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码■：５校代８丨学１０２＃？例Ｘ＃ＳＯＯＣ学号：２０１４４１３２０１４条遂士学位论文一？、业／（专学■、讀參小鼠前扣带皮层ＣＸＣＬ１３及受体ＣＸＣＲ５在神经病理性疼痛中的作用研究ＴｈｅｒＣＬａｎｄｏｌｅｏｆＣＸ．１３ＣＸＣＲ５ｉｎａｎｔｅｒｉｏｒｃｉｎｇｕｌａｔｅｃｍ、ｉｎｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃｐａｉｎｉｎｍｉｃｅ亡研究生：７姓名朱翔指导教师姓名杨建平一—￥专业名称麻醉学研究方向慢性疼痛机制—所在院部苏州大学附属第一医院ｉ论文提交日期２０１７年３月 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究中文摘要目的：探讨脊神经结扎（SNL）诱导神经病理性疼痛小鼠前扣带皮层（ACC）中趋化因子CXCL13（C-X-Cmotifchemokineligand13）及其受体CXCR5（C-X-Cchemokinereceptortype5）的表达与细胞分布，分析它们参与神经病理性疼痛的可能机制。方法：1.小鼠左侧L5脊神经(spinalnerveligation，SNL)结扎诱导神经病理性疼痛的模型；2.采用行为学检测方法判断小鼠机械性触诱发痛与热痛觉过敏；3.采用条件性位置逃避实验来判断痛相关厌恶情绪；4.采用Real-timePCR法检测CXCLl3和CXCR5mRNA的表达；5.采用ELISA法检测CXCL13蛋白含量变化情况；6.采用Westernblot法分析CXCR5蛋白表达变化；7.采用原位杂交与免疫荧光双重染色法分析CXCLl3的细胞定位；8.采用免疫荧光双标染色法分析CXCR5的细胞定位；9.ACC内注射CXCR5干扰慢病毒（LV-CXCR5shRNA），观察对SNL诱导的机械性痛觉过敏及痛相关厌恶情绪的影响；10.全细胞膜片钳记录ACC脑区II/III层锥体神经元上sEPSCs变化。结果1.SNL对小鼠的生长发育及运动协调能力均无影响，但可以诱导同侧后爪产生持续的疼痛，机械性触诱发痛与热痛觉过敏在SNL第ld即开始形成，且能持续超过21d。2.SNL诱导ACC中的CXCL13mRNA和蛋白表达上调；CXCL13mRNA和蛋白的上调都从1d开始（p<0.01），维持10d以上（p<0.001）；原位杂交结果表明CXCLl3I mRNA分布于ACC神经元细胞。3.SNL诱导ACC中的CXCR5mRNA和蛋白表达上调，mRNA在第1d时无显著变化（p>0.05），第3d开始显著升高（p<0.001），持续10d以上（p<0.001）；而且蛋白上调在3d也有显著变化（p<0.001）；免疫荧光双标染色表明ACC中CXCR5表达于ACC神经元细胞。4.ACC内注射CXCR5干扰慢病毒（LV-CXCR5shRNA）不能缓解SNL引起的机械性痛敏，但能缓解SNL引起的痛相关厌恶情绪。5.SNL并不影响II/III层锥体神经元上sEPSCs的发放频率（p>0.05），但sEPSCs幅度出现显著增加（p<0.05）；CXCL13急性处理能引起ACC神经元上sEPSC的幅度出现显著增加（p<0.01），对sEPSC的发放频率也有增加，但作用不显著（p>0.05）。结论：1.SNL可作为可靠的神经病理性疼痛模型，诱导小鼠神经病理性疼痛的产生。2.SNL可诱导ACC中CXCLl3与CXCR5的mRNA及蛋白表达增加；且二者主要表达于ACC神经元细胞。3.抑制ACC水平CXCR5的作用能够缓解SNL引起的痛相关厌恶情绪。4.SNL诱导的情绪改变可能与ACC脑区II/III层锥体神经元兴奋性突触传入功能的改变有关；SNL后ACC区域CXCL13的增加可能直接诱发了ACC脑区II/III层锥体神经元上兴奋性突触传递功能的增强。关键词前扣带皮层；神经病理性疼痛；CXCL13；CXCR5；条件性位置逃避实验；sEPSCs；小鼠作者：朱翔指导教师：杨建平教授II TherolesofCXCL13andCXCR5intheanteriorcingulatecortexinneuropathicpaininmiceAbstractObjectiveTostudytheexpressionandcelldistributionofchemokineCXCL13anditsreceptorCXCR5intheanteriorcingulatecortex(ACC)ofmicewithneuropathicpaininducedbyspinalnerveligation(SNL),andinvestigatetheirregulatingeffectsonneuropathicpain.Method1.TheneuropathicpainmodelwasinducedbyleftL5spinalnerveligation(SNL).2.Themechanicalallodyniaandheathyperalgesiawereevaluatedbybehavioraltest..3.Theplaceescape/avoidanceparadigm(PEAP)wasappliedtodeterminetheextentofpain-relatedaversion.4.TheexpressionsofCXCLl3andCXCR5mRNAweredetectedbytheReal-timePCRmethod.5.ThechangeofCXCL13proteinwasdetectedbyELISA.6.ThechangeofCXCR5proteinwasdetectedbywesternblot.7.ThecelltypeofCXCLl3mRNAwasdetectedbyhybridizationinsituanddouble-labellingimmunofluorescencemethods.8.ThecellulardistributionofCXCR5wasderterminedbytheimmunofluorescencestaining.9.TheCXCR5lentiviral(LV-CXCR5shRNA)wasinjectedinACC,soastoinvestigatetheextentsofSNLonmechanicalhyperalgesiaandpain-relatedaversion.10.ThechangeofsEPSCsinACCII/IIIlayerpyramidalneuronswasrecordedusingthewhole-cellpatchclamp.Result1.SNLhadnoeffectonthegrowth,developmentandmotorcoordinationabilityofmice,butcouldinducetheneuropathicpainofipsilateralhindpaw.Moreover，themechanicalallodyniaandthermalhyperalgesiawereobserved1dafterSNLandcouldlastformorethan21d.III 2.SNLinducedupregulationofCXCL13mRNAandproteininACC;TheexpressionsofCXCL13mRNAandproteinwereincreased1dlater(p<0.01)andwasmaintainedformorethan10d(p<0.001);Thein-situhybridizationresultshowedthatCXCLl3mRNAwasdistributedinACCneurons.3.SNLinducedupregulationofCXCR5mRNAandproteininACC.Meanwhile,CXCR5mRNAshowednosignificantchange1dlater(p>0.05),wassignificantlyincreasedin3d(p<0.001)andwasmaintainedformorethan10d(p<0.001);TheCXCR5proteinshowednosignificantupregulationin3d(p<0.001);Thedouble-labellingimmunofluorescenceresultshowedthatCXCR5wasexpressedinACCneurons.4.MicroinjectionofCXCR5interferinglentivirus(LV-CXCR5shRNA)inACCdidnotalleviatethemechanicalhyperalgesiainducedbySNL,butalleviatedpainrelatedaversioninducedbySNL.5.SNLdidnotaffectthedischargefrequencyofsEPSCspyramidalneuronsonII/IIIlayer(p>0.05),buttheamplitudeofsEPSCswasincreasedsignificantly(p<0.05);TheacuteCXCL13treatmentsignificantlyincreasedtheamplitudeofsEPSCinneurons(p<0.01),butdidnotincreasethedischargedistributionfrequencyofsEPSC,(p>0.05).Conclusion1.TheneuropathicpainmodelwasinducedbyleftL5spinalnerveligation(SNL).SNLinducedtheneuropathicpaininmiceandcouldbeusedasareliableneuropathicpainmodel.2.SNLinducedtheincreasedexpressionsofCXCLl3andCXCR5mRNAandproteininACC;CXCLl3andCXCR5weremainlyexpressedinACCneurons.3.TheinhibitionofCXCR5inACCalleviatedthepain-relatedaversioninducedbySNL.4.SNLinducedpainaffectmightberelatedtotheAMPAreceptorfunctionofpyramidalneuronsexcitatorysynapsepostsynapticafferenceinACCII/IIIlayer;TheincreaseofCXCL13inACCmightdirectlyinducetheenhancedfunctionofexcitatorysynaptictransmissionofpyramidalneuronsonII/IIIACClayerafterSNL.Keywordsanteriorcingulatecortex;neuropathicpain;CXCL13;CXCR5;PEAP;sEPSCs;miceWrittenby:XiangZhuSupervisedby:ProfessorJianpingYangIV 目录第一章绪论....................................................................................................................1第二章材料与方法..............................................................................................................92.1材料..........................................................................................................................92.1.1研究对象（实验动物）...................................................................................92.1.2主要试剂...........................................................................................................92.1.3主要仪器.........................................................................................................112.1.4溶液配制.........................................................................................................122.2方法........................................................................................................................152.2.1脊神经结扎(SpinalNerveLigation，SNL)神经病理性疼痛模型的建立...152.2.2小鼠行为学检测.............................................................................................152.2.3实时荧光定量PCR分析...............................................................................172.2.4ELISA检测....................................................................................................202.2.5WesternBlot...................................................................................................212.2.6组织免疫荧光染色.........................................................................................232.2.7原位杂交检测.................................................................................................232.2.8ACC脑区微量注射慢病毒...........................................................................242.2.9ACC脑片制备...............................................................................................252.2.10ACC脑片全细胞膜片钳记录.......................................................................252.2.11统计方法.........................................................................................................25第三章结果....................................................................................................................263.1基于SNL神经病理性疼痛的模型建立与行为学观察........................................263.1.1小鼠生长发育的影响.......................................................................................263.1.2协调能力的影响...............................................................................................263.1.3诱发小鼠同侧后爪产生神经病理性疼痛.......................................................263.2SNL诱导ACC中CXCL13的表达情况及细胞定位.........................................283.2.1SNL诱导ACC中CXCL13mRNA表达上调..............................................283.2.2SNL诱导ACC中CXCL13蛋白表达上调..................................................293.2.3ACC中CXCL13表达于神经元细胞.............................................................293.3SNL诱导ACC中CXCR5的表达情况及细胞定位...........................................30 3.3.1SNL诱导ACC中CXCR5mRNA表达上调................................................303.3.2SNL诱导ACC中CXCR5蛋白表达上调.....................................................313.3.3ACC中CXCR5表达于神经元细胞..............................................................313.4颅内注射CXCR5干扰慢病毒对SNL诱导慢性病理性疼痛的影响.................323.4.1颅内注射CXCR5干扰慢病毒到ACC脑区能够敲减CXCR5的表达.......323.4.2注射慢病毒后不能缓解SNL引起的机械痛敏.............................................333.4.3注射CXCR5干扰慢病毒至小鼠ACC能缓解SNL引起的痛相关厌恶情绪的产生...........................................................................................................................333.5ACC脑区II/III层锥体神经元上SEPSCS变化..................................................343.5.1SNL引起ACC脑区II/III层锥体神经元兴奋性突触后电流增强..............343.5.2趋化因子CXCL13可诱导ACC脑区II/III层锥体神经元自发兴奋性突触后电流增加.......................................................................................................................35第四章讨论..................................................................................................................37参考文献..............................................................................................................................46结论..................................................................................................................................52综述..................................................................................................................................53参考文献..........................................................................................................................66中英文缩略词表..................................................................................................................75攻读学位期间公开发表的论文..........................................................................................77攻读学位期间参加会议......................................................................................................77致谢..................................................................................................................................78 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第一章绪论第一章绪论疼痛是一种基础感觉机制，用来预警我们即将发生的组织损伤。然而，当疼痛阈值急剧变化时，就会发生与疼痛相关的一系列临床问题。疼痛分为两大类：急性或生理性疼痛，慢性或病理性疼痛。生理性疼痛有助于我们确定潜在的危险刺激并避免其发生，其对生存至关重要。与生理性疼痛不同，病理性疼痛对人体没有任何益处，它只发生在机体损伤以后（例如组织或神经损伤、疾病等），临床常见的神经病理性疼[1,2]痛就是其中的一种。2008年，IASP（TheInternationalAssociationfortheStudyofPain，国际疼痛研究协会）提出新定义，神经病理性疼痛是指直接影响躯体感觉神经[3]系统的病变或疾病。临床常见疾病都可诱发神经病理性疼痛，其特点是疼痛剧烈，有时可达到“痛不欲生”的程度，且持续周期长，通常是原有的疾病治愈后，疼痛仍可持续。据统计，目前在中国约有1500万以上的神经病理性疼痛患者，临床虽然有许多治疗方法和药物，但效果并不十分理想，约半数患者在治疗后仅能达到30%左右的[4]缓解程度。这种状况存在的主要原因是目前对神经病理性疼痛发生、发展的详细机制仍不完全了解所致。因此，从新的角度、深入研究神经病理性疼痛的发病机制，寻找和发现治疗的新靶点变得更为迫切。近年来对慢性疼痛的机制研究取得了很大的进展，尤其是发生于神经系统的炎症[5,6]反应在神经病理性疼痛的作用逐渐受到关注，但机制仍不完全明了。外周的神经损伤或组织损伤不但使局部组织发生炎症反应，也会引起中枢神经系统（CentralNervousSystem，CNS）内的炎症相关细胞因子，如白介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、趋化因子、神经营养因子等表达增高。其中趋化因子（Chemokines）是化学趋化细胞因子简称，它是调节外周免疫细胞运输的小细胞分泌蛋白，是参与炎症反应的一类重要细胞因子。趋化因子也在中枢神经系统中表达，在生理和病理条件下调节中枢神经系统的功能，包括神经发育、突触传递、与疾病相关[7-9]炎症反应等。趋化因子是一个非常大的家族，拥有超过50个成员。研究证明，趋化因子CCL2、CCL7、CXCL1、CCL21和CX3CL1介导中枢神经系统神经元-胶质细[10-13]胞的相互作用，从而促进神经性疼痛、炎症性疼痛的发生和发展。1 第一章绪论小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究随着分子生物学技术广泛应用于与疼痛相关基因的研究，许多与各类神经病理性[14-16]疼痛相关的趋化因子已被陆续报道。但是鲜有关于这些趋化因子，尤其是一些新发现的趋化因子功能研究的报道。我们之前应用mRNA芯片结合聚类分析技术，在小鼠脊神经结扎(Spinalnerveligation，SNL)模型中筛选与神经病理性痛相关的基因。通过比较正常与模型动物的基因表达差异，筛选出若干与神经损伤后引起机体痛觉敏[17]化高度相关的基因，CXCL13是其中的候选基因之一。C-X-C类趋化因子13（CXCL13），也被称为B淋巴细胞趋化因子，最初是在B[18,19]细胞滤泡间质细胞内调节B细胞和T细胞亚群积聚。CXCL13在健康的中枢神经系统中不表达，但会在病理情况下的脑和脊髓表达，如神经、自身免疫性脱髓鞘改[20-22]变，以及原发性中枢神经系统淋巴瘤。在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）[20,21]模型中，人们发现在发炎的脑膜和脊髓的浸润树突状细胞中有CXCL13的产生。CXCR5是CXCL13受体，表达于所有B细胞和血液、淋巴组织和脑脊液（CSF）中[23,24]T细胞的一个亚族。研究已表明CXCL13水平与脑组织和脑脊液中B细胞数量[25][26]有着直接的关系。然而，Rainey-Barger等最近的研究表明，虽然在急性病毒性脑炎的小鼠的脑组织内CXCL13含量和B细胞数量都增加，但CXCL13基因敲除并没有引起B细胞的数量增多，表明CXCL13与B细胞数量之间虽然存在相关性，但两者不一定存在因果关系，而是存在其它未知的机制。在慢性神经病理性疼痛中，趋化因子及其受体参与了不同细胞类型之间的信息传递，在疼痛维持中扮演重要角色。Cxcr5基因缺失小鼠行为学上表现出神经病理性疼痛的减轻，通过检测发现其脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少，这表明CXCL13/CXCR5在脊髓中介导神经胶质激活，从而在神经性疼痛中起到关键作用。我们以往的实验结果显示，正常动物脊髓背角CXCL13蛋白表达很低，SNL后10天术侧脊髓背角CXCL13表达增加；多数CXCL13免疫阳性细胞与神经元的标记物NeuN双标。因此，脊髓背角CXCL13参与[17]神经病理性疼痛的发生和发展，并在其中发挥着重要的作用。目前，细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、趋化因子、神经营养因子等已被证明可以以特殊的方式改变中枢神经系统的功能，如涉及到中枢神经系统控制的自主神经、神[27,28]经内分泌以及行为反应等。脑内细胞因子的功能具有多样性，如参与神经元与胶质细胞的增殖与分化；影响神经系统的可塑性；参与神经系统的再生与退变过程以及多种病理过程，并影响自主活动、摄食、体温调节、慢波睡眠；参与神经系统、内分2 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第一章绪论[29]泌系统及免疫系统之间的相互作用，在这个"免疫特权"部位有了免疫过程。细胞因[30]子家族非常复杂，其在脑内的表达、分布及功能与机体所处的状态密切相关。目前有关细胞因子的研究尚待进一步深入，如能确切了解细胞因子在神经系统中所扮演角色，具有重要的临床意义。前扣带皮层（AnteriorCingulateCortex,ACC）是脊髓上中枢边缘系统中重要的结构之一，前扣带回通过扣带输出到丘脑前核和边缘系统的其它部分，与皮层、皮层下结构中许多的核团存在十分广泛的纤维联系，并参与调节多种生理功能。研究表明，ACC不但参与了痛情绪的形成，还可持续地被外周伤害性的刺激激活，使其产生可[31]塑性的变化。近年来，功能成像、电生理学与行为学的研究显示，ACC与疼痛，尤其与疼痛产生的情绪反应之间关系密切；ACC作为调节情绪的重要脑区，多种感觉中负性的情绪均可激活ACC；由于社会或心理原因所致的负性情绪，以及对遭受[32]痛苦引起的情绪等都与ACC存在千丝万缕的联系。由机体组织损伤产生的疼痛，是一种不愉快的躯体感觉与情感经历，其初级感觉中枢即脊髓痛觉信息接受脊髓上中[33]枢的调节。JaggiAS等发现电刺激SNL大鼠ACC部位可以缓解伤害性的皮肤刺激而引起的负性情绪变化，然而镇痛作用并不明显，提示ACC参与了疼痛情绪维度的调节与加工。近些年来，随着各国学者对痛相关情绪的研究，ACC作为痛觉情绪处理的重要脑区开始被人们认知。临床研究发现，手术扣带回切开术和扣带回切除术，或扣带回神经束和扣带回皮质横行切开都能降低各自对有害刺激的情感反应，但没有改变定位不快刺激的能力，对病人的位置和刺激强度等感觉相关的特性无明显影响。目前，扣带回[34][35]切开术已被用于治疗棘手的癌症疼痛、反射性营养不良、上腹和下胸疼痛、下背[36][37]疼痛以及神经性疼痛，其中有50%病例的疼痛得到有效缓解。研究发现，在逃避有害热刺激的过程中，ACC神经元活动增强，并直接对有害刺激做出反应和/或预测有[38]害刺激，对于非有害化学、机械与热刺激则没有反应。电生理学与功能成像进一步[39,40]表明，ACC能被尖锐硬器、明火等伤害性的暗示或者描述伤害性的话语所激活。采用催眠暗示法发现，当痛刺激强度不变时，受试者随着被暗示刺激强度的增加，痛[41]不愉快的程度也增强，同时，ACC也随之被激活。动物行为学研究表明，双侧ACC损毁后，伤害性条件刺激和伤害性机械刺激所诱导的条件性位置回避反应能力显著降[42-44]低，提示ACC可能主要参与了编码痛的情绪特征。以往大多数检验脊髓局灶性3 第一章绪论小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究大脑刺激或离散细胞核显微药物注射的动物实验都测量到对急性有害刺激的自反行为反应。实际上，实验中有害刺激反应阈值或延迟的提高揭示，激活各种皮质下、脑干和脊髓系统均可产生镇痛作用。这些研究假定操控边缘系统结构可通过选择性调控疼痛效[45]应而改变疼痛处理。随着动物模型应用于痛相关情绪研究之中，许多学者对ACC参与神经病理性疼痛的机制进行了系列研究，但目前其机制还不明确。趋化因子CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中起重要作用，而细胞因子在中枢神经系统中广泛表达，且可以以特殊的方式改变中枢神经系统的功能。ACC是脊髓上中枢边缘系统中主要的结构之一，前扣带回通过扣带输出到丘脑前核和边缘系统的其它部分，与皮层、皮层下结构中许多的核团存在十分广泛的纤维联系，并参与调节多种生理功能。那么，CXCL13/CXCR5是否在ACC中表达？表达和分布于神经元细胞还是胶质细胞？对神经病理性疼痛发生和维持的作用机制是什么？本研究拟采用L5脊神经结扎引起的神经病理性疼痛模型，采用行为学、分子生物学、电生理等多种现代实验技术方法，研究以下问题：（1）神经病理性疼痛模型中ACC内CXCL13及其受体CXCR5在基因和蛋白水平的表达变化时程及细胞类型分布；（2）调节前扣带皮层中CXCLR5的表达对神经病理性疼痛痛行为和痛相关厌恶情绪的影响。以上问题的解决，对于揭示ACC中CXCL13/CXCR5在神经病理性疼痛和厌恶情绪的作用和机制有重要意义，丰富趋化因子参与疼痛和情绪调控理论。参考文献1.SmithAK,O'HaraCL,StuckyCL.Mechanicalsensitizationofcutaneoussensoryfibersinthesparednerveinjurymousemodel.MolPain,2013,29(9):61.2.VonHehnCA,BaronR,WoolfCJ.Deconstructingtheneuropathicpainphenotypetorevealneuralmechanisms.Neuron,2012,73(4):638-652.3.JensenTS,BaronR,HaanpaaM,etal.Anewdefinitionofneuropathicpain.Pain,2011,152(10):2204-2205.4.FishmanSM,BallantyneJC,RathmellJP,etal.Bonica’smanagementofpain.4thed.2010,LippincottWilliams&Wilkins.5.JiRR.Neuroimmuneinteractionsinitch:Dochronicitch,chronicpain,andchroniccoughsharesimilarmechanisms?PulmPharmacolTher,2015,35:81-86.4 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第一章绪论6.SatoKL,JohanekLM,SanadaLS,etal.Spinalcordstimulationreducesmechanicalhyperalgesiaandglialcellactivationinanimalswithneuropathicpain.AnesthAnalg,2014,118(2):464-472.7.CharoIF,RansohoffRM.Themanyrolesofchemokinesandchemokinereceptorsininflammation.NEnglJMed,2006,354(6):610-621.8.RubioN,Sanz-RodriguezF.InductionoftheCXCL1(KC)chemokineinmouseastrocytesbyinfectionwiththemurineencephalomyelitisvirusofTheiler.Virology,2007,358(1):98-108.9.TristãoFS,LazzariniM,MartinS.CX3CR1DisruptionDifferentiallyInfluencesDopaminergicNeuronDegenerationinParkinsonianMiceDependingontheNeurotoxinandRouteofAdministration.NeurotoxRes,2016,29(3):364-380.10.ImaiS,IkegamiD,YamashitaA,etal.Epigenetictranscriptionalactivationofmonocytechemotacticprotein3contributestolong-lastingneuropathicpain.Brain,2013,136(pt3):828-843.11.ZhangZJ,CaoDL,ZhangX,etal.Chemokinecontributiontoneuropathicpain:respectiveinductionofCXCL1andCXCR2inspinalcordastrocytesandneurons.Pain,2013,154(10):2185-2197.12.FreitagCM,MillerRJ.Peroxisomeproliferator-activatedreceptoragonistsmodulateneuropathicpain:alinktochemokines?FrontCellNeurosci,2014,20;8:238.13.GaoYJ,ZhangL,SamadOA,etal.JNK-inducedMCP-1productioninspinalcordastrocytescontributestocentralsensitizationandneuropathicpain.JNeurosci,2009,29(13):4096-4108.14.BiberK,BoddekeE.NeuronalCCchemokines:thedistinctrolesofCCL21andCCL2inneuropathicpain.FrontCellNeurosci,2014,7(8):210.15.LiouJT,LeeCM,DayYJ.Theimmuneaspectinneuropathicpain:roleofchemokines.ActaAnaesthesiolTaiwan,2013,51(3):127-132.16.SapienzaA,Réaux-LeGoazigoA,RostèneW,etal.Chemokinesandattractionofmyeloidcellsinperipheralneuropathicpains.BiolAujourdhui,2014,208(1):31-44.17.JiangBC,CaoDL,ZhangX,etal.CXCL13drivesspinalastrocyteactivationandneuropathicpainviaCXCR5.JClinInvest,2016,126(2):745-761.18.AnselKM,NgoVN,HymanPL,etal.Achemokine-drivenpositivefeedbacklooporganizeslymphoidfollicles.Nature,2000,406(6793):309-314.5 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第一章绪论小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究8-22.45.KobayashiK,TakahashiE,MiyagawaY,etal.InductionoftheP2X7receptorinspinalmicrogliainaneuropathicpainmodel.NeurosciLett,2011,504(1):57-61.8 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法第二章材料与方法2.1材料2.1.1研究对象（实验动物）本文实验对象为6-8周龄的成年雄性ICR小鼠，体重28~30g；幼年ICR小鼠，由南通大学实验动物中心提供（许可证号：SYXK（苏）2012-0031）。2.1.2主要试剂主要试剂如表2-1所示。表2-1主要试剂及来源主要试剂来源主要试剂来源(1)异氟烷Isoflurane(Rhodia)(28)6-0的丝线(Ethicon．Inc．)(2)TrizolReagent(Invitrogen)(29)多聚甲醛(Sigma)(3)PrimeScriptRTreagentkitwithgDNA(Takara)(30)防脱片的载玻片(FisherScientific)Eraser(4)SYBRPremixEx(Takara)(31)山羊血清(Gibco)TaqⅡ(5)裂解液RIPA(Millipore)(32)蔗糖(Sigma)(33)Rabbit-anti-CXC(6)PMSF(Sigma)(PeproTech)L13antibody(34)FITC-goat(7)Proteaseinhibitor(Roche)anti-mouseIgG(Jackson)cocktailtablets(H+L)(8)Phosphatase(35)AlexaFluor488inhibitorcocktail(Roche)goatanti-ratIgG(Jackson)tablets(H+L)(9)BCAProteinAssay(ThermoScientific)(36)Mouse-anti-NeuN(Millipore)kit(10)Mouse(R&D)(37)Cy3-goat(Jackson)9 第二章材料与方法小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究CXCL13-ELISA检验anti-rabbitIgG试剂盒(H+L)(11)Rabbit-anti-CXCR(38)LowGlucose(SantaCruz)(Gibco)5DMEM(12)HRP-goat(39)(Bioworld)(Sigma)anti-mouseIgGP-phenylenediamine(40)Penicillin(13)HRP-goat(Bioworld)Streptomycin(100(Gibco)anti-rabbitIgG×)(41)Fungizone(14)(Millipore)AmphotericinB(100(Gibco)Mouse-anti-GAPDH×)(42)horseserum(15)SDS(Sigma)(Gibco)(heat-inactivated)(16)Acrylamide/Bisacr(GenerayBiotech)(43)HEPES(Gibco)ylamide(29:1)(17)PVDF膜(Millipore)(44)B-27(50×)(Gibco)(18)β-巯基乙醇(Alfresco)(45)1×PBS(Gibco)(19)AP(Sigma)(46)HBSS(Gibco)(20)TWEEN-20(Beyotime)(47)Neurobasal-A(Gibco)(21)Glycine(Amresco)(48)FBS(Gibco)(49)glutamax(100(22)TEMED(Sigma)(Gibco)×)(23)ProteinMarker(Fermentas)(50)Papain(Worthington)(24)Super-SignalWestDuraExtended-(ThermoScientific)(51)胶原(Collagen)(Sigma)DurationSubstrate(52)多聚赖氨酸(25)StrippingBuffer(ThermoScientific)(Sigma)(Poly-D-lysine)(26)Rnase-free的离心(Axygen)(53)DMSO(Sigma)10 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法管和枪头(27)脱脂奶粉(荷兰乳牛)(54)OPTI-MEM(Gibco)其它常用试剂：无水乙醇、氯仿、异丙醇、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、KCl、KH2PO4等。2.1.3主要仪器主要仪器及品牌厂商如表2-2所示表2-2主要仪器及品牌厂商主要仪器品牌/厂商主要仪器品牌/厂商(1)PCR仪(Eppendorf)(15)PH计(MettlerToledo)(2)Model390热痛觉(16)压力蒸汽灭菌锅(IITCLifeScience)(TomyKogyd)过敏测试仪AutoclaveES-315(江苏海门市恒温(3)吸入麻醉机(A.M.BlxkfordInc.)(17)电热恒温干燥箱仪器厂)(4)酶标仪synergy2(BioTek)(18)小型离心机(BioRad)(5)核酸蛋白定量检测(19)高速冷冻离心(Eppendorf)(Hitachi)仪机(6)vonFreyfilament(Stoeling)(20)超纯水仪(ELGA)(7)定量PCR仪(CorbettLife(21)精密电子天平(MettlerToledo)Rotor-Gene3000Science)(BiospecProducts,(上海沪西分析仪(8)电动匀浆器(22)微型旋涡混合仪INC.)器厂)(23)85-1型恒温磁力(江苏金坛市荣华(9)冰冻切片机(Leica)搅拌器仪器厂)(10)低速大容量离心(ThermoElectron(24)凝胶成像系统(Bio-Rad)机Corporation)(11)全套电泳转膜系(ThermoElectron(BioRad)(25)超低温冰箱统Corporation)11 第二章材料与方法小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究(南京新校园生物技(26)小鼠脑立体定位（深圳市瑞沃德生(12)脱色摇床术研究所)仪命科技有限公司）(13)倒置荧光显微镜(Leica)(27)电生理仪器(MolecularDevices)(14)正置荧光显微镜(Leica)2.1.4溶液配制(1)0.2mol/LPB配置(pH7.4)称取60.86gNa2HPO4·12H2O、4.68gNaH2PO4·2H2O，双蒸水定容至1000ml，磁力搅拌器上搅拌，调节pH值至7.4，过滤，室温保存。(2)0.01mol/LPBS配置(pH7.4)取50ml0.2mol/LPB，称取NaCl8.5g，双蒸水定容至1000ml，磁力搅拌器上搅拌，调节pH值至7.4，室温保存。(3)4%多聚甲醛液配置(pH7.4，含1.5%苦味酸)8%多聚甲醛存储液：40g多聚甲醛，双蒸水定容至500ml，加热溶解、过滤，4℃储存备用。用0.2MPB液稀释至4%多聚甲醛固定液，再加入1.5%饱和苦味酸溶液，调节pH7.4，4℃储存。(4)20%蔗糖溶液配置20g蔗糖，双蒸水35ml，磁力搅拌器上加温溶解，加50ml0.2mol/LPB双蒸水定容至100ml，4℃储存。(5)30%蔗糖溶液配置30g蔗糖，双蒸水30ml，磁力搅拌器上加温溶解，双蒸水定容至100ml，加50ml0.2mol/LPB，4℃储存。(6)8%羊血清抗体封闭液(PH7.4)称取0.85gNaCl，0.05gNaN3，加双蒸水86.5ml，轻轻混匀溶解，加0.5mlTritonX-100、5ml0.2mol/LPB及8mlGoat血清，混匀，调节pH值，4℃储存。(7)切片保护液配置称取蔗糖300g，溶于0.01mol/LPBS400ml中，溶解后加入乙二醇300ml，再用0.01MPBS定容至1000ml，4℃储存。(8)蛋白酶抑制剂储存液配置12 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法PMSF174mg溶于异丙醇10ml中，制得100×PMSF(100mM)；1片Proteaseinhibitorcocktailtablet溶于超纯水1ml中，制得10×Proteaseinhibitor；1片Phosphataseinhibitorcocktailtablet溶于超纯水1ml中，制得10×Phosphataseinhibitor；分装并–20℃储存。(9)荧光封片剂配置将P-phenylenediamine50mg加入5ml0.01MPBS中溶解，再加入甘油45ml，混匀，–20℃避光储存。(10)组织/细胞裂解液配置10×RIPA100µl，100×PMSF(100mM)10µl，20×Phosphataseinhibitor50µl，10×Proteaseinhibitor100µl，加超纯水740µl，混匀，现用现配。(11)1.5MTris-HCl配置(pH8.8)45.5gTris加超纯水150ml，浓HCl调节pH至8.8，定容至250ml。(12)1MTris-HCl配置(pH6.8)15.125gTris加超纯水150ml，浓HCl调节pH至6.8，定容至250ml。(13)10%过硫酸铵(AP)配置0.10g过硫酸铵溶于超纯水1ml中，4℃储存。(14)10%SDS配置(pH7.2)10gSDS溶于超纯水100ml中，室温储存。(15)6×SDS蛋白上样缓冲液配置1gSDS2.0ml甘油7.0ml1.5MTris-HCl(pH6.8)1.2mg溴酚蓝用超纯水定容到10ml。混匀，分装，–20℃储存。临用前取6×SDS蛋白上样缓冲液900µl加-巯基乙醇100µl。(16)10×电泳缓冲液的配置(pH8.3)称取Tris30.29g，甘氨酸144.1g，SDS10.0g，加超纯水溶解并定容至1000ml。临用前取10×电泳缓冲液100ml加入超纯水900ml，混匀，即1×电泳缓冲液，室温存放。13 第二章材料与方法小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究(17)10×转膜缓冲液的配置(pH8.3)称取Tris58.15g，甘氨酸29.28g，加超纯水溶解并定容至1000ml。临用前取10×转膜缓冲液100ml加入甲醇200ml，超纯水定容至1000ml，混匀，即1×转膜缓冲液，室温存放。(18)10×TBS溶液配置(pH7.6)称取NaCl80g，Tris24.2g，溶于1000ml双蒸水中，浓HCl调节pH至7.6。临用前取10×TBS溶液100ml，同时加入Tween-201ml搅拌混匀，双蒸水定容至1000ml，即1×TBST溶液，放置4℃保存。(19)75mMd-cAMP储备液的配制dcAMP37.1mg溶解于1006.7µl的0.01MPBS中，分装后于-20℃保存。(20)Westernblot抗体稀释液/封闭液配置（5%脱脂牛奶）称取脱脂奶粉1.0g，加入20ml的1×TBST中溶解，于4℃保存。(21)1×D-Hanks液配置(pH7.2)NaCl8.0gNa2HPO4·12H2O0.134gNaHCO30.35gKCl0.4gKH2PO40.06g双蒸水定容至1000ml磁力搅拌器搅拌溶解，调节pH7.2，过滤，4℃储存。(22)HBSS+HEPES液配置HEPES5mlHBSS495ml混匀，4℃储存。(23)Papain消化液配置HBSS+HEPES液6mlPapain90µl每次使用前配置，并且37℃预热。余量4℃储存。(24)0.1mg/ml多聚赖氨酸(Poly-D-lysine)配置14 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法Poly-D-lysinehydrobromide5mg溶解于超纯水50ml中，分装–20℃储存。(25)2mg/ml胶原(Collagen)配置Collagen25mg溶解于超纯水12.5ml中，分装，4℃储存。(26)玻片包被液配置胶原(Collagen)0.2ml多聚赖氨酸(Poly-D-lysine)0.2ml超纯水1.6ml每次使用前配置。(27)100ng/µlCXCL13配置(储备液)CXCL1310μg溶解于0.01MPBS100µl中，分装，–20℃储存。(28)慢病毒注射液和电生理所需要的溶液配制用Opti-MEM稀释慢病毒，添加Polybrene，增加侵染效率。2.2方法2.2.1脊神经结扎(SpinalNerveLigation，SNL)神经病理性疼痛模型的建立SNL神经病理性疼痛模型根据Kim和Chung于1992年建立的方法进行操作[1]，小鼠腹腔内注射复合麻醉剂后，剪除其背部毛发，消毒并在后正中线左外侧5mm处做1cm纵切口，2/3的切口位于髂嵴之上。再切开小鼠胸腰筋膜，钝性分离竖脊肌并向外牵引，显微镜下露出第6腰椎的横突并咬断，玻璃分针柔和分离L5脊神经并使用6.0号丝线结扎，最后逐层缝合。对照组不结扎脊神经，手术方法同上。2.2.2小鼠行为学检测在小鼠行为学检测之前，将其单独置于测试架上的玻璃格子里，进行连续3天的环境适应，其温度控制在23±1℃。2.2.2.1动物运动协调能力的检测(Rotarodtest)小鼠的运动协调能力测试采用ROTAROD仪器，从而观察建模SNL手术对其运动能力的影响，首先将仪器调整转速为8rpm，正常小鼠在仪器上使用，能够在60s15 第二章材料与方法小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究[2,3]内不掉下。SNL组在不同时间点检测小鼠的运动协调能力，记录小鼠掉下的时间，超过60s则记为60s。2.2.2.2机械性刺激缩爪域值测定（vonFreytest）[4]测定机械性刺激缩爪阈值采用Dixon“upanddown”法，即使用vonFreyfilament检测小鼠爪底机械性感受阈值：将vonFreyfilament设定为0.16g，刺激小鼠左后爪的底部，连续刺激2s并记录小鼠的反应。刺激后出现舔爪、缩爪、甩爪等反应记为出现疼痛，重复6次试验，最后对照阈值表查出对应的缩爪阈值（以g为单位），缩爪阈值越低提示机械性痛觉过敏也越严重。2.2.2.3热刺激缩爪潜伏期测定小鼠热刺激缩爪潜伏期测量的实验方法主要是利用相应强度的热辐射刺激小鼠左后方爪底，在开始计时后，小鼠感到疼痛开始缩爪时停止辐射，记录时间。此实验从最长辐射时间20s开始，为了避免灼伤小鼠，每只小鼠测定3次，间隔5min/次，3次平均值即为热刺激缩爪潜伏期（单位为s）。基础缩爪潜伏期控制在10~12s，以此确定热辐射强度，潜伏期越短提示热痛觉过敏也越严重。2.2.2.4位置逃避实验（PlaceEscape/AvoidanceParadigm,PEAP）装置如下图所示，在高25cm的金属网格板底部放置30×30×30cm的有机玻璃盒子，其中一半使用白纸黏贴，一半使用黑纸黏贴。在实验时，整个装置置于垂直光线下，保持周围环境的安静。16 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法图位置逃避实验装置。无盖有机玻璃盒(30x30x30)一半外面贴黑纸，一半贴白纸，并置于25cm高的金属网格底板之上建立伤害性刺激诱发的位置逃避实验模型(PEAP)，主要分为4组，分别为SNL组；SNL3d组；shamSNL组；shamSNL3d组。其次是研究ACC注射CCR5慢病毒探索其对明暗回避行为的影响，动物实验同样分为4组，SNL+shRNA组；SNL3d+Cxcl13shRNA组；SNL+NCshRNA组；SNL3d+NCshRNA组。具体实验方法：1.先将小鼠随机放到任一箱中，让其自由活动，每隔15s刺激一次足底，在白箱时刺激右侧后足，黑箱时刺激左侧后足。记录5分钟内小鼠在白箱的时间，总共记录30分钟，所得数值为小鼠的基础值。2.将进行Spinalneverligation(SNL)手术的小鼠随机放到任一箱中，同样每隔15s刺激一次足底，在白箱时刺激右侧后足，黑箱时刺激左侧后足。记录5分钟内小鼠在白箱的时间，总共记录30分钟。2.2.3实时荧光定量PCR分析2.2.3.1组织总RNA的提取(1)小鼠麻醉后断头，快速取全脑，至冰浴的0.01MPBS中，放入ArylBrain17 第二章材料与方法小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究Matrix，根据图谱(PaxinosandWatoson1998)确定取材的范围：Bregma向前2.2mm至1.42mm，左右旁开1mm，深1~2mm。将左右两侧从中间分开。由于右侧做过SNL手术，故右侧ACC称为同侧，左侧称为对侧。ACC取出后，用滤纸吸去多余的水分，称重并放入1mlTrizol中，置冰上匀浆，室温静置5min。(2)加入氯仿200µl，剧烈震荡15s，室温静置2min。(3)于12000rpm，4℃离心，15min，吸取上清。(4)加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min。(5)于12000rpm，4℃离心，10min，弃去上清。(6)加75%预冷乙醇1ml(DEPC水现配)洗涤沉淀，于7500rpm，4℃离心，5min，弃上清。(7)沉淀晾干后，加入适量DEPC水溶解(65℃助溶10min)，得到RNA液置于冰上，行浓度测定。2.2.3.2总RNA浓量测定、纯度分析总RNA1µl加到DEPC水99µl中稀释，用核酸蛋白测定仪检测浓度，用OD260/OD280比值估计RNA纯度，一般比值在1.8~2.0。2.2.3.3逆转录反应(20µl体系)(1)取0.2mlRNase-free离心管置于冰上，加下列反应物：试剂使用量gDNAEraser1.0µl5×gDNAEraserBuffer2.0µlTotalRNA1μgRNaseFreedH2Oupto10µl(2)混匀，短暂离心。(3)42℃，2min，消化基因组DNA(gDNA)。(4)迅速置于冰上。(5)配制下面的反应液混合管，再分装到各反应管中：试剂用量RTPrimerMix1.0µl5×PrimeScriptBuffer24.0µl18 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1.0µlRNaseFreedH2O4.0µl(6)混匀并短暂离心。(7)37℃，15min。(8)85℃，5s。(9)4℃保存，或-20℃长期保存。2.2.3.4引物设计与合成由宝生物工程（大连）有限公司设计、合成小鼠CXCL13、CXCR5、GAPDH引物，经NCBI的Primer-BlAST进行引物特异性验证。引物序列如下：GenePrimersSequencesCXCR5Forward5’-TGGCCTTCTACAGTAACAGCA-3’Reverse5’-GCATGAATACCGCCTTAAAGGAC-3’CXCL13Forward5’-GGCCACGGTATTCTGGAAGC-3’Reverse5’-ACCGACAACAGTTGAAATCACTC-3’GAPDHForward5’-GCTTGAAGGTGTTGCCCTCAG-3’Reverse5’-AGAAGCCAGCGTTCACCAGAC-3’2.2.3.5实时荧光定量PCR反应(20µl体系)(1)冰上配制反应液混合管，分装于0.2ml离心管中：(2)SYBRGreenⅠPremixExTaqⅡ(2×)10.0µlPCRForwardPrimer(10μM)0.8µlPCRReversePrimer(10μM)0.8µlROXReferenceDyeⅡ(50×)0.4µl各组cDNA2µlddH2O6µlTotal20µl(3)于Rotor-Gene3000PCR仪上扩增反应，程序如下：95℃预变性30s；然后95℃5s，56℃30s，72℃30s并收集荧光，共40循19 第二章材料与方法小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究环；最后进行Melt分析。—CT2.2.3.6结果分析采用2(1)在Rotor-GeneAnalysisSoftware6.1软件上设定threshold。(2)CT=CT（目的基因）-CT（内参基因）(3)各实验组CT值减去对照组CT：(4)CT=CT（实验组）-CT（对照组）—CT(5)计算表达水平比率：2=表达量的比值。(6)所得结果是通过内参基因表达水平校准的实验组中目的基因相对于对照组的增加或减少的倍数。2.2.4ELISA检测2.2.4.1蛋白质提取及浓度测定蛋白质提取、浓度测定(1)组织：经麻醉后，立即断头，打开小鼠颅脑，迅速取出全脑，至冰浴0.01MPBS中，放入ArylBrainMatrix(1argerate，coronal)，根据图谱（PaxinosandWatoson1998）确定取材的范围：Bregma向前2.2mm至1.42mm，左右旁开1mm，深1-2mm。将左右两侧从中间分开。由于右侧做过SNL手术，故将右侧ACC称为同侧，左侧称为对侧。ACC取出后，滤纸吸去多余水分，称重，放于150µl的组织裂解液中，置冰上匀浆，冰上静置30min。(2)15000rpm，4℃离心，18min。(3)小心吸取上清，即得到蛋白溶液。(4)各样本取5l蛋白溶液测蛋白浓度，用ddH2O稀释5倍，取10l于96孔板中，每样品做2个复孔。(5)96孔板中加入蛋白标准品，采用BCA试剂盒测蛋白浓度。(6)配制反应工作液（A:B＝50:1），每孔加入工作液100l，轻轻混匀，37℃孵育30min。(7)酶标仪检测562nm波长下各孔光密度（OD）值。(8)根据标准品绘制标准曲线，计算各样本蛋白浓度。未使用蛋白–80℃储存。2.2.4.2ELISA法检测CXCL13蛋白含量20 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法(1)ELISA试剂盒于室温平衡30min。(2)样品稀释液稀释标准品：500、250、125、62.5、31.2、15.6pg/ml。(3)分别设6个标准品孔、待测样品孔、1个阳性对照孔、1个空白孔。(4)每孔加反应分析液50l。(5)各标准品孔加50l标准品；空白孔加50l样品稀释液；阳性对照加50l已知浓度的CXCL13蛋白溶液；待测样品孔加蛋白总量为100g的样品蛋白溶液，再用样品稀释液补足至50l。轻轻混匀，盖上封膜，室温孵育2h。(6)弃去液体，洗涤缓冲液洗板5次，吸水纸拍干。(7)每孔加酶标抗体100l，盖上封膜，室温孵育2h。(8)弃去液体，洗涤缓冲液洗板5次，吸水纸拍干。(9)每孔加底物溶液100l（A液与B液等量混合），室温避光15min。(10)每孔加终止液100l，轻轻混匀。酶标仪检测450nm波长下各孔光密度（OD）值，用540nm波长进行校正。(11)根据标准品绘制标准曲线，计算各样本CXCL13含量。2.2.5WesternBlot2.2.5.1蛋白质提取及浓度测定（同ELISA法）2.2.5.2蛋白变性以每孔30μg总蛋白电泳为例，计算所需蛋白溶液体积（µl）=30μg蛋白/蛋白浓度，补ddH2O至15µl，再加入3µl的6×loadingbuffer（6×loadingbuffer与-巯基乙醇比例=9:1），于沸水中煮5min。2.2.5.3SDS-PAGE凝胶电泳(1)10％聚丙烯酰胺分离胶的制备（2块胶量）：30%Acr-Bis3.3ml；ddH2O4ml；110%过硫酸胺0.1ml；.5MTris-HCl缓冲液（pH8.8）2.5ml；10%SDS缓冲液0.1ml；TEMED0.004ml；混匀，吸取分离胶注入垂直电泳槽的玻璃平板夹层中，约2/3高度，缓缓加入1ml异丙醇液封，室温聚合40min左右。(2)5%聚丙烯酰胺浓缩胶的制备（2块胶量）：30%Acr-Bis0.67ml；10%过硫酸胺0.04ml；1.0MTris-HCl缓冲液（pH6.8）0.5ml；10%SDS缓冲液0.04ml；TEMED0.004ml，ddH2O2.7ml；混匀。21 第二章材料与方法小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究(3)倒去凝固的分离胶顶部的异丙醇，用滤纸吸干，将浓缩胶注入夹层并插入梳子，室温聚合40min。(4)胶凝固后，将凝胶板固定于电泳装置上的缓冲液室，拔去梳子，用微量进样器吸取样品液加至加样孔，放入电泳装置中，向上、下缓冲液室加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。(5)接通电源，浓缩胶电压为90V，电泳30min，分离胶电压为120V，电泳至溴酚兰到达分离胶的底部。(6)关闭电源，取出凝胶，根据蛋白Marker切取目的蛋白所在部位的胶。2.2.5.4转膜（全湿法）(1)剪取适当大小的PVDF膜于甲醇中浸1~3min，再转入1×转膜缓冲液中洗15min。将电泳后的凝胶、多孔滤纸、厚滤纸等也用1×转膜缓冲液浸泡5~10min。(2)以负极侧-多孔滤纸-厚滤纸-胶-PVDF膜-厚滤纸-多孔滤纸-正极侧的顺序装好装置，倒入1×转膜液，冰浴转膜，恒流350mA，Bio-RAD电泳仪转移2h。(3)转移结束后，PVDF膜剪去一角来标记膜正反面，用1×TBST溶液漂洗3次，每次10min。2.2.5.5免疫反应(1)将膜放入5%脱脂奶粉液中室温封闭2h。(2)一抗用5%脱脂奶粉液稀释至适当浓度，膜上覆盖适量抗体，4℃孵育过夜。(3)TBST洗3次，10min/次。(4)二抗用5%脱脂奶粉液稀释至适当浓度，膜上覆盖适量抗体，室温湿盒孵育2h。(5)TBST洗3次，10min/次。(6)将ECL试剂盒中的A、B两种试剂等体积混合，加到膜上（避光），化学发光凝胶图像系统拍照。2.2.5.6图像分析使用ImageJ图像软件分析目的蛋白和内参蛋白的平均光密度值，各组目的蛋白的数值比各组内参蛋白数值，表示各组目的蛋白的相对表达量。再进行统计分析，每组5只小鼠。22 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法2.2.6组织免疫荧光染色2.2.6.1组织切片的准备各组小鼠分别取材，经麻醉后，打开小鼠胸腔以暴露心脏，拨开包心膜，灌注针插入左心室，剪开右心耳，快速注射生理盐水20ml，冲洗血液，然后4%多聚甲醛灌注50ml固定。在灌注完毕后，立即取脑，使用4℃的多聚甲醛固定2hrs，然后再4℃下依次使用10%、20%、30%的蔗糖溶液进行梯度脱水。在组织块完全沉底之后，采用恒冷切片机对组织块进行连续冠状切片，切片的厚度为14um，在干燥后置于-20℃保存。2.2.6.2免疫荧光染色(1)使用0.01MPBS漂洗组织切片，摇床漂洗3次，每次10min。(2)5%羊血清抗体封闭液封闭，室温孵育2h。(3)2.5%羊血清抗体稀释液稀释一抗：ACC切片分别行免疫荧光双标，CXCL13(goat,1:100,SantaCruz,sc-8182)+NeuN(1:1000)；CXCR5(rabbit,1:200;SantaCruz,sc-30029)+NeuN(1:1000)4℃孵育过夜。(4)0.01MPBS漂洗组织切片3次，每次10min。(5)0.01M稀释二抗：3Cy-donkeyanti-goatIgG+AlexaFluor488goatanti-rabbitIgG(1:1000)，3Cy-goatanti-rabbitIgG(1:1000)+FITC-goatanti-mouseIgG(1:1000)；组织切片加入相应二抗，摇床上室温孵育2h，避光。(6)0.01MPBS漂洗组织切片3次，每次10min，避光。(7)组织切片裱片（避光），荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察，拍片。2.2.7原位杂交检测2.2.7.1组织的准备小鼠灌注固定方法同上，吸入麻醉后，打开小鼠胸腔以暴露心脏，拨开心包膜，将灌注针插入左心室，剪开右心耳。依次灌注20ml37℃生理盐水，50ml4%多聚甲醛，灌注完成后取脑，使用4℃的多聚甲醛固定2h，然后在4℃下依次用10%、20%、23 第二章材料与方法小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究30%的蔗糖液进行梯度脱水。在组织块完全沉底之后，采用恒冷切片机对组织块进行连续冠状切片，切片厚度为14um，干燥后置于-80℃保存。2.2.7.2操作流程（1）暴露mRNA核酸片段：以3%柠檬酸1ml和浓缩型胃蛋白酶2滴混匀，在切片上滴加，37℃下消化10s，用PBS洗3次，每次5min。DEPC水洗1次。（2）将含有0.1MPB和0.1%DEPC的多聚甲醛（4%）在室温固定10min，DEPC水洗3次。（3）预杂交：切片上滴加预杂交液，放置湿盒中，40℃杂交过夜。（4）洗涤：37℃2×SSC洗2次，每次5min，37℃0.5×SSC洗2次，每次15min，37℃0.2×SSC洗3次，每次15min。（5）加封闭液37℃孵育30min。（6）加生物素化的mouse-抗地高辛IgG抗体，37℃孵育1h，用PBS洗4次，每次5min。（7）加入SABC(StreptAvidin-BiotinComplex)-Cy3(原位杂交mPBS稀释100倍)，37℃孵育30min，用PBS洗3次，每次5min。（8）用荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察并摄片。2.2.8ACC脑区微量注射慢病毒将小鼠（出生1周）放入冰盒内麻醉4-8min，放于冰盒上，消毒器颅骨顶部皮肤，手术刀纵行切开0.8cm的切口，确定幼年小鼠的ACC位置，依据幼年小鼠与成年小鼠Bregma点与Lambda点间距离的比例（成年小鼠和刚出生小鼠Bregma点与Lambda点的距离有明显不同，成年小鼠为0.9cm，刚出生小鼠为0.6cm）。根据此比例，1周小鼠ACC在Bregma点前1.98mm，旁开0.4mm，深度1.5mm。，使用针头蘸取商量膀胺天蓝在确定位置处做标记，将微量进样器尖端连接一段PEIO管，管的顶端则连接0.2mm的1ml注射器针头给药，给药部分正好置于ACC位置上。微量9注射器将1ul浓度的lxl0Tu慢病毒shRNA或NC注入小鼠ACC部位，缓慢推进药物，给药时间持续5min，结束后留针5min，使药物缓慢扩散。以同样方式在另一侧给予同样剂量的药物，在双侧ACC给药之后，缝合皮肤并消毒伤口。24 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第二章材料与方法2.2.9ACC脑片制备将6-8周龄的成年ICR小鼠迅速断头，剪开颅骨取脑，脑组织置于0-4℃的人工脑脊液（ACSF）中，连续通混合气（95%CO2/5%O2），冷却1min，然后再预冷冰台上，切含有ACC的脑组织块，将吻侧向上黏在振动切片机的载物台上，注入0-4℃的人工脑脊液，持续通氧，将脑组织切成300urn的薄片，移入已通混合气的人工脑脊液中，在34℃的水浴锅内孵育30min，室温下恢复60min后进行下一步实验。2.2.10ACC脑片全细胞膜片钳记录2.2.10.1溶液和药品ACC脑片全细胞膜片制备及实验记录中采用的人工脊脑液的主要成分：125mMNaCl，3.0mMKCl，1.25mMNaH2PO3，26mMNaHCO3，1.25mMMgCl2，2.5mMCaCl2，10mMglucose。电极内液：用KOH将pH值调至7.2-7.4，渗透压为电极内液的主要成分：2.0mMKCl，2.5mMCaCl2，1.25mMMgCl2，5mMEGTA，5mMNa2ATP，135mMKGluconate，5mMHEPES，配置后调节pH值至7.2-7.4，渗透压为300-320mosmol/l。2.2.10.2电压钳记录将脑片移入记录槽记录，灌流液中加入100uM的GABAa受体阻断剂PTX，灌流速度2-3ml/min，在红外显微镜下，将ACC转到视野正中，使用长度10cm，内、外径分别为0.86mm、1.5mm的硬质玻璃毛坯管，记录电极内充有电极内液后阻抗4-8兆欧。电压钳模式下记录ACC第Ⅱ/Ⅲ层椎体神经元，-70mV记录稳定的自发兴奋性突触后电流，于5-8min后再次通过压力喷射的方式持续加入趋化因子CXCL13，持续2-3min。2.2.11统计方法本文统计软件使用SPSS16.0，计量资料均使用mean±SEM，组间比较采用方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。使用SigmaPlot2001为作图软件。25 第三章结果小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第三章结果3.1SNL神经病理性疼痛的模型建立与行为学观察3.1.1鼠生长发育的影响我们对SNL组、手术对照组(Sham组)及正常组(Naive组)的小鼠手术前后进行体重的检测。三组小鼠在相同温湿度环境中饲养，食物、水充足，每日下午5时称量体重。结果显示，Naive组与Sham组小鼠体重无明显差异，虽然SNL组体重较Sham组略低，但无统计学意义(见图1)。图1三组的小鼠体重的增长情况3.1.2调能力的影响我们通过rotarod试验分析在SNL前后小鼠运动协调能力的变化，结果表明，SNL对小鼠运动协调能力无明显影响(见表1)。TimeafterSNL(days)BL1d3d7d10d14d21d60sec60sec60sec60sec60sec60sec60sec表1SNL对小鼠运动协调能力的影响3.1.3发小鼠的同侧后爪产生神经病理性的疼痛3.1.3.1SNL可诱发小鼠的同侧后爪产生机械性的触诱发痛VonFreyfilament刺激正常小鼠机械性的痛阈值为2.14±0.21g，而SNL后小鼠26 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第三章结果同侧后爪对vonFreyfilament刺激引起的机械性的痛阈值在第1d就有显著下降(0.36±0.06g，p<0.001)，第3d下降更显著(0.08±0.03g，p<0.001)，且能持续到21d(0.14±0.08g，p<0.001)以上，Sham组在术后各时间点差异无统计学意义（p>0.05）。结果提示SNL诱发小鼠产生了机械性的触诱发痛(见图2A)。3.1.3.2SNL可诱发小鼠的同侧后爪产生热痛觉过敏我们发现正常小鼠热痛阈值为12.07±0.11S，而在SNL后小鼠同侧后爪对热刺激引起的痛阈值在第1d就明显下降(7.16±0.36S，p<0.05)，第3d下降更为明显(5.94±0.44S，p<0.01)，且能持续21d(8.06±0.38S，p<0.05)以上，Sham组在术后各时间点差异无统计学意义（p>0.05）。结果提示SNL诱发小鼠产生热痛觉过敏(见图2B)。图2SNL诱发小鼠神经病理性疼痛L5脊神经结扎后可诱发小鼠的同侧后爪产生机械性及热痛觉过敏。(A)SNL后同侧后爪对vorlFreyfilament刺激的缩爪阈值从第1d就明显降低，且可持续21d以上；(B)SNL后同侧27 第三章结果小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究后爪对伤害性热刺激的缩爪潜伏期第1d开始明显下降，且可持续21d以上。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与基础阈值（BL）相比（n=8），检测部位为SNL结扎侧后爪底，BL为基础值。3.2SNL诱导ACC中CXCL13的表达情况及细胞定位3.2.1ACC中CXCL13mRNA表达上调小鼠SNL模型产生神经病理性疼痛，用实时荧光定量PCR方法检测ACC中CXCL13mRNA表达变化。实验结果显示，在SNL后第1d，CXCL13mRNA表达水平比正常小鼠升高了2.1倍，p<0.01，至结扎后第10d表达仍维持较高水平，增高约10.8倍，p<0.001。而Sham组CXCL13mRNA表达水平与Naive组相比无显著性差异，p>0.05（见图3）。图3SNL诱导ACC中CXCL13mRNA表达上调实时荧光定量PCR方法检测SNL诱导同侧ACC中CXCL13mRNA表达变化。ACC中CXCL13mRNA表达水平在SNL诱导1d就明显升高，第3d、10d仍然维持升高水平。Sham组CXCL13mRNA水平与正常小鼠相比无显著性差异。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与正常组相比（n=4）。28 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第三章结果3.2.2SNL诱导ACC中CXCL13蛋白表达上调ELISA法检测SNL后ACC中CXCL13蛋白含量的变化。Naive组小鼠ACC中CXCL13含量为16.51pg/ml，SNL组1d、3d、10d含量均显著增多（p<0.01），SNL10d时CXCL13蛋白表达达到最高28.91pg/ml，上升约1.76倍，且与正常组相比有显著性差异（p<0.001）（图4）。图4SNL诱导ACC中CXCL13蛋白的表达上调ELISA方法检测SNL侧ACC中CXCL13蛋白表达变化。SNL后1d、3d、10d时CXCL13蛋白表达量显著增加。**p<0.01，***p<0.001，与正常组相比（n=5）（纵坐标以正常小鼠ACC中CXCL13的蛋白浓度折算为1做比较）。3.2.3ACC中CXCL13表达于神经元细胞SNL小鼠ACC中CXCL13表达出现上调，为了明确表达CXCL13的具体细胞类型，我们采用原位杂交与免疫荧光双重染色法，观察SNL第10dACC中CXCLl3在神经细胞中表达分布情况。用CXCL13反义探针显示CXCLl3mRNA表达，用NeuN抗体显示神经元细胞。我们发现CXCLl3mRNA杂交信号出现在NeuN阳性的神经元细胞的胞浆中，提示在SNL后小鼠神经元细胞可表达CXCLl3mRNA（见图5）。29 第三章结果小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究图5CXCL13与ACC中NeuN共定位原位杂交和免疫荧光双重染色显示在SNL第10d，同侧ACC中CXCLl3mRNA与NeuN染色共定位。(A)CXCLl3mRNA原位杂交荧光信号(绿色)，(B)NeuN免疫阳性的神经元细胞(红色)，(C)为A和B的叠加图。3.3SNL诱导ACC中CXCR5的表达情况及细胞定位3.3.1SNL诱导ACC中CXCR5mRNA表达上调用实时荧光定量PCR方法检测ACC中CXCR5mRNA的变化。结果显示，在SNL后1d，CXCR5mRNA表达量无显著变化，SNL后3d与10d的CXCR5mRNA表达水平比正常小鼠升高超过了2倍，p<0.001）。Sham组CXCR5mRNA水平与正常小鼠相比无显著性差异（p>0.05）（图6）。图6SNL诱导ACC中CXCR5mRNA表达上调30 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第三章结果实时荧光定量PCR方法检测SNL诱导同侧前扣带皮层（ACC）中CXCR5mRNA的变化。SNL诱导ACC中CXCR5mRNA水平1d无显著变化，3d、10d显著升高。Sham组CXCR5mRNA水平与正常小鼠相比无显著性差异。***p<0.001，与正常组相比（n=4）。3.3.2SNL诱导ACC中CXCR5蛋白表达上调用WesternBlot方法对SNL10d组结扎侧ACC与Naive组ACC中CXCR5蛋白表达进行检测，以GAPDH为内参照。结果显示，CXCR5蛋白为一条特异性条带，SNL组第3dCXCR5蛋白条带较Naive组深一些（见图7A）。对各组CXCR5蛋白条带与内参蛋白条带灰度比值行统计分析，SNL组第10dACC中CXCR5蛋白含量比Naive组增加0.5倍，p<0.001（见图7B）。图7SNL诱导ACC中CXCR5蛋白表达上调WesternBlot方法检测SNL侧ACC中CXCR5蛋白表达变化。SNL后10dCXCR5蛋白表达量显著增加。(A)示正常组和SNL10d组CXCR5和GAPDH蛋白条带。(B)各组CXCR5和GAPDH蛋白条带灰度比值统计分析，柱状图为SNL组第10dCXCR5蛋白含量与Naive组的比值。***p<0.001，n=5。3.3.3ACC中CXCR5表达于神经元细胞SNL小鼠ACC中CXCR5表达出现上调，为了明确表达CXCR5的具体细胞类型，我们采用免疫荧光双标法，选用SNL组第10d的脑切片，进行CXCR5与ACC中神经元细胞标记物NeuN共标染色。结果显示，SNL模型CXCR5的表达明显多于正常组（见图8A,B），共标记结果显示，CXCR5可与NeuN共定位（见图8D），提示ACC中神经元细胞可表达CXCR5。31 第三章结果小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究图8CXCR5与ACC中NeuN共定位免疫荧光双标染色显示SNL10d的同侧ACC中CXCR5和NeuN共定位。(A)示正常组CXCR5表达，(B)示SNL10dCXCR5表达(红色)，(C)示SNL10dNeuN免疫阳性的神经元细胞(绿色)，(D)为B和C的叠加图。3.4颅内注射CXCR5干扰慢病毒对SNL诱导慢性病理性疼痛的影响3.4.1颅内注射CXCR5干扰慢病毒到ACC脑区能够敲减CXCR5的表达小鼠脑内注射携带有绿色荧光蛋白报告基因GFP的CXCR5干扰慢病毒（LV-CXCR5shRNA）到ACC脑区，注射3天后制备小鼠脑组织切片于荧光显微镜下观察发现，病毒能够侵染小鼠小脑的左右两侧ACC区域，且在神经元中分布较多，侵染效率高。实时荧光定量PCR结果显示LV-CXCR5能够显著降低ACC脑区CXCR5mRNA的表达（p<0.05）（图9）。图9LV-CXCR5降低ACC脑区CXCR5的表达ACC脑区内注射CXCR5干扰慢病毒（LV-CXCR5shRNA），(A)示病毒能够侵染小鼠小脑的左右两侧ACC区域，(B)局部放大显示CXCR5干扰慢病毒在神经元中分布较多。(C)实时荧光定量PCR结果显示LV-CXCR5能够显著降低ACC脑区CXCR5mRNA的表达。32 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第三章结果3.4.2注射慢病毒后不能缓解SNL引起的机械痛敏如图10所示，在SNL术后3d，小鼠就可以产生显著的机械性痛觉过敏（p<0.001）。小鼠ACC注射慢病毒2周后，造SNL模型，结果发现，与注射对照慢病毒LV-NCshRNA组相比，注射LV-CXCR5shRNA干扰慢病毒对SNL诱发的机械性痛觉过敏无显著影响。无论是对照慢病毒，还是CXCR5干扰慢病毒，均不影响小鼠外周神经损伤诱导的机械性痛(图10)。图10注射LV-CXCR5shRNA干扰慢病毒对SNL诱发的机械性痛觉过敏的影响行为学结果显示注射LV-CXCR5shRNA干扰慢病毒对SNL诱发的机械性痛觉过敏的影响。(A)示在SNL术后3d，小鼠可以产生显著的机械性痛觉过敏。(B)示注射对照慢病毒或CXCR5干扰慢病毒，小鼠仍可以产生显著的机械性痛觉过敏。***p<0.001，与正常组相比（n=8）。3.4.3注射CXCR5干扰慢病毒至小鼠ACC能缓解SNL引起的痛相关厌恶情绪的产生结果显示，成功建立了SNL诱导的位置逃避实验，SNL3d小鼠在非条件匹配室的停留时间显著高于造模前小鼠（p<0.01），而Sham3d的小鼠在非条件刺激室停留时间与造模前无显著变化(图11A)。ACC内注射对照慢病毒和CXCR5干扰慢病毒的小鼠造SNL模型，然后进行PEAP行为检测，结果显示对照病毒不能降低SNL后，小鼠在非条件刺激时停留的时间，不影响SNL诱导的条件性位置回避。CXCR5干扰病毒能够降低SNL后小鼠在非条件刺激室停留的时间。这表明，ACC区CXCR5激活后会导致痛厌恶情绪的产生(图11B)。33 第三章结果小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究图11注射LV-CXCR5shRNA干扰慢病毒的小鼠对SNL诱导的条件性位置回避的影响成功建立了SNL诱导的位置逃避实验，(A)示SNL3d小鼠在非条件匹配室的停留时间显著高于造模前小鼠，Sham组与造模前无显著变化。(B)示ACC内注射对照慢病毒和CXCR5干扰慢病毒后，对照病毒不能降低SNL后，小鼠在非条件刺激时停留的时间，不影响SNL诱导的位置逃避。CXCR5干扰病毒能够降低SNL后小鼠在非条件刺激室停留的时间。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与正常组相比（n=8）。3.5ACC脑区II/III层锥体神经元上sEPSCs变化3.5.1SNL引起ACC脑区II/III层锥体神经元兴奋性突触后电流增强SNL3d后全细胞膜片钳记录ACC脑区II/III层锥体神经元上sEPSCs，结果显示，与对照组相比，SNL并不影响II/III层锥体神经元上sEPSCs的发放频率（p>0.05），但sEPSCs幅度出现显著增加（p<0.05）。这些结果提示SNL诱导的情绪改变可能与ACC脑区II/III层锥体神经元兴奋性突触传入突触后AMPA受体功能的改变有关（图12）。34 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第三章结果图12SNL引起ACC脑区II/III层锥体神经元兴奋性突触后电流增强SNL3d后全细胞膜片钳记录ACC脑区II/III层锥体神经元上sEPSCs，(A)显示SNL3d组与Control组神经元上sEPSCs的发放频率无显著差异。(B)显示SNL3d组（n=12）与Control组(n=10)神经元上sEPSCs幅度显著增加。*p<0.053.5.2趋化因子CXCL13可诱导ACC脑区II/III层锥体神经元自发兴奋性突触后电流增加我们进一步检测了CXCL13对ACC脑区II/III层锥体神经元上sEPSC的影响，采用全新膜片钳记录的结果显示，CXCL13急性处理能引起神经元上sEPSC的幅度出现显著增加（p<0.05），对sEPSC的发放频率也有增加，但作用不显著（p>0.05）。以上结果进一步提示SNL后ACC脑区CXCL13的增加可能直接诱发了ACC脑区II/III层锥体神经元上突触后AMPA受体功能的增强（图13）。35 第三章结果小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究图13CXCL13诱导ACC脑区II/III层锥体神经元自发兴奋性突触后电流增加采用全新膜片钳记录的结果显示，CXCL13急性处理后，(A)显示SNL3d组神经元上sEPSCs的发放频率有所增加，但无显著差异。(B)显示SNL3d组神经元上sEPSCs幅度显著增加。*p<0.05，baseline为基础值（n=8）。36 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第四章讨论第四章讨论研究发现，周围神经损伤诱导脊髓神经元释放表达趋化因子CXCL13，并作用于星形胶质细胞上的受体CXCR5，诱导星形胶质细胞激活，维持神经病理性疼痛。CXCL13/CXCR5是能够在神经病理性疼痛中调节由脊髓神经元-星形胶质细胞相互作用的趋化因子及受体。CXCL13受miR-186-5p负调控，在SNL后的脊髓神经元中[5]表达上调，从而引起神经病理性疼痛。而疼痛初级感觉中枢即脊髓的痛觉信息接受脊髓上中枢的调节。而该中枢中的ACC是边缘系统中最为重要的结构之一；ACC不但参与痛情绪形成，而且可被外周伤害性的刺激持续激活，使ACC产生可塑性的变化。本研究运用电生理学、免疫组织化学、分子生物学、动物行为学等技术较系统的研究了小鼠ACC中CXCL13在神经病理性疼痛中的作用及可能分子机制。我们的研究表明，经外周神经损伤所致的神经病理性疼痛可引起双侧ACC中CXCL13与CXCR5mRNA和蛋白表达水平的升高，而且CXCL13及其受体CXCR5mRNA蛋白表达水平的升高与痛相关厌恶情绪的形成密切相关；ACC中CXCL13和CXCR5是产生在神经元细胞，抑制ACC的激活，不仅抑制CXCR5的表达，也阻止痛相关的厌恶情绪形成；且ACC中CXCR5基因沉默可抑制兴奋性突触传递的效能，SNL诱导的情绪改变可能与ACC脑区II/III层锥体神经元兴奋性突触传入突触后AMPA受体功能的改变有关；SNL后ACC脑区CXCL13的增加可能直接诱发了ACC脑区II/III层锥体神经元上突触后AMPA受体功能的增强。其可能阻断了ACC神经元的长时程增强(LTP)的产生。我们将对本课题中模型的选择及实验结果进行逐一的讨论。4.1选择动物疼痛模型我们的实验结果显示SNL模型可模拟周围神经损伤而引起的神经病理性疼痛症状。相比于其他的动物模型，尽管SNL模型手术过程较为繁琐，但在大量的操作和锻炼后，可以在较短的时间内完成模型的建立，减少人为所致的误差，而且受损的和未受损的脊神经以及相应脊髓节段完全分开。因而选择L5SNL模型研究ACC中CXCLl3在周围神经损伤引起神经病理性疼痛中作用机制。通常用啮齿动物进行伤害感受机制的研究，既在其身上使用各种模拟人类临床疼[6]痛的刺激。小鼠与人类基因相似度能达到约99％，这是小鼠被用作人类生理学的模37 第四章讨论小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究型的原因之一。目前已经有各种各样的小鼠慢性疼痛测试模型，每种测试检查不同的疼痛形式。常用的是注射福尔马林试验和完全福氏佐剂（CFA）来研究炎症性疼痛。[7]其由组织损伤引起，并且当基础诱因消失时是可逆的。神经性疼痛由神经系统组织损伤引起，如初级传入神经、脊髓和皮质区。由于神经损伤后的神经性疼痛发作可能发生延迟，因此即使愈合后，疼痛仍然可能存在。此外，神经性疼痛通常是糖尿病和癌症等疾病的继发性症状，并且可能会随着如化疗剂或细胞毒性药物等治疗而产生[8]。此外，由于疼痛系统是动态性的，所以神经性疼痛的体征和症状随时间而改变，并且疼痛不仅存在于损伤部位，它对周围神经也有损伤，而且能引发受影响神经的其[9]它部分功能变化和生化改变，最终发展到脊髓和脑中的高阶神经元。现已研究开发出许多动物模型模拟人周围神经性疼痛的病症。对于周围神经损伤模型的研究已经非常普遍，这些模型具有不同的损伤位置和[10]形式，包括损伤和结扎等精确方法。坐骨神经部分损伤常用于诱导神经性疼痛行为，[11]包括由Bennett和Xi发明的坐骨神经的松散结扎，由Kim和Chung发明的脊髓L5/L6[1]神经结扎等。除了炎性疼痛和神经性疼痛外，目前已经报导了多种其它疼痛模型来诱导小鼠的生理和病理性疼痛，例如热伤害感受和内脏疼痛。本研究结果与美国德州大学的Kim和Chung于1992年建立的SNL模型相一致，将小鼠左侧L5脊神经结扎，从而诱导小鼠产生机械性触诱发痛及热痛觉过敏，在SNL后第l天即产生痛觉过敏，且可持续21天以上。SNL手术不影小鼠的生长发育，小鼠运动协调能力不受影响。因而该模型可以用于研究ACC中CXCLl3在周围神经损伤引起神经病理性疼痛中作用机制。4.2SNL后ACC神经元表达CXCL13-CXCR5表达上调与神经病理性疼痛4.2.1神经炎症反应在神经病理性疼痛中的重要作用实验结果表明，经外周神经损伤所致的神经病理性疼痛可引起双侧ACC中CXCL13与CXCR5mRNA和蛋白表达水平的升高，并且都表达于ACC神经元细胞。CXCL13是CXC类趋化因子成员之一。趋化因子（chemokines）是化学趋化细胞因子的简称，是参与炎症反应的一类重要细胞因子，属于小分泌蛋白家族，也是众所周知的外周免疫细胞运输调节剂。我们注意到，本次实验ACC中CXCL13及其受体CXCR5介导神经炎症反应，在SNL所引起的神经病理性疼痛的中明显增高，ACC中产生神经炎症反应，通过双标染色定位发现其均位于神经元细胞。这充分说明38 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第四章讨论CXCL13及其受体CXCR5参与SNL引起的神经病理性疼痛，并在疼痛的维持中起作用。近年来对慢性疼痛的机制研究取得了很大的进展，尤其是发生于神经系统的炎症[12,13]反应在神经病理性疼痛的作用逐渐受到关注，但机制还不完全清楚。我们实验室一直对慢性疼痛进行研究，之前的实验发现，外周的神经损伤或组织损伤不但使局部组织发生炎症反应，也会引起中枢神经系统内的细胞因子、趋化因子、神经营养因子等表达量增高，它们有的由初级传入末梢或胶质细胞（主要为星型胶质细胞和小胶质细胞）释放作用于神经元，同时也有由神经元释放，在胶质细胞起作用。它们通过在神经元与胶质细胞之间的相互调节作用，在神经病理性疼痛的发生和维持中起着十分[14,15]重要的作用。在神经损伤后，初级传入神经元的突触前末梢（突触前膜）和脊髓神经元（突触后膜）释放CCL2和CX3CL1，分别激活脊髓小胶质细胞上的CCR2和CX3CR1。星形胶质细胞可以释放CCL2和CXCL1，分别激活脊髓神经元上的CCR2和CXCR2，。星形胶质细胞也可以产生CCL7并识别小胶质细胞上的受体CCR2。小胶质细胞活化后产生细胞因子TNF-α、IL-18，通过TNFR和IL-18R激活星形胶质细胞。小胶质细胞能够通过P2X4活化产生神经营养因子脑源性神经营养因子（BDNF），[16,17]从而提高伤害性突触传递。目前在哺乳动物已发现50多种趋化因子和20多种受体，它们在介导炎症反应、[18]免疫调节、创伤愈合以及移植排斥等方面发挥着重要作用。虽然对趋化因子的功能的发现起源于对免疫系统功能的研究，但目前所知，神经系统中趋化因子在神经元、[19]神经前体细胞、胶质细胞中均可表达，它们在生理和病理状态下，调节包括神经元发育、突触传递、和疾病相关的神经炎症在内的中枢神经系统功能。近几年的研究表明，中枢神经系统内趋化因子CCL2、CX3CL1、CCL21和CXCL12参与疼痛的调节，[20]其中对脊髓内CCL2和CX3CL1研究较多。在SNL诱导神经病理性的疼痛中，CCL2（又称单核细胞趋化因子，MCP-1）在脊髓星形胶质细胞内长时间表达上调；抑制CCL2的功能能够缓解神经病理性疼痛，但镇痛作用时间短暂，而且只能部分缓解热[21]痛觉过敏和机械性触诱发痛。同时，我们在腰椎间盘突出模型（LDH）诱导的神[22]经病理性疼痛中实验，我们发现CCL2及其受体CCR2有着相同的作用。发生于神经系统内的神经炎症反应是与慢性疼痛的产生和维持密切相关的一个不可忽视的因素。但是除这几种经典的炎症前细胞因子之外，还有哪些物质介导神经39 第四章讨论小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究炎症反应、它们的表达是如何被调控的，它们如何参与神经病理性疼痛调节等问题，还很不清楚。而揭示神经炎症反应的细胞和分子机制对于认识神经病理性疼痛发生发展的机制以及开发新的镇痛药物都具有重要的意义。那么，我们如何选择到CXCL13及受体CXCR5呢？之前的实验我们用L5脊神经结扎方法诱导神经病理性疼痛，通过基因芯片筛选出CXCL13及受体CXCR5，并[5]在脊髓水平进行了一系列的研究。发现SNL增加突触前末梢谷氨酸的释放，激活突触后神经元NMDA受体，并且miR-186-5p的表达降低，从而导致脊髓神经元CXCL13的上调。CXCL13作用于星形胶质细胞的CXCR5受体并激活ERK信号通路，导致星形胶质细胞介质的释放和表达，如CCL2、CCL7，以保持小胶质细胞的激活。[16,23,24]星形胶质细胞也能通过P2X4，P2X7和P2Y12受体产生ATP，激活小胶质细[21,25]胞。这些星形胶质细胞介质可以通过突触前和突触后调制直接增强痛觉传递。总之，脊髓背角CXCL13-CXCR5介导的神经元-胶质细胞相互作用能增强神经病理性疼痛，并延长其时程。CXCL13从功能上命名为B淋巴细胞趋化因子1（Bcell-attractingchemokine-1,BCA-1；或B-lymphocytechemokine，BLC)。研究表明，在健康的中枢神经系统中CXCL13是不表达的，但在病理条件下（例如神经疏螺旋体病、自身免疫脱髓鞘、原[26,27]发性中枢神经系统淋巴瘤），其可调节脑和脊髓。CXCL13参与淋巴组织中B细胞的归巢和迁移，和慢性炎症时的异位淋巴组织的形成有关。CXCR5是CXCL13的[28,受体，并在血液、淋巴组织和脑脊液（CSF）中的所有B细胞和T细胞亚群上表达29]。有报道指出缺乏CXCL13的动物有正常的脑脊液B细胞募集，但有轻度的、自限的脑脊髓炎，这些结果提示CXCL13或CXCR5可以通过B细胞独立机制调节这种[30]神经炎症疾病，CXCL13能趋化B细胞到中枢神经系统炎症区域。但是，Rainey-Barger等最近的研究表明，虽然在急性病毒性脑炎的小鼠的脑组织内CXCL13含量和B细胞数量都增加，但CXCL13基因敲除并没有影响B细胞的数量增多，表[30]明CXCL13与B细胞的增多虽然存在相关性，但两者之间不一定是因果关系。另外，Cao和DeLeo曾报道，在腰5脊神经切断诱导的神经病理性疼痛模型中，损伤后+[31]7天在脊髓腰膨大CD4的T淋巴细胞显著增多，但并没有检测到B淋巴细胞。这些结果提示，SNL诱导的神经病理性疼痛中CXCL13的表达增加，其主要作用可能[32]不是B细胞的聚集，而是存在其它未知的功能。40 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第四章讨论4.2.2脑内细胞因子参与神经炎症反应目前，细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、趋化因子、神经营养因子等已被证明可以以特殊的方式改变中枢神经系统的功能，如涉及到中枢神经系统控制的自主神经、神[33,34]经内分泌以及行为反应等。脑内细胞因子的功能具有多样性，如参与神经元与胶质细胞的增殖与分化；影响神经系统的可塑性；参与神经系统的再生与退变过程以及多种病理过程，并影响自主活动、摄食、体温调节、慢波睡眠；参与神经系统、内分[35]泌系统及免疫系统之间的相互作用，在这个"免疫特权"部位有了免疫过程。细胞因[36]子家族非常复杂，其在脑内的表达、分布及功能与机体所处的状态密切相关。如脑内TNF-α表达于早期的疼痛炎症反应，IL-1β、IL-6则在疼痛炎症反应中持续的存在，最新的研究表明，许多趋化因子如CCL2、CCL7、CXCL1、CCL21和CX3CL1等也参加神经病理性疼痛中枢神经系统的神经炎症反应，且很多都持续存在。目前有关细胞因子的研究尚待进一步深入，如能确切了解细胞因子在神经系统中所扮演角色，具有重要的临床意义。那么，作为脊髓上中枢边缘系统中主要的结构之一，在SNL引起的神经病理性疼痛中，前扣带皮层（AnteriorCingulateCortex，ACC）会不会同样有CXCL13mRNA表达增加，它是如何调控的呢？本次实验结果验证，SNL能诱导ACC中CXCL13及其受体CXCR5mRNA和蛋白表达上调并表达于ACC的神经元细胞中。但对于其具体的机制，我们还要开展相关的研究和实验，这也是接下来需要开展的工作，我们将更加详细的了解和掌握CXCL13在中枢神经系统的作用机制，为长期、精准控制CXCL13基因的表达调控提供靶点。4.2.3CXCLl3-CXCR5参与神经病理性疼痛[37]趋化因子和受体通常表达于不同的细胞类型，从而参与细胞间的crosstalk。例[38]如，CCL2表达于脊髓星形胶质细胞，它的受体CCR2表达于神经元；也有研究[39]认为CCL2表达于初级传入末梢，CCR2表达于小胶质细胞。再如，CX3CL1表达[40]于脊髓神经元，受体CXCR3表达于小胶质细胞。多种趋化因子及其受体在神经病理性疼痛的发生和维持过程中发挥着重要作用，参与不同的细胞类型间的信号传递。那么，CXCLl3-CXCR5是如何参与神经病理性疼痛？通过以往的研究和文献报道发现，脊髓神经和脊神经背根神经节中的几种趋化因子（例如CCL2，CCL7，CXCL1和CX3CL1）在神经损伤或组织炎症诱导的慢性疼痛的发病机理中发挥关键作用。尤41 第四章讨论小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究其是最初在B细胞滤泡的基质细胞中确定的CXCL13，是脊神经结扎（SNL）诱导的神经性疼痛脊髓中可检测的变化最为敏感的趋化因子。神经损伤后CXCL13在神经元内表达增高，并释放到细胞外并参与调解其它类型的细胞。SNL后CXCR5mRNA在脊髓的表达增加；而且体外培养的星形胶质细胞和小胶质细胞有CXCR5的表达，并可被TNF-α刺激上调。这些结果提示CXCR5可能表达于脊髓胶质细胞。因此，[5]在脊髓水平调节CXCR5的功能很可能也会有镇痛作用。另有文献报道，三叉神经病理性痛CXCL13-CXCR5-ERK级联中的CXCR5（属[41]于G蛋白偶联受体（GPCR）家族）激活G蛋白偶联受体，调节多种信号传导通路，而脊髓和背根神经节中的MAPKs是诱导细胞内信号传导和调节慢性疼痛中G蛋白偶[42][43,44]联受体的关键因子。外周完全弗氏佐剂炎症（CFA）和SNL诱导的神经损伤模型ERK激活DRG神经元。颞下颌关节炎症增加三叉神经（trigeminalganglion，TG）[45]里pERK表达。我们发现，pIONL增加WT小鼠TG神经元pERK的表达。在Cxcr5基因缺陷小鼠中pERK表达降低。此外，TG内注射CXCL13诱导CXCR5依赖性pERK[5]上调。同时，CXCL13通过CXCR5激活脊髓星形胶质细胞ERK信号通路。鞘内注[46]射MEK抑制剂减轻CFA致炎性痛及神经损伤引起的神经病理性疼痛。TG内注射PD98059能抑制pIONL或CXCL13引起的机械性痛觉过敏。众所周知，ERK介导炎[47]症介质的表达，包括生长因子和炎性细胞因子（如IL-1β）。pIONL能增加WT小鼠TNF-α和IL-1β表达，但表达均低于CXCR5基因敲出小鼠。此外，TG内注射CXCL13诱导CXCR5/ERK依赖性的TNF-α和IL-1β上调。在背根神经节和脊髓中，[48]TNF-α和IL-1β是介导慢性疼痛的重要炎性细胞因子。行为学数据进一步表明，抑制TNF-α或IL-1能缓解pIONL或CXCL13所致的痛觉过敏。那么，ACC中CXCL13-CXCR5如何调节，其相关的信号通路以及下游机制，我们还需要进一步制定实验方案进行研究。4.3ACC中CXCL13-CXCR5参与神经病理性疼痛的情绪调节4.3.1ACC参与疼痛情绪我们通过对前扣带皮层中趋化因子CXCLl3-CXCR5的测定，研究其与SNL引起的神经病理性疼痛的联系。前面讨论了炎症反应及趋化因子与疼痛的关系，那么，ACC区域和疼痛又有着什么紧密的联系呢？又是通过什么联系的呢？通过分子生物及行为学实验证实，CXCL13及其受体CXCR5mRNA及蛋白表达的升高与痛觉相关42 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第四章讨论的厌恶情绪的形成紧密相关，慢病毒注射阻断CXCR5mRNA，能缓解SNL引起的痛的相关厌恶情绪的产生，但是不能缓解SNL引起的机械痛敏。这一结果说明，趋化因子CXCL13同样参与高级中枢ACC对神经病理性疼痛的调节，并在神经病理性疼痛，尤其是疼痛情绪的维持上起着重要的作用。CXCR5基因沉默不仅抑制了兴奋性的突触传递效能，而且阻止了ACC中LTP的产生。神经解剖学和行为药理学研究表明，在导水管周围灰质（PAG）上存在一个脊髓疼痛抑制系统。ACC激活可启用PAG水平上的疼痛抑制系统。实际上，ACC局灶性脑刺激可抑制背角神经元对机械刺激[49,50][51]的反应，但也有研究论证了疼痛行为反应受到促进作用。实验证明ACC激活[52]作用与否是PAG水平上的内生疼痛抑制系统所起作用的。ACC是大脑中一个十分关键的区域，是参与疼痛处理的重要部分。扣带回切开术已被用于治疗各种疼痛，如反射性营养不良、上腹和下胸疼痛、癌症晚期疼痛以及神经性疼痛。研究表明，ACC不但参与了痛情绪的形成，还可持续地被外周伤害性的刺激激活，使其产生可塑性的变化。近年来，功能成像、电生理学与行为学的研究显示，ACC与疼痛，尤其与疼痛产生的情绪反应之间关系密切。ACC作为调节情绪的重要脑区，多种感觉中负性的情绪均可激活ACC；由于社会或心理原因所致的负性情绪，以及对遭受痛苦引起的情绪等都与ACC存在千丝万缕的联系。临床研究发现，切除ACC及其周围皮层组织可明显抑制并缓解慢性疼痛病人的焦虑、抑郁等情绪，但对病人的位置和刺激强度等感觉特性的分辨并无影响。4.3.2ACC中CXCL13-CXCR5参与神经病理性疼痛情绪调节的机制探索本实验通过全细胞膜片钳记录ACC脑区II/III层锥体神经元上sEPSCs变化，发现SNL并不影响II/III层锥体神经元上sEPSCs的发放频率，但sEPSCs幅度出现显著增加；同时CXCL13急性处理能引起神经元上sEPSC的幅度出现显著增加，对sEPSC的发放频率也有增加，但作用不显著。提示SNL诱导的情绪改变可能与ACC脑区II/III层锥体神经元兴奋性突触传入突触后AMPA受体功能的改变有关；SNL后ACC脑区CXCL13的增加可能直接诱发了ACC脑区II/III层锥体神经元上突触后AMPA受体功能的增强。这可能与ACC脑区II/III层锥体神经元LTP时程变化有密切关系。在神经性疼痛的动物模型中，ACC中的突触反应在异常性疼痛发生发展时[53,54]被强化，通常在神经损伤后1-2周。此时，LTP的晚期成分也不能再被θ节律刺激诱导，表明已发生了最大强化。这些结果表明神经性疼痛与ACC中LTP表达的机43 第四章讨论小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究制有关。功能依赖性立即早期基因，如Fos和Egr1的表达与海马体中晚期LTP的诱[55]导有关，并且常在学习和记忆研究中将其表达作为LTP的标志物。与慢性疼痛与ACC中的持续性LTP相关的想法一致，患慢性炎性疼痛、神经性疼痛、骨癌疼痛和[56,57]慢性内脏痛的啮齿动物模型都与ACC神经元中的Fos和Egr1活化相关。此外，[58]在慢性疼痛模型中,神经元兴奋性增加，也有有关突触强化的证据。外周神经阻滞实验已证明，外周神经活动对于维持ACC中刺激诱发的突触反应强化不是必须的，表明指示ACC中的突触可塑性可通过脊髓上中枢机制维持。突触传递中与疼痛相关[59]的长时程变化不仅限于强化。在外周组织损伤后，ACC神经元的低频重复刺激诱导的LTD可能会受到显著影响。例如，在切除尾尖和足趾的啮齿动物中，在切断手术后45分钟和2周，ACC中[57,60][61]LTD的诱导被抑制。此外，在骨癌痛小鼠模型中，ACC中的LTD也被损坏。基于这些观察，我们提出，慢性疼痛与LTP的饱和晚期成分有关，并且还与ACC中的LTD抑制有关。在对小鼠进行周围神经结扎之后，AMPAR介导的兴奋性突触后电流增加，该电流可从II-III和V层的锥体神经元记录，并且可通过ACC内的局部电[56,62]刺激诱发。在由CFA诱导的炎症小鼠模型中，我们发现ACC神经元发生了类似[56,63]的变化。这些变化与AMPAR的整流变化有关。膜上含GluA1的AMPAR群体增加，而含GluA2或GluA3的AMPAR没有受到显著影响。遗传学研究也进一步支持了GluA1对于EPSC增加的选择性促进作用。敲除GluA1，但仍保留GluA2将显着减少由外周损伤触发的Fos活性，脊髓背角也是如此，且对于外周损伤的行为反应[64]也减少了。最近的电子显微镜数据进一步支持以下结论，即突触后GluA1受体将[63]在外周损伤后增加。未来研究无疑将处理这些问题，继而进一步推动我们对ACC中发生的细胞变化及这些变化影响疼痛神经相互传导的方式的理解。疼痛刺激可使得ACC中天冬氨酸[65]（NMDA）受体增多，且福尔马林诱导条件位置避免的形成与此有关。研究也发[66]现天冬氨酸配合基谷氨酸具有类似的表现。其他研究支持了这样一个观点：许多疼[63]痛状态持续存在的一个重要方面是，ACC中谷氨酸增多。LaGraize和Fuchs确认了ACC伽马氨基丁酸（GABA）在调节疼痛情感组分中的重要作用。新陈代谢变化，[53][67]包括PKMζ和SIP30等蛋白激酶的变化，也表现出对ACC中疼痛处理的促进作用。对这些细胞变化的理解将在研究人员使用功能方法深入研究疼痛的过程中给予其44 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究第四章讨论指引。我们的结果只是初步揭示了ACC中趋化因子CXCL13参与神经病理性疼痛的产生和发展，且主要表现为对痛厌恶情绪反应。疼痛的产生与维持在机体高级中枢中涉及记忆、认知等高级神经活动全过程，其具体机制十分的复杂。在神经病理性疼痛中，ACC中的CXCL13如何被激活？其激活受到哪些因素的调节与影响？激活后的胞浆与胞核内的作用靶点是什么，可诱导哪些下游相关基因的表达？其在痛情绪与痛记忆形成中具有怎样的关键性意义？除了CXCL13外，还有哪些趋化因子或炎症因子参与ACC区域的调节神经病理性疼痛过程？在一系列疼痛产生的环节中，具体哪一个是参与激活或者抑制痛觉反应的重要环节？以上这些问题需要我们不断的实验分析研究，找出相应问题的答案，为临床疼痛相关的综合治疗提供理论与实验依据。45 参考文献小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究参考文献1.KimSH,ChungJM.Anexperimentalmodelforperipheralneuropathyproducedbysegmentalspinalnerveligationintherat.Pain,1992,50(3):355-363.2.IyerSV,BenavidesRA,ChandraD,eta1.Alpha4-ContainingGABA(A)ReceptorsareRequiredforAntagonismofEthanol-InducedMotorIncoordinationandHypnosisbytheImidazobenzodiazepineRo15-4513.FrontPharmacol,2011,2:18.3.WernerDF,SwihartAR,FergusonC,etal.Alcohol-inducedtoleranceandphysicaldependenceinmicewithethanolinsensitivealphalGABAAreceptors.AlcoholClinExpRes,2009,33(2):289-299.4.ChaplanSR，BachFW,PogrelJW,eta1.Quantitativeassessmentoftactileallodyniaintheratpaw.NeurosciMethods,1994,53(1):55-63.5.JiangBC,CaoDL,ZhangX,etal.CXCL13drivesspinalastrocyteactivationandneuropathicpainviaCXCR5.JClinInvest,2016,126(2):745-761.6.WaterstonRH,Lindblad-TohK,BirneyE,etal.Initialsequencingandcomparativeanalysisofthemousegenome.Nature,2002,420(6915):520-562.7.MifflinKA,KerrBJ.Thetransitionfromacutetochronicpain:understandinghowdifferentbiologicalsystemsinteract.CanJAnaesth,2014,61(2):112-122.8.CostiganM,ScholzJ,WoolfCJ.Neuropathicpain:amaladaptiveresponseofthenervoussystemtodamage.Annu.RevNeurosci,2009,32(3):1-32.9.YamanakaH,NoguchiK.Pathophysiologyofneuropathicpain:molecularmechanismsunderlyingcentralsensitizationinthedorsalhorninneuropathicpain.BrainNerve,2012,64(11):1255-1265.10.AttalN,JazatF,KayserV,etal.Furtherevidencefor'painrelated'behavioursinamodelofunilateralperipheralmononeuropathy.Pain,1990,41(2):235-251.11.BennettG.J,XieYK.Aperipheralmononeuropathyinratthatproducesdisordersofpainsensationlikethoseseeninman.Pain,1988,33(1):87-107.12.FreitagCM,MillerRJ.Peroxisomeproliferator-activatedreceptoragonistsmodulateneuropathicpain:alinktochemokines?FrontCellNeurosci,2014,20;8:238.46 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结论小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究结论1．SNL能诱发小鼠产生神经病理性疼痛，是可靠的神经病理性疼痛模型；2．SNL诱导ACC中CXCLl3和CXCR5mRNA和蛋白表达增加；CXCLl3和CXCR5主要表达于神经元细胞；3．抑制ACC水平CXCR5的作用能够缓解SNL引起的痛的相关厌恶情绪；4．SNL诱导的情绪改变可能与ACC脑区II/III层锥体神经元上兴奋性突触传入功能的改变有关；SNL后ACC脑区CXCL13的增加可能直接诱发了ACC脑区II/III层锥体神经元上兴奋性突触传递功能的增强。52 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究综述综述前扣带皮层与疼痛情绪朱翔综述杨建平审校前言疼痛是一种基础感觉机制，用来预警我们即将发生的组织损伤。然而，当疼痛阈值急剧变化时，就会发生与疼痛相关的一系列临床问题。疼痛分为两大类：急性或生理性疼痛，慢性或病理性疼痛。生理性疼痛有助于我们确定潜在的危险刺激并避免其发生，其对生存至关重要。与生理性疼痛不同，病理性疼痛对人体没有任何益处，它只发生在机体损伤以后（例如组织或神经损伤、疾病等）。除了自发性疼痛之外，还有在组织或神经损伤后发生病理状况所引起的异常性疼痛，其疼痛阈值已经降低，它使通常不引起疼痛的非伤害性刺激诱导了疼痛；痛觉过敏，对伤害性刺激具有增强作用。科学家们使用动物模型以及人类的大脑成像技术进行研究发现，慢性疼痛可能是[1]由于躯体感觉通路的敏感，包括外周组织、脊髓和皮质的长期变化所引起的。此外，[2,3]控制到达大脑疼痛信息量的双相调制系统，也发生了可塑性变化。基于先行研究中对疼痛调控的神经回路机制缺乏深入了解，特别是对皮层下相关脑区的疼痛调节机制尚有诸多不明之处，且情绪与疼痛的关系也有诸多不明确。因此，从临床角度考量，将情绪与疼痛结合进而进行综合的药物和心理治疗，能够最大限度改善患者的疼痛程度。同时探索大脑对疼痛刺激的感知以及情绪等心理因素的交互作用，将有助于深入探讨痛觉的调控机制及临床治疗。历史研究1968年，Melzack和Casey提出一个组成参与疼痛情感和动机确定的脑干网状结构和边缘系统的神经结构模型。这个系统独立于参与疼痛感觉与识别维度的神经结构，基于疼痛体验，同时包含情绪和感觉组分。尽管伴随许多持久疼痛状态的病痛都潜藏[4-6]情感组分，但以往很少有临床或基础研究会关注到这个关键功能。疼痛神经矩阵理论整合了Melzack和Casey提出的认知评估、感觉识别和动机情53 综述小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究[7,8]感组分，并指出疼痛是大脑广泛神经网络独特神经签名产生的复杂体验。ACC是[9-11]大脑中一个十分关键的区域，是参与疼痛信息处理的重要部分。目前，扣带回切开术已被用于治疗各种疼痛，如反射性营养不良、上腹和下胸疼痛、癌症晚期疼痛以[12-15]及神经性疼痛，有一半以上的患者能够得到明显缓解。Ballintine等人研究表明，35位遭受晚期癌症病痛的患者和77位遭受良性疾病的患者中分别有22位和48位患者在扣带切开术后疼痛得到显著缓解。诸多大脑成像研究都报告，在出现急性有害刺[16,17]激前及其过程中产生持续疼痛时，ACC神经元活动增强。在有害刺激前及其过程中使用安眠药，可选择性降低疼痛效应，促使疼痛不愉快评级降低，但疼痛强度不受[18]影响。使用安眠药控制疼痛导致的不愉快还改变了ACC中的局部大脑血流（rCBF），但体觉皮质中的局部大脑血流不受影响。这表明，ACC参与疼痛相关效应的处理，但[18]不参与对有害刺激的感觉处理。除安眠药使用，实时核磁共振成像（fMRI）研究表明，健康对照组和慢性疼痛患者组都可通过训练降低ACC中的活动，从而缓解疼痛，[19]其中更大的神经反馈“控制”对应于更低的疼痛评级，但Birbaumer等人指出，实时核磁共振成像在调节大脑机制并控制疼痛中的作用需要进一步验证。最近，大量使用动物模型来研究ACC在情感疼痛处理中的作用。以往大多数检验脊髓局灶性大脑刺激或离散细胞核显微药物注射的动物实验都测量到对急性有害刺激的自反行为反应。实际上，实验中有害刺激反应阈值或延迟的提高揭示，激活各种皮质下、脑干和脊髓系统均可产生镇痛作用。这些研究假定操控边缘系统结构可通过选择性[20,21]调控疼痛效应而改变疼痛处理。ACC的解剖结构与生理功能1.解剖结构ACC形成扣带皮层的前部，且啮齿动物和人类的脑皮层包括I，II-III和V-VI，和其他皮层区域不同，ACC没有第IV层。I层含有来自其他中枢神经系统区域的中间神经元和投射纤维，其中一些与ACC更深层中的神经元形成了突触联系。II-III层主要包[22,23]含锥体细胞。ACC更深层包含锥体细胞和中间神经元，并且这些层中的许多都将[22-24]其投射发送到其它如岛叶皮层的皮层区域以及皮质下区域和脊髓（图1）。深层锥体细胞的树突蔓延到ACC的表面层，因此ACC的不同层之间的神经元也可能形成突触联系。人们已经证实了不同类型的单突触联系，包括锥体神经元—锥体神经元，抑制54 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究综述性神经元——锥体神经元和抑制性神经元——抑制性神经元单突触联系。这些联系中许[25]多是相互交接的，这表明ACC具有复杂的网络架构。来自体细胞和内脏器官伤害性信息至少通过三个主要的投射系统间接传递给[26]ACC。其中一个系统来自丘脑，ACC神经元接收来自内侧丘脑的疼痛感觉输入，继而通过脊髓丘脑束接收来自脊髓投射纤维的输入。通过使用体内丘脑刺激的电生理学实[27]验，证实了这些投射功能的存在。最近，有实验表明内侧丘脑神经元直接激发背侧ACC中的小清蛋白阳性中间神经元，被认为介导了II-III层中锥体神经元的前馈抑制[28]。伤害信息还通过杏仁核传递到ACC，包括中央核，其又通过臂旁复合体接收脊柱[29]感觉输入。ACC的伤害感受输入的第三来源来自皮质的其他疼痛相关区域，例如S1[30]和岛叶皮层（图1）。第V层的锥体细胞投射到皮层下结构，如下丘脑和导水管周围灰质，后者与脊髓[31]感觉传递的下行性调控有关（图1）。此外，ACC的深层锥体细胞还包括背角的脊[24]髓直接投射。ACC神经元也会与处理恐惧和焦虑中发挥关键作用的杏仁核中的神经[32][23]元形成联系。此外，哺乳动物中的ACC刺激可诱导发声，这种发声可能通过对运[33]动皮质的投射来暗示疼痛或恐惧。ACC神经元也投射到PFC，并且此类联系可能影[34]响睡眠和认知。ACC到蓝斑的投射会影响小鼠的热痛觉阈值。此外，来源于皮层下[35]区域的多巴胺能，5-羟色胺能，胆碱能和肾上腺素能纤维使ACC受神经支配。虽然对这些投射的具体作用知之甚少，但可推测，这种广泛的联系使得ACC在处理疼痛及其相关情绪中的起着关键而又复杂的作用。前扣带皮层（ACC）神经元接收来自各种皮质和皮层下结构的输入。这些输入通过丘脑传输伤害性信息，还可以传输参与调节情绪状态的中枢神经系统区域的信息，例如杏仁核和岛叶皮层（IC）。ACC神经元投射到介导感觉调节，焦虑，恐惧和记忆的中枢神经系统区域。ACC深层中的神经元也可将其投射直接或间接地发送到脊髓背角。这种自上而下的电路让皮质神经元可直接调节到达中枢神经系统的感觉输入。复杂的感觉输入可能会增加皮质神经元在生理条件下对于周围感觉刺激的敏感性。同时，这种正向循环，即脊髓背角丘脑——皮质——脊髓背角也可能是中枢敏化的一种形式。大多数投射是双向的。55 综述小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究图1ACC的主要感觉输入和输出a前扣带皮层（ACC）神经元接收来自各种皮质和皮层下结构的输入。bACC神经元投射到介导感觉调节，焦虑，恐惧和记忆的中枢神经系统区域。大多数投射是双边的，为了简单起见，这里仅示出一侧。PAG导水管周围灰质；PB臂旁复合体；PFC前额皮质；RVM延髓头端腹内侧区；S1初级体感皮质；S2次级体感皮质。2.ACC的生理功能通过低频刺激实验诱导ACC快速兴奋性突触后反应主要受AMPA受体[36]（AMPAR）介导。但是，红藻氨酸受体也可以组成锥体神经元中的快速兴奋性突触传导。红藻氨酸受体介导的兴奋性突触后电流（EPSC）比AMPAR介导的兴奋性突触后电流慢，其在高频传输期间会有效叠加，并涉及GluK1（也称为GluR5）和GluK2（也称为GluR6）亚基的激活。ACC中的NMDA受体（NMDAR）介导更慢[37]的兴奋性反应，同时也会在高频传输期间有效叠加。代谢型谷氨酸受体（mGluR）[38]可以调节ACC中的突触传导。和皮质中的其他区域一样，GABA是ACC中的主[39]要抑制性递质，其对A型GABA（GABAA）受体和B型GABA（GABAB）受体[40][39]都会产生作用。ACC中含GluK1的红藻氨酸受体的激活可以调节GABA释放。56 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究综述ACC与疼痛情绪疼痛是一种不愉快的躯体感觉和情感体验，所有脊椎动物的疼痛通过使生物体意识到潜在的组织损伤来发挥重要的生理功能。当存在有害刺激时，外周伤害感受器中的活性触发运动反射以使组织损伤最小化。急性疼痛可导致机体形成持久的恐惧记忆，会让生物体将特定的环境信号与适当的运动反应联系起来，预期急性疼痛也会引起焦虑。与急性疼痛相关的令人不快会迅速消失，但其恐惧记忆都是持久的存在着[41]。与急性疼痛不同，持续时间为几周或更长时间的疼痛，即慢性疼痛对人体并没有明显的保护和有益作用。除了令人不快之外，慢性疼痛与恐惧，焦虑和认知功能障碍[41,42]有关。1.疼痛恐惧和前扣带皮层在动物和人类中，急性疼痛可导致条件性恐惧行为的表达，与疼痛发作相关的环境刺激或特定刺激可触发这种行为。相反，慢性疼痛与疼痛加剧的恐惧有关（在人类文学中通常称为“恐惧回避”）。有证据表明，前扣带皮质（ACC）神经元与恐惧记忆有密切关系。除了杏仁核和海马之外，啮齿动物中的经典恐惧条件反射激活ACC中的神经元[43]。此外，ACC神经元的电活化可以让自由活动的动物感受到寒冷，并在同一位置[44]产生条件性恐惧记忆。与此相同，啮齿动物中ACC神经元的化学活化诱导了对于[45]活化发生地的厌恶。相反，ACC的双侧（不是单侧）化学失活抑制了因足底电击[44,46]而造成的条件性恐惧记忆的形成。将NMDA受体拮抗剂注射到双侧ACC，能减[47]少或阻断恐惧记忆的形成。总之，这些结果表明ACC神经元与恐惧记忆相关。此外，ACC神经元的放电模[48,49]式在痕迹性恐惧条件反射期间发生了改变，这些改变或许可以预测厌恶事件。和[50]啮齿动物一样，人体中的痕迹性恐惧条件反射激活了数个脑区，包括ACC。ACC还在长久恐惧记忆中发挥关键作用。在使用环境条件化恐惧的实验中，长久记忆的恢复（条件反射后36天），但不是最近的环境恐惧记忆（条件反射后1天）的恢复，增加了ACC中早期生长反应1（Egr1）的表达，将利多卡因输入ACC中能[51]破坏长久恐惧记忆。为了获取ACC活性，有人报道了观察性恐惧学习，即通过观[46]察经过常规训练的动物行为，获得恐惧学习。[45,46]虽然人们已经知道急性伤害感受可触发恐惧记忆的形成，但恐惧记忆和慢性57 综述小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究疼痛之间的关系尚未被广泛研究。然而，在患有慢性疼痛的人中，恐惧是导致痛苦的[52,53]关键因素之一。在啮齿类动物中，痕迹性恐惧条件反射触发了ACC中AMPA受[68][54]体介导的突触后反应的增强，并且慢性疼痛模型中也有类似的情况。此外，在患慢性疼痛的啮齿动物模型中，已经证明新痕迹性恐惧记忆的形成一直受到损害。在患慢性疼痛的啮齿动物模型中，ACC中发生的突触变化或许可部分解释患慢性疼痛[55]的人的认知功能受损的原因。2.疼痛焦虑和前扣带皮层我们已经知道人类的焦虑以及恐惧可以增强疼痛感觉，并且慢性疼痛可导致持续的焦虑。此外，焦虑的人更可能感觉到慢性疼痛，而抗焦虑药物可以减缓一些患者的[52,53][56][57]慢性疼痛。研究表明，对于暴露于焦虑诱导性环境的人以及患焦虑症的人，其前扣带皮层（ACC）中的活性增强。因此，慢性疼痛和焦虑可以相互促进。通过对啮齿类动物的实验得到类似结论。与对照组相比，慢性疼痛的啮齿动物的[58,59]类焦虑行为显著增加。相反，较高水平的焦虑促成了急性内脏伤害性反应增加[60][61,62]。ACC与涉及情感反应的杏仁核和其他皮质下区域的解剖联系解释了ACC在处理与疼痛刺激或经历相关的焦虑和恐惧中的潜在作用。啮齿动物中ACC的永久[63]损伤或化学失活也产生了抗焦虑效应。此外，小鼠ACC的锥体神经元选择性光遗[64]传活化诱导了类焦虑和类抑郁行为。这些发现进一步支持了ACC的神经元活性影响焦虑的这一观点。在患慢性胃肠疼痛的小鼠模型中，将超极化激活环核苷酸门控阳[58,65]离子通道阻断剂ZD7288注射到ACC会减少类焦虑行为，表明此区域的突触可塑性破坏可干扰疼痛和焦虑之间的相互作用。突触前长时程增强（LTP）是ACC中在慢性疼痛条件下促成类焦虑行为的一种可能的突触机制。例如，较高水平的焦虑防止了ACC中突触前长时程增强的诱导。此外，ZD7288的使用会逆转突触前长时程增强。它还抑制在患神经性疼痛的小鼠模[58]型中有活性的ACC神经元中的突触传导。总之，涉及慢性疼痛反应的ACC神经元由于突触前长时程增强而接受强化的丘脑皮层输入，且该信号可能导致相关焦虑。我们已知突触前长时程增强和突触后长时程增强可在ACC神经元中一起发生[58]，因此这两种形式的LTP的加性效应可作为慢性疼痛和焦虑相互增强作用的原因。我们可以用突触后长时程增强对与慢性疼痛相关的令人不快进行编码，这还会涉及AMPA受体功能的改变，且可用突触前长时程增强对于慢性疼痛相关的焦虑进行编58 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究综述码，其与递质释放的概率增加有关。由于信号（令人不快）和显著性（与令人不快相关的焦虑水平）完全由独立的机制编码，所以它们是可叠加的——即使在单个突触的层面也是可叠加的。原则上，突触后长时程增强达到饱和的突触仍然可以通过诱导突触前长时程增强而被进一步强化。然而，我们仍尚不清楚ACC中的疼痛和焦虑之间的关系是发生在突触水平还是神经元水平。疼痛与中枢神经系统的突触可塑性通过动物模型研究，我们已知脊髓和皮质下区域及皮层区域中伤害感受器的外周[42,66]致敏和长期突触可塑性导致了慢性疼痛。虽然急性和慢性疼痛神经通路类似，但区分慢性和急性疼痛的细胞及分子机制目前还不是十分清楚。这对于研发可在减轻慢性疼痛同时对急性疼痛造成最小影响的药物很重要。通过脑成像的研究，目前已初步掌握了关于不同类型疼痛中皮层区域的重要信息[67]。前扣带皮层（ACC）和其他皮层区域，包括岛叶皮层、初级躯体感觉皮质（S1）、次级躯体感觉皮质（S2）和前额皮层（PFC）都会被各种急性躯体刺激和内脏伤害性[67,68]刺激所激活。健康个体中，ACC在对于有害温度刺激的感知期间处于活跃状态。例如，在热烧灼错觉中，无害温暖和寒冷刺激在空间的分布是交错的，这就会产生异[69]常痛苦的感觉。ACC只有在温暖和寒冷刺激一起出现时才会被激活。这明显表明，ACC与急性疼痛相关的令人不快的信号传导有关。对于患有神经性疼痛如肠易激惹综合征的慢性内脏疼痛病例的个体功能性MRI检查研究表明，ACC功能区域一直处[67,68]于超活化状态。另外，ACC的激活也与疼痛相关情绪或心理有关，用实验方法[70]诱导产生悲伤、社会排斥或拒绝都导致该皮层区域的活性增加。因此，ACC可能导致慢性疼痛中各种负面效应，包括疼痛的令人不愉快。人们通过动物模型、细胞学和分子生物学，对诱导及维持慢性疼痛的机制进行了[42,66]深入的研究。目前许多已知与疼痛相关的结构都与突触可塑性相关联，包括脊髓的灰质后角和许多皮层结构。在这些结构中，人们对ACC中的突触可塑性研究最为广泛。动物模型发现，ACC在急性和慢性疼痛处理中都有着非常重要的作用。目前有关中枢神经系统与疼痛相关的突触可塑性的研究有以下这些。脊髓背角包括从外周到背角传输疼痛相关信息的C类纤维感觉突触可发生长时程增强[71][72][73]（LTP）。在体实验或切片记录所示，对于神经病理性疼痛和炎性痛动物模型，59 综述小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究初级传入纤维和脊髓背角神经元之间的突触传导显著增强。C类纤维低频（1Hz）刺[73]激诱导投射到臂旁复合体的LTP。丘脑[74][75]虽然有报道神经病理性疼痛和炎性疼痛的动物模型，丘脑的一些神经元放电率增加，但目前尚未明确脊髓丘脑投射神经元和丘脑神经元之间的联系中是否发生LTP或长时程抑制（LTD）。杏仁核[76][77,78]在炎症疼痛和神经性疼痛的动物模型中，臂旁复合体到杏仁核的中央核的输入之间的兴奋性突触增强。岛叶皮层[79,80]冰冻脑片切片显示，岛叶皮层的兴奋性突触会发生LTD或LTP。神经性疼[81,82]痛模型NMDA受体和AMPA受体介导反应的兴奋性传递增强。前额皮质[83]神经性疼痛的动物模型中，前额皮质中的兴奋性传递增强。神经性疼痛模型，初级躯体感觉皮质（S1）和次级躯体感觉皮质（S2）中的兴奋性传递增强，这可能促成前扣带皮层通过从S1和S2到ACC通路来增加ACC的活[30]性。ACC在疼痛中的角色ACC中的神经元会对有害和无害机械或热感刺激做出反应。特别是整合来自各[82,83]种皮质层的输入锥体神经元被有害机械刺激所激活。ACC中的非锥体细胞是含[84]有GABA和各种神经肽的抑制性神经元。在局部回路中，抑制性神经元接受来自锥体细胞的兴奋性谷氨酸能支配，导致GABA反馈释放到锥体细胞周围区域。人和[83]动物中的许多ACC锥体神经元都具有分散的接受域。在几种不同的慢性疼痛动物模型中，ACC的化学或电解损伤减弱了疼痛状态的[85,86]情感组分，这反应在有害刺激诱导的条件性位置厌恶减少以及位置回避的减少[87]。相反，对于年幼啮齿动物，在没有任何外周有害刺激的情况下，ACC的电刺激[85]诱导其被传递的厌恶，表明该区域的激活足以诱导与疼痛情感一致的行为。值得注意的是，在神经性疼痛动物模型中，ACC损伤并没有一直减弱机械性触诱发痛，表[86,88,89]明其他皮层区域也可能与这种慢性疼痛状态的感觉成分相关。60 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究综述[84]ACC中锥体神经元的特异性激活降低了小鼠的机械性疼痛阈值。然而，爪底皮下注射完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎性痛小鼠模型进行相同测试时，ACC锥体神经元的光遗传学刺激并没有进一步降低机械痛阈，。另外，采用光遗传学技术，在胸腺细胞抗原1θ（Thy1）启动子的作用下，将紫红质通道蛋白2在抑制性中间神经元中表达，ACC中抑制性GABA能中间神经元的光遗传学刺激对伤害感受起作用。[90]小鼠中ACC的光遗传活化减弱了福尔马林注射入后爪所诱导的伤害性行为。Cre-loxP方法实现了紫红质通道蛋白2更准确的细胞型特异性表达，小清蛋白阳性中[84]间神经元的光遗传活化减弱了CFA诱导的机械超敏反应。对机械性超敏反应的抑制作用可能是通过ACC中锥体神经元的抑制而被介导的，因为对于伤害感受的影响和钙/钙调素依赖性蛋白激酶II型（CaMKII）表达的锥体细胞中放电的光遗传抑制所引起的影响相类似。换句话说，ACC锥体神经元的激活对于超敏性的介导也是必需的。总之，通过最新的光遗传学方法，能更好的了解ACC在疼痛中的角色，同时，还能让我们对特定神经元类型在疼痛的感觉，情感和认知成分中的作用进行详细研究。疼痛与ACC中的突触可塑性在学习和记忆中，长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）是广泛研究的突触[91]可塑性的两种形式。慢性疼痛被认为是一种持续感觉记忆。脊髓背角和皮层区域包括ACC中的LTP和LTD都与慢性疼痛有联系。大量动物模型实验研究证明，脊髓中的C类纤维突触处的LTP可造成痛觉过敏，并且LTP的逆转通过去增强作用降低了[92,93]伤害性行为。在患慢性疼痛的啮齿动物模型中，介导ACC中兴奋性传递上调的信号通路其前扣带皮层中的突触发生了长期的突触前和突触后变化。在突触前位点，谷氨酸释放增加，在突触后位点，AMPA受体（AMPAR）表达增加。在慢性疼痛模型中发生的这些突触前和突触后变化与体外诱导的突触前LTP和突触后LTP有些相似的机制（图2）。前扣带皮层（ACC）中可记录两种形式的LTP：突触后LTP和突触前LTP。如图2，这两种形式可发生在相同突触处。突触后LTP（a部分）的诱导需要激活NMDA受体（NMDAR），且维持突触后LTP的表达需要非典型蛋白激酶C（PKC）同种型（最可能是PKMζ）的突触后活性。腺苷酸环化酶1（AC1）对于ACC中突触后LTP61 综述小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究2+诱导也是至关重要的。环AMP依赖性蛋白激酶（PKA）的激活驱动了可渗透Ca的AMPA受体（CP.AMPAR；GluA1同聚体）插入。PKA也易位到核，它会在这里将转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB）磷酸化，导致几种下游可塑性蛋白的合成，包括智力低下蛋白（由Fmr1编码的FMRP）。PKMζ可通过上调GluA1-GluA2异聚体来维持LTP。此外，FMRP水平增加可增强AMPAR以及NMDAR的突触后功能。ACC中的突触前LTP（b部分）不依赖于NMDAR；相反，突触前红藻氨酸受体和AC1激活对其诱导是不可少的，并且突触前LTP表达可能需要超极化激活环状核苷酸门控（HCN）通道的激活。cAMP结合到HCN通道以增加其敏感性，且PKA增强囊泡融合。c，dLTD也可以在ACC突触处被诱导，并且可分成至少两种形式：NMDAR和代谢型谷氨酸受体（mGluR）依赖的LTD。两种形式的LTD都需要AMPAR的突触后修饰才能表达。对于NMDAR依赖性LTD（c部分），钙调蛋白（CaM）结2+合通过NMDAR进入的Ca，并激活蛋白质磷酸酶1（PP1）。PP1对AMPAR去磷酸化，从而达到降低应答的目的。此外，与C激酶1（PICK1）相互作用的蛋白质可能影响GluA2和与谷氨酸受体相互作用的AMPAR结合蛋白之间的相互作用（ABP-GRIP）。mGluR依赖的LTD（d部分）与mGluR1的激活相关，并且L型电压门控钙通道（L-VGCC）也促成了mGluR1的激活，而且mGluR依赖性LTD受突触再可塑性的PKC依赖形式的调节。62 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究综述图2ACC中：突触后LTP和突触前LTPa，b前扣带皮层（ACC）中可记录两种形式的长时程增强（LTP）：突触后LTP和突触前LTP。NSF，N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性因子。在慢性疼痛模型中，除了突触后AMPAR的表达增加，突触后NMDA受体（NMDAR），特别是含有Glu2B亚基的突触后NMDA受体的表达也增加。腺苷酸环化酶1（AC1）对于谷氨酸释放的突触前增强和AMPAR和NMDAR的突触后强化都是必需的（图3）。63 综述小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究图3ACC中介导兴奋性传递上调的信号通路CaM钙调蛋白；cAMP环磷酸腺苷；CREBcAMP反应元件结合蛋白；FMRP智力低下蛋白（由Fmr1编码）；HCN超极化激活环核苷酸门控；L-VGCCL型电压门控钙通道；PKA蛋白激酶A；PKMζ蛋白激酶Mζ。除了突触传导发生变化之外，慢性疼痛状态下的ACC神经元的放电模式和固有电学特性都发生了长期变化。ACC中至少有三种类型的锥体细胞，并且可根据其动作电位的发放模式对其进行分类：RS（regular-spiking）细胞，IB（intrinsic-bursting）细胞和中间类型的细胞。在小鼠外周神经损伤1-2周之后，这三个细胞组的亚群分布和单个动作电位性质不受影响。然而，神经性疼痛动物的中间类型细胞初始放电频率更高。此外，在注射CFA1-3天后或神经损伤1-2周后，ACC中放电动作电位的时间精度降低。慢性疼痛不会引起ACC神经元放电的频率发生显著变化，但ACC中信息编码的时间精度在长时间段内都下降了。通常用遗传和药物处理的方法来研究ACC中突触可塑性因为外周损伤诱导而发生变化的分子机制。这其中很可能涉及cAMP信号传导通路。小鼠中AC1基因缺失消除或减缓了神经性疼痛，慢性炎症和慢性肌肉疼痛模型中的异常性疼痛反应。此64 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究综述外，外周损伤触发了GluA1亚基在PKA磷酸化位点Ser845处的磷酸化作用，并导致GluA1亚基的表达增加，AMPAR介导的兴奋性突触后电流增加。CREB在包括ACC的前脑神经元中的超表达导致神经病性和炎性疼痛的鼠科动物模型中LTP增强和行为伤害性反应增强。[67,68]急性疼痛中ACC瞬时超活化，而在慢性疼痛中，ACC持续性超活化。在突触上，暴露于瞬间热刺激时不会引起鼠科动物ACC中突触前LTP或突触后LTP发生[10,58]变化，而神经性损伤会影响LTP的两种形式。尽管可因此得出结论，ACC传输增强与慢性疼痛相关，与急性疼痛无关，但ACC中的LTP与疼痛处理之间的关系可能比这种简单解离要复杂得多。虽然急性伤害感受持续时间短，但它可以触发与恐惧记忆形成相关的持续性突触[32][32,94]变化，恐惧记忆是在啮齿类动物中被广泛研究的一种学习形式。杏仁核和ACC[44,45]中的突触可塑性是形成恐惧记忆的结构基础。因此，急性疼痛可以使ACC中的突触塑性机制编码生理相关信息，即使这些信息与慢性疼痛没有直接关系。慢性疼痛的某些形式可能与有害刺激的持续存在相关，例如与肿瘤生长相关的疼痛。但是目前还不清楚突触可塑性与此种形式的疼痛之间相关程度。疼痛通路中的LTP可能会在再巩固过程中发生反复更新，正如有助于空间记忆的海马通路。实际上，最近一项关于小鼠中辣椒素诱导的机械性异常性疼痛的研究表明，脊髓背角中发生了再巩固过程。在这里，第二次将辣椒素用于皮肤，同时鞘内注射NMDAR阻断剂或蛋白质合成，导致了疼痛记忆无法再巩固，并且异常性疼痛随[95,96]之消除。确定ACC中是否也会发生需要NMDAR依赖和蛋白质合成依赖的可塑性的相似再巩固过程会很有意义。如果是这样的话，可能解释一些阻断LTP诱导的[37,97]药物镇痛作用，例如GluN2B或AC1抑制剂。表在啮齿动物模型中，调节ACC中与疼痛相关可塑性的药物药物类型给药途径对急性疼痛的对慢性疼痛的对ACC中可塑性的影响效果效果前LTP后LTP加巴喷丁全身用药减缓减缓或无效果无数据无影响TRPV1全身用药减缓无效果无数据无影响抑制剂GluN2B拮局部ACC；无效果减缓无影响减弱抗药全身用药AC1抑制局部；ACC；无效果减缓减缓减弱65 综述小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究剂（NB001）全身用药PKMζ抑制局部；ACC无效果减缓无影响减弱剂HCN通道局部；ACC无效果减缓减缓无数据（lh通道）抑制剂确定ACC中突触可塑性对于疼痛的不同形式的作用并不简单。一种可能性是，LTP在ACC中的诱导对于疼痛刺激（包括恐惧记忆）的生理过程是必不可少的，而ACC中调节异常或过多的LTP可能导致了慢性疼痛状态。更精确定义ACC中LTP与疼痛反应的不同情感和时间成分之间的关系还需要进一步的研究工作。总结ACC参与了疼痛情感的调节和处理，ACC内的多重变化改变了疼痛处理的情感组分。在假定逃避/避免行为可证明动物对有害刺激的厌恶情绪的模型下，测量对有害刺激的逃避和/或避免行为，已被成功用于研究啮齿高阶疼痛处理的潜在神经解剖学和神经化学机制。众多实验结果均显示，ACC是一个疼痛处理的关键脑区。临床上可通过减少感觉输入及操作情感动机和认知因素来处理疼痛感觉。因此，深入理解介导疼痛刺激情感处理的神经基础，将有助于推进我们对疼痛处理的认知，从而减少临床条件中占据病痛极大重量的情感组分。参考文献1.SmithAK,O'HaraCL,StuckyCL.Mechanicalsensitizationofcutaneoussensoryfibersinthesparednerveinjurymousemodel.MolPain,2013,29(9):61.2.VonHehnCA,BaronR,WoolfCJ.Deconstructingtheneuropathicpainphenotypetorevealneuralmechanisms.Neuron,2012,73(4):638-652.3.LluchGirbésE,NijsJ,Torres-CuecoR,etal.Paintreatmentforpatientswithosteoarthritisandcentralsensitization.PhysTher,2013,93(6):842-851.4.ShackmanAJ,SalomonsTV,SlagterHA,etal.Theintegrationofnegativeaffect,pain,andcognitivecontrolinthecingulatecortex.NatRevNeurosci,2011,12(3):154-167.5.DavisKD,MoayediM.CentralmechanismsofpainrevealedthroughfunctionalandstructuralMRI.JNeuroimmunePhar,2013,8(3):518-534.66 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小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究中英文缩略词表中英文缩略词表缩写英文名称中文名称ACCanteriorcingulatecortex前扣带皮层ACSFartificialcerebrospinalfluid人工脑脊液APammoniumpersulfate过硫酸铵BisN,N'-MethylenaBisacrylamideN,N'-甲叉双丙烯酰胺cAMPadenosine-3',5'-cyclicmonophosphate3',5'-环腺苷酸CNScentralnervoussystem中枢神经系统CGRPcalcitoningene-relatedpeptide降钙素基因相关肽DRGdorsalrootganglia背根神经节d-cAMPdibutyryl-cyclicadenosinemonophosphate双丁酰环腺苷酸ERKextracellularsignaling-regulatedkinases细胞外调节蛋白激酶EPSCexcitatorypostsynapticcurrent兴奋性突触后电流EPSPexciatorypostsynapticpotential兴奋性突触后电位FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素GFAPgliafibrillaryacidicprotein胶质纤维酸性蛋白GAPDHglyceraldehydesphosphatedehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IL-1interleukin1beta白介素-1IL-6interleukin-6白介素-6IgGimmunoglobulin免疫球蛋白KDakilodalton千道尔顿LTPlong-termpotentiation长时程增强MCP-1monocytechemoattractantprotein单核细胞趋化蛋白mRNAmessengeribonucleicacid信使RNANMDAN-methyl-D-aspartateReceptorN-甲基-D-天门冬氨酸75 中英文缩略词表小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究NeuNneuronalnuclearantigen神经元特异性核蛋白NSnormalsaline生理盐水PApolyoxymethylene多聚甲醛PBphosphatebuffer磷酸缓冲液PEAPplaceescape/avoidanceparadigm位置逃避实验pERKphosphor-ERK磷酸化ERKPMSFphenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟PNSperipheralnerveoussystem外周神经系统PKAcAMP-dependentproteinkinaseA蛋白激酶APWTpawwithdrawalthreshold缩爪阈值PWLpawwithdrawallatency缩爪潜伏期Real-timePCRReal-timepolymerasechainreaction实时荧光定量聚合酶链式反应SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SNLspinalnerveligation脊神经结扎TBStris-bufferedsalineTris缓冲盐水TEMEDN’,N’,N,N-tetramethylethylenediamineN’,N’,N,N-四甲基乙二胺TNF-tumornecrosisfactoralpha肿瘤坏死因子Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷Tris·HCLtrishydrochlorideTris盐酸盐76 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究发表的论文和参加的会议攻读学位期间公开发表的论文1.ZhuX,LiuJ,GaoY,CaoS,ShenS.ATP-sensitivepotassiumchannelsalleviatepostoperativepainthroughJNK-dependentMCP-1expressioninspinalcord.IntJMolMed.2015May;35(5):1257-65.（SCI收录）（影响因子:2.348）2.ChenJJ,DaiL,ZhaoLX,ZhuX,CaoS,GaoYJ.Intrathecalcurcuminattenuatespainhypersensitivityanddecreasesspinalneuroinflammationinratmodelofmonoarthritis.SciRep.2015May19;5:10278.（SCI收录）（影响因子:5.228）3.朱翔戴林朱铭镝.依那西普缓解腰椎间盘突出模型大鼠的痛觉过敏并减少趋化因子CCL2和受体的表达.基础医学与临床,2015,35(8):1061-66.4.朱翔,曹苏,杨建平.吡那地尔对术后持续性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1释放的影响.东南大学学报医学版,2016,35(5):678-682.5.朱翔,曹苏,杨建平.右美托咪定对LPS诱导星形胶质细胞MCP-1分泌的影响.安徽医科大学学报医学版,2017,52(1):90-94.攻读学位期间参加会议江苏省第21次、22次麻醉年会（2016年5月，南京、2017年3月，苏州）江苏省麻醉科医疗质量控制中心2015年会（2016年3月，南通）第24次全国麻醉学术年会（2016年8月，广州）第16届世界麻醉医师大会(WCA2016)（2016年9月，中国香港）77 致谢小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究致谢2014年9月，我进入苏州大学，攻读专业型博士学位，师从杨建平教授，并实习于苏州大学附属第一医院。时光荏苒，岁月如梭，一晃三年的学习生涯即将结束，在毕业论文将要完成之际，回首三年的学习、工作经历，许多感慨涌上心头。漫步在美丽的校园中，春暖花开，繁花似锦，往事历历在目。这些年走过来，无论是在工作，学习，还是课题设计，实验完成，论文书写，修改等诸多方面，都有着很多的老师、同学、朋友的关怀和帮助，正是他们无私的奉献，我才能不断的前行，才有勇气去攻克一个又一个的难关，并最终坚定的走完这人生旅途中最宝贵的一段旅程。首先，我要衷心感谢我的恩师杨建平教授，读书期间，他身为苏州大学附属第一医院的院领导，本身工作十分繁忙，却能在政务工作中抽出时间，毫无保留的教授我们。导师全面扎实的基础知识，严谨的学术作风，高超的临床技能操作及专业的技术水平，让我们受益匪浅。更为重要的是，导师敬业的精神，泰而不骄、矜而不争的为人风范，深深的感染着我，从导师的身上，不仅仅学到的是专业的知识，而且学会许多做人的道理，处事的方式。导师的言传身教已经并将继续对学生的专业发展起极为重要的作用。还要一并感谢苏州大学附属第一医院麻醉科这个团队，衷心感谢科室主任嵇富海教授，虽然并不是您的亲传弟子，但是您一样的对我工作和学习上的悉心指导。感谢主持临床工作的成浩主任医师、主持重症监护的陈军主任医师，临床工作任务繁重，各位主任总是能不厌其烦的认真辅导我们，让我们能学到更专更广的专业知识。分担临床工作和科学教研的王丽娜老师、孟晓文老师两位老师为了我们求学默默地做了许许多多烦琐的事务，两位辛苦了！感谢麻醉科全体老师！虽然即将离开，但有幸能参与过这个团队，我深感骄傲！衷心感谢航海医学研究所高永静教授，姜保春、吴小波博士！实验过程中有幸得到你们的指点和帮助，实验室的专业知识和对待实验工作认真严谨的态度让我受益匪浅，在今后的工作学习中，我将会继续沿袭这种优良的工作方法和态度！衷心感谢苏州大学附属第一医院科教处于立华老师，从入学到毕业，你在各个方面关心，帮助我，为我的毕业提供有力的后援保障，让我能安心投入到工作和学习当中！78 小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究致谢衷心感谢我的实验伙伴们！没有你们的付出，没有你们的协作，也没有最后的成功！衷心感谢博士同学熊响清、魏磊、王春光等，三年的携手并进，三年的泪水和汗水，化作彼此间亲密无间的深厚友情，从今往后我们在事业上互相关心和帮助，在生活上更是永远的好朋友！最后，我要感谢我的家人，读书学习期间，他们付出了很多很多，我要对父母亲表示最诚挚的谢意，谢谢你们支持我完成学业！我要谢谢我的妻子和儿子，谢谢你们默默的支持着我！我们一家人一起加油努力，共创美好的明天！谨以此文献给所有关心支持我的亲人和朋友！朱翔2017年3月谨于苏州大学79 ＝一ＩｍＷｊ＾一苏州大学研究生院统．
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