/mlSMCindrinkingwaterfor12monthsstartingfrom2-monthage.Wefound:1)SMCimprovedspatiallearningandmemorydeficitsof3×TgADmice;2)SMCtreatmentsignificantlyreducedAβandtaupathology,andsubsequentlypreservedneuronalactivityandsynapticproteinsinthebrainsof3×TgADmice;3)SMCmodulatedthelevelsanddistributionofseveralmetalionsinADmousebrains;4)SMCpromotedautophagyandthegenerationofautophagolysosomebyregulationtheactivityofmTOR;5)SMCstimulatedMitobiogenesisandinhibitedMitoapoptosisbyactivationofAKT,promotedATPgenerationbyincreasingtheexpressionofenergymetabolismrelatedproteins,maintainedbalancebetweenMitofissionandfusion,improvedtheMitomobilityintheneuronalaxons,andprotectedMitomembranepotentialandmPTP.Insum,ourstudysuggestedSMCasapromisingcompoundforthepreventionorinterventionofAD.IV Se-Methylseleno-L-CysteineinterfereswithAlzheimer'sdiseasepathogenesisbytheregulationofauthophagyandmitochondriaKeywords:Alzheimer'sdisease(AD);Se-methylselenocysteine(SMC);Mitochondria;autophagy;metalionsV 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究目录摘要...........................................................IAbstract......................................................IV第一章前言....................................................11.1阿尔茨海默症概述...........................................11.2阿尔茨海默症发病机制假说...................................11.2.1淀粉样蛋白级联假说....................................21.2.2Tau蛋白异常磷酸化假说................................31.2.3自噬障碍假说..........................................41.2.4线粒体功能紊乱假说....................................71.2.5其他假说..............................................91.3阿尔茨海默症疾病治疗药物进展...............................91.3.1以Aβ和Tau蛋白为靶点的相关药物......................91.3.2以胆碱能为靶点的相关药物............................111.3.3自噬调控与阿尔茨海默症..............................111.3.4线粒体调控与阿尔茨海默症............................121.3.5其他.................................................121.4硒类药物在阿尔茨海默症中的研究进展........................131.4.1硒的生物学功能.......................................131.4.2硒类药物的研究.......................................131.5本实验研究创新性..........................................14第二章材料与方法.............................................152.1实验材料..................................................152.1.1实验动物和药物.......................................152.1.2实验细胞系...........................................152.1.3实验试剂.............................................15 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究2.1.4实验仪器.............................................172.1.5实验主要试剂配制.....................................182.16实验主要抗体..........................................212.2实验方法..................................................232.2.1实验动物饲养.........................................232.2.2实验动物分组.........................................232.2.3行为学检测SMC对3xTg小鼠治疗效果....................232.2.4小鼠脑组织解剖及冰冻切片制作.........................252.2.5组织切片染色.........................................252.2.6蛋白提取及WesternBlot检测..........................262.2.7ICP-MS检测小鼠脑组织金属离子含量....................292.2.8同步辐射X射线荧光（SR-XRF）检测小鼠脑内金属离子含量和分布.........................................................292.2.9皮层原代神经元培养...................................302.2.10细胞系培养..........................................312.2.11线粒体损伤检测......................................31第三章实验结果与分析.........................................363.1SMC对14月龄3xTgAD小鼠行为学的影响.....................363.1.1Morris水迷宫检测小鼠空间探索和记忆能力................363.1.2旷场实验检测小鼠自发活动与探索行为...................383.2SMC调节3xTg-AD小鼠脑内金属离子的含量和分布...............383.2.1SMC对3xTg-AD小鼠皮层区金属离子含量的影响............383.2.2SMC对3xTg-AD小鼠海马和皮层区金属离子分布的调节作用..393.3SMC对3xTg-AD小鼠Aβ病理、Tau病理及突触蛋白表达水平的影响..............................................................423.3.1SMC抑制3xTg-AD小鼠的Aβ病理.......................423.3.2SMC抑制3xTg-AD小鼠的tau病理.......................443.3.3SMC保护3xTg-AD小鼠突触蛋白并改善神经元活性..........45 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究3.4SMC对3xTg-AD小鼠脑内自噬活性的调控作用..................463.5SMC对AD模型中线粒体动力学和功能的调控作用...............503.5.1SMC促进了3xTg-AD小鼠脑内线粒体的生物发生............503.5.2SMC促进了3xTg-AD小鼠脑内线粒体的能量代谢障碍.......513.5.3SMC对3xTg-AD小鼠脑内线粒体分裂融合平衡的调控作用...523.5.4SMC对AD模型中线粒体凋亡和线粒体膜损伤的抑制作用.....523.5.5SMC对AD神经元轴突内线粒体指数和运动的影响...........54第四章讨论...................................................57第五章结论...................................................67参考文献......................................................68附录一、攻读硕士研究生期间的研究成果..........................78附录二、英文缩写对照表........................................79致谢..........................................................80 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究第一章前言1.1阿尔茨海默症概述阿尔茨海默病（Alzheimers’Disease,AD）是一种与年龄相关的，多因素的，神经退行性疾病，其主要特点为记忆缺失、认知损伤，并因此而改变人的性格和行为活动。来自2016年的世界阿尔茨海默病报告揭示：目前，540万美国人患有AD病，到2050年可能会增加到160万。随着老龄化人口的增加，不仅仅是在美国而是在全世界，AD病成为一个主要关注的健康问题。AD病对经济有巨大的影响，在2016年单单是痴呆健康治疗这一项花费的经费已经达到了8300亿美元[1]。尽管加大了AD的研究力度，现今仍没有药物或者候选药能够延迟或者预防AD的发生发展，以及没有任何可以用于直接诊断早期AD的生物标记物。阿尔茨海默病与以下几个方面有关：突触丢失、线粒体功能缺失、自噬障碍、淀粉样蛋白（Aβ）的产生和聚集、神经炎症反应、磷酸化tau蛋白的形成和聚集、金属离子失调；这些方面都会造成钙失调以及神经元缺失，并且在大脑的学习和记忆区域产生老年斑块聚集和形成神经纤维缠结（NFT）[2]。突触的病理变化以及线粒体损伤已经鉴定为AD病理过程中的早期事件[3]。而在AD病人中，Aβ的聚集以及磷酸化tau蛋白在突触的错误定位造成神经元的饥饿和凋亡[4]。目前，造成AD病理发生的确切原因还不是很清楚。近年来，对于AD的研究还在继续，但是用于临床的药物还是少之又少，且治疗效果小以及产生的副作用大。AD病机制的深入研究以及进一步探索可靠的诊断标记和研究有效的缓解、预防药物仍然是现今的研究方向。1.2阿尔茨海默症发病机制假说AD病的致病因素有很多，目前并不是所有的致病因素都被研究者掌握，只能解释部分现象。目前学术界主要存在的假说有：Aβ级联假说；tau蛋白过度磷酸化假说；此外还存在基因假说、炎症反应假说、自由基代谢异常假说、金属代谢1 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究紊乱等等。另外自噬功能障碍以及线粒体功能障碍等均能引起AD的发生发展，并且近年来的研究越来越多。对于多因素发病的AD病来说，从单方面已无法进行充分解释，需要从多角度进行。1.2.1淀粉样蛋白级联假说该学说认为，AD患者脑内Aβ的产生与清除的失衡是AD发病的先决条件，引起神经元的退化直至痴呆的发生，该假说提出后被大多数学者所认可。Aβ多肽是胞外老年斑块的主要成分，其主要是淀粉样前体蛋白（Amyloidprecursorprotein,APP）在内质网、高尔基体、或者内体小泡-溶酶体途径代谢过程中异常切割产生40个氨基酸多肽（Aβ[5]1-40）或者产生42个氨基酸多肽（Aβ1-42）。而APP是一种I型跨膜糖蛋白。在哺乳动物体中除了APP之外还有类APP样蛋白1（APLP1）和类APP样蛋白2（APLP2）。尽管APP在哺乳动物或者非哺乳动物中广泛表达，但是APP的作用还不是很清楚[6]。APP多肽经历翻译后修饰（例如糖基化或磷酸化），随后通过分泌途径附着在质膜上，通过内吞作用到达核内质系统。一部分的APP会重新循环运输到细胞表面，而另一部分的APP将会到达溶酶体进行降解。在稳定状态下，APP会定位在高尔基体以及高尔基体转运网络中，只有小部分定位在细胞表面[7]。APP会经历两种不同的途径进行翻译后修饰。淀粉样蛋白途径涉及到β淀粉酶和γ淀粉酶的连续切割，从而产生Aβ。第二种途径是由α分泌酶和γ分泌酶连续切割但是不产生Aβ。α分泌酶是在Aβ肽段区域进行切割，阻止了Aβ的形成。研究显示蛋白酶属于金属蛋白酶（A-disintegrinandmetalloproteinase,ADAM）家族，具有α分泌酶活性[8]。ADAM是细胞表面蛋白，α分泌酶切割可能发生在质膜水平以及膜上的APP库[9]。由α分泌酶切割产生氨基酸末端片段称为分泌型APP即(sAPP)α和碳末端片段CTF83。β分泌酶是一种I型跨膜蛋白，由其切割产生sAPPβ和CTF99。与α分泌酶切割不同的是，β分泌酶切割主要发生在细胞内小泡而不是细胞表面，而此处会使得BACE1（β-siteAPPcleavingenzyme-1）和APP迅速回收。γ分泌酶的切割产生的Aβ肽有不同的长度，将38到43个氨基酸的Aβ肽切割产生Aβ1-40和Aβ1-42形式的淀粉样蛋白。与Aβ1-40相比，Aβ1-42的原纤维形式和神经毒性更高。研究发现，Aβ对于体外培养的神经元具有显著的毒性，从而导致神经元的功能失2 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究调和死亡[10]。APP经过一系列的切割后已经很难区分这些产物所起的作用，然而一般而言，在APP以及其切割产物sAPPα对大脑是有益的。APP可以促进细胞增殖、干细胞分化、突触生长、细胞黏着以及调节长时程增强（LTP，long-termpotentiation）。然而研究显示在APP-KO小鼠是生长完好以及可以生育的，说明APP对于小鼠的生长并不是很重要。然而在缺失APP的小鼠中却出现了体重和脑体积减少，痉挛和LTP损伤。这些现象可以采用增加sAPPα来缓解，说明sAPPα在大脑中可能起了重要作用[11]。Aβ单体对细胞不造成毒性，且可以调节神经元活性，促进神经元短暂生长，但是当Aβ寡聚体聚集成β结构或者大的纤维后会在细胞外形成老年斑块，造成神经毒性，加速AD病的病例进程[12]。在此过程中丝状的Aβ1-42异构体会引发其他β-淀粉样蛋白的错误折叠。最初认为只有老年斑中的不溶性的Aβ具有神经毒性，有报道证实可溶性的Aβ寡聚体也能破坏海马的LTP和神经突触可塑性[13]。1.2.2Tau蛋白异常磷酸化假说Tau蛋白是微管相关蛋白家族的成员之一，tau蛋白基因位于17号染色体长臂上，长臂超过100kb，含有16个外显子，通过转录后mRNA不同方式的剪切，翻译后形成tau蛋白。Tau蛋白几乎全部分布于轴突中，只有少部分位于神经细胞体和树突中。Tau蛋白存在六种异构体，其不同之处在于C端重复序列（R）的数量以及N端的一个或者两个插入序列（N），其中重复序列区域与tau蛋白的微管结合功能有关[14]。Tau蛋白主要分布在中枢和神经系统神经细胞的轴突中，tau蛋白对于微管聚集的起始和延伸以及稳定起到十分重要的作用[15]。Tau蛋白是一种与微管组装相关的磷酸蛋白，在正常神经元中，tau蛋白通过在微管间形成交叉结构来聚合微管蛋白，参与微管的组装及稳定，将营养从胞体输送到突触末端。Tau蛋白是一种磷酸化蛋白，正常情况下每mol的tau蛋白包含1-3mol的磷酸，而在AD病人脑中，tau蛋白磷酸化水平比正常人高了3~4倍[16]。NFT是由异常过度磷酸化的tau蛋白组成的。在AD中tau蛋白过度磷酸化使其几乎完全丧失了对微管的亲和力，导致微管解体且危及轴突运输，造成神经元及突触的机能障碍。过度磷酸化的tau蛋白容易发生沉积形成不溶性丝状缠结，进一步损伤神经细胞。Tau蛋白的活性主要受到多个磷酸化位点的调控，磷酸化激酶主要3 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究有GSK-3β、PKA、CDK5、CD2。其磷酸化位点有85个，因为tau的非折叠结构形式，许多位点受到磷酸化并且实验中发现的磷酸化位点有45个[16]，其中主要的磷酸化位点有Ser396、Ser404、Ser422、pT231在AD中富集较多。过度磷酸化的tau蛋白聚集后进一步形成NFT，最终不能维持神经元的形态进而使细胞死亡。然而在研究中哪些位点的磷酸化在AD病中起作用，或者哪些位点磷酸化使tau蛋白更加有毒性，至今的研究还不是很清楚[17]，这将成为今后研究的热点。当tau蛋白过度磷酸化后，蛋白磷酸酶2A（PP2A）可以通过去磷酸化作用将过度磷酸化的tau蛋白逆转回来。与AD组相比，治疗组在刺激过程中tau可以快速（~2h）进行重新分配和高度磷酸化，说明在生理条件下而不是在病理条件下，此效应可以得到逆转[17,18]。当磷酸化和去磷酸化的平衡被破坏时，PP2A的活性会受到环境的影响而下降，使得tau蛋白进一步磷酸化，加重AD病的发展。目前，tau蛋白过度磷酸化与NFT的形成是AD的起因还是结果还不是很清楚。只能确定tau蛋白磷酸化在AD的发病过程中起着重要的作用。1.2.3自噬障碍假说（1）自噬简介自噬是一种分解代谢过程，使用自身的酶分解错误折叠的蛋白或者受损及衰老的细胞器，更新长寿命蛋白，并将这些降解的成分转运至溶酶体进行进一步的降解，起到对细胞保护及更新换代的作用[19]。自噬（Autophagy）即自己吃掉自己，这里有三种不同的生理功能的自噬基本类型：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）、分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy）。在真核生物中，自噬降解途径主要通过巨自噬的方式进行。巨自噬，这里我们简称为自噬，是蛋白质和细胞器降解的主要方式，通过形成双层膜囊泡状的自噬体（autoph-agosome）来降解蛋白质和细胞器。为了降解细胞质成分，自噬体将会融合溶酶体形成自噬溶酶体（autolysosome）[20]。研究显示，自噬可以在神经元中起到细胞质量控制的作用以及可以维持正常的内稳态，并且自噬功能障碍将会导致神经退行性疾病的发生，例如：阿尔茨海默病[21]。（2）自噬形成过程自噬的过程涉及一系列的步骤，包括自噬的起始，载体识别和分选，囊泡的形4 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究成，自噬体-溶酶体融合，载体消化以及最终释放消化物质到胞质[22]。目前研究显示自噬起始可以是由多种刺激引起的，例如：蛋白质的变性和聚集，细胞器损伤、氧化应激、缺氧以及应激[23]。自噬模型建立最好的是在酵母细胞中且涉及多种自噬相关蛋白（autophagy-related,ATG）。当自噬引起后，双层膜的吞噬泡（phagophore）会在ATG蛋白的作用下扩展延伸，ATG蛋白与吞噬泡融合成的杂合体也称为自噬前体，会继续包裹自噬底物最终扩展延伸成封闭的的球形自噬体（autophagosome）。当自噬体形成后，ATG蛋白会脱离自噬体重新进入下一轮的自噬体组装。而此时自噬体会继续与溶酶体融合形成自噬溶酶体（auto-lysosome），自噬溶酶体内包裹了各种酸性的水解酶用于将物质进行水解，如：组织蛋白酶D（cathepsinD,CatD）[24]。（3）自噬调控机制研究至今，与自噬形成过程相关的ATG蛋白有35种与之相关的基因有50多种，而在自噬的上游还存在对自噬更加复杂的调控机制。在哺乳动物中，雷帕霉素靶酶（thekinasemammaliantargetofrapamycin,mTOR)是自噬的主要调节器，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。mTOR会接受来自不同信号通路的信号，除了那些感知细胞能量状态的信号或者终止蛋白质合成的信号[25]。研究首次提出将mTOR作为免疫抑制剂的生理学靶点[26]。mTOR是磷脂酰肌醇3激酶（phos-phatidylinositol3kinase，PI3K）以及AKT激酶（AKT）的下游底物，当胞外信号激活PI3K后，将会募集AKT并使其磷酸化，当AKT磷酸化后会作用于mTOR。磷酸化的mTOR（p-mTOR）会结合下游的40S核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）从而抑制自噬先关蛋白的功能进而抑制自噬体的产生。而自噬体的形成需要ATG1（哺乳动物中是ULK1，Unc-51-likekinase1）与ATG13和ATG17（哺乳动物中是FIP200，thefocaladhesionkinasefamily-interactingproteinof200kD）形成复合物的介导[27]。研究显示，当胞内营养充足时，mTOR活性激活通过与ULK1-ATG13-FIP200复合物结合以及磷酸化ULK1和ATG13从而抑制自噬体的形成[28]。而当mTOR活性受到抑制或者饥饿条件下ULK1去磷酸化，从而自噬起始。mTOR在自噬体与溶酶体的稳态中也起到了重要的作用[29]。而自噬溶酶体降解产物是在长时间饥饿的情况下将会导致mTOR的重新激活，抑制自噬的进行[29]。而研究认为p70S6K是自噬的负调控因子[30]。另外，自噬还与能量代谢有关。mTOR还能通过AMP依赖蛋白激酶（AMP-dependentproteinkinase,AMPK)调5 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究节。当胞内受到氧化应激或者ATP水平较低时，AMPK酶被激活，从而抑制mTOR的活性，促进自噬体的产生从而降解更多的物质产生能量供应生物体[31]。在自噬的发展过程中，FIP200在复合物中也会与ATG16结合，而ATG16会进一步结合ATG5和ATG12形成ATG12-ATG5-ATG16复合物与PE结合共轭到LC3B（microtubule-associatedprotein1lightchain3beta）上，LC3B的同源物是ATG8，在自噬早期阶段被ATG4切割后形成LC3-I,接着在ATG8、ATG7和ATG3的活化下与PE共轭形成LC3-II，进一步使得双层膜结构延伸形成包裹自噬体[32]。LC3II接着会携带变性和聚集的蛋白质以及损伤的细胞器进入自噬体[33]。当自噬体闭合后大多数的自噬相关蛋白会从囊泡上掉落，而LC3-II一直留在自噬体上直到自噬溶酶体降解，因此在研究中可以将LC3-II作为自噬体的标志物进行追踪。在哺乳动物系统中p62/SQSTM1(sequestosome1)参与泛素载体蛋白识别，作为自噬接头分子，p62会与LC3-II结合，将需要降解的底物运输到自噬体中与底物一起进行降解。若自噬功能障碍，自噬体中的底物以及p62大量积累得不到及时的清除，因此在研究中，可以检测p62的水平来表征自噬体清除效率。另外，自噬的起始还可以通过III型PI3K（classIIIphosphatidylinositol-3kinase）与Vps15(p150),Atg14(Barkor)和ATG6(beclin1)形成复合物来激活自噬。研究显示beclin1和ATG7的敲除导致自噬的损伤以及AD病中APP的进一步恶化[34]。而beclin1的过表达可以降低AD转基因小鼠的胞外和胞内Aβ含量[35]。Beclin1是自噬起始所必须的，研究显示在AD病人的大脑中beclin1的含量是下降的，在AD转基因小鼠模型中beclin1的下降导致了自噬能力下降，使得Aβ聚集以及神经退行性疾病的恶化[35]。（4）自噬与AD的发展在AD病人的大脑中可以观察到营养不良的神经突触中聚集了大量的自噬体[36]。说明在自噬溶酶体中存在干扰细胞质成分降解的物质。早老素1（PS1）与家族性AD有关，其包含在γ-分泌酶中以及在成熟的V-ATP酶中起着重要的作用，并且与溶酶体的酸化有密切的关系。若溶酶体酸化障碍将会造成自噬溶酶体形成受到阻碍，导致自噬体的聚集以及自噬体中Aβ的聚集[23,37]。此外，在AD模型鼠中，通过雷帕霉素抑制mTOR信号通路激活的自噬降低了Aβ的水平以及改善了认知功能障碍[38]。这些研究提示自噬在AD中起着重要的作用，而控制自噬的程度可能是在治疗AD中是一个潜在的治疗方法。6 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究1.2.4线粒体功能紊乱假说线粒体是真和生物中的双层膜细胞器，是生物体内提供能量重要的细胞器，人体内90%的能量是由线粒体产生的[39]。线粒体可以不断的给细胞提供三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）。研究表明线粒体功能障碍发生在AD早期阶段，早于老年斑的形成，说明线粒体损伤是AD早期发生发展的一个重要因素[53]。（1）线粒体生物发生线粒体生物发生在维持细胞健康内稳态中起着重要的作用，线粒体生物发生改变或者核基因编码的线粒体蛋白改变时，线粒体功能发生障碍[41,42]。研究显示与正常人相比在AD病人脑的海马体中以及在过表达突变APP的M17细胞中线粒体的个数是减少的[43]，说明在AD中线粒体的生物发生是损伤的。当细胞不能产生线粒体时，将会依赖于线粒体转录系统即通过核调节蛋白，包括NRF1、NRF2(nuclearrespiratoryfactors1and2)和mTFA（mitochondrialtranscriptionfactorA）[43]。NRF1是核基因的转录激活子，负责线粒体呼吸酶的拷贝数，其包括五种呼吸链复合物[44]。同时，NRF1也是激活mTFA的必须因子[45]，一旦mtDNA需要进行转录和翻译时，NRF1对于线粒体的生物发生至关重要[44]。研究显示，在3xTgAD小鼠中，NRF1的水平是下降的[46]。并且在APP/PS1的转基因鼠中也发现与正常组相比NRF1的水平是显著下降的[47]。NRF2也高度参与了线粒体生物发生。在现阶段的研究中发现在3xTgAD小鼠海马区NRF2的水平显著下降[46]，且之前的研究也显示在3月龄APP/PS1的转基因动物中[47]以及PS1/PS2敲除的细胞中[48]NRF2的转录水平是下降的。当然，除了NRF1外，NRF2也参与激活mTFA[45,49]。mTFA的增加会使得mTFA-mtDNA减少，从而促使线粒体转录。并且在线粒体中ND1(NADHdehydrogenasesubunit1)可以激活mTFA，ND1是线粒体呼吸链编码蛋白，其蛋白水平下降将会使得线粒体功能障碍[50]。（2）线粒体能量代谢在产能过程中，线粒体的电子从呼吸链复合物I（COXI）传递到呼吸链复合物IV（COXIV），电子从低电位的传递至高电位从而造成电势差，产生线粒体的7 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究产能能源。线粒体还是胞内钙离子缓冲器，维持胞内钙离子稳定[51]。当钙稳态失调时会使得线粒体膜孔通道转换孔（mitochondrialpermeabilitytransitionpore，mPTP）开放诱导凋亡。而mPTP的开放会使得促凋亡蛋白释放到胞质中，激活半胱天冬酶（caspase）级联反应[52]。多项研究显示，在AD病人和转基因AD小鼠中检测发现与线粒体代谢功能相关的关键酶如细胞色素C氧化酶（cytochromecoxidase，COX）、丙酮酸脱氢酶（pyruvatedehydrogenase，PDH）的表达水平及活性均显著性下降[53]。COXIV是由至少13条肽链组成的，所起的作用主要是将从细胞色素c获得的电子传递给氧分子，还原氧负离子的同时结合基质中的质子并生成水。兼具质子泵的功能，将电子泵出的同时到达线粒体膜间隙，推动ATP的合成。有研究显示Aβ的聚集通过ABAD(amyloid-βbindingdehydrogenase)阻断呼吸链对电子的传递，干扰了COXIV的活性，最终抑制ATP的生成，导致能量供应不足，神经系统功能失常[54]。PDH复合物是由PDHE1、PDHE2、PDHE3以及相应的辅因子组成的[55]。而PDHE1α是PDHE1的一个亚基，在催化丙酮酸转化为CoA中起着关键作用。而CoA可以进入三羧酸循环产生大量的ATP。若PDHE1α表达水平下降，将会最终影响ATP的产生。研究证明，在AD病中PDHE1α表达水平下降[39]。（3）线粒体分裂融合在细胞内线粒体是以多种形式存在的，而形态的差异是与线粒体的分裂（fission）与融合（fusion）的动态平衡有关。而线粒体的分裂与融合也与线粒体的分布和活性密切相关。在真核生物细胞中，不同的线粒体沿着微管运动，当处于同一条微管相遇时可能发生融合，而融合需要外膜线粒体融合蛋白1(mitofusin1，Mfn1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin2，Mfn2)及内膜视神经萎缩蛋白1(opticatrophy1，OPA1)的参与[56]。而线粒体分裂由动力相关蛋白1(dynamin-relatedprotein1,Drp1)和线粒体分裂蛋白1(fission1，Fis1)调控。Fis1分布在线粒体外膜的受体上，募集Drp1参与线粒体的分裂。为了研究线粒体在AD神经元中的分布，王等人，在成神经细胞瘤（M17）细胞中沉默了DRP1、OPA1、Mfn1、Mfn2基因以及过表达了Fis1来研究线粒体的分布。研究发现在AD神经元中基本上线粒体都集中在细胞核周围，而在远离细胞核的区域基本上没有线粒体[57]。另一方面，Calkins等人采用过表达APP的小鼠原代神经元以及细胞系，使用分子和电子显微镜来研究线粒体的运动、含量、分布以及线粒体运8 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究输。研究发现与野生型组相比，过表达APP的海马神经元中聚集了大量的线粒体碎片，并且进一步发现在过表达突变的APP和Aβ神经元中线粒体的顺行运动减少，说明线粒体的分布是不正常的以及神经元的突触退化[58]。提示线粒体动力学失衡引起线粒体的异常分布对AD的发生发展至关重要。1.2.5其他假说另外还有一些关于AD发病机制的机理假说，例如基因假说、炎症反应、自由基代谢异常、金属离子代谢紊乱等等。1.3阿尔茨海默症疾病治疗药物进展研究有效的治疗神经退行性疾病的候选药物是现代社会一个比较有风险性及挑战性的难题。Cammings等人报道，在2002–2012期间，413种临床药物实验中只有244种可以作为有希望治疗AD的药物，而其中只有124种药物进入临床I期，206种进入临床II期，最终只有83种进入临床III期。直到2007年美国食品和药物管理局引进临床药物强制注册管理办法，只有54种药物能进入临床III期[59]。尽管花费了大量的研究以及金钱，如今在市场上仍然没有能够有效的治疗AD的药物。目前，临床上大量使用的抗AD药物有多奈哌齐（爱亿欣）、加兰他敏（利忆灵）、卡巴拉汀（艾斯能）和美金刚。前三种都是乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂（AChEI）。而美金刚是谷氨酸受体的天门冬氨酸（NMDA）亚型的低亲和力非竞争性拮抗剂[60]。其余的药物都还处于临床研究当中。药物研究主要以以下的靶点进行。1.3.1以Aβ和Tau蛋白为靶点的相关药物诱发Aβ的其中一个机制是Aβ的沉积，因此在AD药物研究中降低Aβ是当前的研究热点。第一类药物主要目的是加速Aβ清除。采用免疫疗法，目前ElyLilly研究的疫苗最成功可溶性单体是Solanezumab，但是却在III期临床的时候失败了，有小部分的患者却从中受益。Lilly在2016年10月份多这小部分人进9 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究行III期临床试验，并且有希望在2017年用于AD患者[59,61]。2015年9月UnitedBiomedical公司发行了疫苗UB-311，用于结合Aβ[62]1-14的N端。由ACImmune和Genetech公司引进的Crenezumab可作用于可溶性和聚集的Aβ，目前以高剂量治疗达到临床II期[63]；目前有9种疫苗正处于临床I期的研究中，其中的5种是用于干扰Aβ的形成：SAR-228810(Sanofi公司),MEDI-1814(AstraZeneca),KHK-6640(KyowaHakkoKirin),Lu-AF-20513(Lundbeck)，TTP-4000(TransTechPharma)。虽然免疫疗法一定程度上减少了Aβ的形成，但是免疫疗法除了治疗AD外还伴随有其他的复杂作用，实验过程中容易出现脑膜炎、局部脑出血、血管源性水肿等等，免疫疗法治疗用于临床还需要攻克很多困难。第二类药物主要是降低Aβ的生成，主要包括：α-分泌酶激动剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂；β-和γ-分泌酶切割会直接产生Aβ。目前正在研究的大量候选药物都是β-分泌酶抑制剂（BACE-1）。特别是MK8931或者Verubecestat、AZD-3293(LY-3314814)、JNJ-54861911目前正处于临床III期研究，用于治疗中度到重度的AD患者。而BACE-1抑制剂E-2609处于临床II期试验，以及候选药物BI-1181181正处于临床I期研究当中。而γ-分泌酶抑制剂处于临床实验：EVP-0962处于临床II期研究和BMS-932481处于临床I期研究[60]第三类药物主要阻止Aβ聚集形成老年斑。正在进行III期临床的药物ALZT-OP1有望发展为预防和治疗早期AD，能够抑制Aβ的聚集和神经炎症。GV-971是治疗中度到重度AD病的候选药物，目前正在进行III期临床实验，体外实验显示其可以降低Aβ的毒性。II期临床实验还包括多种小分子化合物：Posiphen在临床前实验中可以降低APP和Aβ的水平，有望用于治疗MCI、AD、帕金森[64]；Scyllo-Inositol(ELND005)在AD患者的临床II期实验中可以降低Aβ聚集，但是结论还存在争议[65]。与Aβ治疗一样，Tau蛋白的治疗也存在免疫疗法，目前存在几种正在研究的疫苗。RG-7345正处于临床I期研究；AADvac-1致力于治疗中度到重度发展的AD患者，且目前正在进行II期临床研究；而Methyleneblue(MB)在20年前发现可以阻碍Tau聚集，目前在AD治疗领域上成功完成II期研究[66]，准备投入到临床III期。另一个候选药TPI-287，实验证明可以稳定微管结构,，正处于临床I期研究。10 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究1.3.2以胆碱能为靶点的相关药物胆碱酯酶抑制剂（CholinesteraseInhibitors,ChEI）用于研究治疗AD在研究史上是最快和最多的。但是ChEI的强大效应是依赖于完整的突触前神经元。很显然，突触前神经元在疾病的晚期出现大量的减少，特别是在类胆碱神经元中数目是显著性的减少。ChEI的药效目前研究还是很低[79]。目前ChEI的研究聚焦于选择性抑制剂BuChE即Bisnorcymserine；BuChE非选择性抑制剂Memogain；这两种AD药物还处在临床I期研究当中。1.3.3自噬调控与阿尔茨海默症在AD病人大脑的肿胀和营养失调的神经元中可以观察到大量的自噬小体中包含了沉积的Aβ，说明自噬是与AD是密切相关的[67]。牛蒡甙元（arctigenin）是菊科植物中发现的木酚素，包括大牛蒡（牛蒡子）(Arctiumlappa)和钻叶风毛菊（Saussureaheteromalla）。在AD细胞模型和转基因小鼠模型中，采用牛蒡甙元进行治疗发现降低了BACE-1的表达量以及抑制了Aβ的产生。牛蒡甙元可能是促进了自噬去清除淀粉样前体蛋白，其途径可能是通过激活(Akt)/mTOR途径以及激活AMPK途径[68]。白藜芦醇（Resveratrol）是一种从葡萄中提取的植物抗毒素，具有多种生物活性。在Aβ转基因线虫的研究中发现在培养基中添加100μM的白藜芦醇给予线虫孵化，降低了异常Aβ的产生，其发现的结果是白藜芦醇介导了自噬小体的形成激活。研究结果表明白藜芦醇可以激活自噬从而减少Aβ的毒性[68]。雷公藤甲素(Triptolide)是以一种昆明山海棠植物中提取出来的有效成分，具有抗氧化和神经保护作用。在AD细胞模型PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）中，采用雷公藤甲素进行处理发现降低了细胞中Aβ的毒性以及减少了细胞的凋亡，而这个是与雷公藤甲素介导了自噬有关[69]。在APP/PS1转基因小鼠模型中，采用姜黄素（curcumin）治疗后进行脑部切片免疫组化验证，姜黄成分的姜黄素抑制了Aβ的产生；免疫荧光和免疫蛋白印记分析（westernblot）证明姜黄素提高了自噬相关蛋白LC3的表达水平，而PI3K、磷酸化AKT、磷酸化mTOR的表达水平下降。因此实验推测：Aβ的减少可能是通过11 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究PI3K/Akt/mTOR途径来激活自噬的[70]。以上的实验研究表明，在AD病的治疗中，自噬可以作为一个潜在的治疗靶标[71]。1.3.4线粒体调控与阿尔茨海默症线粒体机能不足会导致AD病理过程，研究已经在AD患者大脑，血细胞和神经瘤母细胞中得到证实。线粒体功能失调会增加AD的线粒体DNA(mtDNA)的删除、突变、基因多态性；损伤钙信号通路；损伤能量代谢。而这些与Aβ、tau蛋白有关。Aβ损伤能量代谢过程，使得呼吸酶活性缺失，增加了ROS，破坏了线粒体膜电位（Δψm）导致mPTP开放，改变了线粒体的生物学和动力学[72]。有研究显示，在mAPP/ABAD转基因小鼠中，ABAD增加了Aβ介导的细胞应激，促进神经元中ROS的释放。因此有研究认为将ABAD调节器作为线粒体的一个靶标来治疗AD是一种新型的治疗方式[73,74]。ABAD调节器可以增加COX活性和ATP水平，说明其可以保护线粒体性能[73]。夫仑替唑（Frentizole）是一种免疫抑制药，已经鉴定可以抑制Aβ-ABAD反应；其他的苯并噻唑脲衍生物（benzothiazoleureaderivatives）和夫仑替唑类似物已经研制出[75]。在AD病理过程中mPTP与细胞和神经元稳定性有密切的关系。目前有一系列的喹唑啉脲衍生物正在研发[76]，其用于调节Aβ减缓对线粒体功能障碍，抵制Aβ干扰Δψm和mPTP。从实验研究中可以将mPTP作为一个新的方向设计mPTP调节器来治疗AD[72]1.3.5其他而其他靶点的药物还存在金属螯合剂，如：氯碘羟喹（CQ）用于螯合Cu；PBT-2可以螯合Cu、Zn；早年开发的Fe螯合剂有铁敏，其他的Fe螯合剂还有VK-28、DP-109、Feralex-G等；尼莫地平、维拉帕米、氟桂利嗪、粉防己碱都是Ca拮抗剂。抗氧化靶点存在的药物，如：丁苯酞、葛根素、广藿香醇、五味子酮、红景天苷、南岭柞木苷G等天然活性药物。12 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究1.4硒类药物在阿尔茨海默症中的研究进展1.4.1硒的生物学功能硒（Selenium,Se）是大脑中的一种重要的微量元素，在大脑低硒情况下会优先摄取硒。硒的主要生物化学结构在过去的5年已经呈现出来，适量的补硒对人的身体健康是有益的[77]。Se的生物利用度是根据机体的营养程度的，研究发现有机硒的利用度较高且生物毒性低。目前存在一系列的Se化合物，其可以治疗疾病主要是依赖于它们自身的多种活性[78]。大量研究显示多种形式的Se可以减少体内和体外的AD相关病理指标。实验证明，Se可以干扰老年斑和NFT的形成，除此之外，动物模型研究揭示改变硒含量会影响神经递质传递，而神经递质代谢失调与AD的发生发展有密切关系[79]。人类中，存在25种硒蛋白具有Se的生物学活性[80]。其对生命体都有重要作用，主要的氨基酸形式为硒代蛋氨酸(SeMet)和硒代半胱氨酸(Sec)[81]。这些氨基酸存在于食物中，如：面包，谷类，坚果，肉，鱼及其他海鲜。但是食物中硒的类型与地理位置和季节变换有关，与食物中蛋白质含量和加工过程也有关。并不是每一种硒蛋白的功能都一样。如：谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx1-4,Gpx6)降解氢氧化物形成水或者降解脂质氢氧化物形成乙醇。硒蛋白P(SelP)的序列中包含10种以上的硒代半胱氨酸(Sec)，其主要作用是维持Se的平衡及抗氧化。硫氧还蛋白还原酶(TrxR)在体内维持氧化还原平衡及调节氧化还原信号通路。硒蛋白R（SelR）主要是将蛋白中的R-MetO残基变成蛋氨酸(Met)。其余的硒蛋白，例如：硒蛋白15（Sep15）、硒蛋白M,H,K,N,S,T,V,W,I都是抗氧化剂和转录因子，具体的生物学功能还不是很清楚。1.4.2硒类药物的研究硒类化合物的药物在医药界是不可缺少的，并且在30年前就已经用过硒化合物治疗过疾病。硒化合物的存在形式主要依赖于其化学形态和浓度，这里主要存在有机硒和无机硒两种形式。亚硒酸钠和硒酸钠是两种无机硒化合物，研究表明13 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究其可以治疗癌症、心血管疾病和AD病[82]。具有生物学活性的有机硒包括Se-Met、Se-Cys、硒甲基硒代半胱氨酸（Se-Methyl-Selenocysteine,SMC）、甲基硒酸（MSA）、依布硒啉（ebselen）、硒唑嘌呤（selenazofurin）、乙烷硒啉（ethaselen）、氨苄硒林（amselamine）以及他们的衍生物和类似物。研究显示在Tg2576转基因小鼠中喂养富硒食物和缺硒食物，发现与富硒组相比缺硒组喂养的小鼠脑中形成了大量的Aβ斑块，说明硒的存在与Aβ的清除是有关系的[83]。无机硒亚硒酸钠可以降低原代神经元中Aβ的含量[84],目前在本实验室中研究的有机硒有Se-Met、ebselen、硒酵母以及本文研究的SMC在转基因小鼠模型上均具有潜在的预防AD的效果。SMC是一种广泛存在于食物中的天然有机硒化合物，与无机硒相比，具有毒性低，生物利用度高等特点。SMC具有明显的抗氧化和抗肿瘤作用，但其在神经退行性疾病包括AD中的作用尚无报道。在前期研究中，采用SMC给药小鼠7个月发现显著改善了3xTgAD小鼠的认知障碍及AD病理指标[85]，本实验将进一步研究SMC给药12月以后，探究SMC对AD病的预防效果，为AD病的治疗提供新的理论和实验依据。1.5本实验研究创新性本次研究的重点在于寻找可以适用于临床以及毒副作用较小的治疗药物。以3xTgAD小鼠为模型，检测其药物在行为学、病理学以及分子水平上指标，以此来分析阿尔茨海默病的发病机理及其规律，从而寻找最佳的预防干预时间。通过观察各项病理指标的改善情况，进一步研究SMC对AD的干预机理，为AD病的病程缓解提供有效的科学依据，为临床药物的开发奠定基础。14 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究第二章材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物和药物本研究采用的3xTgAD小鼠（B6;129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/J），野生型小鼠（B6;129SF2/J），均采购于美国Jax实验室，实验分组详见2.2.2。硒甲基硒代半胱氨酸（Se-Methylseleno-L-Cysteine，SMC）采购于LKTLaboratories,Inc.（CasNo.26046-90-2）2.1.2实验细胞系本研究采用的细胞系是小鼠神经瘤N2a细胞（Neuro-2a），及稳转APP695基因的小鼠神经瘤N2a细胞即N2a-APP695-sw（N2a-sw），由厦门大学张云武教授提供。2.1.3实验试剂试剂厂家NaCl广州化学试剂厂KCl广州化学试剂厂Na2HPO4广州化学试剂厂KH2PO4广州化学试剂厂无水乙醇广州化学试剂厂尼氏染液碧云天过硫酸铵上海生工15 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究简易磷酸化蛋白提取试剂盒凯基生物30%丙烯酰胺Biorad4xLoadingBuffer博士德生物青霉素/链霉素碧云天TrissolarbioSDS国药集团甘氨酸Scientificchemical无水甲醇东江化学试剂有限公司Tween-20麦克林PFASigamaTriton100AMRESCOBSAgenviewMOPS碧云天opti-MEM培养基LifetenologyDMEM培养基Lifetenology胎牛血清BI胰蛋白酶粉碧云天Neurobasal-AMediumLifetenologyB27LifetenologyGlnSigama多聚赖氨酸Sigama中性树脂南山化试技硝酸铵上海生工硝酸银上海生工硅钨酸上海生工碳酸钠上海生工硫代硫酸钠上海凌风化学试剂二甲苯南山化试技浓硝酸阿拉丁ATP检测试剂盒碧云天16 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究BCA定量试剂盒Thermomito-GFP-AAV山东维真生物包装OCTTissue-tekPVDF膜GE10-170kD蛋白预染标记Thermo2.1.4实验仪器仪器名称厂家通风柜深圳申立电热鼓风干燥箱上海浦东跃新科学仪厂立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司恒温培养摇（THZ-300）上海一恒科技有限公司水平摇床北京六一仪器厂恒温水浴锅上海精宏小鼠独立通气笼苏杭科技器材有限公司Morris水迷宫仪器成都泰盟科技有限公司高压锅美的冰箱美的正置显微镜CX21OlympusCorporation正置荧光显微镜CX51OlympusCorporation荧光共聚焦显微镜OlympusCorporation微量移液器Gilson酶标仪Model550蛋白电泳仪Tanon电转仪Tanon电子分析天（BS110S）Sartorius高速冷冻离心机5804REppendorf显影仪Carestream-80度冰箱Thermo17 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究纯水仪Millipore超声波破碎仪宁波新芝科技股份有限公司紫外分光光度计岛津生物有限公司NanodropThermo2.1.5实验主要试剂配制（1）PBS（磷酸盐缓冲液）配制试剂用量NaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g加入800mLddH2O搅拌溶解，调节pH7.4值，定容至1L，高温高压灭菌后，0.22μm滤头过滤，4℃保存。（2）WesternBlot相关试剂配制溶液试剂用量溶剂定容备注10%过硫酸铵溶液过硫酸铵1gddH2O10mL可现配现用，分装后-20℃保存（AP）1.5MTris-HCLTris18.15gddH2O100mL0.22μm滤头过滤后，室温保存(pH6.8)1MTris-HCLTris12.1gddH2O100mL0.22μm滤头过滤后，室温保存(pH8.8)10%SDSSDS10gddH2O100mL勿剧烈晃动，可37℃加热溶解18 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究Tris30.3g10x电泳缓冲液甘氨酸144.1gddH2O1L勿剧烈晃动，可37℃加热溶解SDS10gTris1.5g转膜缓冲液甘氨酸7.2gddH2O500mL使用前提前预冷无水甲醇100Ml10xTBS溶液Tris12.14gddH2O1L0.22μm滤头过滤后，4℃保存(pH7.6)NaCl87.75g1xTBST溶液10xTBS50mLddH2O500mL0.22μm滤头过滤后，4℃保存Tween-202.5mL封闭液脱脂奶粉5g1xTBST100mL实验当天配置抗体稀释液相应抗体根据比例1xTBST-存放于4℃（3）免疫荧光相关试剂配制溶液试剂用量溶剂定容备注4%多聚甲醛PFA4gPBS(pH7.4)100mL较难溶，提前一（PFA）周配置TBST（0.2%Triton1000.2mL1xTBS100mL4℃保存Triton100）封闭液BSA1gTBST（0.2%100mL4℃保存Triton100）19 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究（4）线粒体肿胀液配制试剂用量KCl（120mM）0.89gMOPS（20mM）0.418gTris-HCl（10mM）0.1211gKH2PO4（5mM）0.06g加入90mLddH2O搅拌溶解后，滴加盐酸调pH7.4，定容到100mL，4℃保存。（5）细胞系培养试剂配制溶液试剂用量定容备注5%胎牛血清（FBS）5mLN2a细胞45%opti-MEM培养基45mL100mL0.22μm滤头过滤后，完全培养基49%DMEM培养基49mL4℃保存1%青霉素/链霉素1mL5%胎牛血清（FBS）5mLN2a-sw细胞45%opti-MEM培养基45mL0.22μm滤头过滤后，完全培养基49%DMEM培养基49mL100mL4℃保存1%青霉素/链霉素1mL0.2%G418200μL0.25%胰蛋白酶粉0.25g1L0.22μm滤头过滤，-胰蛋白酶1xPBS1L20℃保存冻存液90%FBS900μL10%DMSO100μL1mL现配现用20 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究（6）神经元细胞培养试剂配制溶液试剂用量定容备注DMEM培养基44.5mL0.22μm滤头过滤，现配终止液FBS5mL50mL现用1%青霉素/链霉素500μLNeurobasal-AMedium47.75mL饲养液B271mL50mL0.22μm滤头过滤,4℃1%青霉素/链霉素500μL保存Gln250μL木瓜酶悬浮液Papain40μL4mL0.22μm滤头过滤，现配DMEM培养基3.6mL现用多聚赖氨酸多聚赖氨酸10mg工作浓度0.1mg/mL，（1mg/mL）PBS10mL10mL-20℃避光保存2.1.6实验主要抗体抗体名称主要实验二抗厂家SEEP1WB兔抗Abcam6E10WB，IF鼠抗BioLegendBACE1WB兔抗AbcamAPPWB兔抗AbcampS422-tauWB兔抗AbcampS404-tauWB兔抗AbcampS396-tauWB兔抗AbcampT231-tauWB兔抗Abcam21 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究PP2AWB兔抗AbcamP-PP2AWB兔抗AbcamSynapsin-1WB兔抗RuiyingBiologicalPSD95WB兔抗AbcamAKTWB兔抗AbcamP-AKTWB兔抗AbcamNRF1WB兔抗SantaCruzNRF2WB兔抗SantaCruzPDHE1αWB鼠抗SantaCruzCOXIVWB兔抗AbclonalND1WB羊抗SantaCruzVDAC1WB兔抗ProteintechmTFAWB羊抗SantaCruzMfn2WB兔抗AbcamDRP1WB兔抗SantaCruzCleaved-Caspase3WB兔抗CSTmTORWB兔抗CSTP-mTORWB兔抗CSTP70s6KWB兔抗CSTP-P70s6KWB兔抗CSTBeclin-1WB兔抗CSTAMPKαWB兔抗CSTP-AMPKαWB兔抗CSTLC3WB兔抗CSTp62WB兔抗CSTCatDWB兔抗CSTβ-actinWB鼠抗ProteintechGAPDH-HRPWB—Abways22 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究2.2实验方法2.2.1实验动物饲养将硒甲基硒代半胱氨酸（SMC）溶解在ddH2O中，至终浓度3μg/mL，作为加药组饮用水。所有的小鼠维持在标准的实验室条件：12h光照，12h黑夜的循环模式，温度在22±2◦C，小鼠自由摄取食物和水。2.2.2实验动物分组分组治疗年龄治疗时间药物浓度喂药方式动物（♂/♀）野生型2月龄10个月0μg/mL给水5♂+5♀对照组3xTgAD2月龄10个月0μg/mL给水5♂+5♀对照组3xTgAD2月龄10个月3μg/mL给水5♂+5♀SMC治疗组2.2.3行为学检测SMC对3xTg小鼠治疗效果2.2.3.1Morris水迷宫检测小鼠空间探索和记忆能力如图所示Morris水迷宫示意图，主要是一个大的圆形水池，其直径为160cm，高为50cm，水深为26cm。实验过程中水温保持在26℃，整个水池采用黑布笼罩，配备探照灯，保持光线恒定。根据系统设定，人为的将水池分为4个象限，在其中的一个象限内，放置一个乳白色的圆形站台且距离池壁30cm，其直径为12cm，23 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究高24cm。水位要淹没站台且距离1-2cm。系统摄像头置于水池正上方，用于同时记录采集小鼠的运动轨迹。随后采用Morris水迷宫视频分析系统进行相关信息数据进行处理。实验小鼠WT对照组、3xTgAD对照组、3xTgADSMC治疗组分别做好标记放在不同的饲养笼中。Morris水迷宫检测实验主要分为定位航行实验和空间探索实验，整个实验历时7天，定位航行为5天，空间搜索2天。定位航行实验第1天为训练期：实验开始前将小鼠放置于平台适应3s，随后将小鼠从平台对角象限面对池壁放入池中，限时60s内，小鼠登上平台停止2s后停止记录，若小鼠在规定时间内找不到平台，将小鼠放置于平台上适应3s，最后将小鼠擦干放入鼠笼。第2天到第5天为定位航行检测期：每天要在同一个时间段进行实验，并做好相关数据保存。定位航行结束后开始计时24h和72h小鼠穿过平台所在象限的次数为空间搜索。空间搜索实验时通过软件圈定平台位置后将平台撤去，记录120s内小鼠穿过平台的时间以及穿过平台所在象限的时间。根据水迷宫系统得到的数据，利用Graphpad进行数据分析作图，p<0.05具有显著性差异。2.2.3.2旷场实验检测小鼠自发活动与探索行为旷场实验常用来检测小鼠的自发活动以及探索行为。由于实验操作简单且一次实验可以得到对小鼠自发活动、探索行为、焦虑情况、抑郁状态的定量评估，在药物研发中广泛应用。旷场实验装置如图，主要是一个圆形活动框，内画有无数个正方形格子，正上方有摄像头追踪小鼠活动轨迹。实验要在安静的环境下进行，实验开始前需保证旷场环境清洁无异味。提住小鼠尾部，轻轻放入旷场实验箱正中格，观察时间120s，期间进行摄像和计时，时间结束停止摄像。记录120s内小鼠在正中格停留时间、穿过格子数、站立次数、排便次数。采用酒精清洗箱内壁和底面，以免上次动物残留的信息影响下只动物的结果，更换小鼠，继续实验。利用Graphpad进行数据分析作图，组间差异采用方差分析，p<0.05具有显著性差异。24 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究2.2.4小鼠脑组织解剖及冰冻切片制作取小鼠用乙醚迷晕后断颈，剪下头部，迅速剥开脑部取出大脑，去除小脑部分后，左脑分开皮层和海马部分保存于-80℃用于蛋白水平检测，右脑用于OCT包埋制作冰冻切片。冰冻切片制作流程：（1）取出的新鲜组织迅速放入4%多聚甲醛（PFA）进行4℃固定,2h后更换新的4%PFA，6h后再次更换新的4%PFA，24h后开始脱水处理。（2）采用梯度脱水的方法，蔗糖溶于PBS中，15%蔗糖溶液脱水6-7h（沉淀即可）；20%蔗糖溶液脱水2-3h（沉淀即可）；30%蔗糖溶液脱水12-14h或者过夜。（3）OCT包埋组织，放于-20℃固定后可开始切片，或者-80℃保存。（4）切片：组织样品预先放入冰切机中30min，切片厚度为16mm贴于吸附性载玻片作为各种染色实验；50mm贴于无金属离子胶布作为同步辐射实验，将切片保存于-80℃。2.2.5组织切片染色2.2.5.1Gallys染色检测NFT（1）将切片取出后解冻，用免疫组化笔给组织画圈，滴入4%PFA固定30min后，PBS清洗5min。（2）滴加5%高碘酸室温孵育5min。（3）ddH2O清洗2min。添加3体积的溶液II（硝酸铵2g、硝酸银2g、硅钨酸10g、蒸馏水1000mL，上一个物质溶解完全后方可添加下一个原料）到10体积的溶液I（碳酸钠（无水）50g、蒸馏水100ml）中。确保充分混匀，然后添加7体积的溶液III（硝酸铵2g、硝酸银2g、硅钨酸10g、甲醛7.3ml、蒸馏水1000ml，上一个物质溶解完全后方可添加下一个原料），混匀使溶液澄清，组织变黑后（大约10min），ddH2O冲洗。（4）0.5%冰乙酸室温孵育2min，ddH2O冲洗。25 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究（5）1%硫代硫酸钠孵育2min，ddH2O冲洗。（6）中性树脂封片，显微镜拍片。2.2.5.2尼氏染色检测尼氏小体（1）将切片取出后解冻，用免疫组化笔给组织画圈，滴入4%PFA固定30min后，PBS清洗5min。（2）滴加尼氏染液37℃培养箱孵育15min（3）脱色：95%酒精脱色1min；无水乙醇1脱色1min；无水乙醇2脱色1min；二甲苯：无水乙醇=1:1脱色1min；二甲苯1脱色1min；二甲苯2脱色1min（4）滴加中性树脂，封片，显微镜拍片。2.2.6蛋白提取及WesternBlot检测（1）组织蛋白提取：①配置裂解液：按照1mLlysisbuffer+10μl磷酸酶抑制剂+1μl蛋白酶抑制剂+10μlPMSF（Ser蛋白酶抑制剂）比例配制溶液，冰上放置待用。②取出之前-80℃冻存的组织，解冻后按照质量体积比=1:9加入裂解液③超声破碎，超声1s停1s，超声1min。④将超声后的蛋白样品放于冰上,摇床上30min。⑤12000rpm于4℃离心30min⑥取上清，其余样品分装于-80℃保存⑦取部分样品加入4xLoadingBuffer水煮5min使蛋白变性⑧样品制备完毕后于-80℃保存备用。（2）组织蛋白定量：①制作标准曲线：取96孔酶标板按照以下表格进行加样管号12345678项目BSA标准品01248121620稀释液（PBS）2019181612840浓度（ug/ml）00.0250.050.10.20.30.40.5②配置BCA工作液：A液+B液按50:1充分混匀③在其余孔中每个孔加入20μl待检测蛋白样品26 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究④每孔加入200μlBCA工作液⑤放置37℃培养箱30min⑥A562nm读取吸光值，记录数值，做好标准曲线后计算相应蛋白样品浓度（3）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（SDS-PAGE）①根据需要检测抗体的分子量大小配制相应浓度的分离胶，如下表：分离胶及浓缩胶的配制12％分离胶15％分离胶8%分离胶浓缩胶类型5ml10ml5ml10ml5ml10ml4mlddH2O1.6ml3.3ml4.9ml2.3ml2.3ml4.6ml2.7ml30％丙烯酰胺2.0ml4.0ml6.0ml5.0ml1.3ml2.7ml0.67ml1.5MTris-HCl1.3ml2.5ml3.8ml2.5ml1.3ml2.5ml———(pH8.8)1MTris-HCl——————————————————0.5ml(pH6.8)10%SDS0.05ml0.1ml0.05ml0.1ml0.05ml0.1ml0.04ml10%AP0.05ml0.1ml0.05ml0.1ml0.05ml0.1ml0.04mlTEMED0.01ml0.01ml0.01ml0.01ml0.01ml0.01ml0.01ml②配胶板检漏：将胶板夹好后加入ddH2O，5min后如水液面下降，则拆板重新夹紧，倒出ddH2O，用吸水纸吸干。③先配制分离胶，根据以上列表逐一加进烧杯中，AP会和TEMED迅速反应凝固，在加入TEMED前充分摇晃混匀，加入TEMED后迅速加入夹好的胶板中，至2/3处停止。在胶上面加入一层无水乙醇压线，隔绝空气并促进胶的凝集。30min后分离胶凝集完毕，吸水纸吸干无水乙醇，按照表格试剂顺序配制浓缩胶，配好后倒入胶槽中，插入预先准备好的梳子，凝胶30min。④上样：每孔上样蛋白5-10μg，蛋白marker上样5μl，上样时避免产生气泡，内槽添加新的电泳液，外槽可添加回收的电泳液，注意内槽的溶液渗漏时注意添加溶液。采用80V电压电泳，待样品到了分离胶时切换电压到120V。（4）转膜：实验电流1-2mA/cm2，我们采用的是100mA。根据目的蛋白分子量大小及胶浓度确定转膜时间如下：27 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究目的蛋白分子大小（kDa）胶浓度转移时间（h）80---1408%1.5-2.025---8010%1.515—4012%0.75<2015%0.5①电泳结束后，将胶板撬开后切除浓缩胶，放到电转液中浸泡几分钟，同时准备滤纸及相应大小的PVDF膜，将PVDF膜放在甲醇中浸泡一下（尽量不要污染膜），将滤纸和PVDF膜放到电转液中浸泡几分钟，转膜备用。②打开转移盒，将浸透电转液的海绵置于转移盒壁上，尽量赶走气泡并保持海绵湿润。③按照“黑色胶板—海绵—3层滤纸（大）—凝胶—膜—3层滤纸（小）—海绵”的顺序装置好，并且在每一层都要轻轻驱赶气泡，添加电转液，从而防止海绵、胶、滤纸及PVDF膜的干燥。④将电转夹子放入电转槽中，添加提前预冷的新配置的电转液，并在电转槽周围加冰避免电转过程中产热。连接好电极恒流100mA转移90min。（5）鉴定转移效果：将转膜后凝胶用考马斯亮兰微波加热染色1min，将考马斯亮兰倒掉后加水微波加热10min两次后无背景颜色，观察胶上是否还有残余的蛋白条带，用于检测转膜的效果。或者用丽春红染液对PVDF膜进行染色，观察转膜效果后用水洗掉丽春红。（6）封闭：转膜结束前用1xTBST配制5%脱脂奶粉,转膜结束后将PVDF膜转移到提前倒好封闭液的孵育盒中，室温水平摇床封闭2h或4℃封闭过夜（封闭液尽量覆盖膜，避免污染）（7）洗涤：封闭结束后，用1xTBST在水平摇床上洗涤3次，每次10min。洗涤是为了尽量去除脱脂奶粉，避免抗体孵育时背景过高。（8）一抗孵育：根据所需检测的抗体及相应工作浓度用1xTBST配制好一抗，置于摇床上孵育室温2h或者4℃过夜。可根据抗体量及膜上抗原量相应的缩短或者延长孵育时间。（9）洗涤：回收一抗，用1xTBST在水平摇床上洗涤3次，每次10min。尽量洗去非特异性结合的一抗，减少背景杂带。（10）二抗孵育：根据实验需要选择合适的美标二抗和工作浓度，注意，浓度太28 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究高容易导致非特异结合，1xTBST配制好二抗，室温水平摇床孵育1-2h。（11）洗涤：弃二抗，用1xTBST在水平摇床上洗涤3次，每次10min。尽量洗去非特异性结合的二抗，减少背景杂带。（12）显影：增强化学发光法（ECL）①将A液和B液按照1:1的比例进行配制②在显影仪镜头上方均匀的滴加配制好的显影液，将PVDF膜从TBST中取出后用吸水纸吸干，铺到显影液上③预览条带亮度，根据亮度调节曝光时间④曝光结束后，取出PVDF膜，擦干显影液，并用ddH2O清洗，擦干，保存图片（13）数据处理及分析利用quantityone光密度分析软件对图片进行灰度值分析；利用Graphpad软件进行数据整理作图分析，并进行组间t检验，p<0.05具有显著性的统计学意义。2.2.7ICP-MS检测小鼠脑组织金属离子含量ICP-MS全称电感耦合等离子体质谱，将ICP技术和质谱结合起来的一种技术。（1）器皿处理：将实验所用到的玻璃器皿及塑料器皿用洗洁精清洗干净后，冲洗干净，用ddH2O冲洗干净后，10%硝酸浸泡过夜。冲洗掉硝酸，超声清洗15min,ddH2O清洗，烘干备用。（2）样品处理：100μl组织匀浆+400μl浓硝酸（电子纯），45℃硝化16h后，采用1%硝酸稀释，酸处理过的容量瓶定容到5mL。（3）将处理好的样品送到中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所进行检测。2.2.8同步辐射X射线荧光（SR-XRF）检测小鼠脑内金属离子含量和分布（1）样品准备：见2.2.4，样品扫描前可常温保存或存放于-80℃冰箱。（2）样品扫描：采用上海第三代同步辐射光源BLl5U1(硬x微聚焦及应用光束线)工作站的SR-XRF进行分析。X、Y、Z扫描时的精度可达0.1μm，光能量为29 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究12.95keV，采用大光斑（100μmx100μm）进行扫描，步长为100μm。每点扫描时间为２s。采用GeoPIXE(CSIRO,Australia)软件从能量分散图谱提取各种金属元素在每个象素点的荧光计数，并以IgorPro(WaveMetrics,USA)软件作图。2.2.9皮层原代神经元培养（1）实验前准备：①按照2.15（6）配制多聚赖氨酸、终止液、木瓜酶、饲养液②培养皿需要用0.1mg/ml多聚赖氨酸包被处理2h以上，使用前PBS清洗3次后烘干备用；解剖器皿以及枪头需要提前灭菌烘干，准备冰块，实验时需在冰上操作。（2）培养步骤：①将新生小鼠泡在75%酒精消毒后，断颈后，去掉脑壳，将整脑取出②将大脑置于提前预冷的终止液中，去除小脑部分，在解剖镜下剥除胼胝体，尽量剥除皮层周边的血管膜，避免血管膜遗留在原代培养中影响神经元的生长，将嗅球正对面月牙形的海马去除后，夹取一部分皮层用于培养③将分离出的皮层于冰上用囊膜剪尽量剪成0.5~1mm2大小的组织块，吸走终止液，加入提前配制好的木瓜酶37℃培养箱消化30min；消化时间到后，移走木瓜酶，加入2~3mL终止液，静置3min④待组织沉底后，吸去终止液，加入3ml新的终止液，用移液枪缓慢吹打10次，静置3min，待组织块沉底后，将上层细胞悬液吸到新的15ml管中；重新加入3ml新的终止液，用移液枪缓慢吹打10次，静置3min，待组织块沉底后，将上层细胞悬液吸到新的15ml管中；再次加入4ml新的终止液用移液枪缓慢吹打10次，静置3min，待组织块沉底后，继续将上层细胞悬液吸到新的15ml管中⑤取出培养箱中烘干的培养板，将细胞稀释到一定浓度后铺到细胞板中，并在显微镜下观察细胞密度；将培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养4~8h⑥4~8h之后换成饲养液继续培养，3~4天半量换液30 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究2.2.10细胞系培养（1）细胞复苏从液氮中取出N2a和N2aSW细胞，于37℃水浴摇晃至全部溶解后，1000rpm离心5min,加入提前配制好的N2a和N2aSW细胞培养液，重悬细胞，加入到相应的培养瓶中，37℃，5%CO2培养过夜后，第二天更换新鲜的完全培养基。（2）细胞传代待细胞培养密度达到80-90%后即可进行传代。将旧的培养基小心吸出，加入2mLPBS缓冲液，轻轻晃动培养瓶使死的细胞掉落下来，吸出PBS，重新加入2mLPBS缓冲液，清洗第二次。加入1mL0.25%的胰蛋白酶进行消化细胞，轻轻晃动培养瓶使细胞尽量接触到胰酶，室温消化至看到边缘细胞脱落即可停止，吸尽胰蛋白酶。加入2mL完全培养基进行终止消化，轻轻吹打细胞使细胞成为单细胞悬液，按照1:3的比例传入新的培养瓶中，添加新的培养基，37℃，5%CO2继续培养。（3）细胞保种待细胞长到第3~10代保种更佳，遵循“慢冻快溶”的原则。由于DMSO产生的热量会对细胞有害，提前配制好冻存液。从培养箱中将细胞取出，小心吸出旧培养基，吸取PBS缓冲液缓慢清洗细胞2次。加入1mL0.25%的胰蛋白酶进行消化细胞，尽量吸尽胰酶，加入提前配置好的冻存液进行终止消化。对细胞进行计数，将浓度调整至2×106/mL左右。将细胞悬液分装至冻存管中，封口，写好标签。于4℃放置30min，-20℃放置2h，-80℃放置过夜后即可放入液氮进行长期保存。2.2.11线粒体损伤检测2.2.11.1线粒体膜电位检测JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位ΔΨm的理想荧光探针。可以检测细胞的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，31 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究此时JC-1为单体，产生绿色荧光。可以方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)进行检测，具体步骤如下：（1）实验采用活体观察，细胞铺板于Confocal皿中，细胞贴壁后，加药处理24h；原代神经元则是在第7天开始加药，加药处理24h（细胞培养步骤请参照2.2.9—2.2.10）。（2）对于一个Confocal皿，吸除培养液，用PBS溶液洗涤细胞两次，加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。（3）在清洗细胞前配置好JC-1工作液，并放置于冰上待用。加入1mlJC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。（4）在孵育期间，按照每1mlJC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。（5）37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。（6）加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。（7）荧光共聚焦显微镜20x即可观察染色整体情况。（8）拍摄：JC-1聚合物可参考红光通道；JC-1单体可参照绿色荧光通道（9）保存图片，采用ImagJ软件对图片进行处理分析。2.2.11.2线粒体ATP检测ATP作为最重要的能量分子在细胞各种生理、病理过程中起着用。ATP水平的改变会影响细胞的功能。通常ATP水平的下降表明线粒体的功能受损或下降。ATP检测试剂盒可以用于检测细胞或组织内的ATP水平。具体实验步骤如下：（1）样品准备：对于贴壁细胞：吸除培养液，按照6孔板每孔加入200μl裂解液的比例(即相当于细胞培养液量2mL的1/10)加入裂解液，裂解细胞。裂解细胞时为了裂解充分，可以使用移液器进行反复吹打或晃动培养板使裂解液充分接触并裂解细胞。通常细胞在接触裂解液后会立即裂解。裂解后4ºC12000g离心5min，取上清，用于后续的测定。对于组织样品：按照每20mg组织加入约100-200μl裂解液的比例加入裂解液，然后用玻璃匀32 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究浆器或其它匀浆设备进行匀浆。充分匀浆可以确保组织被完全裂解。裂解后4ºC12000g离心5分钟，取上清，用于后续的测定。（2）标准曲线测定准备冰浴上溶解待用试剂，把ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成适当的浓度梯度。检测可以按照0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μM这几个浓度标准曲线可按照如下表格（体系：20μl）：浓度(μM)0.010.030.10.31310标准品4μl12μl4μl12μl4μl12μl4μl预稀释标准品0.05μM0.5μM5μM50μMATP检测裂解液16μl8μl16μl8μl16μl8μl16μl（3）ATP工作液配制按照每个样品或标准品需100μlATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上溶解。取适量的ATP检测试剂，按照1:9的比例用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂。例如100μlATP检测试剂可以加入900μlATP检测试剂稀释液配制成1mLATP检测工作液。稀释后的ATP检测试剂即为用于后续实验的ATP检测工作液。ATP检测工作液可在冰上暂时保存。（4）ATP浓度的测定：a.加100μlATP检测工作液到检测孔内。室温放置3-5min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底。可以一次性把10-20个检测孔或检测管分别加上100μlATP检测工作液，从而节省时间。b.在检测孔内加上20μl样品或标准品，至少间隔2s后，用luminometer测定RLU值，根据做出的标准曲线算出ATP浓度（μmol/L）(注：样品的体积可以自行在10-100μl范围内调节。如果样品中的ATP浓度比较低则可以加入100μl样品，如果样品中ATP浓度比较高则可以加入较小体积的样品，同时标准品也需要使用相同的体积。如果样品中ATP的浓度特别高，可以用ATP检测裂解液稀释样品后再测定。本试剂盒在加入10-100μl标准品时，大致在5nmol/L-10μmol/L的浓度范围内有很好的线性关系）（5）BCA定量具体方法参照2.2.6（2）33 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究（6）ATP最终浓度计算换算浓度:μmol*ml=nmol/mgL*mg2.2.12.3线粒体膜孔通道（mPTP）检测线粒体通透性转移孔（mPTP）位于线粒体内外膜之间的接触点上，参与基质的离子平衡和线粒体体积的调节。mPTP开放水平高时，会引起线粒体肿胀和膜系完整性的破坏，导致线粒体丧失正常功能。Ca超载加剧膜孔通道的开放。线粒体通透性转移孔开放程度可用分光光度法测量520nm光吸收来检测。具体实验步骤如下：（1）细胞线粒体提取：（采用细胞线粒体分离试剂盒）①贴壁的细胞用PBS缓冲液清洗2次后，用胰酶消化终止后采用1000rpm离心5min,弃上清②加入1-2.5ml线粒体分离试剂，轻轻重悬细胞③把细胞悬液转移到玻璃匀浆器中，匀浆50下左右，用取约2μl细胞匀浆于载玻片上，加入30-50μl台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性(蓝色)细胞的比例。如果阳性细胞比例不足50%，增加15次匀浆。随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。当阳性比例超过50%时即可停止匀浆进入下一步。请勿过度匀浆，过度匀浆会导致线粒体的机械损伤。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。④把细胞匀浆在600g，4℃离心10min⑤小心把上清转移到另一离心管中，在11,000g，4℃离心10min⑥小心去除上清。沉淀即为分离得到的细胞线粒体。⑦采用Nanodrop微量测定仪进行线粒体把浓度大致测定。（2）在两个比色皿中加入肿胀液调零，然后取出其中一个比色皿加入用肿胀液稀释好的线粒体0.25g/L，在520nm波长下检测mPTP开放水平，每20s检测一次，共检测10min。（3）取出比色皿用ddH2O清洗干净，重新加入用肿胀液稀释好的线粒体0.25g/L，此时加入5μL5mM的CaCl2溶液，检测Ca超载情况下mPTP开放水平，每20s检测一次，共检测10min，可以看到吸光度值下降。（4）采用GraphpadPrism5软件进行图像处理分析。34 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究2.2.12.4线粒体迁移检测（1）原代细胞培养，步骤参见2.2.9（2）原代细胞培养到第五天可开始转染mito-GFP-AAV，正式实验开始前需要预实验转染观察效果，神经元比较脆弱，AAV的量需要在预实验中控制一个范围。AAV浓度大细胞可能会在转染1h左右轴突会发生萎缩，可尽量减少AAV浓度适当加长转染时间。转染mito-GFP-AAV过夜（4-12h左右）可换液，48h后加药处理24h。（3）荧光共聚焦显微镜拍摄线粒体迁移。拍摄时先在60x倍镜下拍摄神经元整体图片，比例尺标记距离胞体20μm和100μm的距离。之后在此基础上用ZOOM放大3.6倍，记录距离胞体20-100μm的轴突片段上的线粒体运动，记录2.5min。每个confocal皿记录6个细胞。独立实验3次数据具有统计学意义。（4）ImagJ描绘线粒体轨迹图（5）计算线粒指标：线粒体指数（线粒体指数是线粒体长度和与神经丝长度的比值，反映单位神经丝长度中线粒体的总量）；线粒体迁移率（线粒体的运动迁移率表明一定长度的神经纤维中运动的线粒体个数与总的线粒体数目的比值）；线粒体密度（单位神经丝中线粒体数目与神经丝长度的比值）；线粒体平均长度（线粒体长度之和与线粒体个数的比值）；线粒体速率（单位时间内线粒体运动的轨迹长度）。35 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究第三章实验结果与分析3.1SMC对14月龄3xTgAD小鼠行为学的影响3.1.1Morris水迷宫检测小鼠空间探索和记忆能力首先采用Morris水迷宫检测14月龄WT、AD和AD+SMC三组小鼠的定位航行及空间探索能力。在定位航行实验中，与WT组相比，AD组小鼠找到目标平台的时间明显延长，寻找路线更复杂；而以SMC处理12个月之后，小鼠找到平台的时间显著缩短（图3-1A）。而且，在前5天的定位航行训练中，WT组在每天的逃避潜伏期均低于AD组，而SMC加药组的逃避潜伏期趋向于WT组（图3-1B）。此外我们发现，SMC加药处理后，小鼠的游泳速度明显增加，接近WT组小鼠的水平（图3-1C）。停止训练24h后检测小鼠的短期记忆能力，发现AD组小鼠穿过原平台的次数和在原平台所在象限停留的时间明显低于WT组，SMC处理显著增加了AD组小鼠穿过目标平台的次数和在目标象限停留的时间，说明SMC显著改善了AD小鼠的短期记忆能力（图3-1D、E）。36 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究图3-1Morris水迷宫检测小鼠空间学习和记忆能力。A各组小鼠定位航行轨迹图；B各组小鼠逃避潜伏期（*WT+VehiclevsAD+Vehicle）；C各组小鼠平均游泳速度；D各组小鼠24h内穿过原平台所在象限的次数；E各组小鼠24h内在原平台所在象限停留的时间（n=10,*p<0.05,**p<0.01）37 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究3.1.2旷场实验检测小鼠自发活动与探索行为之后采用旷场实验检测14月龄WT、AD和AD+SMC小鼠的自发活动与探索能力(每组各10只)。与WT组小鼠相比，AD组小鼠在120s内穿过格子数显著减少，说明AD组小鼠的自发活动能力较WT组小鼠弱（图3-2A）；排便次数显著增加，说明AD组小鼠的焦虑情绪较严重[95]（图3-2B）；小鼠站立次数显著减少，说明AD组小鼠对外界事物的探索欲望降低（图3-2C）。SMC加药处理12个月，显著增加了AD小鼠在一定时间内的穿过格子数和站立次数，同时显著减少了AD小鼠的排便次数，说明SMC可明显改善AD小鼠的自发活动能力和探索能力，同时缓解AD小鼠的焦虑情绪（图3-2）。图3-2旷场实验检测WT、AD及AD+SMC小鼠的自发活动与探索能力。A小鼠探索穿过的格子数；B小鼠的排便次数；C小鼠站立次数（n=10,*p<0.05,***p<0.001）3.2SMC调节3xTg-AD小鼠脑内金属离子的含量和分布3.2.1SMC对3xTg-AD小鼠皮层区金属离子含量的影响金属离子的内稳态失衡是AD发生发展的一个重要因素，大量研究表明Cu、Fe、Zn等金属离子在脑内的过度聚集促进Aβ的聚集和tau蛋白的过度磷酸化；另一方面，长期缺硒伴随着认知障碍和AD发生[86,87]。采用ICP-MS，我们发现与WT鼠相比，AD鼠皮层区Cu、Fe、Zn、Ba、Co的含量显著升高，Se和V的38 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究含量显著降低；SMC显著降低了Cu、Fe、Zn、Ba、Co在AD小鼠皮层区的含量，同时显著增加了Se和V的含量（图3-3），说明SMC对AD鼠脑内金属离子的内稳态失衡具有一定的调节作用，但其具体机制尚不清楚。图3-3ICP-MS检测14月龄小鼠皮层区金属离子含量。A-H;14月龄WT、AD和AD+SMC小鼠皮层区各种金属离子含量（n=5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）3.2.2SMC对3xTg-AD小鼠海马和皮层区金属离子分布的调节作用进一步地，我们采用同步辐射-X射线荧光光谱（SR-XRF）检测了各种金属离子在小鼠脑内（海马和皮层）的分布情况。与WT+Vehicle组相比，AD+Vehicle组小鼠皮层和海马区Se、V、Ni的含量明显降低，而Zn、Cu、Fe、Ca、K的含量显著增加；SMC处理后，Fe和Ca的含量显著降低，Se、V、Ni的含量明显回调，接近或超过WT+Vehicle组小鼠（图3-4，图3-5）。但是SMC处理不仅未能降低K的含量，相反促进K在整个检测脑区的大量富集（图3-4-D）。此外，我们发现SMC显著降低了Zn在皮层区的含量，但对海马区影响不大，甚至使得Zn在海马的CA3区出现局部的富集（图3-4-E）。与此类似，SMC同样造成海马39 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究CA3区Cu的富集（图3-4-C）。图3-4XRF检测检测14月龄小鼠皮层区金属离子（Se,Cu,Fe,Zn）分布。A组织切片显微镜拍摄图。B-E不同金属在检测脑区的分布和含量扫描图。40 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究图3-5XRF检测检测14月龄小鼠皮层区金属离子（V,Ca,K,Ni）分布。A组织切片显微镜拍摄图。B-E不同金属在脑区分布和含量扫描图。本课题组的工作发现，硒蛋白P可调控脑内多种金属离子的含量和分布（unpublisheddata）。鉴于SMC对AD小鼠皮层和海马区的金属含量及分布的调节作用，本研究采用Westernblot检测了SMC对于AD鼠脑内硒蛋白P的表达水平的影响，发现SMC显著提高了AD小鼠皮层区硒蛋白P的表达水平（图3-41 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究6A、B），说明SMC可能是通过增加硒蛋白P的表达调控脑内金属离子的含量。图3-6AWesternBlot检测小鼠皮层区SelP蛋白的表达水平；B小鼠皮层区SelP蛋白的灰度值分析（n=5，**p<0.01）3.3SMC对3xTg-AD小鼠Aβ病理、Tau病理及突触蛋白表达水平的影响3.3.1SMC抑制3xTg-AD小鼠的Aβ病理Aβ的大量产生并聚集形成淀粉样斑块是AD的主要病理特征之一，在Aβ的各种聚集形式中，可溶性的寡聚体被认为是毒性最强的物种。通过WesternBlot检测发现，SMC给药后显著降低了14月龄3xTg-AD小鼠皮层区Aβ各种寡聚体42 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究图3-7小鼠皮层区Aβ病理相关蛋白检测。AWesternBlot检测小鼠皮层区Aβ、BACE1、APP蛋白表达水平；B小鼠皮层区Aβ、BACE1、APP蛋白的灰度值分析（n=5，*p<0.05）;C免疫荧光检测各组小鼠皮层区Aβ的表达水平（20x,bar:20μm）。的表达水平（图3-7A、B），同时显著降低了Aβ前体蛋白APP及β分泌酶BACE1（催化APP切割为Aβ）的表达水平（图3-7A、B）。进一步地，采用免疫荧光染色检测发现，AD+Vehicle组在皮层区的Aβ含量显著高于WT+Vehicle组，而SMC加药处理后AD小鼠皮层区Aβ的含量显著下降（图3-7C）。上述结果显示，SMC加药12个月可显著抑制3xTg-AD小鼠的Aβ病理。43 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究3.3.2SMC抑制3xTg-AD小鼠的tau病理图3-8SMC对小鼠皮层区Tau磷酸化及NFT含量的影响。A：WesternBlot检测小鼠皮层区PP2A、PP2A-pY307、及Tau蛋白磷酸化位点422、404、396、231蛋白表达水平。B：小鼠皮层区PP2A、PP2A-pY307、及Tau蛋白磷酸化位点422、404、396、231蛋白灰度值分析（n=5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）；CGallys染色检测各组小鼠皮层、CA1和CA3区NFT的含量（40x，bar:50μm）。Tau蛋白的过度磷酸化及神经纤维缠结（NFT）的形成是AD的另一重要病理特征。采用Gallys染色的方法检测3xTg-AD小鼠脑内NFT的含量，发现在44 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究AD+Vehicle组小鼠的皮层区及CA3区神经元内产生大量的NFT，而CA1区没有产生NFT；12个月的SMC加药处理后发现在皮层区及CA3区的NFT基本消失（图3-8C）。此外，本研究发现SMC显著抑制了tau蛋白在422、404、396、231等位点的磷酸化水平。进一步地，我们研究了SMC抑制tau蛋白过度磷酸化的机制，发现SMC对催化tau磷酸化的激酶GSK3β的表达水平和活性无显著影响（datanotshown），但是显著增加了催化磷酸化tau去磷酸化的酯酶PP2A的表达水平，同时显著降低了p-PP2A（失活状态）的表达水平（图3-8A、B），说明SMC通过促进PP2A的表达和活性抑制tau蛋白的过度磷酸化及NFT的形成。3.3.3SMC保护3xTg-AD小鼠突触蛋白并改善神经元活性图3-9小鼠皮层区突触蛋白水平及尼氏小体检测。AWesternBlot检测小鼠皮层区突触蛋白SynapasinI及PSD95的表达水平；B小鼠皮层区SynapasinI及PSD95蛋白的灰度值分析（n=5，**p<0.01）；C尼氏染色检测小鼠尼氏小体（20x，bar:50μm）45 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究Aβ斑块的沉积以及tau蛋白的过度磷酸化都会损伤突触，进而使神经元死亡。基于SMC对AD小鼠Aβ病理和tau病理的显著抑制作用，我们进一步研究了SMC对神经元活性和突触蛋白的保护作用。通过尼氏染色检测尼氏小体，发现在3xTg-AD小鼠中，受损的神经元在SMC加药处理10个月后，尼氏小体有所增加，尤其是在CA3区显著性增加，说明SMC给药处理后神经元的机能有所改善，神经元的数量有所增加（图3-9C）。WesternBlot检测发现，相较于AD+Vehicle组，AD+SMC组突触素蛋白Syn1和突触后致密蛋白PSD95的表达量均有所增加，其中Syn1的表达量显著性增加（图3-9A，3-9B）。3.4SMC对3xTg-AD小鼠脑内自噬活性的调控作用（1）mTOR，P70s6K和Beclin-1大量证据显示，AD中自噬受到抑制，从而使得错误折叠或聚集的蛋白无法有效清除。mTOR激酶是自噬诱导过程中关键的分子,mTOR及其下游P70s6K的激活抑制自体吞噬，相反，mTOR和P70s6K活性被抑制时可激活自噬。如图3-10所示，SMC显著抑制了3xTg-AD小鼠皮层区mTOR、p-mTOR、P70s6K及p-P70s6K的表达水平，说明SMC通过抑制mTOR及P70s6K活性激活自噬。同时，我们发现Beclin-1的表达水平经SMC处理后显著增加。Beclin1是自噬起始必须物质，其含量在AD患者脑中下降[42]。SMC处理后显著增加了Beclin-1的表达水平，进一步证明SMC对3xTg-AD小鼠皮层区自噬的激活作用。46 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究图3-103xTgAD小鼠皮层区自噬相关蛋白检测。AWesternblot检测3xTgAD小鼠皮层区mTOR、p-mTOR、P70s6K、p-P70s6K、Beclin-1的表达水平。B3xTgAD小鼠皮层区mTOR、p-mTOR、P70s6K、p-P70s6K、Beclin-1灰度值分析（n=5，*p<0.05，***p<0.001）。（2）AMPKα和AKT为了阐明SMC抑制mTOR活性的机制，我们研究了调控mTOR活性的两条经典通路，PI3K/AKT和AMPK通路。PI3K/AKT通过激活mTOR抑制自噬，而AMPK通过负调控mTOR激活自噬。然后如图3-11所示，SMC处理后AKT表达量下降，但p-AKT含量显著上升，说明AKT被激活；AMPKα和p-AMPKα的表达水平均下调，说明AMPK活性被抑制，与预期不一致。因此我们推测SMC可能是通过其他通路如p53或MAPK调控mTOR的活性。MAPK/ERK通路可以激活mTOR抑制自噬，如图3-11C、D检测结果所示，发现SMC处理后显著下调了p-ERK的表达水平，说明ERK活性被抑制，则mTOR活性受到抑制，可以说明SMC通过MAPK/ERK通路抑制mTOR的活性促进自噬。47 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究图3-113xTgAD小鼠皮层区自噬相关蛋白检测。AWesternblot检测3xTgAD小鼠皮层区AKT、p-AKT、AMPKα、p-AMPKα的表达水平。B3xTgAD小鼠皮层区AKT、p-AKT、AMPKα、p-AMPKα的灰度值分析（n=5，*p<0.05,**p<0.01）。CWesternblot检测3xTgAD小鼠皮层区ERK、p-ERK的表达水平。D3xTgAD小鼠皮层区ERK、p-ERK的灰度值分析（n=5，***p<0.001）（3）LC3、p62、CatDLC3II/LC3I的比值直接反映了自噬水平和自噬小体的数量。如图3-12A,B所示，SMC显著降低了LC3II/LC3I的比值，说明自噬小体的数量减少，进一步地，我们检测了自噬接头蛋白p62和组织蛋白酶D（CatD）的表达水平，发现SMC处理后p62含量下降，CatD含量上升，说明SMC不仅激活了自噬，而且促使自噬体向自噬溶酶体方向发展。48 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究图3-123xTgAD小鼠皮层区自噬相关蛋白检测。AWesternblot检测3xTgAD小鼠皮层区LC3、p62、CatD的表达水平。B3xTgAD小鼠皮层区LC3、p62、CatD的灰度值分析（n=5，**p<0.01）。C细胞系转染AAV-mCherry-LC3-GFP检测自噬体的生成过程（白色箭头表示自噬体，63x5μm）。此外，我们利用自噬双标病毒载体AAV-mCherry-LC3-GFP转染N2a-APP695-sw细胞，直接观察SMC处理对细胞内自噬体自噬溶酶体含量的影响。如图3-12C所示，黄色荧光点代表自噬体，红色荧光点代表自噬溶酶体，SMC处理24h显著增加了N2a-APP695-sw细胞内的红色荧光点，说明SMC处理后促进了自噬溶酶体的产生。49 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究3.5SMC对AD模型中线粒体动力学和功能的调控作用3.5.1SMC促进了3xTg-AD小鼠脑内线粒体的生物发生AD中线粒体的生物发生受到抑制。前面研究检测到SMC激活了AKT的活性，而AKT的激活可促进线粒体的生物发生。如图3-13所示，SMC处理的AD小鼠皮层区线粒体生物发生相关蛋白NRF1、NRF2和mTFA的表达水平显著增加，说明SMC对AD模型中线粒体的生物发生具有明显的促进作用。图3-13小鼠皮层区线粒体生物发生相关蛋白表达量的检测。A：WesternBlot检测小鼠皮层区mTFA、NRF1、NRF2的表达水平；B小鼠皮层区mTFA、NRF1、NRF2灰度值分析（n=5，*p<0.05，**p<0.01）。50 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究3.5.2SMC促进了3xTg-AD小鼠脑内线粒体的能量代谢障碍图3-143xTgAD小鼠线粒体能量代谢相关蛋白检测及ATP水平检测。AWesternBlot检测小鼠皮层区PDHE1α、COXIV、ND1蛋白的表达水平。B小鼠皮层区PDHE1α、COXIV、ND1蛋白灰度值分析（n=5，*p<0.05，**p<0.01）。C细胞系、原代细胞、12月龄3xTgAD小鼠ATP水平检测（n=3）。AD模型中，线粒体能量代谢相关蛋白的表达水平减少，使线粒体产生的ATP量减少。进一步地，本研究检测了SMC在改善AD模型中线粒体生物发生的障碍后是否同时促进了线粒体的能量代谢。结果如图3-14A、B所示，与AD+Vehicle组相比，AD+SMC组线粒体能量代谢相关蛋白PDHE1α、COXIV、ND1的表达水平显著提高，说明SMC可以纠正AD模型中线粒体能量代谢相关蛋白的表达障碍。51 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究此外，本研究检测了AD模型小鼠皮层区和模型细胞内（原代神经元及N2aSW细胞）ATP含量的变化，发现SMC显著增加了AD小鼠及细胞内的ATP水平，使其接近或超过野生型小鼠或正常对照细胞内的ATP含量（图3-14C），进一步说明了SMC对AD模型中线粒体能量代谢障碍的改善作用。3.5.3SMC对3xTg-AD小鼠脑内线粒体分裂融合平衡的调控作用线粒体的分裂融合对于维持线粒体正常的形态和功能至关重要，在AD中，线粒体分裂增加，融合减少。由图3-15A、B可以看出，SMC给药后显著增加了融合蛋白Mfn2蛋白的表达水平，并下调了DRP1蛋白的表达水平，说明SMC可在一定程度上维持线粒体分裂与融合的平衡，从而维持线粒体的动态平衡及行使其正常功能。图3-153xTgAD小鼠线粒体分裂蛋白融合蛋白检测。AWesternBlot检测小鼠皮层区融合蛋白Mfn2和分裂蛋白DRP1的表达水平。B小鼠皮层区融合蛋白Mfn2和分裂蛋白DRP1的灰度值分析（n=5，**p<0.01）。3.5.4SMC对AD模型中线粒体凋亡和线粒体膜损伤的抑制作用AKT的激活可抑制CleavedCaspase-3的表达，检测可知，SMC显著下调了AD小鼠皮层区CleavedCaspase-3的表达水平（图3-16），说明SMC可能通过调节AKT活性抑制线粒体凋亡。52 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究图3-163xTgAD小鼠线粒体凋亡相关蛋白检测。AWesternBlot检测小鼠皮层区CleavedCaspase-3的表达水平。B小鼠皮层区CleavedCaspase-3的灰度值分析（n=5，*p<0.05）进一步本研究采用JC-1染色检测线粒体膜电位研究了SMC对N2aSW细胞和原代培养的AD神经元线粒体膜的保护作用。如图3-17A所示，阳性对照组（N2A细胞）聚集体（红色荧光）显著多于AD模型组（N2aSW细胞），并且线粒体的损伤程度较少（绿色荧光），其整体的线粒体损伤情况较少（黄色荧光）。以SMC（3μM）处理N2aSW细胞24h后检测其膜电位，发现其线粒体膜电位显著恢复（红色荧光），但是仍存在部分未恢复的线粒体膜电位（绿色荧光），其整体线粒体膜电位损伤情况显著性降低（图3-17A下）。在原代水平上，本研究也得到相同的结果验证，神经元培养到第7天，以3μM的SMC处理24h后检测线粒体膜电位。可以发现，SMC处理后AD神经元的线粒体膜电位有所恢复，并且整体的线粒体膜损伤有所下降（图3-17B）。另外，通过紫外分光光度法本研究检测了线粒体的肿胀程度来间接反映线粒体膜孔通道（mPTP）的开放程度，mPTP的开放程度反映了线粒体膜的受损程度。以样品在520nm处的吸收值表征mPTP的开放程度。检测发现，N2aSW组和N2+诱导的情况下，其吸收值相差无几，表明在无Ca2+超2aSW+SMC组在无Ca载的情况下两种细胞的mPTP开放程度是一样的。当Ca2+超载后，N2aSW+SMC组的吸收值大于N2aSW组，表明在Ca超载情况下，N2aSW组mPTP开放程度较大，而SMC加药后可以降低mPTP的开放程度，进而抑制线粒体的膜损伤（图3-17C）。53 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究3.5.5SMC对AD神经元轴突内线粒体指数和运动的影响根据以上结果，本研究发现SMC对AD模型中线粒体形态和功能损伤具有明显的保护作用。线粒体在神经元轴突内的运输对于维持神经元能量和信息的正常传递非常重要，而AD中，Aβ聚集和tau蛋白过度磷酸化均可抑制线粒体在轴突内的运输，因此本研究检测了SMC对线粒体在神经元轴突内分布和运动的影响。待原代神经元生长到第5天后，进行AAV-mito-GFP转染，第7天后加3μMSMC处理24h后采用共聚焦荧光显微镜进行延时成像拍摄。图3-18A、C反映了线粒体在神经元轴突内的分布情况，经统计分析后，计算了线粒体的平均长度（3-18E）和线粒体指数（线粒体长度和与神经丝长度的比值，反映单位神经丝长度中线粒体的总量）（3-18E），发现SMC加药处理后，线粒体的平均长度和指数均增加，这与本研究前面检测到SMC促进线粒体的生物发生及线粒体融合相关蛋白表达，抑制线粒体分裂相关蛋白表达的结果一致。图3-18B、D反映了线粒体在轴突内的运动情况，本研究发现AD神经元轴突内的线粒体在检测时间内（2.5min）几乎完全处于静止状态，SMC增加了线粒体的运动情况（黑色的直线代表静止的线粒体，曲线代表运动的线粒体）。54 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究图3-17线粒体膜电位及线粒体肿胀检测。A细胞系线粒体膜电位检测（JC-1探针在线粒体基质形成聚集体显示红色；若为游离形式则显示绿色，20x，bar:10μm）；B原代神经元线55 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究粒体膜电位检测（JC-1探针在线粒体基质形成聚集体显示红色；若为游离形式则显示绿色,20x，bar:10μm）；C细胞系线粒体膜肿胀程度实验检测。图3-183xTg-AD小鼠皮层原代神经元轴突线粒体延时成像检测。A、C线粒体轴突内线粒体分布；B、D线粒体轴突内线粒体运动轨迹图（检测2.5min，每5s拍摄一次）；E轴突内线粒体平均长度；F轴突内线粒体指数56 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究第四章讨论（1）SMC与ADAD作为一种原发性神经退行性疾病，目前全球已经有超过4600万的患者。过去30年，全球几大药物公司在AD治疗药物上投入了上千亿美元，有1000多个新药进行了临床试验，但至今依然没有可以有效逆转或延缓AD的药物上市，其中一个非常重要的原因在于AD发病机理十分复杂：既有遗传因素、更有外部条件及人体自身衰老引起的一系列退行性病变。生物必需微量元素硒对维持中枢神经系统的正常功能具有重要作用，长期缺硒会引起包括AD在内的多种脑疾病，越来越多的研究证明硒缺乏影响AD病理过程中的诸多环节，造成认知功能降低和AD的形成[88]。因此，包括本课题组在内的多个研究团队，采用长期低剂量或短期高剂量补硒的方式处理AD模型小鼠，发现各种形态的硒或硒蛋白不仅能抵御Aβ聚集产生的氧化损伤，还能防止Tau蛋白的过度磷酸化，从而有效抑制AD的发生发展[89]。天然有机硒化合物硒甲基硒代半胱氨酸（SMC）首次从二沟黄芪（Astragalusbisulcatus）中发现[90]，大量的体外和体内实验证实SMC是一种有效的抗癌化合物。但到目前为止，SMC的研究重点仍集中在其抗肿瘤和抗氧化活性方面，关于SMC在神经退行性疾病包括AD中的作用和机制尚不清楚。研究显示低剂量补硒有助于增加GPx的表达含量和活性[91]。前期我们采用低剂量补充SMC的方式处理AD模型小鼠，发现SMC可显著改善9月龄AD小鼠的学习和记忆能力，对AD的Aβ和tau病理均表现出明显的抑制作用。基于上述结果，本研究采取长期低剂量饮水补充SMC（3μg/L）的方式，研究SMC对14月龄AD小鼠的作用和机制，侧重于研究SMC对AD中线粒体功能紊乱和自噬损伤的作用。根据之前的毒性试验，本研究所用的SMC剂量为安全剂量[85]。研究中采用的AD模型鼠为3xTgAD小鼠（B6;129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/J），其中PS1、APP和tauP301有效的模拟了AD的病理特征，能够在不患AD病的小鼠海马和皮层中发生病变导致中枢神经系统功能紊乱。研究发现AD模型鼠在3-4月龄时在神经元内会产生Aβ沉积，而在6月龄时出现突触功能传导异常[92]；因此在本实验中当小鼠2月龄时开始加药直到14月龄，期望从早期做到预防AD病的发生发展。57 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究（2）SMC对AD小鼠行为认知及经典病理特征的作用本研究采用两种行为学手段评估SMC对AD模型小鼠的学习和记忆能力的影响。Morris水迷宫实验（Morriswatermaze）最初是由英国心理学家Morris设计的实验，主要用于研究学习和记忆，如老年痴呆方面；同时该实验也可以作为评价动物行为与记忆与药物效果之间的关系[93]，现今的神经科学研究中水迷宫占据了重要的地位。Morris水迷宫实验分为定位航行和空间搜索。而定位航行过程中所记录的指标有逃避潜伏期、游泳速度、运动轨迹。本实验利用小鼠会游泳但是怕水的天性来强迫其入水后找到潜在的平台，进而通过训练在大脑中形成平台的位置的空间记忆，在需要时从脑区抽取记忆快速找到平台。空间搜索检测24小时后小鼠穿过平台所在位置的次数及穿过平台象限的时间。空间搜索涉及到神经传导路径，通过实验数据可以排除其余缺陷带来的干扰。从实验结果显示，在Morris水迷宫实验中SMC给药12月后，AD小鼠的逃避潜伏期有所降低但是没有显著性变化（图3-1B）；从运动轨迹来看（图3-1A），SMC加药处理后确实加快了小鼠找到平台的时间且从整体的游泳速度上（图3-1C）有了显著的改善。24小时短时记忆检测发现SMC加药组相对于AD组目标平台停留时间显著增加，并且其穿过目标平台次数也有所增加（图3-1D、E）。说明AD小鼠的记忆和认知损伤在SMC长期给药后得到了显著的改善。而这一实验结果与本实验室研究的其他硒化合物如硒酸钠、硒酵母、硒代蛋氨酸（SeMet）的结果是一致的，且与SMC处理7个月的实验结果一致。旷场实验（OpenFieldTest）由Halletal.发明，最初用于大鼠后转为小鼠的研究[94]。利用小鼠畏惧空旷场地的趋避性以及探索新事物的好奇心来研究小鼠的自发活动和探索行为，从而去评价小鼠的自发活动能力以及焦虑状况。目前旷场实验应用到神经学以及精神药理学当中，可以用于检测药物的副作用。因旷场实验操作简单，一次实验就可以得到关于动物的自发活动以及探索行为和焦虑状况的大量数据，因此在药物研发中得到广泛应用[95]。研究结果显示，相较于AD组SMC加药处理后小鼠穿过旷场的格子数增加（图3-2A），排便次数显著减少（图3-2B），站立次数显著增加（图3-2C）；说明SMC加药促进了小鼠的自发活动能力并且降低了小鼠的焦虑的状况，同时说明低剂量补硒的副作用是比较小的。两种行为学检测方法证明了SMC有效提高了AD小鼠的活动能力和认知能力。58 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究AD的主要病理特征是由于两种蛋白沉积造成的。Aβ肽在胞外聚集形成老年斑，tau蛋白过度磷酸化在胞内形成NFT。Aβ是由APP在β淀粉酶和γ分泌酶的连续切割下产生的，所产生的寡聚体Aβ1-40和Aβ1-42具有神经毒性，造成神经元功能损伤甚至凋亡[10]。前期的研究显示亚硒酸钠通过降低β分泌酶的含量来减少Aβ，以保护神经元[84]。在本实验室研究中发现Se-Met干预了AD模型细胞和AD小鼠中老年斑块和NFT的生成[82,89,96]。本实验研究显示SMC显著降低了BACE-1以及APP的表达水平，发现Aβ寡聚体的含量显著下降（图3-7A、B），并且免疫荧光也观察到SMC加药后减少了老年斑块的沉积（图3-7C）。说明SMC可能通过调节β-分泌酶及APP的表达水平以降低Aβ的生成、寡聚体的含量及其沉积。正常情况下，处于低磷酸化状态的tau蛋白与微管结合促进微管的组装和稳定[15]，但是在AD患者脑内tau蛋白发生高度磷酸化，一方面从微管解离破坏了微管的稳定性，另一方面解离下来的tau蛋白聚集形成NFT，直接影响神经元的活性，加剧了AD的发展。GSK-3β和PP2A是维持tau蛋白和p-tau蛋白平衡的两个重要酶，已有研究报道在AD中GSK-3β活性增加而PP2A的活性下降[97]，致使AD脑中tau蛋白的过度磷酸化和NFT的大量产生。在本研究中我们发现SMC显著下调了14月龄3xTgAD小鼠皮层中tau蛋白在Thr231、Ser396、Ser404、Ser422位点的磷酸化水平（图3-8AB）。进一步地，我们发现SMC显著提高了PP2A的活性但对GSK-3β活性影响不大（未显示结果）（图3-8AB），因此与硒酸钠一样，SMC主要通过稳定PP2A活性抑制AD模型小鼠脑内tau蛋白的过度磷酸化。高度磷酸化的tau蛋白可在神经元内聚集形成NFT[16],是AD的主要病理特征之一。本研究中脑组织冰冻切片结合银染实验显示在14月龄AD鼠脑皮层区、CA1区、CA3区聚集了大量的NFT，而SMC加药处理后NFT在上述脑区的聚集情况显著降低（图3-8C），直接反映了SMC对tau病理的抑制作用。Aβ的聚集导致神经元功能失调甚至死亡[10]，而tau蛋白的过度磷酸化造成突触的功能障碍[15]，这两者都会使突触蛋白急剧减少。因此我们研究了SMC对Aβ和tau病理的抑制作用是否可改善AD中的突触缺失。研究发现SMC显著增加了14月龄AD小鼠皮层组织中突触素蛋白Syn1的表达水平，并增加了突触后致密蛋白PSD95的表达水平（图3-9A、B）。尼氏小体是神经元胞质中一种嗜碱59 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究性物质，主要用于合成蛋白质，是脑高级神经活动时（学习记忆过程）所必需的。尼氏小体与神经元的功能有着密切的关系，在兴奋传导过程中神经元不断消耗蛋白质，这时需要尼氏小体不断合成新的蛋白质用于补充这种消耗。正常情况下，尼氏小体大、数量多，反应了神经细胞合成蛋白质的功能较强，而在神经元受损时尼氏小体数量减少或消失。因此，神经元的机能状态可以用尼氏小体的密度进行表征。采用尼氏染色检测发现SMC加药后相比于对照组，AD小鼠的CA3区尼氏小体显著增加（图3-9C），说明SMC可以一定程度上恢复AD神经元的机能。因此，SMC通过抑制AD模型中的Aβ和tau病理，改善了AD中的突触损伤和神经元机能障碍，从而改善了AD模型小鼠的学习和记忆及探索能力的障碍。（3）SMC对AD模型小鼠脑内金属离子内稳态的调控作用目前金属离子的非正常代谢与AD之间的关系越来越备受关注。具有生物活性的金属，如Fe、Cu、Mn显示在氧化应激中起着关键作用，特别是在线粒体损伤和蛋白错误折叠、聚集中，最终导致AD。大量实验证实AD患者以及AD小鼠脑中的金属离子的失调得到恢复后可以阻止Aβ的聚集，降解老年斑块以及延迟AD病的认知损伤程度[98]。研究显示Zn2+可以干扰APP的剪切过程导致其异常切割形成大量的Aβ，Zn2+也可与Aβ结合从而导致Aβ的沉积[99]。此外Zn2+的含量增加也加剧了tau蛋白的磷酸化程度以及NFT的生成。在本研究中，我们采用ICP-MS和XRF检测SMC对14月龄AD模型小鼠脑内金属离子的含量和分布的影响。结果发现与WT小鼠相比，AD小鼠皮层和海马区Se、V、Ni的含量明显降低，而Zn、Cu、Fe、Ca、K的含量显著增加；SMC给药12个月后，Fe和Ca的含量显著降低，Se、V、Ni的含量明显回调，接近或超过WT小鼠（图3-4，图3-5）。SMC降低了皮层区Zn的含量，但对海马区影响不大，甚至使得Zn在海马的CA3区出现局部的富集（图3-3D、图3-4E），有可能Zn以某种方式代谢到了海马中，但其具体机制尚有待进一步的研究。与Zn2+一样，Cu2+在AD患者脑中含量较多，特别是大量聚集于老年斑。虽然Cu2+可以直接与Aβ结合，但是其机制比Zn2+复杂的多，其结合位点尚不明60 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究确。Cu2+与Aβ结合促进了Aβ的聚集，与Zn2+不同的是Cu2+促进Aβ聚集形成毒性更强的寡聚体。但是另一方面也有报道显示，Cu2+阻碍了Aβ的产生，其原因是在Cu2+和Aβ之间生成了组氨酸隔离膜。虽然Cu2+与Aβ结合产生了神经毒，但是Cu2+并不是造成Aβ沉积的主要金属。Cu2+也可促进tau蛋白的磷酸化。体外实验表明Cu2+可以结合tau片段，并且在APP/PS1/tau转基因小鼠中揭示Cu暴露促进了tau病理过程。本研究显示SMC显著降低了AD小鼠皮层区Cu2+的含量以及分布（图3-3B、图3-4C），这与SMC降低了AD小鼠皮层区Aβ寡聚体的含量及NFT的生成相吻合（图3-7、图3-8）。然而，与Zn2+类似，SMC加药后在海马区也聚集了Cu2+，原因不清。由于Cu2+复杂的代谢方式，其代谢方式有待进一步探究。除了Zn2+和Cu2+之外，Fe3+与AD病理的相关性也比较高。最早于1953年人们发现AD患者大脑中聚集了大量的铁并且与老年斑[100]和NFT的形成有关。Fe3+结合Aβ和tau不仅仅是介导Aβ的聚集以及tau蛋白的磷酸化形成老年斑和NFT，还增加神经元中Aβ和tau的毒性。并且，铁引起的Aβ聚集与ROS形成有关[101]。在本研究中我们发现SMC处理后减少了AD小鼠皮层区和海马区Fe的含量（图3-3C，3-4D）；这可能与Aβ寡聚体及NFT生成的减少相关（图3-7C、图3-8C）。此外，我们发现SMC对其他金属离子的含量和分布也有一定的调节作用，例如Ca2+在AD鼠脑的皮层和海马大量富集，SMC降低了Ca2+的含量。大量研究显示Ca2+含量和分布紊乱影响AD病理机制的多个方面，包括氧化压力，线粒体损伤，突触功能等，因此SMC对AD病理的干预作用可能也与其调控Ca2+的含量和分布有关。SMC同样逆转了V在AD小鼠脑内的缺乏（与WT小鼠相比），有趣的是，本课题组的另一项研究发现补充V可有效干预AD的多项病理。此外我们发现SMC也调节了Ba、Cr、Co、K、Ni的含量和分布（图3-3，3-5）。本课题的另一项研究显示，硒蛋白P可调控脑内多种金属离子的含量和分布（unpublisheddata）。鉴于SMC对AD小鼠金属离子内稳态的调节作用，我们检测了SMC对于AD鼠脑内硒蛋白P的表达水平的影响，发现SMC显著提高了AD小鼠脑内硒蛋白P的表达水平（图3-6A、B），初步说明SMC有可能通过增加硒蛋白P的表达调控脑内金属离子的含量。金属离子可以促进老年斑和NFT的形成，另一方面，老年斑和NFT的聚集也会募集大量金属离子；因此SMC也61 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究可能是通过抑制老年斑和NFT的形成调控金属离子的含量与分布。但在“调控金属离子含量和分布”与“抑制老年斑和NFT的形成”之间，孰因孰果，很难确定。关于SMC对AD模型鼠脑内金属离子内稳态的调控作用和机制尚处于初步研究阶段，有待进一步的深入研究。（4）SMC对AD模型自噬活性的调节作用由以上的实验结果我们发现SMC可显著抑制AD中的Aβ病理和tau病理，但其详细的分子机制尚不清楚，除了可能与调控Aβ产生和tau蛋白磷酸化的关键蛋白（或酶）的表达和活性相关，及金属离子的含量和分布有关，我们怀疑可能还与自噬有关。自噬是细胞内一种重要的程序，用于清除细胞碎片以及有毒的蛋白质。在AD中由于自噬小体在营养缺乏的突触中聚集导致自噬损伤[37]，自噬的缺失直接影响了Aβ在胞外的沉积[37,102]。Tau蛋白的功能与微管蛋白结合和组装有密切的关系，而自噬途径中自噬小体运输主要依靠微管来移动。有研究显示PP2A的上调激活了神经元的自噬，而PP2A的下调，自噬受阻，tau蛋白聚集[103]。自噬通路可能与tau蛋白的清除有重要的关系，而tau蛋白的聚集也可能是由于自噬的缺失造成的，自噬的损伤进一步加重AD病的进程。mTOR是自噬的主要调节器，会接受来自不同信号通路的信号[25]（如图4-1），p-mTOR激活其下游P70S6K，而p-P70s6K抑制了自噬小体的形成。本研究显示SMC显著下调了3xTgAD小鼠皮层区mTOR、p-mTOR、P70S6K及p-P70s6K的表达量（图3-10A、B），说明SMC具有潜在的促进自噬的活性。Beclin1是自噬起始所必须的物质，并且研究显示其含量在AD患者脑中下降[35]。本研究中添加SMC处理后显著增加了beclin1的表达水平，进一步证明SMC促进了3xTg-AD小鼠皮层区自噬的起始。为了阐明SMC抑制mTOR活性的机制，我们研究了调控mTOR活性的两条经典通路，PI3K/AKT和AMPK通路。PI3K/AKT通过激活mTOR抑制自噬，而AMPK通过负调控mTOR激活自噬。然后如图3-11所示，SMC处理后AKT表达量下降，但p-AKT含量显著上升，说明AKT被激活；AMPKα和p-AMPKα的表达水平均下调，说明AMPK活性被抑制，与预期不一致。因此我们推测SMC可能是通过其他通路如p53或MAPK调控mTOR的活性。检测结果发现SMC显著下调了p-ERK的表达水平，说明ERK的活性62 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究是显著抑制的，mTOR活性受到抑制，激活自噬。说明SMC是通过MAPK/ERK1/2来激活自噬的。图4-1自噬流程图从上游的通路来看我们并不能确定自噬是彻底被激活的还是彻底被抑制的，于是进一步通过LC3的比值来表征自噬水平[33]；通过检测自噬接头分子p62/SQSTM1来检测自噬清除效率并检测CatD来表征自噬小体与溶酶体的融合程度，即形成自噬溶酶体[24]。研究结果显示SMC显著下调了LC3II/LC3I的比值，显著下调了p62/SQSTM1的表达水平并且显著提高了CatD的表达水平（图3-12A、B），由此结果来看SMC下调了LC3II/LC3I的比值并不是自噬水平下降了，p62的下降说明了自噬水平是显著增加的，CatD水平的增加进一步说明了随着自噬水平的增加，自噬小体在生成的同时快速地向自噬溶酶体的方向生成，从而加快降解有毒或者聚集的蛋白质。近期我们课题组的另一项研究显示Se-Met在低月龄的小鼠中促进自噬，上调LC3II/LC3I的比值，且产生了大量的自噬小体[24]；而本研究中采用的是14月龄的AD小鼠，由于其月龄较大脑内生成较多的Aβ和NFT，可能使得体内产生的自噬小体快速向自噬溶酶体转变以清除Aβ和NFT。此推论在细胞实验中得到进一步的验证，我们发现SMC处理AD细胞模型N2aSW后，自噬溶酶体的含量显著上升（图3-12C）。以上结果说明SMC63 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究一方面能调控自噬体的过度产生避免积累过多，另一方面又可以促进自噬溶酶体的生成。此外，我们发现SMC可以上调AD模型细胞和小鼠内的cirRNA7的表达，cirRNA7通过抑制micRNA7的活性，上调ATG7和UBE2A的表达（数据未显示），ATG7直接参与自噬体的形成，而ATG7的增加也进一步证明自噬能力的增强，进而会影响到并改善线粒体的功能[34]。此外UBE2A参与Aβ的清除，这可能也是SMC降低AD模型小鼠脑内老年斑和Aβ寡聚体含量的原因之一。（5）SMC对AD模型中线粒体动力学和功能的调节作用a、SMC对线粒体生物发生的调节作用线粒体是细胞供能的重要细胞器，有研究显示，线粒体生物发生是依赖于AKT途径的[104]，AKT的激活即p-AKT会进一步激活NRF1，而NRF1作为mTFA激活的必须因子也会激活mTFA[44,45]。NRF1和NRF2主要负责mtDNA转录调节器的激活，mTFA主要负责mtDNA的转录调节。研究显示，在3xTgAD小鼠中NRF1、NRF2的表达水平下降[46]。本次研究中SMC加药处理后在3xTgAD小鼠皮层区中显著增加了AKT的活性，并且发现NRF1和NRF2的表达水平有所提高，进而显著的提高mTFA的表达水平（3-13A、B），在qPCR检测结果中也发现SMC显著提高mtDNA中NRF1以及mTFA的mRNA水平（结果未显示）。说明SMC可以通过激活AKT来促进线粒体的生物发生。b、SMC对线粒体能量代谢的调节作用ND1是线粒体呼吸链编码蛋白，可以激活mTFA，ND1水平下降会造成线粒体功能障碍[105]。COXIV是细胞呼吸链复合物之一，参与线粒体细胞呼吸的进行，其水平的下降会影响ATP的生成；PDHE1α丙酮酸脱氢酶的一个亚基，参与ATP的生成。在AD患者中这三者的蛋白水平下降[54,106]。Chen等人采用淫羊藿苷在3xTgAD小鼠中提高了COXIV及PDHE1α的表达水平[107,108]。在本实验研究中SMC显著提高了COXIV、PDHE1α及ND1的表达水平（图3-14A、B），说明SMC对线粒体能量代谢相关蛋白表达水平是有显著的改善作用的，并且在细胞系水平、原代神经元水平以及动物水平均发现SMC显著提高ATP的水64 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究平（图3-14C），提示SMC可能是通过保护线粒体的参与能量代谢的关键蛋白来维持细胞的能量生成。线粒体功能受损直接影响神经元的突触蛋白表达和突触功能，本研究中发现的SMC对突触蛋白表达和功能的保护作用也可能与SMC对线粒体的保护作用相关，即SMC通过调控线粒体功能维持正常的突触功能，从而改善小鼠的学习和记忆能力，进而延缓AD的发生发展。c、SMC对线粒体动力学（分裂/融合）的调节作用线粒体分裂（fission）与融合（fusion）的动态平衡决定了线粒体的分布、形态和活性。研究发现，在AD患者脑组织神经元中线粒体的分布与正常对照有明显差异，神经元突触的线粒体密度显著降低，且Drp1，Mfn1/2，OPA1和Fis1等调控线粒体分裂或融合的蛋白的表达水平较正常脑组织均出现显著变化，提示线粒体动力学失衡引起的神经元线粒体异常分布对AD发病的重要作用重要作用[109]，这一变化很可能导致神经元突触功能退化或丧失，神经元兴奋传递能力下降。本研究发现SMC可以显著提高线粒体融合蛋白Mfn2的表达水平并且对分裂蛋白DRP1具有下调作用（图3-15A、B），提示SMC对线粒体分裂融合的调节作用。d、SMC对线粒体轴突运输的调节作用线粒体在轴突中的正常运输对提供能量以支持神经信号传递和神经元信息交流等突触活动至关重要。线粒体转运受阻会削弱突触功能并导致神经退化[110-113]。研究发现，Aβ和Tau蛋白的过度磷酸化都会导致神经元线粒体运动力下降[114-116]。本研究采用线粒体延时成像技术检测了SMC对AD神经元轴突内线粒体运动和指数的影响，发现加药处理后显著加快了线粒体的整体运动，使得线粒体的平均长度有所增加，轴突内线粒体的指数也有所增加（图3-18）。提示SMC可能通过调节线粒体的生物发生、能量代谢、分裂融合等维持线粒体在神经元轴突的正常运动。e、SMC对线粒体损伤和凋亡的调节作用AD模型小鼠和细胞内，线粒体的膜流动性和膜电位（Δψm）均降低，膜孔通道转换口（mPTP）开放并诱导线粒体凋亡。实验结果显示在细胞系水平和原代细胞水平SMC处理24h后都能显著的恢复膜电位水平（Δψm）（图3-17A、B）；钙超载的情况下mPTP会开放，采用添加Ca2+诱导线粒体膜孔通道开放，结果显示在Ca2+不存在的情况下加药组以及不加药组的mPTP开放程度区不大，而在65 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究Ca2+存在的情况下SMC加药组mPTP开放程度小于不加药组（图3-17C）。当钙稳态失调时会使得mPTP开放，激活caspase级联反应[52]，而AKT的激活会保护线粒体免遭凋亡[117]。实验结果显示SMC显著下调了CleavedCaspase-3的表达水平（图3-16A、B）。提示SMC有可能是通过保护线粒体的膜损伤来维持线粒体的动力学和生物学。线粒体动力学和功能异常在AD病理进程中发挥重要作用，线粒体缺陷通常与AD等神经退行性疾病中的突触功能丢失直接相关，SMC在维护线粒体正常功能和动力学方面的显著作用提示其可作为预防或缓解AD中神经退化的潜在药物。66 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究第五章结论1.长期低剂量补充硒甲基硒代半胱氨酸（SMC）可有效改善3xTg-AD小鼠的学习、记忆和探索能力，并改善其焦虑情绪。2.SMC降低AD模型小鼠皮层内Aβ的沉积及寡聚体的含量，抑制tau蛋白的过度磷酸化及NFT的形成，进而有效保护了突触蛋白的表达和神经元活性。3.SMC对AD模型小鼠脑内多种金属离子内稳态紊乱具有一定的调节作用。4.SMC通过调控mTOR/p70S6K通路调节自噬，并能促进自噬小体向自噬溶酶体转化，进而清除病理性蛋白。5.SMC通过激活AKT促进线粒体的生物发生并抑制线粒体凋亡；通过调节线粒体能量代谢相关蛋白的表达纠正体内ATP产生障碍；维护线粒体分裂融合的平衡并改善线粒体在神经元轴突内的运输障碍；保护线粒体膜电位和并抑制线粒体膜孔通道的过度开放。6、基于SMC对AD模型中Aβ病理和Tau病理的干预作用，对金属离子内稳态的调控作用，对自噬受损的改善作用，及对线粒体动力学和功能的保护作用，有望将SMC开发为一种潜在的AD干预药物或保健品。67 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究参考文献[1].WorldAlzheimerReport2016:Improvinghealthcareforpeoplelivingwithdementia;coverage,qualityandcostsnowandinthefuture.[R]2017.[2].Liddell,J.R.,Targetingmitochondrialmetaldyshomeostasisforthetreatmentofneurodegeneration.[J]NeurodegenerativeDiseaseManagement,2015,5(4):345-364.[3].P.HemachandraReddy,R.T.,QuangTroung.AbnormalMitochondrialDynamicsandSynapticDegenerationasEarlyEventsinAlzheimer’sDisease:ImplicationstoMitochondria-TargetedAntioxidantTherapeutics.[J]BiochimicaetBiophysicaActa,2012,1822(5):639-649.[4].Reddy,P.H.,AbnormalTau,MitochondrialDysfunction,ImpairedAxonalTransportofMitochondria,andSynapticDeprivationinAlzheimer’sDisease.[J]BrainResearch,2011,1415(1415):136-148.[5].Haass,C.andD.J.Selkoe,Cellularprocessingofβ-amyloidprecursorproteinandthegenesisofamyloidβ-peptide.[J]Cell,1994,75(6):1039-42.[6].Jacobsen,K.T.andK.Iverfeldt,Amyloidprecursorproteinanditshomologues:afamilyofproteolysis-dependentreceptors.[J]Cellular&MolecularLifeSciencesCmls,2009,66(14):2299-318.[7].Thinakaran,G.andE.Koo,AmyloidPrecursorProteinTrafficking,Processing,andFunction.[J]JournalofBiologicalChemistry,2008,283(44):29615-29619.[8].TanabeC.,HotodaN，SasagawaNetal.,ADAM19istightlyassociatedwithconstitutiveAlzheimer'sdiseaseAPPalpha-secretaseinA172cells.[J]Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2007,352(1):111-117.[9].De,S.B.andW.Annaert,Proteolyticprocessingandcellbiologicalfunctionsoftheamyloidprecursorprotein.[J]JournalofCellScience,2000,113(Pt11)(11):1857-1870.[10].PereiraC.,FerreiroE,CardosoSMetal.,Celldegenerationinducedbyamyloid-betapeptides:implicationsforAlzheimer'sdisease.[J]JournalofMolecularNeuroscience,2004,23(1):97-104.68 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究[11].Dawkins,E.andD.H.Small,Insightsintothephysiologicalfunctionoftheβ-amyloidprecursorprotein:beyondAlzheimer'sdisease.[J]JournalofNeurochemistry,2014,129(5):756-69.[12].Kamenetz,F.,TaisukeTomita,HelenHsieh,etal.,APPProcessingandSynapticFunction.[J]Neuron,2003,37(6):925-937.[13].Hardy,J.andD.J.Selkoe,TheAmyloidHypothesisofAlzheimer'sDisease:ProgressandProblemsontheRoadtoTherapeutics.[J]Science,2002,297(5580):353-356.[14].马云峰,王湘庆,郎森阳,微管相关蛋白Tau蛋白及Tau病的研究进展.[J]解放军医学院学报,2015,36(6):621-624.[15].Binder,L.I.,A.Frankfurter,andL.I.Rebhun,DifferentiallocalizationofMAP-2andtauinmammalianneuronsinsitu.[J]AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,1986,466(1):145-166.[16].Diane,P.,AndertonBH,NobleWetal.,Tauphosphorylation:thetherapeuticchallengeforneurodegenerativedisease.[J]TrendsinMolecularMedicine,2009,15(3):112-119.[17].Stieler,J.T.,BullmannT,KohlF,etal.,ThePhysiologicalLinkbetweenMetabolicRateDepressionandTauPhosphorylationinMammalianHibernation.[J]PlosOne,2011,6(1):e14530.[18].Zempel,H.andE.Mandelkow,Lostaftertranslation:missortingofTauproteinandconsequencesforAlzheimerdisease.[J]TrendsinNeurosciences,2014,37(12):721-32.[19].Abada,A.andZ.Elazar,Gettingreadyforbuilding:signalingandautophagosomebiogenesis.[J]EmboReports,2014,15(8):839–852.[20].Shen,H.M.andN.Mizushima,Attheendoftheautophagicroad:anemergingunderstandingoflysosomalfunctionsinautophagy.[J]TrendsinBiochemicalSciences,2014,39(2):61-71.[21].MizushimaN.,LevineB,CuervoAMetal.,Autophagyfightsdiseasethroughcellularself-digestion.[J]Nature,2008,451(7182):1069-1075.[22].He,C.andD.J.Klionsky,Regulationmechanismsandsignalingpathwaysofautophagy.[J]AnnualReviewofGenetics,2009,43(1):67-93.[23].Kiriyama,Y.andH.Nochi,TheFunctionofAutophagyinNeurodegenerativeDiseases.[J]InternationalJournalofMolecularSciences,2015,16(11):26797-26812.69 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究[24].Sridharan,S.,K.Jain,andA.Basu,RegulationofAutophagybyKinases.[J]Cancers,2011,3(2):2630-2654.[25].Cuyàs,E.,Corominas-FajaB,JovenJ,etal.,CellCycleRegulationbytheNutrient-SensingMammalianTargetofRapamycin(mTOR)Pathway.[J]MethodsinMolecularBiology,2014,1170:113-144.[26].Sabers,C.J.,MartinMM,BrunnGJ,etal.,IsolationofaproteintargetoftheFKBP12-rapamycincomplexinmammaliancells.[J]JournalofBiologicalChemistry,1995,270(2):815-822.[27].Mizushima,N.,TheroleoftheAtg1/ULK1complexinautophagyregulation.[J]CurrentOpinioninCellBiology,2010,22(2):132-139.[28].Chang,H.J.,JunCB,RoSH,etal.,ULK-Atg13-FIP200complexesmediatemTORsignalingtotheautophagymachinery.[J]MolecularBiologyoftheCell,2009,20(20):1992-2003.[29].Yu,L.,McPheeCK,ZhengLetal.,TerminationofautophagyandreformationoflysosomesregulatedbymTOR.[J]Nature,2010,465(7300):942-6.[30].BlommaartEF.,LuikenJJ,BlommaartPJ,etal.,PhosphorylationofribosomalproteinS6isinhibitoryforautophagyinisolatedrathepatocytes.[J]JournalofBiologicalChemistry,1995,270(5):2320-6.[31].GwinnDM.,ShackelfordDB,EganDF,etal.,AMPKphosphorylationofraptormediatesametaboliccheckpoint.[J]MolecularCell,2008,30(2):214-226.[32].Fujita,N.,etal.,TheAtg16LcomplexspecifiesthesiteofLC3lipidationformembranebiogenesisinautophagy.[J]MolecularBiologyoftheCell,2008,19(5):2092-20100.[33]Wild,P.,D.G.Mcewan,andI.Dikic,TheLC3interactomeataglance.[J]JournalofCellScience,2014,127(1):3-9.[34].Wu,J.J.,etal.,Mitochondrialdysfunctionandoxidativestressmediatethephysiologicalimpairmentinducedbythedisruptionofautophagy.[J]Aging,2009,1(4):425-437.[35].Pickford,F.,etal.,Theautophagy-relatedproteinbeclin1showsreducedexpressioninearlyAlzheimerdiseaseandregulatesamyloidbetaaccumulationinmice.[J]JournalofClinicalInvestigation,2008,118(6):2190-2199.[36].Nixon,R.A.,etal.,ExtensiveinvolvementofautophagyinAlzheimerdisease:animmuno-70 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究electronmicroscopystudy.[J]JournalofNeuropathology&ExperimentalNeurology,2005,64(2):113-122.[37].Lee,J.H.,etal.,Lysosomalproteolysisandautophagyrequirepresenilin1andaredisruptedbyAlzheimer-relatedPS1mutations.[J]Cell,2010,141(7):1146-1158.[38].Majumder,S.,etal.,InducingAutophagybyRapamycinBefore,butNotAfter,theFormationofPlaquesandTanglesAmelioratesCognitiveDeficits.[J]PLoSOne.2011;6(9):e25416.[39].Du,H.,etal.,EarlydeficitsinsynapticmitochondriainanAlzheimer'sdiseasemousemodel.[J]ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,107(107):18670-18675.[40].Swerdlow,R.H.,J.M.Burns,andS.M.Khan,TheAlzheimer'sdiseasemitochondrialcascadehypothesis:Progressandperspectives.[J]BiochimicaEtBiophysicaActa,2014,1842(8):1219-1231.[41].St-Pierre,J.,etal.,SuppressionofreactiveoxygenspeciesandneurodegenerationbythePGC-1transcriptionalcoactivators.[J]Cell,2006,127(2):397-408.[42].Perry,G.,X.Wang,andM.S.X.Zhu,MitochondrialAbnormalitiesinAlzheimerDisease.[J]NeurobiologyofAging,2001,21(9):3017-3023.[43].Viña,J.,etal.,Mitochondrialbiogenesisinexerciseandinageing.[J]AdvancedDrugDeliveryReviews,2009,61(14):1369–1374.[44].Scarpulla,R.C.,Transcriptionalparadigmsinmammalianmitochondrialbiogenesisandfunction.[J]PhysiologicalReviews,2008,88(2):611-638.[45].Dhar,S.S.andM.T.Wong-Riley,Couplingofenergymetabolismandsynaptictransmissionatthetranscriptionallevel:roleofnuclearrespiratoryfactor1inregulatingbothcytochromecoxidaseandNMDAglutamatereceptorsubunitgenes.[J]JournalofNeurosciencetheOfficialJournaloftheSocietyforNeuroscience,2009,29(2):483-92.[46].Carvalho,C.,etal.,Alzheimer'sdiseaseandtype2diabetes-relatedalterationsinbrainmitochondria,autophagyandsynapticmarkers.[J]BiochimicaEtBiophysicaActa,2015,1852(8):1665-1675.[47].Pedrós,I.,etal.,EarlyalterationsinenergymetabolisminthehippocampusofAPPswe/PS1dE9mousemodelofAlzheimer'sdisease.[J]BiochimicaEtBiophysicaActa,2014,1842(9):1556-1566.71 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究[48].Sindreu,C.,etal.,Zinctransporter-1concentratesatthepostsynapticdensityofhippocampalsynapses.[J]MolecularBrain,2014,7-16.[49].Dhar,S.S.,H.L.Liang,andM.T.Wong-Riley,Transcriptionalcouplingofsynaptictransmissionandenergymetabolism:roleofnuclearrespiratoryfactor1inco-regulatingneuronalnitricoxidesynthaseandcytochromecoxidasegenesinneurons.[J]BiochimicaEtBiophysicaActa,2009,1793(10):1604-1613.[50].Carvalho,C.,etal.,MetabolicAlterationsInducedbySucroseIntakeandAlzheimer’sDiseasePromoteSimilarBrainMitochondrialAbnormalities.[J]2012,61(5):1234-1242.[51].Wojda,U.,E.Salinska,andJ.Kuznicki,Calciumionsinneuronaldegeneration.[J]InternationalUnionofBiochemistry&MolecularBiologyLife,2008,60(9):575-590.[52].Hengartner,M.O.,Thebiochemistryofapoptosis.[J]Nature,2000,407(6805):770-776.[53].Valla,J.,etal.,ReducedPosteriorCingulateMitochondrialActivityinExpiredYoungAdultCarriersoftheAPOEepsilon4Allele,theMajorLate-OnsetAlzheimer'sSusceptibilityGene.[J]2010,22(1):307-313.[54].Lim,Y.A.,etal.,Abetaandhumanamylinshareacommontoxicitypathwayviamitochondrialdysfunction.[J]Proteomics,2010,10(8):1621-1633.[55].Prasad,C.,T.Rupar,andA.N.Prasad,Pyruvatedehydrogenasedeficiencyandepilepsy.[J]Brain&Development,2011,33(10):856-865.[56].Song,Z.,etal.,MitofusinsandOPA1mediatesequentialstepsinmitochondrialmembranefusion.[J]MolecularBiologyoftheCell,2009,20(15):3525-3532.[57].Wang,X.,etal.,ImpairedbalanceofmitochondrialfissionandfusioninAlzheimer'sdisease.[J]JournalofNeurosciencetheOfficialJournaloftheSocietyforNeuroscience,2009,29(28):9090-9103.[58].Kandimalla,R.andP.H.Reddy,Multiplefacesofdynamin-relatedprotein1anditsroleinAlzheimer'sdiseasepathogenesis.[J]BiochimicaetBiophysicaActa,2015,1862(4):814-828.[59].Bachurin,S.O.,E.V.Bovina,andA.A.Ustyugov,DrugsinClinicalTrialsforAlzheimer'sDisease:TheMajorTrends.[J]MedicinalResearchReviews,2017[Epubaheadofprint].[60].Bachurin,S.O.,E.V.Bovina,andA.A.Ustyugov,DrugsinClinicalTrialsforAlzheimer'sDisease:TheMajorTrends.[J]MedResRev,2017[Epubaheadofprint].72 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究[61].Jc,D.L.T.,Phase3trialsofsolanezumabandbapineuzumabforAlzheimer'sdisease.[J]NewEnglandJournalofMedicine,2014,370(15):1459-1460.[62].Wang,C.Y.,etal.,Site-specificUBIThamyloid-betavaccineforimmunotherapyofAlzheimer'sdisease.[J]Vaccine,2007,25(16):3041-3052.[63].Adolfsson,O.,etal.,Aneffector-reducedanti-β-amyloid(Aβ)antibodywithuniqueaβbindingpropertiespromotesneuroprotectionandglialengulfmentofAβ.[J]JournalofNeuroscience,2012,32(32):9677-9689.[64].Maccecchini,M.L.,etal.,PosiphenasacandidatedrugtolowerCSFamyloidprecursorprotein,amyloid-βpeptideandτlevels:targetengagement,tolerabilityandpharmacokineticsinhumans.[J]JournalofNeurologyNeurosurgery&Psychiatry,2012,83(9):894-902.[65].Sinha,S.,etal.,Comparisonofthreeamyloidassemblyinhibitors:thesugarscyllo-inositol,thepolyphenolepigallocatechingallate,andthemoleculartweezerCLR01.[J]AcsChemicalNeuroscience,2012,3(6):451-8.[66].Friedman,S.D.,etal.,Growthhormone-releasinghormoneeffectsonbrainγ-aminobutyricacidlevelsinmildcognitiveimpairmentandhealthyaging.[J]2013,70(7):1-8.[67].Moreira,P.I.,etal.,AutophagyinAlzheimer'sdisease.[J]ReviewsintheNeurosciences,2015,26(7):1209-18.[68].Zhu,Z.,etal.,ArctigenineffectivelyamelioratesmemoryimpairmentinAlzheimer'sdiseasemodelmicetargetingbothβ-amyloidproductionandclearance.[J]JournalofNeurosciencetheOfficialJournaloftheSocietyforNeuroscience,2013,33(32):13138-49.[69].Xu,P.,etal.,TriptolideInhibitedCytotoxicityofDifferentiatedPC12CellsInducedbyAmyloid-Beta25–35viatheAutophagyPathway.[J]PlosOne,2015,10(11):e0142719.[70].Wang,C.,etal.,DownregulationofPI3K/Akt/mTORsignalingpathwayincurcumin-inducedautophagyinAPP/PS1doubletransgenicmice.[J]EuropeanJournalofPharmacology,2014,740:312-320.[71].Huang,Z.andH.Adachi,NaturalCompoundsPreventingNeurodegenerativeDiseasesThroughAutophagicActivation.[J]JournalofUoeh,2016,38(2):139-148.[72].Hroudová,J.,etal.,ProgressindrugdevelopmentforAlzheimer'sdisease:Anoverviewinrelationtomitochondrialenergymetabolism.[J]EuropeanJournalofMedicinalChemistry,73 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究2016,121:774-784.[73].Valasani,K.R.,etal.,IdentificationofHumanABADInhibitorsforRescuingAβ-MediatedMitochondrialDysfunction.[J]CurrentAlzheimerResearch,2014,11(2):128-36.[74].Yun-AnLim,A.G.,MariaGiese,AyikoeGuyMensah-Nyagan,J.ErnestVillafranca,LarsM.Ittner,AnneEckert,JürgenGötz,InhibitionoftheMitochondrialEnzymeABADRestorestheAmyloid-β-MediatedDeregulationofEstradiol.[J]PlosOne,2011,6(12):e28887.[75].Valasani,K.R.,etal.,Structure-baseddesignandsynthesisofbenzothiazolephosphonateanalogueswithinhibitorsofhumanABAD-AβfortreatmentofAlzheimer'sdisease.[J]ChemicalBiology&DrugDesign,2013,81(2):238-49.[76].Elkamhawy,A.,etal.,Novelquinazoline-ureaanaloguesasmodulatorsforAβ-inducedmitochondrialdysfunction:design,synthesis,andmoleculardockingstudy.[J]EuropeanJournalofMedicinalChemistry,2014,84:466-475.[77].Seale,L.A.andM.J.Berry,Seleniuminhumanhealthanddisease.[J]Antioxidants&RedoxSignaling,2011,14(7):1337-83.[78].Valdiglesias,V.,etal.,Invitroevaluationofseleniumgenotoxic,cytotoxic,andprotectiveeffects:areview.[J]ArchivesofToxicology,2010,84(5):337-351.[79].Gao,S.,etal.,SeleniumlevelisassociatedwithapoEε4inruralelderlyChinese.[J]PublicHealthNutrition,2009,12(12):2371-2376.[80].Kryukov,G.V.andV.N.Gladyshev,Characterizationofmammalianselenoproteomes.[J]Science,2003,300(5624):1439-43.[81].Papp,L.V.,A.Holmgren,andK.K.Khanna,Seleniumandselenoproteinsinhealthanddisease.[J]Antioxidants&RedoxSignaling,2009,12(7):793-795.[82].Song,G.,etal.,Selenomethionineamelioratescognitivedecline,reducestauhyperphosphorylation,andreversessynapticdeficitinthetripletransgenicmousemodelofAlzheimer'sdisease.[J]JournalofAlzheimersDiseaseJad,2013,41(1):85-99.[83].M,H.,etal.,Elevatedamyloid-βplaquedepositionindietaryselenium-deficientTg2576transgenicmice.[J]2013,5(5):479-483.[84].Du,X.,C.Wang,andQ.Liu,PotentialRolesofSeleniumandSelenoproteinsinthePreventionofAlzheimer'sDisease.[J]CurrentTopicsinMedicinalChemistry,74 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究2016,16(8):835-848.[85].郑友标,两种硒化合物对阿尔茨海默症的作用及其分子机制[D].2015,深圳大学.[86].B.R.Cardosoetal.,NutritionalstatusofseleniuminAlzheimer'sdiseasepatients[J].BrJNutr103,2010,803-806.[87].L.M.Broersenetal.,Aspecificmulti-nutrientdietreducesAlzheimer-likepathologyinyoungadultAbetaPPswe/PS1dE9mice[J].JAlzheimersDis33,2013,177-190.[88].Du,X.B.,C.Wang,andQ.Liu,PotentialRolesofSeleniumandSelenoproteinsinthePreventionofAlzheimer'sDisease.[J]CurrentTopicsinMedicinalChemistry,2016,16(8):835-848.[89].Zhang,Z.H.,etal.,Selenomethioninereducesthedepositionofbeta-amyloidplaquesbymodulatingβ-secretaseandenhancingselenoenzymaticactivityinamousemodelofAlzheimer'sdisease.[J]Metallomics,2016,8(8):782-789.[90].Trelease,S.F.,D.I.SOMMAAA,andA.L.Jacobs,Seleno-aminoacidfoundinAstragalusbisulcatus.[J]Science,1960,132(3427):618.[91].Verma,P.,A.Kunwar,andK.I.Priyadarsini,EffectofLow-DoseSeleniumSupplementationontheGenotoxicity,TissueInjuryandSurvivalofMiceExposedtoAcuteWhole-BodyIrradiation.[J]BiolTraceElemRes.2017[Epubaheadofprint].[92].Auriel,E.,K.Regev,andA.D.Korczyn,Chapter38-Nonsteroidalanti-inflammatorydrugsexposureandthecentralnervoussystem.2014:ElsevierHealthSciences.577-84.[93].方松,余化霖,Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展.[J]临床与病理杂志,2010,30(4):321-326.[94].Hall,C.S.,Emotionalbehaviorintherat.I.Defecationandurinationasmeasuresofindividualdifferencesinemotionality.[J]JournalofComparative&PhysiologicalPsychology,1934,18(3):385-403.[95].王维刚,旷场实验在小鼠行为分析中的应用.[J]《中国细胞生物学学报》,2011(11):1191-1196[96].Zhang,Z.H.,etal.,SelenomethionineAmelioratesNeuropathologyintheOlfactoryBulbofaTripleTransgenicMouseModelofAlzheimer’sDisease.[J]InternationalJournalofMolecularSciences,2016,17(10)pii:E1595.[97].Gong,C.X.andK.Iqbal,HyperphosphorylationofMicrotubule-AssociatedProteinTau:A75 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究PromisingTherapeuticTargetforAlzheimerDisease.[J]CurrentMedicinalChemistry,2008,15(23):2321-2328.[98].Adlard,P.,etal.,RapidrestorationofcognitioninAlzheimer'stransgenicmicewith8-hydroxyquinolineanalogsisassociatedwithdecreasedinterstitialAbeta.[J]Neuron,2008,59(1):43-55.[99].Damante,C.A.,etal.,MetalloadingcapacityofAbetaN-terminus:acombinedpotentiometricandspectroscopicstudyofzinc(II)complexeswithAbeta(1-16),itsshortormutatedpeptidefragmentsanditspolyethyleneglycol-ylatedanalogue.[J]InorganicChemistry,2009,48(21):10405-10415.[100].Goodman,L.,Alzheimer'sdisease;aclinico-pathologicanalysisoftwenty-threecaseswithatheoryonpathogenesis.[J]JournalofNervous&MentalDisease,1953,118(118):97-130.[101].Wang,P.andZ.Y.Wang,MetalIonsInfluxisaDoubleEdgedSwordforthePathogenesisofAlzheimer'sDisease.[J]AgeingResearchReviews,2016,35:265-290.[102].Nilsson,P.andT.C.Saido,Dualrolesforautophagy:degradationandsecretionofAlzheimer'sdiseaseAβpeptide.[J]Bioessays,2014,36(6):570–578.[103].Magnaudeix,A.,etal.,PP2Ablockadeinhibitsautophagyandcausesintraneuronalaccumulationofubiquitinatedproteins.[J]NeurobiologyofAging,2013,34(3):770-790.[104].Wright,G.L.,etal.,VEGFstimulationofmitochondrialbiogenesis:requirementofAKT3kinase.[J]FasebJournal,2008,22(9):3264-3275.[105].Carvalho,C.,etal.,MetabolicAlterationsInducedbySucroseIntakeandAlzheimer’sDiseasePromoteSimilarBrainMitochondrialAbnormalities.[J]Diabetes,2012,61(5):1234-1242.[106].Du,H.,etal.,EarlydeficitsinsynapticmitochondriainanAlzheimer'sdiseasemousemodel.[J]ProcNatlAcadSciUSA,2010,107(107):18670-18675.[107].Chen,Y.,etal.,TheProtectiveEffectofIcariinonMitochondrialTransportandDistributioninPrimaryHippocampalNeuronsfrom3×Tg-ADMice.[J]InternationalJournalofMolecularSciences,2016,17(2),pii:E163.[108].Chen,Y.J.,etal.,NeuroprotectiveEffectsofIcariinonBrainMetabolism,MitochondrialFunctions,andCognitioninTriple‐TransgenicAlzheimer'sDiseaseMice.[J]CnsNeuroscience&Therapeutics,2015,22(1):63-73.76 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究[109].Wang,X.,etal.,ImpairedbalanceofmitochondrialfissionandfusioninAlzheimer'sdisease.[J]JNeurosci,2009,29(28):9090-103.[110].Dhillon,V.S.andM.Fenech,Mutationsthataffectmitochondrialfunctionsandtheirassociationwithneurodegenerativediseases.[J]MutatResRevMutatRes,2014,759:1-13.[111].Knott,A.B.,etal.,Mitochondrialfragmentationinneurodegeneration.[J]NatRevNeurosci,2008,9(7):505-18.[112].Lee,S.H.,etal.,Impairedshort-termplasticityinmossyfibersynapsescausedbymitochondrialdysfunctionofdentategranulecellsistheearliestsynapticdeficitinamousemodelofAlzheimer'sdisease.[J]JNeurosci,2012,32(17):5953-63.[113].Wilson,T.J.,A.M.Slupe,andS.Strack,Cellsignalingandmitochondrialdynamics:Implicationsforneuronalfunctionandneurodegenerativedisease.[J]NeurobiolDis,2013,51:13-26.[114].Calkins,M.J.andP.H.Reddy,AmyloidbetaimpairsmitochondrialanterogradetransportanddegeneratessynapsesinAlzheimer'sdiseaseneurons.[J]BiochimBiophysActa,2011,1812(4):507-13.[115].Du,H.,etal.,EarlydeficitsinsynapticmitochondriainanAlzheimer'sdiseasemousemodel.[J]ProcNatlAcadSciUSA,2010,107(43):18670-5.[116].Wang,X.,etal.,Amyloid-beta-deriveddiffusibleligandscauseimpairedaxonaltransportofmitochondriainneurons.[J]NeurodegenerDis,2010,7(1-3):56-59.[117].Bai,T.,D.S.Dong,andL.Pei,Resveratrolmitigatesisoflurane-inducedneuroapoptosisbyinhibitingtheactivationoftheAkt-regulatedmitochondrialapoptoticsignalingpathway.[J]InternationalJournalofMolecularMedicine,2013,32(4):819-826.77 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究附录一、攻读硕士研究生期间的研究成果学术性论文：YongliXie,YibinTan,YoubiaoZheng,DuXiubo*andLiuQiong*.EbselenAmelioratesβ-amyloidPathology,TauPathologyandCognitiveImpairmentinTriple-TransgenicAlzheimer'sDiseaseMice.JournalofBiologicalInorganicChemistry,2017（2区，IF:2.495）会议论文：1．谢永丽，郑友标，倪嘉缵，刘琼*，都秀波*（2015）。“硒甲基硒代半胱氨酸在干预阿尔茨海默病中的潜在作用”2015深圳-香港阿尔茨海默症早期诊断与防治机理研讨会，中国深圳2．YongliXie,JiazuanNi,QiongLiu*andXiuboDu*(2016),“PotentialRoleofSe-MethyselenocysteineintheInterventionofAlzheimer'sDisease”.InternationalAlzheimer'sDiseaseConference2016.HongKong3.YongliXie,JiazuanNi,QiongLiu*,XiuboDu*(2016).“Se-MethyselenocysteineintheinterventionofAlzheimer'sDiseasethroughprotectingMitochondriaandregulatingAutophagy”.The6thInternationalSeleniumConference(Se2016).GuangZhou,China78 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究附录二、英文缩写对照表英文缩写英文全称中文全称SMCSe-Methyl-Selenocysteine硒甲基硒代半胱氨酸ADAlzheimer'sdiseases阿尔茨海默综合症APPamyloidproteinprecursor淀粉蛋白样前体NFTneurofibrillarytangle神经纤维缠结SelPSelenoproteinP硒蛋白PAβbeta-amyloidprotein淀粉样蛋白BCAbicinchoninicacid2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠ADAMA-disintegrinandmetalloproteinase金属蛋白酶BACE1β-siteAPPcleavingenzyme-1APPβ位点切割酶LTPlong-termpotentiation长时程增强CatDcathepsinD组织蛋白酶DmTORthekinasemammaliantargetofrapamycin雷帕霉素靶酶P70S6kribosomalproteinS6kinase40S核糖体蛋白S6激酶AMPKAMP-dependentproteinkinaseAMP依赖蛋白激酶LC3Bmicrotubule-associatedprotein1lightchain3beta微管相关蛋白轻链1-3βNRF1nuclearrespiratoryfactors1核呼吸因子1NRF2nuclearrespiratoryfactors2核呼吸因子2mTFAmitochondrialtranscriptionfactorA线粒体转录因子AND1NADHdehydrogenasesubunit1NADH脱氢酶亚基1mPTPmitochondrialpermeabilitytransitionpore线粒体膜孔通道转换孔ABADamyloid-βbindingdehydrogenaseAβ结合脱氢酶PDHE1αPyruvatedehydrogenaseE1componentsubunitalpha丙酮酸脱氢酶E1复合物α亚基COXIVCytochromecoxidaseIV细胞色素C氧化酶IVDRP1dynamin-relatedprotein1动力相关蛋白-1Mfn2mitofusin2融合蛋白279 硒甲基硒代半胱氨酸通过调控自噬和线粒体功能干预阿尔茨海默症病理的机制研究致谢转瞬间，三年的研究生生涯已经过去，感慨良多，虽然迷茫过，但是却未停过探索的脚步。三年里，不仅学会了专业知识以及实验技能，还学会了自己设计实验自己解决问题，懂得了付出就会有回报，懂得了责任和感恩。在这里我要对这三年来给予我帮助的家人、老师、师弟师妹、师兄师姐、朋友表示由衷的感谢！首先，我要感谢倪嘉缵院士课题组给我提供的科研平台，让我从迷茫中能够学会探索，获得自己想要的知识。我还要感谢我的导师——刘琼老师和都秀波老师，从实验的设计到研究的进展再到毕业论文的撰写，她们都给予了我极大的帮助，刘琼老师科研的探索精神，是我终生学习的榜样；都秀波老师对我的实验过程的指导以及生活上的关心，我心存感激，默默记在心里。其次，我要感谢三年来一直陪伴我的全体同学们，感谢同门师兄师姐师弟师妹们对我实验的帮助和支持，感谢生科院实验平台的所有老师的帮助。最后，感谢我的家人给予我精神上的支持和鼓励，让我可以放心探索我的科研。80