《鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
Ｓ８５５３分类号：．授予学位单位代码：１０４３４密级：保密学号：２０１４１：２０２３２山東農業大學＇＇：．－．．．全日制硕士专业学位论文＇？．■＇乂鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅｎｏｍｉｃＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ－ＤｕｃｋＤｅｒｉｖｅｄＮｅｗＧｏｏｓｅＰａｒｖｏｖｉｒｔｕｓ月４年？－．究生：郑肖强学位类别：兽医硕士专业：兽医研究方向：禽病学学院：动物科技学院指导教师：刁有祥教授＇＇＇…■＇，■．：：．…２０１６年６月６日＇－＇入 。＂．＇■？ｔ？，Ｖ’■－，，Ｕ一．＊ｆ？、：论文提交日期．２８：２０１６．０４－’？－？－．７，２０１６．０６．０４论文答辩日期：学位授予日期：２０１６．０６．■＊－，学位类别：兽医硕士＇■－＊＊＂乂ｒ答辩委员会主席：吴家强ｉ？Ｌ－． 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果＾对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：爽氙來导师签名：华日期：＾７ 符号说明缩写英文名称中文名称Ampampicillin氨苄青霉素bpbasepair碱基对℃centigrade摄氏度cDNAcomplementaryDNA互补DNAcmcentimeter厘米dday天DNADeoxyribonucleotideacid脱氧核糖核酸DIGDigoxigenin地高辛EDTAethylenediamineteraaceticacid乙二胺四乙酸EID50Meaninfectivedose半数感染量ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验ggram克GPVGooseParvovirus鹅细小病毒hhour小时ITRInvertedterminalrepeats反向末端重复序列LLiter升LBluria-bertinimedium普通琼脂培养基LALatexagglutinationassay乳胶凝集试验LAMPLoop-mediatedisothermal环介导等温扩增反应amplificationmgmilligram毫克minminute分钟mLMilliliter毫升MDPVMuscovyduckparvovirus番鸭细小病毒 NCnitrocellulose硝酸纤维素膜N-GPVNewGooseParvovirus新型鹅细小病毒nmnanometer纳米ORFopenreadingframe开放阅读框PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应VNvirus-neutralizationtest血清中和试验 目录中文摘要.....................................................................................................................................IABSTRACT...........................................................................................................................III1前言.........................................................................................................................................11.1水禽细小病毒感染概述......................................................................................................11.1.1雏番鸭细小病毒感染.......................................................................................................11.1.2鹅细小病毒感染...............................................................................................................31.1.3鸭短喙侏儒综合征...........................................................................................................51.2水禽细小病毒生物学特征..................................................................................................51.2.1水禽细小病毒的分类与结构...........................................................................................51.2.2水禽细小病毒的理化性质...............................................................................................51.2.3水禽细小病毒的培养特性...............................................................................................61.3水禽细小病毒的分子生物学特征......................................................................................61.4水禽细小病毒诊断技术......................................................................................................81.4.1血清学诊断技术...............................................................................................................81.4.2分子生物学检测技术.....................................................................................................101.5水禽细小病毒病的防治....................................................................................................121.5.1水禽细小病毒病的预防.................................................................................................121.5.2水禽细小病毒病的治疗.................................................................................................131.6地高辛标记核酸探针技术................................................................................................131.6.1地高辛标记核酸探针技术简介.....................................................................................131.6.2地高辛标记核酸探针技术的应用.................................................................................141.7本试验研究的目的和意义................................................................................................142材料与方法...........................................................................................................................142.1试验材料............................................................................................................................142.1.1病料采集.........................................................................................................................142.1.2鸭胚、菌株和毒株.........................................................................................................142.1.3试验动物.........................................................................................................................142.1.4主要试剂.........................................................................................................................15 2.1.5主要仪器.........................................................................................................................152.1.6主要试剂配制.................................................................................................................152.1.7培养基及其它试剂.........................................................................................................162.2试验方法............................................................................................................................172.2.1鸭短喙侏儒综合征病原的分离鉴定.............................................................................172.2.2鸭源新型鹅细小病毒全基因组序列测定分析............................................................222.2.3鸭源新型鹅细小病毒地高辛标记核酸探针检测方法的建立.....................................233结果.......................................................................................................................................253.1鸭短喙侏儒综合征病原的分离鉴定结果........................................................................253.1.1临床症状.........................................................................................................................253.1.2剖检变化.........................................................................................................................263.1.3病理组织学变化.............................................................................................................263.1.4细菌分离.........................................................................................................................273.1.5病原分离.........................................................................................................................273.1.6PCR扩增结果................................................................................................................273.1.7EID50测定结果...............................................................................................................273.1.8血凝试验结果.................................................................................................................273.1.9动物回归试验.................................................................................................................283.2鸭源新型鹅细小病毒全基因组序列测定分析................................................................283.2.1全序扩增结果.................................................................................................................283.2.2分离株全基因组序列拼接及特征分析.........................................................................293.2.3全基因组遗传进化分析.................................................................................................293.2.4非结构蛋白NS2遗传进化分析....................................................................................313.2.5结构蛋白VP3遗传进化分析........................................................................................323.2.6末端重复序列分析.........................................................................................................343.2.7潜在糖基化位点预测.....................................................................................................353.3地高辛标记核酸探针检测方法的建立............................................................................363.3.1PCR扩增结果................................................................................................................363.3.2PCR产物克隆与测序.....................................................................................................363.3.3敏感性试验结果.............................................................................................................36 3.3.4特异性试验结果.............................................................................................................363.3.5探针临床应用及与病毒分离结果比较.........................................................................374讨论.......................................................................................................................................374.1鸭短喙侏儒综合征病原的分离鉴定................................................................................374.2鸭源新型鹅细小病毒全基因组序列分析.......................................................................384.3鸭源新型鹅细小病毒地高辛标记核酸探针的制备........................................................405结论.......................................................................................................................................41参考文献..................................................................................................................................42致谢..........................................................................................................................................50攻读硕士期间论文发表情况..................................................................................................51 山东农业大学全日制硕士专业学位论文中文摘要2015年年初在我国山东、安徽、江苏、河南等地的樱桃谷肉鸭养殖地区出现了一种以患鸭短喙、舌外伸和生长发育受阻为主要特征的疾病，根据该病发病特征将其称为“鸭短喙侏儒综合征”。该病自出现以来发病率不断升高，因其影响肉鸭产品的后期加工，因而对肉鸭养殖户和养殖企业造成了巨大的经济损失。本研究对引起该病的病原进行了分离鉴定，并对一株分离株进行了全基因组序列的测定和分析，同时建立了地高辛标记核酸探针检测方法，为该病的流行病学调查提供了理论依据。为确认引起该病的病原，本研究从不同地区发病鸭场采集患病鸭的肝脏组织，分别进行了细菌的分离鉴定、常规PCR检测，结果显示，仅少数组织分离出大肠杆菌。样品PCR检测结果显示所有样品均呈GPV阳性。肝脏组织研磨处理后，经绒毛尿囊膜途径分别接种鸭胚和鹅胚，观察见病毒能引起鸭胚尿囊膜增厚混浊和胚体的出血，但对鹅胚无明显致病性。收取鸭胚尿囊液，鉴定结果显示尿囊液呈GPV阳性。选取分离自山东聊城某鸭场的一株病毒命名为SDLC01株，血凝血凝抑制试验结果显示该病毒对鸡、鸭、鹅三种禽类红细胞无凝集性，动物回归试验表明SDLC01株接种肉鸭后能导致试验鸭出现喙短，舌外伸和生长发育受阻等特征性症状。初步确认引起“鸭短喙侏儒综合征”的病原为鹅细小病毒。根据已知小鹅瘟全基因组序列设计并合成了5对特异性引物，覆盖整个基因组，利用PCR方法对SDLC01株的全基因组序列进行扩增，得到了SDLC01株的全基因组序列。分析表明，SDLC01株全长5006bp，基因组两侧为ITR，长度为366bp，中间部分含左右两个ORF，分别编码NS蛋白（NS1和NS2）和VP蛋白（VP1、VP2和VP3），NS1和NS2长度分别为1884bp和1356bp，VP1、VP2和VP3长度分别为2199bp，1764bp和1605bp。全基因组序列分析显示SDLC01株与GPV同源性为92.3%~97.2%，与MDPV同源性为81.4%~85.5%，该株病毒在进化上与欧洲源GPV亲缘关系较近，可能具有同一祖先。分离株VP3基因与GPV同源性为93.1%~98.5%，NS2基因与GPV同源性为93.1%~98.2%，同源性均较高。分离株与GPV致病株、疫苗株和MDPV致病株ITR区域的比较显示SDLC01分离株ITR区域存在明显缺失现象。用在线软件对分离株进行糖基化位点的预测，结果显示SDLC01分离株共有6个潜在糖基化位点，对病毒感染宿主范围和病毒毒力或有影响。根据SDLC01株VP3基因核苷酸序列设计了一段长度为301bp的特异性引物，通过I 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析PCR扩增，目的片段回收纯化，地高辛标记，建立了鸭源新型鹅细小病毒地高辛标记核酸探针检测方法。特异性试验结果表明探针只与鸭源新型鹅细小病毒发生特异性反应，与其它常见鸭源病毒均无杂交反应。敏感性试验结果显示探针的最低检测量为25pg，用该探针对不同地区采集的患鸭病料进行检测，与病毒分离鉴定结果相比相符率可达98%，可应用于临床检测。关键词：鸭源新型鹅细小病毒；分离鉴定；核酸探针；全基因组II 山东农业大学全日制硕士专业学位论文ABSTRACTCalledasshortbeakanddwarfismsyndrome,adiseasemainlycharacterizedasshortbeakandinhibitionofthestickingoutoftonguesaswellasthegrowthanddevelopmentofducksappearedinbreedingareasofthecherryvalleyduckinShandong,Anhui,JiangsuandHenaninearly2015.Theincidenceofthediseasehasbeenincreasingsincetheemergenceofthedisease.Duetoitsinfluenceonmeat-typeduckproducts,hugeeconomiclosseshavebeencausedonduckbreedinghouseholdsandenterprises.Thestudyisolatedandidentifiedthepathogenofthediseaseandmeasuredandanalyzedthewholegenomesequenceofoneisolatedstrain.Atthesametime,thedetectionmethodofthedigoxinlabelednucleicacidprobewasestablishedtoprovideatheoreticalbasisfortheepidemiologicalinvestigationofthedisease.Inordertoidentifythepathogencausingthedisease,diseasedducklivertissueswerecollectedfromdifferentduckbreedingareasinthepaperforrespectiveisolationandidentificationaswellastheconventionalPCRdetectionofthebacteria.TheresultsshowedthatEscherichiacoliwasisolatedfromafewtissues.ThePCRdetectionresultsshowedthatallthesampleswereGPVpositive.Afterthegrindingoflivertissues,theduckembryoandgooseembryowereinoculatedthroughthechorioallantoicmembranetoobservethethickeningandopacificationofthechorioallantoicmembraneandembryohemorrhagecausedbyknownviruses,whichhoweverhadnoobviouspathogenicityongooseembryo.TheallantoicfluidoftheduckembryowascollectedandtheidentificationresultshowedthattheallantoicfluidwasGPVpositive.AvirusnamedSDLC01strainisolatedfromaduckfarminLiaocheng,Shandongwasselected.Theresultsofthecoagulationinhibitiontestshowedthatthevirushadnoagglutinationonredbloodcellsofthreekindsofpoultryincludingchicken,ducksandgeese.TheanimalregressiontestshowedthattheSDLC01straincouldcauseshortbeakandinhibitionofthestickingoutoftongueaswellasgrowthanddevelopmentofducksaftertheinoculationinmeat-typeducks.Thepathogenyofshortbeakanddwarfismsyndromewasconfirmedtobetheduck-derivednewgooseparvovirus.Accordingtotheknownwholegenomesequenceofgoslingplague,fivepairsofspecificprimersweredesignedandsynthesizedtocoverthewholegenome.ThePCRmethodwasIII 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析usedtoamplifyandobtainthewholegenomesequenceoftheSDLC01strain.TheanalysisshowedthatthefulllengthoftheSDLC01strainwas5006bpandthetwosidesofthegenomewereITRwiththelengthof366bp.ThemiddlepartcontainstheleftandrightORFstorespectivelyencodeNSproteins(NS1andNS2)andVPproteins(VP1,VP2andVP3).ThelengthsofNS1andNS2wererespectively1884bpand1356bp.AndthelengthsofVP1,VP2andVP3wererespectively2199bp,1764bpand1605bp.TheanalysisofwholegenomesequenceshowedthattheSDLC01strainhadahomologyof92.3%-97.2%withGPV,and81.4%-85.5%withMDPV.ThestrainofvirushasaclosergeneticrelationshipwithEurope-sourceGPVinevolutionandmayhavethesameancestor.ThehomologyofVP3geneoftheisolatedstrainbetweenGPVwas93.1%-98.5%andthehomologyofNS2genewithGPVwas93.1%-98.2%,whichwereallhigher.ComparedwiththeITRregionsoftheGPVpathogenicstrain,vaccinestrainandMDPVpathogenicstrain,theisolatedstrainshowedamarkedlossintheITRregionoftheisolatedstrain.Theonlinesoftwarewasusedtopredicttheglycosylationsitesoftheisolatedstrain.Theresultsshowedthattherewere6potentialglycosylationsitesintheisolatedstrainofSDLC01,whichmayhaveaneffectonthehostrangeandvirulenceofthevirus.Aspecificprimerwithalengthof301bpwasdesignedaccordingtothenucleotidesequenceoftheVP3geneofSDLC01strain.ThroughthePCRamplification,thetargetfragmentwasrecovered,purifiedandlabeledwithdigoxintoestablishthedetectionmethodofthedigoxinlabelednucleicacidprobeoftheduck-derivednewgooseparvovirus.Thespecificitytestresultsshowedthattheprobeonlyhadaspecificreactionwiththeduck-derivednewgooseparvovirusbuthadnohybridizationreactionwithothercommonduck-deriveviruses.Thesensitivitytestresultsshowedthattheminimumdetectionamountoftheprobewas25pg.Theprobewasusedtodetectthediseasedduckscollectedfromdifferentareas,whichhadacoincidencerateof98%comparedwiththeresultsofthevirusisolationandidentification.Keywords:Duck-DerivedNewGooseParvovirus;IsolationandIdentification;Nucleicacidprobe;CompleteGenomicIV 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1前言1.1水禽细小病毒感染概述水禽细小病毒在我国主要感染鹅和番鸭，根据宿主不同分为鹅细小病毒（GooseParvovirus,GPV）和番鸭细小病毒（Muscovyduckingparvovirosis,MDPV）。鹅细小病毒感染可引起仔鹅和雏番鸭较高的感染率和死亡率，以肠道卡他性或纤维素性坏死为特征性病变，又称为小鹅瘟。雏番鸭细小病毒感染与鹅细小病毒感染相似，感染率和死亡率非常高，主要感染3周龄以内的雏番鸭，因此又称“三周病”。2015年年初在我国安徽、江苏、山东、河南等地区樱桃谷肉鸭群中发生了以喙短、舌外伸和生长发育受阻为特征的疾病，本实验室研究确认该病为鸭源新型鹅细小病毒感染导致，这在我国大陆尚属首次报道。该病在法国、波兰和我国台湾地区均有发生，其感染宿主包括半番鸭、绿头鸭、番鸭、白改鸭以及褐莱鸭(Luetal,1993;Brownetal,1995;Tatar-Kisetal,2004)。流行病学调查结果显示，该病发病范围已由起初疫源地逐渐向周边地区扩大，对肉鸭养殖业的危害也愈加严重。1.1.1雏番鸭细小病毒感染雏番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒（Muscovyduckingparvovirosis,MDPV）引起的雏番鸭以腹泻、喘气和软脚为主要症状的急性败血型传染病，因其主要侵害3周龄内雏番鸭，故又称“三周病”。该病传染性极强，发病率和死亡率高，对我国番鸭养殖业影响极大。该病于1985年在我国福建省莆田、仙游、安溪、福州、福清、长乐和闽侯等地区的鸭场和孵化场发生，造成雏番鸭的大量死亡，随后在我国南方多个省区的番鸭养殖场内发生，造成严重的经济损失。1988年，程由铨等首次分离该病毒并确认该病毒为雏番鸭细小病毒(程由铨等,1993;)。1.1.1.1流行病学雏番鸭细小病毒感染只发生于雏番鸭，对麻鸭、半番鸭、北京鸭、樱桃谷鸭、鹅和鸡无致病性，人工接毒亦不出现临床症状。该病的发病率和死亡率与日龄密切相关，日龄越小，发病率和死亡率越高，最早发病日龄可见于4~5日龄，10日龄达到发病高峰，发病率随日龄增大逐渐降低。该病主要侵害3周龄以内的雏番鸭，发病率为27%~62%，病死率22%~43%，30日龄番鸭也可感染，但发病率和死亡率较低，患鸭痊愈后往往成为僵鸭。1 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析本病既能水平传播也能垂直传播。患鸭可通过粪便排出大量病毒，排出的粪便污染饲料、饮水、养殖工具和饲养人员，在与易感番鸭接触后水平传播该病。垂直传播是指患鸭的排泄物污染种蛋蛋壳，刚出壳雏鸭接触蛋壳可感染病毒，引起该病爆发。(王欣,2008;周天星,2013)。雏番鸭细小病毒病的发生没有明显的季节性，但由于冬春季节育雏室内空气流通不畅，空气中氨气和二氧化碳浓度较高，导致发病率和死亡率较高。夏季通风较好，发病率和死亡率明显降低(阮二垒等,2009;粟硕等,2013)。1.1.1.2临床症状本病潜伏期为4~9d，病程一般为2~7d，病程的长短与发病的日龄密切相关。根据病程的长短可分为最急性型、急性型和亚急性型。最急性型主要发生于6日龄以内的雏番鸭，病程短暂，仅几个小时，患鸭常无明显前驱症状而突然倒地死亡，患鸭羽毛蓬乱，喙短，濒死时双脚呈游泳状，头颈向一侧弯曲。最急性型发病率较低，约为4%~6%。急性型主要见于7~14日龄的雏番鸭。患鸭主要表现为精神萎顿，羽毛蓬松，两翅下垂，尾端向下弯曲，双脚无力不愿走动，食欲减退，不同程度的腹泻，排灰白色或淡绿色稀粪，粪便粘附于肛门周围。个别患鸭流泪。呼吸困难，甩头、流鼻涕，喙端发绀，后期常蹲伏，张口呼吸。病程一般为2~4d，濒死前两脚麻痹，倒地，最后衰竭死亡。亚急性型多发生于日龄较大的雏番鸭，主要表现为精神沉郁，喜蹲伏，双脚无力，行走迟缓，排黄绿色或灰白色稀粪，粪便易粘附于肛门周围。病程多为5~7d，死亡率低。大部分病愈鸭颈部、尾部脱毛，喙变短，生长发育受阻，成为僵鸭(胡奇林等,1993;査湖生,2013;何兰玲等,2014)。1.1.1.3剖检变化最急性型：发病急、病程短，病变并不明显，仅肠道出现急性卡他性炎症，肠粘膜出血，内脏无明显病变。急性型：病变较为典型，大部分病死鸭肛门周围有稀粪粘附，泄殖腔扩张外翻。心脏变圆，心壁松弛，尤其以左心室变化最为明显。肝脏轻微肿大，胆囊充盈。肾脏和脾脏轻微肿大，胰腺肿大，表面散布针尖大灰白色病灶。肠道呈卡他性炎症或粘膜有不同程度的充血和点状出血，尤其以十二指肠和直肠后段粘膜表现最为明显，个别病例盲肠粘膜也会出现点状出血。(程由铨,1995;娄高明等,1999)1.1.1.4组织学变化2 山东农业大学全日制硕士专业学位论文肝小叶间血管扩张、充血，肝细胞发生局灶性的脂肪变性和颗粒变性，淋巴细胞和单核细胞浸润。心肌束间有少许红细胞渗出，伴有炎性细胞浸润，血管扩张充血，心肌纤维结构疏松，有不同程度的颗粒样变化。大部分肺细末支气管增宽、充血及淤血，数量减少，少数肺细末支气管扩张。肾小管上皮细胞变性，管腔红染，分泌物蓄积。胰腺呈散在性腺泡坏死，在坏死灶区有异嗜性白细胞、颗粒细胞和淋巴细胞浸润。脑实质血管扩张充血，部分脑血管周围间隙扩大，脑神经细胞轻度变性，胶质细胞轻度增生。局部肠粘膜脱落，固有层和肠腺间有大量异嗜性细胞、颗粒细胞和少量淋巴细胞浸润。法氏囊滤泡中淋巴细胞减少，个别滤泡淋巴细胞消失而被结缔组织所代替。脾窦充血，淋巴细胞减少，局部淋巴细胞变性。(陈少莺等,2001;牛艺儒等,2006)1.1.2鹅细小病毒感染鹅细小病毒病（GooseParvovirus,GPV）是初生雏鹅的一种急性或亚急性败血性传染病，又称为小鹅瘟或Derzsy’s病(Takeharaetal,1995;李琳等,2008)。病鹅主要表现为精神沉郁、食欲废绝、严重下痢，个别出现神经症状。病变主要表现为肠粘膜坏死、脱落，在肠道内形成栓子，阻塞肠腔。1956年我国专家方定一首先在扬州报道该病，将其命名为“小鹅瘟”(方定一,1962)，并用鹅胚首次分离了病毒。1965年以后，德国、匈牙利、前苏联、荷兰、意大利、英国、以色列、法国、南斯拉夫、越南等国家(李福伟等,2006)相继报道该病的发生。1.1.2.1流行病学鹅细小病毒感染主要发生在3周龄以内的雏鹅，发病率和死亡率可达90%~100%，最早发病日龄为2~5d，死亡率高达95%以上；6~10日龄雏鹅死亡率为70%~90%；11~15日龄死亡率为50%~70%；16~20日龄死亡率为30%~50%；21~30日龄死亡率为10%~30%；30日龄以上死亡率为10%左右。(相伟等,2010)目前已见报道的小鹅瘟最大感染日龄为50日龄。病鹅和带毒鹅是该病主要的传染源，患鹅排出的粪便当中含有大量的病毒。该病主要通过消化道和呼吸道进行传播。鹅细小病毒感染死亡率与患鹅的日龄密切相关，患鹅日龄越大，发病率和死亡率就越低，反之越高；同时与母鹅当年的免疫状况相关，如果母鹅的免疫力强，发病率和死亡率则低。鹅细小病毒对各种类型的鹅有特异性致病作用，而对鸡、鸭、鸽子、鹌鹑等禽类和哺乳动物均无致病作用(张国红,2003;相伟等,2010)，万春和等(ChunHeetal,2016)在鸿雁身上分离到了鹅细小病毒，因此鸿雁可作为该病的潜在宿主传播该病。3 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析除呼吸道和消化道传播该病外，该病也可经由种蛋和孵化器发生传播，种蛋被病毒污染后进入孵化器，将孵化器污染，导致下一批种蛋发生污染。小鹅瘟每隔数年会出现一次大范围流行，大流行之后，存活下来的鹅群因为痊愈或感染未发病而获得免疫力，由其种蛋孵出的雏鹅体内含有较高的母源抗体，从而使雏鹅获得了被动免疫，能够抵挡病毒的侵染，而母源抗体可以在雏鹅体内维持较长时间，因此该病的流行呈现周期性。1.1.2.2临床症状该病潜伏期一般3~5d，根据病程经过可以分为最急性、急性和亚急性3种。病鹅精神沉郁、食欲废绝、严重下痢，出现神经症状。排黄白色或黄绿色水样混有气泡的稀粪，多数病鹅在发病后12~48h内死亡。最急性型：多发生于7日龄以内的雏鹅，发病突然，传播迅速，往往没有前驱症状而突然死亡。雏鹅发病率可达100%，病死率高达95%以上，患鹅精神沉郁，数小时内出现衰弱，倒地两腿划动并死亡，或在昏睡中衰竭死亡。急性型：多发生于1~2周龄的雏鹅、食欲减退或废绝，病鹅虽随群采食，但采食后不吞咽，行动迟缓、无力，站立不稳，喜蹲卧，排黄白色或黄绿色带气泡的稀粪。张口呼吸，口鼻有棕色或绿褐色浆液性分泌物流出，喙端发绀，蹼变暗，患鹅有脱水现象。死亡前出现麻痹或抽搐现象。亚急性型：多发生于15日龄以上雏鹅，病程2~5d，症状较轻，以食欲不振和下痢为主，病程3~7d或更长。(欧启贵,2007;周萌等,2012;金文杰等,2014)1.1.2.3剖检变化剖检病变主要表现为患鹅肝脏肿大，呈深紫红色或黄红色，质脆易碎。心肌颜色变淡，胆囊充盈，脾脏和胰腺充血，偶见灰白色坏死点。小肠发生急性卡他性纤维素性坏死性肠炎，中下段整片肠黏膜坏死脱落，与凝固的纤维素性渗出物形成栓子，阻塞肠腔。剖检时可见靠近卵黄与回盲部的肠段，外观极度膨大，质地坚实，状如香肠，剖开后可见淡灰色或淡黄色的栓子将肠管全部堵塞，栓子的中心为深褐色干燥的肠内容物。个别病例在小肠内形成扁平长带状的纤维素性凝固物。临床上部分患鹅并不形成典型的凝固栓子，肠道亦不膨大坚实，肠腔中充满粘稠的内容物，肠粘膜充血发红，表现急性卡他性肠炎的变化。(刘文波等,2001;王欣,2008;甄辉欣,2014)1.1.2.4组织学变化心肌纤维有不同程度的颗粒变性和脂肪变性。肌纤维断裂，排列散乱，肌间血管充4 山东农业大学全日制硕士专业学位论文血并有小出血区，肌纤维间有淋巴细胞和单核细胞浸润。多数病例心内膜下心肌浅层显示局部粘液性水肿，肌纤维消失或萎缩断裂。肝细胞严重颗粒变性和不同程度的脂肪变性，有时为水泡变性。少数病例肝实质中有针头大至粟粒大的坏死灶，并有淋巴细胞和单核细胞浸润。肾小球充血肿胀，内皮增生，肾小管上皮细胞颗粒变性，肾实质中有小坏死灶，间质内炎性细胞浸润。肠道粘膜组织结构被破坏，固有层中有多量淋巴细胞、单核细胞及少数嗜中性白细胞浸润。肠壁平滑肌纤维发生实质变性和空泡变性以及蜡样坏死。(朱堃熹等,1980;孙明辉,2014)1.1.3鸭短喙侏儒综合征鸭源新型鹅细小病毒病是2015年年初发生在我国安徽、江苏、山东、河南等地区肉鸭群中的新发传染病，因其导致患鸭喙变短，生长发育不良，所称其为“鸭短喙侏儒综合征”。2015年陈浩等(陈浩等,2015)首先报道了该病在大陆的发生，对其进行了分离鉴定，确认该病病原为鸭源新型鹅细小病毒。1.2水禽细小病毒生物学特征1.2.1水禽细小病毒的分类与结构水禽细小病毒主要包括鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）以及鸭源新型鹅细小病毒（N-GPV），它们在分类地位上属于细小病毒科成员，2004年以前一般认为它们为细小病毒属成员。1995年匈牙利学者Zadori(Zadorietal,1995)发现GPV和MDPV与依赖病毒的核酸同源性远高于自主病毒，随后很多专家建议将GPV和MDPV划入依赖病毒属，直到2004年GPV和MDPV被正式划归为依赖病毒属(Tsaietal,2004)。水禽细小病毒成员均为单股线状DNA病毒，病毒粒子呈球形或六角形，无囊膜，电镜下呈晶格状排列，有带核酸结构的完整病毒粒子形态和缺少核酸结构以空壳形态存在的不完整病毒粒子形态两种形式存在，呈圆形等轴二十面体对称，长度约为5.1kb，病毒直径为20~25nm(陈宏远等,2003;朱海侠等,2011)。1.2.2水禽细小病毒的理化性质水禽细小病毒对环境抵抗力较强，病毒对乙醚、氯仿、胰蛋白酶等均不敏感，酸和热处理对其毒力影响不大。但MDPV对紫外线较为敏感(刘红玉,2013)。鹅细小病毒和番鸭细小病毒对多种哺乳类及鸟类动物的红细胞均无血凝性，但鹅细小病毒能够凝集黄牛精子(Pelegetal,1974)，并能够被抗小鹅瘟病毒血清所抑制。5 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析1.2.3水禽细小病毒的培养特性鹅细小病毒能在鹅胚、番鸭胚、鹅胚成纤维细胞（GEF）、番鸭胚成纤维细胞（MDEF）中增殖并形成细胞病变，在鸡胚和鸡胚成纤维细胞（CEF）以及其他类型的细胞中均不增殖，且随着传代次数增加，细胞病变会越来越明显。用鹅胚分离病毒，一般在接种后5~7d后死亡，且病毒对雏鹅致病力减弱，死亡鹅胚绒毛尿囊膜局部水肿增厚，胚体皮肤、肝脏及心脏出血，心肌和肝脏变性，随着在鹅胚中传代次数增多，鹅胚死亡时间稳定在3~4d(方定一等,1981;王学娟等,2010;刘兵,2012)。番鸭细小病毒可以在番鸭胚、鹅胚、麻鸭胚中增殖并引起胚体病变，但不能在鸡胚中增殖。胚体病变主要表现为绒毛尿囊膜增厚，胚胎充血，且胚体头、颈、背、胸、翅和趾部等出现大小不一的出血点，接毒后3~7d可引起胚体死亡。病毒可在适应的胚体制备的成纤维细胞上以及番鸭胚肾细胞（MDEK）上增殖并引起细胞病变，而不能在鸡胚成纤维细胞（CEF）、猪肾传代细胞（PK15）、地鼠肾传代细胞（BHK21）和猴肾传代细胞（Vero）上增殖(林世棠等,1991;叶伟成,2000;阮二垒等,2011)。1.3水禽细小病毒的分子生物学特征鹅细小病毒（GPV）和雏番鸭细小病毒（MDPV）基因组长约5kb，均为线性、单链DNA病毒，含有正链DNA病毒粒子和负链DNA病毒粒子两种病毒粒子，两种粒子数目相当，各占50%。正负链病毒DNA分子两端都含有末端回文结构，这是单股DNA分子容易发生退火的主要原因。在提取病毒核酸的过程中，两种极性的链很容易发生退火形成互补的双链DNA分子(LeGall-ReculeandJestin,1994;Zadorietal.,1994)。纯化的病毒DNA可以作为模板在体外自动引发复制,形成双链DNA。酶切鉴定发现GPV和MDPV的酶切位点差异较大，但杂交试验却表明二者具有很高的同源性(Zadorietal,1994)。鹅细小病毒（GPV）和雏番鸭细小病毒（MDPV）基因组两端均为末端重复序列（Invertedterminalrepeats,ITR），且ITR的大小和形状与人细小病毒B19非常相似(Zadorietal,1995)。鹅细小病毒和雏番鸭细小病毒ITR分别为444bp和457bp，是病毒增殖的起始位点，在病毒的复制增殖过程中起重要作用，ITR同时可以提供信号引导病毒核酸及结构蛋白进行病毒颗粒的组合。鹅细小病毒ITR头部407bp和雏番鸭细小病毒ITR头部457bp均可折叠形成“U”形双链发卡结构，发卡结构中分别含有181bp和186bp的无错配“茎”部和一个分别为44bp和45bp的“泡”区，外形类似“箭”状，在箭头处有一6 山东农业大学全日制硕士专业学位论文个SphⅠ限制性内切酶的酶切位点，形成二分对称中心(朱海侠等,2011)。鹅细小病毒和雏番鸭细小病毒的ITR中均含有大量4~10bp的小核苷酸重复序列和许多短的重复序列(Vihinen-Rantaetal,2002)，还含有Y-盒、E-盒、GC-盒及ATF/CREB、C-FOS等许多结构域，这些短重复序列和结构域与已知的转录因子的识别序列相吻合，表明ITR在病毒基因组转录和复制调节过程中起重要作用(BristerandMuzyczka,1999)。GPV两端ITR中均含有末端解离位点，在病毒的复制过程中NS1以ATP依赖方式在解离位点处切割DNA的复制起始位点。同时GPV的ITR与其他的细小病毒相同，可作为复制的起始位点，并且能为包装提供顺式信号(Kajigayaetal,1991;Salikietal,1992)。GPV和MDPV基因组的中间部分为编码区，包含左右两个开放阅读框（Openreadframe,ORF），两个开放阅读框间距18bp，左侧开放阅读框编码非结构蛋白NS，包括NS1和NS2，它们拥有相同的终止密码子。右侧开放阅读框编码结构蛋白VP，包括VP1、VP2和VP3三种，三种结构蛋白分别有不同的起始密码子，VP2的起始密码子为不典型的ACG，但它们共用同一个终止密码子，其中VP1片段最长，包含有VP2和VP3所有的核酸序列。通过TATA盒寻找，发现鹅细小病毒和雏番鸭细小病毒基因组中可能含有3个启动子，分别为P9、P19和P41，它们分别位于NS1、NS2和VP1基因的起始密码子之前，分别启动NS1、NS2和VP1的转录。GPV的P41启动子为一个非典型的“TTTAA”结构，它的位点与AAV2的P40位点相类同，可能是有功能性的启动子。另外，在GPV和MDPV的RORF第一个ATG下游2732bp和2743bp处分别有一个TATA盒样单元，它是否为功能性启动子目前尚不清楚。GPV和MDPV均有两种非结构蛋白NS1和NS2，主要参与调节病毒DNA的转录与复制，同时能够对宿主细胞产生毒性作用。NS1蛋白主要参与病毒对细胞的毒性作用、病毒的复制及基因表达，同时具有许多生物化学功能，如ATP结合和切割活性、ATPase活性、解旋酶活性等(Legrandetal,1992;Pujoletal,1997)。有研究表明NS2蛋白与病毒DNA和蛋白质的有效合成以及病毒的增殖有关(Flotteetal,1993)。NS2蛋白与NS1蛋白之间具有相互协同作用，它本身并没有细胞毒性作用，但它却能够促进NS1蛋白对细胞的毒性作用(Pujoletal,1997;Smithetal,1999;BornholdtandPrasad,2008)。Comore等(Cotmoreetal,1997)研究发现缺失NS2基因的病毒，在病毒感染初期衣壳蛋白虽能正常合成，但病毒粒子的装配受到影响，最终会影响病毒衣壳蛋白的合成。GPV和MDPV有VP1、VP2和VP3三种结构蛋白，其中VP1基因最长，它包含7 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析VP2和VP3的所有基因序列，同时VP2又包含了VP3的所有序列(Vihinen-Rantaetal,2002)，它们有相同的羧基端。VP3蛋白是GPV和MDPV主要的结构蛋白，大约占总蛋白含量的80%，它含有细小病毒主要的抗原决定簇，能够诱导机体产生保护性中和抗体，是重要的免疫保护性抗原，因此VP3蛋白是目前研究较多也较为透彻的蛋白。VP2蛋白具有免疫原性，是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白，可以作为制备基因工程疫苗的候选保护性抗原(LeGall-Reculeetal,1996)。VP1蛋白的功能现在还未确定，但Tullis等(Tullisetal,1993)通过对小鼠细小病毒（MVM）VP1蛋白的研究发现，缺少VP1的病毒粒子与野生型病毒相比可以更好地结合细胞，但是不能有效感染细胞，因此猜测VP1可能与宿主细胞的特殊受体相作用。1.4水禽细小病毒诊断技术1.4.1血清学诊断技术1.4.1.1琼脂扩散（AGP）试验琼脂扩散试验是利用可溶性抗原与抗体在半固体琼脂中发生扩散，在合适比例处发生免疫沉淀反应，形成较大的颗粒沉淀不再扩散，进而出现一条白色的沉淀线。AGP可以对未知的抗原或抗体进行定性和定量检测，但琼脂扩散试验敏感性较低，且容易发生交叉反应，因此临床多用于抗体的检测。秦爱建等(秦爱建等,1993)利用抗小鹅瘟病毒酶标单克隆抗体建立了免疫酶琼脂扩散试验，该方法的灵敏度是常规琼脂扩散试验的256倍，克服了常规琼脂扩散试验敏感性不高的问题，可直接检出尿囊液和病料中的小鹅瘟病毒，提高了琼扩试验在小鹅瘟的诊断和抗体水平检测中的应用。何海蓉等(何海蓉等,2000)利用鹅胚尿囊液制备琼扩试验抗原，能够与抗番鸭细小病毒血清和抗鹅细小病毒血清发生反应，并成功运用到了番鸭细小病毒疫苗的免疫检测上，为番鸭细小病毒疫苗的质量及免疫效果的评估提供了更好的方法。1.4.1.2酶联免疫吸附(ELISA)试验酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前应用最广、发展最快的一项技术，能对大批量样品进行快捷的检测，已被广泛应用于临床诊断和抗体水平检测。利用抗原抗体之间的特异性结合，通过将抗原（或抗体）吸附于固相载体上，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后通过分光光度计判定结果，进行定性或定量分析(Dowalletal.,2012;Kimetal.,2012;Slutzkietal.,2012)。布日额等(布日额等,2009)以小鹅瘟VP1-VP3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原，建立了Dot-ELISA检测方法，该方法等够鉴别GPV全病毒8 山东农业大学全日制硕士专业学位论文抗体和VP3亚单位抗体，为小鹅瘟VP3基因工程疫苗的研制及推广应用提供了技术支持。龚建森等(龚建森等,2008)将不同的抗体与GPV抗体结合使用，形成了酶标羊抗兔抗体双夹心结构，建立了双抗体夹心ELISA方法，敏感性相较AGP方法提高了近100倍，为小鹅瘟的疫情监测、疗效检查和流行病学的调查提供了可靠的方法。李永锋等(李永锋,2010)以纯化的鹅细小病毒（GPV）重组VP3蛋白为包被抗原，建立了检测雏番鸭细小病毒抗体的间接ELISA方法。黎敏等(黎敏等,2010)以纯化的DPV全病毒作为包被抗原，建立了间接ELISA方法，但该方法与GPV阳性血清有一定的交叉免疫反应，尚待改善。1.4.1.3乳胶凝集（LPA）试验胶乳凝集试验又称为间接乳胶凝集试验，通过将抗原或抗体结合到聚苯乙烯乳胶上，形成抗原或抗体致敏乳胶，当与相应抗体（或抗原）相遇时，乳胶颗粒即被动凝集在一起，在液滴中形成肉眼明显可见的乳胶凝集块，即为阳性反应，如仍为均匀混浊的乳胶悬液，则为阴性反应(Chambersetal,1986)。朱小丽等(朱小丽等,2012)将GPV单克隆抗体结合到聚苯乙烯乳胶上制备致敏乳胶，建立了针对GPV抗原的胶乳凝集试验方法，该方法特异性强，仅与GPV抗原发生凝集反应，与其他鸭源病毒抗原均无反应，为基层小鹅瘟的诊断提供了良好的方法。程由铨等(程由铨等,1997)利用番鸭细小病毒单克隆抗体与聚苯乙烯乳胶结合制备致敏乳胶，建立了番鸭细小病毒的胶乳凝集试验方法，同时利用凝集反应可被番鸭细小病毒抗体抑制的原理建立胶乳凝集抑制试验（LPAI），凝集试验特异性结果显示致敏乳胶只与DPV发生凝集，与GPV等不发生凝集，田间试验表明建立的LPA和LPAI方法不仅适用于病原检测和流行病学调查，也可用于疫苗质量监控。1.4.1.4病毒中和（VN）试验病毒中和试验是对病毒进行定性和研究病毒与抗体关系的经典试验，该试验的原理是利用病毒或毒素能与相应的抗体结合的特性，致使病毒失去致病性。赵坤等(赵坤等,2000)利用中和试验对GPV进行了检测，效果良好。中和试验结果虽准确，但检测周期长，不适于大批量样本检测。1.4.1.5免疫荧光（IF）抗体技术免疫荧光抗体技术是利用对抗原抗体无影响的荧光素对抗原或抗体进行标记，再与相应的抗体或抗原进行反应，在荧光显微镜下呈现荧光反应。邱平等(邱平等,1996)用FITC标记小鹅瘟单抗，建立了检测小鹅瘟病毒直接免疫荧光技术，检测迅速，只需两9 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析小时。朱小丽等(朱小丽等,2012)将抗番鸭GPV单抗腹水用透析法标记FITC，制备抗GPV荧光抗体，建立了GPV抗原的直接免疫荧光检测方法。蔡羲等(蔡羲等,2009)用FITC标记鸭源GPV单抗建立了间接免疫荧光检测方法，特异性检测发现番鸭细小病毒无荧光反应，不仅可以定位GPV在患鹅各器官的分布情况，也可以应用于临床快速检测小鹅瘟病毒感染。1.4.1.6胶体金免疫层析（GICA）技术胶体金免疫层析技术（GICA）是指将胶体金标记技术、免疫检测技术和蛋白层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。该技术以硝酸纤维素膜为固相载体，待检样品溶液借助毛细管作用在层析条上泳动；同时，样品中的待检物与层析材料上针对待检物的受体（如抗体或抗原）发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域，通过观察暗红色条带进行结果的判断。邵周伍林等(邵周伍林等,2015)利用双抗体夹心原理，将胶体金标记到抗GPVVP3蛋白单克隆抗体2D5上，在硝酸纤维素膜上涂上抗GPVVP3蛋白单克隆抗体4A8和羊抗鼠IgG抗体作为检测线和质控线，建立了GPV胶体金免疫层析检测方法，该方法具有良好的特异性和敏感性，为小鹅瘟的快速诊断提供了技术支持。李长瑜等(李长瑜,2006)将GPV单克隆抗体2B8用胶体金标记，将马抗GPV多克隆抗体包被于检测线上，羊抗鼠抗体包被在阴性对照线上，制备了GPV胶体金免疫检测试纸条。1.4.2分子生物学检测技术1.4.2.1PCR技术聚合酶链式反应（PCR）是近年来兴起的分子生物学检测技术，具有特异、敏感、简便等优点，目前发展已非常成熟，是临床检测最主要的方法之一。通过借助PCR仪对微生物的核酸进行体外扩增，具有特异性强、灵敏度高、对核酸的浓度和纯度要求较低等优点。胡桂学等(胡桂学等,2003)、李福伟等(李福伟等,2006)、于新友等(于新友等,2015)、Limn(Limnetal,1996)和Sirivan(Sirivanetal,1998)均建立了针对小鹅瘟的PCR检测方法，王暖成等(王暖成等,2010)针对GPVVP3基因设计了两对引物，建立了GPV的套式PCR检测方法。刘家森等(刘家森等,2007)根据MDPV和GPV全基因组序列分别设计了一对特异性引物，能够分别对MDPV和GPV进行PCR检测。鲜思美等(鲜思美等,2010)针对GPV非结构蛋白NS和MDPVNS2-VP1设计了两对引物，建立了GPV和MDPV双重PCR检测方法。李林林等(李林林等,2013)建立了能迅速鉴别MDPV的套式PCR检测方法。Jestin(LeGall-ReculeandJestin,1995)针对MDPV建立了PCR方法，10 山东农业大学全日制硕士专业学位论文能检出最低1.6fg的核酸量。1.4.2.2核酸探针技术核酸探针技术也叫作基因诊断或基因探针技术。核酸探针是一段用特殊标记物（如同位素、生物素、地高辛等）标记的核酸片段（DNA或RNA），它能与特定的核苷酸序列发生特异性结合，用于样品中特定基因片段的检测。段玉友等(段玉友等,1993)、余兵等(余兵等,2002)、布日额等(布日额等,2005)分别用地高辛标记探针，运用斑点杂交法建立了GPV地高辛标记核酸探针检测方法。JestinV等(LeGall-ReculeandJestin,1995)建立了MDPV的地高辛核酸探针检测方法。核酸探针检测技术特异性强、灵敏性高、可进行大批量样本检测，应用范围日益广泛。1.4.2.3环介导等温扩增（LAMP）技术2000年Notomit等(Notomietal,2000)建立了环介导等温扩增技术（LAMP），它针对特定基因的6个区域设计4条特异性引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下短时间（通常为1h）内对核酸进行扩增，LAMP技术具有高度的特异性和敏感性，而且操作简便，成本相对较低，适于基层检测使用。尚毅等(尚毅等,2011)、傅秋玲等(傅秋玲等,2013)建立了GPV的LAMP检测方法，灵敏度高、特异性好、检测迅速，非常适用于临床检测。谢丽基等(谢丽基等,2013)建立了番鸭细小病毒的LAMP检测方法，敏感性可达10fg，比常规PCR高10倍，且反应可在1h内结束，特异性好，适用于MDPV的临床快速检测。1.4.2.4实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术实时荧光定量PCR技术，是指将荧光基团加入PCR反应体系中，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分`析的方法，实时荧光定量。目前荧光定量方法有TaqMan探针法和SYBRGreenI染料法两种。与常规PCR方法相比，实时荧光定量方法特异性更强，全封闭式反应能够有效解决PCR反应中的污染问题。目前实时荧光定量技术已广泛应用于临床实践中。阮二垒等(阮二垒等,2010)建立了GPV的SYBRGreenI荧光定量检测方法，该方法最低能够检测出3.52×10个拷贝的模板，重复性和特异性良好。董浩等(董浩等,2011)在GPVVP3序列的保守区域设计了引物和探针，建立了GPVTaqMan探针法荧光定量检测方法，该方法标准曲线相关系数均大于0.99，呈良好的线性关系，特异性和重复性试验结果良好，为GPV在机体内的定量提供了良好的方法。虽然实时荧光定量PCR具有特异性和敏感性强，操作方便等优点，但也存在着成本高，操作复杂、不适用于临床检测等缺点尚需克服(Kim11 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析etal,2007;Wiseetal,2004)。1.5水禽细小病毒病的防治1.5.1水禽细小病毒病的预防随着饲养管理水平的提高以及相关疫苗的研制应用，水禽细小病毒病对鸭鹅养殖业的影响得到了控制，但其对养殖业的威胁仍不容忽视，必须严格做好预防措施。在采取相应的生物安全措施的同时，疫苗的免疫工作尤为重要，目前国内外专家已经研制了弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗，能够很好的控制水禽细小病毒病的发生。1.5.1.1生物安全措施（1）养殖场尽量选择远离公路、家禽屠宰场、活禽交易市场以及畜产品加工场所等可能存在病毒的地方。场内粪便以及死亡家禽等及时进行无害化处理。禁止从疫区引种。（2）消毒工作须做好，切断病原传播途径。禽舍的消毒要保证彻底，无死角，尤其是家禽采食饮水设备要定期消毒。水禽细小病毒易在种蛋的孵化过程进行传播，种蛋孵化前用甲醛熏蒸消毒，孵化设备使用前严格消毒，若孵化设备已被污染，应立即停止孵化，彻底消毒后再继续孵化。（3）加强饲养管理。保持养殖场及其周边环境整洁卫生，合理调整禽舍内的温度、湿度以及饲养密度。1.5.1.2疫苗防控措施水禽细小病毒传播范围广，对我国水禽养殖业造成了巨大的影响，经过国内外专家多年的研究，水禽细小病毒疫苗的研制取得了很大的进展，目前通过接种疫苗已经能够很好的控制水禽细小病毒病的发生，常用的疫苗主要有灭活苗、弱毒苗和基因工程疫苗。1.5.1.2.1灭活苗潘玉民等(潘玉民等,1992)用当地分离的毒株以白油为佐剂制备了GPV油乳剂灭活疫苗，实验室检验、田间试验和扩大试验表明疫苗效果良好。李琳等(李琳等,2008)将小鹅瘟病毒灭活后按一定比例加入蜂胶作为佐剂制备了蜂胶灭活疫苗。蜂胶作为佐剂能够激发机体细胞免疫，具有免疫增强作用，且容易被机体吸收，区域应用试验证明其免疫效果要远好于油乳剂灭活苗，保护率可达90%以上。1.5.1.2.2弱毒苗江美娟等(江美娟等,1984)采用鸭胚致弱的小鹅瘟病毒制备鸭胚弱化小鹅瘟弱毒12 山东农业大学全日制硕士专业学位论文苗，经现场试验发现该弱毒苗经皮下注射效果良好，雏鹅存活率达到90%。潘玉民等(潘玉民等,1992)采用英国鸭胚化小鹅瘟21/486弱毒株制备弱毒苗，试验表明雏鹅接种疫苗后7天即可获95%~100%的保护力，安全性良好，可用于免疫接种。娄华等(娄华等,1998)将分离的一株番鸭细小病毒致弱后制备了弱毒苗，在8个养殖场对226200只雏番鸭进行区域试验后发现平均保护率能达到95%，疫苗经易感动物5代后未发现毒力返强现象，表明疫苗不会造成新的传染源，也不会造成环境污染。1.5.1.2.3基因工程苗韩新峰等(韩新锋,2008)成功构建了含有GPVVP3全基因的疫苗表达载体pcDNA-VP3，通过间接免疫荧光抗体试验表明pcDNA-VP3能够在真核细胞内高效表达GPV的VP3蛋白，为GPVDNA疫苗的动物试验打下基础。李雪梅等(李雪梅等,2002)将鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MPV）的结构蛋白VP2-VP3基因克隆到核酸疫苗质粒pIRES1neo载体上，构建了核酸疫苗重组质粒pIGVP1和pIMVP，转染到鹅胚成纤维细胞和番鸭胚成纤维细胞上，Westernblot检测证明表达产物有良好的免疫原性。1.5.2水禽细小病毒病的治疗高免血清是目前治疗和紧急预防水禽细小病毒病最有效的方法，疫区的雏禽出壳后需立即注射高免血清或精制卵黄抗体，可有效防治和控制细小病毒病的发生，同时会对已感染的雏禽产生较高的保护率，对于发病初期的雏禽治愈率约为50%。抗生素对水禽细小病毒病无治疗作用，但可配合疫苗使用，防止继发细菌或霉菌感染。1.6地高辛标记核酸探针技术1.6.1地高辛标记核酸探针技术简介地高辛（Digoxin，DIG）又称异羟基洋地黄毒甙，是从植物中提取的甾体强心甙类药物，多年来一直作为有效的强心甙类药物而广泛应用于临床。国外利用地高辛水解去糖后的产物地高辛配基（digoxigenin-dUTP）作为半抗原免疫动物以获得单克隆抗体，其抗体以其他任何固醇类似物无交叉反应。地高辛标记核酸探针技术最早出现在上世纪90年代初期，它具有与放射性同位素标记核酸探针相近的灵敏度（可检测的最低量为0.1pg），但不产生放射性污染。同时克服了生物素标记核酸探针容易产生内源性生物素干扰的问题，是新一代的核酸探针技术，具有广阔的发展前景。标记好的探针经过斑点杂交过程可进行结果的判定。13 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析1.6.2地高辛标记核酸探针技术的应用地高辛标记核酸探针技术目前在分子生物学领域发挥着重要的作用，因其具有灵敏、特异及大批量样本检测等优点，所以在病原诊断方面发挥的作用尤为显著。根据目前已有的报道，地高辛标记探针在家禽、猪等动物的病毒和细菌病的检测上均发挥着巨大的作用。1.7本试验研究的目的和意义2015年年初在我国樱桃谷肉鸭群中发生了以喙短、舌外伸和生长发育受阻为特征的疾病，患鸭生长发育受阻，翅部骨骼易折，给肉鸭养殖企业和养殖户造成了严重的经济损失，因此尽快确认该病的病原并建立迅速有效的检测方法至关重要，病原全基因组序列的分析对该病分子流行病学的发展亦具有非常大的意义。本次研究确认了导致该病的病原为鸭源新型鹅细小病毒，成功分离并鉴定了一株鸭源新型鹅细小病毒毒株，并对病毒的部分特性进行了研究。对分离的毒株进行了全基因组序列的测定和分析。建立了针对鸭源新型鹅细小病毒的地高辛标记核酸探针检测方法，并对其特异性和敏感性进行了试验，证明该探针能够应用于临床检测，检测迅速，结果准确，为该病的诊断以及流行病学调查奠定了基础。2材料与方法2.1试验材料2.1.1病料采集从山东、江苏、安徽等地的养殖场采集有喙短小、舌外伸及发育不良症状的樱桃谷肉鸭组织样本，同时采集健康樱桃谷肉鸭组织样本。2.1.2鸭胚、菌株和毒株鸭源新型鹅细小病毒（N-GPV）SDLC01株、小鹅瘟病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MPV）、鸭肠炎病毒（DEV）、鸭甲肝病毒（DHAV-I）、鹅腺病毒（GAV）、坦布苏病毒（TMUV）、新城疫病毒（NDV）、H9N2亚型禽流感病毒（AIV）和鸭圆环病毒（DcuV）病料均由本实验室分离并保存，新型鸭呼肠孤病毒（N-DRV）由福建省农科院黄瑜研究员惠赠。健康鸭胚购自泰安某养殖公司。DH5α大肠杆菌菌种由本实验室保存。2.1.3试验动物1日龄临床表现健康的樱桃谷肉鸭购自泰安某种鸭场14 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2.1.4主要试剂DIG-HighprimerDNALabelingandDetectionStarterKitⅠ购自Roche公司；硝酸纤维素膜购自美国Pall公司；pMD18-T载体、氨苄青霉素购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海Sangon生物工程有限公司；HiFi高保真DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；Tris-平衡酚购自北京索莱宝科技有限公司；氯仿、无水乙醇、甲醛等均为国产分析纯。2.1.5主要仪器PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）、连接仪（杭州奥盛仪器有限公司）、电泳仪和紫外凝胶成像仪（美国Biorad公司）、500型电热恒温培养箱（龙口先科仪器有限公司）、高速冷冻离心机（美国贝克曼尔公司）、倒置显微镜（德国leica公司）、超净工作台（济南科赛特科技有限公司，江苏苏净科技有限公司）、微量移液器（上海雷勃分析仪器有限公司）、全自动孵化器（合肥三巨科技有限公司）、数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）、超低温冰箱（海尔集团）、数显恒温振荡器（常州冠军仪器制造有限公司）、电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）、漩涡振荡器、微波炉、电磁炉、注射器、照蛋器等。2.1.6主要试剂配制2.1.6.1琼脂糖凝胶电泳试剂1%琼脂糖凝胶：在200mL三角瓶中，将1g琼脂糖加入100mL1×TAEbuffer中，微波炉加热3min至其完全溶化即可。50×TAEBuffer(pH8.5)：称取242gTrisBase和37.2gNa2EDTA·2H2O置入锥形瓶中，再向瓶中加入800mL去离子水，搅拌混匀。最后加入57.1mL醋酸溶液，充分搅拌，用离子水定容至1L，保存备用。2.1.6.2斑点杂交试剂20×SSC：称取22.05g柠檬酸钠、43.825gNaCl，去离子水定容至250mL用NaOH调至pH7.0；10%SDS：称取10gSDS，去离子水定容至100mL，用HCl调至pH7.2；变性液：0.5mol/LNaOH、1.5mol/LNaCl，即称取5gNaOH、21.938gNaCl，用去离子水定容至250mL；中和液：0.5mol/LTris•Cl，3.0mol/LNaCl，即称取15.142gTris•Cl、43.875gNaCl去离子水定容至250mL，用NaOH调至pH7.4；15 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析预杂交液：5×SSC、0.2%SDS、2%BlockingReagent即量取67.5mL20×SSC、5mL10%SDS并称取5gBlockingReagent用离子水定容至250mL；洗液Ⅰ：2×SSC，0.1%SDS即量取25mL20×SSC、2.5mL10%SDS去离子水定容至250mL；洗液Ⅱ：0.5×SSC，0.1%SDS即量取6.25mL20×SSC、2.5mL10%SDS去离子水定容至250mL；缓冲液Ⅰ：0.1mol/LTris•Cl、0.15mol/LNaCl，调pH至7.5即称取6.057gTris•Cl、4.3875gNaCl去离子水定容至500mL，用NaOH调至pH7.5；缓冲液Ⅱ：称取10gBlockingReagent，加入缓冲液Ⅰ500mL即可；缓冲液Ⅲ：0.1mol/LTris•Cl、0.1mol/LNaCl、0.05mol/LMgCl2，调pH至9.5即称取6.057gTris•Cl、2.925gNaCl、5.075gMgCl去离子水定容至500mL，用NaOH调至pH9.5；抗体溶液：试剂盒中溶液4按1:5000的比例用缓冲液Ⅱ稀释，溶液4用前10000r/min，5min；显色液：将试剂盒中溶液5（NBT/BCIP）和检测液按1:50的比例混合，现配现用，即200μL溶液5加入10mL检测液中；TE缓冲液：10mmol/LTris•Cl，1mmol/LEDTA，调pH至8.0。2.1.7培养基及其它试剂普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血液琼脂平板、高盐甘露醇琼脂培养基等均按照常规方法配制。DEPC水：将DEPC原液和去离子水按照1：1000比例混合，避光过夜，使DEPC原液完全溶解即可。LB液体培养基：取胰蛋白胨2g、酵母粉1g、NaCl2g，溶于200mL去离子水中，121℃高压灭菌15min后4℃保存备用。+100mg/mL氨苄青霉素（Amp）贮存液：称取5g氨苄青霉素置于50mL容量瓶中，加入40mL去离子水，充分混合溶解后，定容至50mL，用0.22µm无菌滤器过滤除菌，分装至1.5mLEP管中，置于-20℃保存备用。+Amp/LB液体培养基：将LB液体培养基高压灭菌后冷却至50℃以下，按照5μL/mL加入氨苄青霉素储存液，使其终浓度达到50μg/mL，4℃保存备用。+Amp/LB固体培养基：按LB液体培养基配制方法配制，同时按1.5%（W/V）加16 山东农业大学全日制硕士专业学位论文入琼脂粉，高压灭菌后冷却至50℃以下，按5μL/mL加入氨苄青霉素储存液，使其终浓度达到50μg/mL，无菌操作将其倒入高压灭菌的玻璃培养皿中，冷却至培养基凝固，4℃保存备用。2.2试验方法2.2.1鸭短喙侏儒综合征病原的分离鉴定2.2.1.1临床症状和病理组织学变化观察患鸭的临床症状及剖检变化，做好详细记录。取患鸭舌、心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、胰腺、胸腺、气管、法氏囊等组织器官，用4%中性福尔马林溶液固定3d后，将组织块进行常规处理，石蜡包埋，苏木精和伊红染色后进行观察。具体步骤如下：3（1）取材：尽量选取新鲜的组织器官，修剪为0.5×0.5×0.5cm的组织块。（2）固定：将组织块置于4%福尔马林溶液中，防止组织腐败与自溶，保持组织原始状态，同时使组织硬化，便于制作。（3）脱水：将固定好的组织块用流水冲洗24h，然后梯度乙醇脱水：70%乙醇过夜，80%乙醇2h，90%乙醇30min，95%乙醇30min，无水乙醇Ⅰ15min，无水乙醇Ⅱ15min。（4）透明：用二甲苯溶液进行两次透明，二甲苯Ⅰ30min，二甲苯Ⅱ20min。（5）浸蜡：将透明后的组织块放入装有液态石蜡的烧杯中浸泡1.5h。（6）包埋：将浸好石蜡的组织块放入盛满液态石蜡的包埋框中包埋，待石蜡冷却后取出蜡块。（7）切片：将蜡块进行适当的修整，置于冰箱内预冷，固定于切片机上，进行切片，切片厚度约为4-6μm。（8）展片与贴片：将切下的组织薄片用干毛笔轻轻托起放入展片槽中，让其在水面上自然伸展。取洁净载玻片在展好的薄片附近垂直插入水中，缓缓上提，使薄片贴附于载玻片上，将其置于55℃烘箱中烘干24h。（9）脱蜡：将干燥的切片用二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水洗：二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，无水乙醇5min，95％乙醇5min，80％乙醇3min，乙醇2min，蒸馏水3min。（10）HE染色：苏木精溶液染色5min，蒸馏水冲洗；盐酸乙醇分化30s（上下抽提数次）；温水（约50℃）浸泡5min；1%伊红溶液染色2min。17 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析（11）脱水，透明，封片：95％乙醇Ⅰ30s，95％乙醇Ⅱ2min，无水乙醇Ⅰ2min，无水乙醇Ⅱ2min，二甲苯Ⅰ1min，二甲苯Ⅱ1min，中性树胶封片镜检。2.2.1.2细菌分离从患鸭的肝脏、血液和脑等组织器官进行细菌分离，分别接种于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血液琼脂平板和高盐甘露醇琼脂平板上，将平板置于37℃恒温培养箱中过夜培养，观察细菌生长情况。2.2.1.3病原的分离与传代无菌采集发病鸭新鲜肝脏组织进行研磨，加入无菌生理盐水，按1：4比例制成组织悬液，振荡混匀，反复冻融三次充分释放病毒，3000r/min离心30min，吸取上清并用0.22μm滤器过滤除菌，按0.2mL/胚经绒毛尿囊膜途径接种9日龄鸭胚和11日龄鹅胚，盲传三代后收取尿囊液，观察胚体病变情况。2.2.1.4引物的设计与合成参考Genbank上发表的小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、鸭肠炎病毒、鸭甲肝病毒、传染性支气管炎病毒、网状内皮组织增生症病毒、鹅腺病毒、鹅多瘤病毒、坦布苏病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒和鸭圆环病毒的基因序列，用Oligo7.0软件设计并合成特异性引物，引物序列如下表（表1）所示：表1片段扩增引物Table1Theprimersforfragmentamplification病毒引物序列（5’-3’）目的片段长度（bp）PrimersNucleotidesequence（5’to3’）Lengthofproducts(bp)GPVF5’-GAGCATCAACTCCCGTATGTCC-3’661R5’-CTACTTCCTGCTCGTCCGTGA-3’DEVF5’-TTCAATGCAACTGATAGGCCGC-3’690R5’-CTTTTAATTCGCGAGCGCGAAGTA-3’DHAV-ⅠF5’-ATGGGGAAACACAAGGTCAG-3’261R5’-CCCAACATAGTCACAACAGG-3’IBVF5’-TTGAAAACTGAACAAAAGACCG-3’1760R5’-TACAAAACCTGCCATAACTAACAT-3’REVF5’-GAGACTCTATCAGGCTTATCGG-3’369R5’-CAGTTCTTCTTCCAATGTCCC-3’18 山东农业大学全日制硕士专业学位论文GAVF5’-AAGTTCAGGCAGACGGT-3’884R5’-TAGTGATGCCGGGACATC-3’GPoVF5’-CTGAGGTGGCTCTGCTGGAA-3’546R5’-TCCACGGGATAAGCACCAT-3’TMUVF5’-CTGAAATAGCGGAAGCACTGA-3’250R5’-CTGGAGGTGTGGCTGTCAT-3’NDVF5’-AGGGACTGAAGAGGAGGATT-3’427R5’-TGAGTGTGATTGTATTAGGTGG-3’AIVF5’-GGAGGTTGGTCAGGATTAGTTG-3’560R5’-ACAAGAGATGAGGCGACAGT-3’DcuVF5’-CGGGAAATGACGTAGTCGTCATG-3’599R5’-GATAATGCGAC(C/T)GGCGACG-3’N-DRVF5’-TGAGACGCCTGACTACGATT-3’369R5’-ATGCTTGGAGTGAGACGACT-3’2.2.1.5病原核酸提取2.2.1.5.1DNA提取（1）取少量病鸭肝脏组织研磨，加入500μL10%SDS溶液和50μL蛋白酶K溶液，56℃水浴消化过夜。（2）取消化后的液体加入等量（250μL）的苯酚和氯仿溶液，振荡混匀，12000r/min离心10min，重复一次。（3）小心吸取上清液并转移至1.5mL离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，振荡混匀，-20℃静置沉淀30min。（4）沉淀结束后12000/min离心10min，小心倒掉上清，加入75%冷乙醇（事先置于-20℃预冷），12000/min离心10min，重复一次。（5）弃去上清，置于室温下晾干，用50μLddH2O溶解，置于-20℃备用。2.2.1.5.2RNA提取（1）取少量病鸭肝脏组织研磨，加入1mLTriZol，振荡混匀，室温下静置5min。（2）加入200μL氯仿溶液，充分振荡混匀（15s以上），冰盒上放置10min。（3）4℃12000r/min离心15min。（4）小心吸取上清500μL，转移至经DEPC处理过的1.5mLEP管中，加入500μL预冷的异丙醇溶液，振荡混匀后于-20℃沉淀30min。19 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析（5）12000r/min离心15min，弃去上清，加入1mLDEPC水配制的75%乙醇溶液，振荡混匀。（6）12000r/min离心10min，弃去上清，室温下自然干燥。（7）用40μLddH2O溶解，置于-80℃保存备用。2.2.1.5.3反转录以提取的RNA为模板进行反转录，反应条件为：30℃10min，42℃60min，70℃15min。反转录体系为10μL体系，如下表所示：表2RT体系Table2AmplificationsystemofRT试剂用量RNA酶抑制剂0.5μLM-MLV反转录酶0.5μL10mMdNTP1μL随机引物(100μM)1μL5×M-MLVbuffer2μL模板5μL2.2.1.6病原鉴定2.2.1.6.1PCR鉴定利用PCR鉴定提取的核酸，反应采用25μL体系，反应体系如下：表3PCR扩增体系Table3AmplificationsystemofPCR反应组分含量上游引物0.5μL下游引物0.5μL10×HiFiBuffer2.5μL2.5mMdNTPs2μLHiFiDNA聚合酶0.5μLddH2O18μL模板1μL20 山东农业大学全日制硕士专业学位论文PCR反应程序依不同引物做相应调整。2.2.1.6.2目的片段的回收纯化将目的片段切下后，用胶回收试剂盒进行回收，过程如下：（1）向吸附柱内加入500μLGBL溶液，室温静置2min以平衡吸附柱，12000r/min离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，备用。（2）将带有目的片段的琼脂糖凝胶放入2mL离心管中，称重，加入2倍体积的BufferGC溶液，56℃水浴10min，其间经常晃动，使凝胶充分溶解。（3）将上述溶液加入到平衡好的吸附柱中，室温静置2min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（5）向吸附柱中加入600μLDNAWashBuffer，12000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（6）重复步骤5。（7）12000r/min开盖离心2min，置于室温下自然晾干。（8）将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50μLElutionBuffer，室温放置2min。12000r/min离心2min收集离心管中的DNA溶液，置于-20℃保存备用。2.2.1.6.3连接将胶回收产物按照全式金说明书的要求进行连接，连接体系如下：pMD18-T载体0.5μLDNA回收产物4.5μLSolutionⅠ5μL配好连接体系后，将其置于连接仪中16℃连接2h。2.2.1.6.4转化（1）取100μLDH5α感受态细胞置于冰上融化，将10μL连接产物小心加入到感受态细胞当中，轻轻混匀，冰浴30min。（2）将混合液迅速转移到42℃水浴当中热击90s，随后迅速置于冰浴中2min。（3）加入800μL液体LB，置于37℃恒温摇床中200r/min1h，使细菌复苏。（4）3000r/min离心5min，弃去大部分上清，留少许（约200μL）将细菌沉淀重悬。+（5）将重悬后的菌液涂布到含有Amp的固体培养基上，涂布均匀，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养，21 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析2.2.1.6.5挑取阳性克隆与测序+随机挑取琼脂板上的白色菌落，接种至1mLAmpLB液体培养基中，置于37℃摇床中过夜培养。取2μL菌液进行PCR鉴定，经鉴定为阳性的菌液进行扩大培养，送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。2.2.1.7EID50的测定将分离自山东聊城某种鸭场的一株病毒命名为SDLC01株，取其盲传至第3代鸭胚-1-8尿囊液，用生理盐水稀释成10~108个稀释度，每个稀释度按0.2mL/胚接种9日龄鸭胚6枚，置于37℃自动孵化器中孵化，弃去24h内死亡的鸭胚，每天观察3次，连续观察3~5d。将5d后未死亡的鸭胚置于4℃冻死，收取尿囊液。提取DNA进行PCR鉴定，记录阳性样本数量。根据Reed-Muench法计算半数感染量（EID50）。2.2.1.8血凝试验分别采集健康鸡、鸭、鹅的血液，按常规方法制备1%红细胞悬液，以H9N2禽流感病毒作为阳性对照进行血凝试验，检测SDLC01株是否具有血凝性，方法如下：（1）取96孔“V”形微量反应板，自左往右，每孔加入50μL生理盐水。（2）在前三排左侧第一孔内加入50μL病毒液，第4~6排加入等量的H9N2病毒原液，反复吹打混匀，吸取50μL至第二孔，依次倍比稀释至第11孔，弃掉多余的50μL，第12孔作空白对照。（3）在第1、2、3排分别加入1%鸡、鸭、鹅红细胞悬液，4、5、6排也分别加入1%鸡、鸭、鹅红细胞悬液。（4）振荡混匀，将96孔“V”形微量反应板置于37℃恒温培养箱中反应15min，观察结果。2.2.1.9动物回归试验用SDLC01株病毒进行动物回归试验。取30羽健康1日龄樱桃谷雏鸭，分为两组：6其中20羽经胸部肌肉接种病毒尿囊液，按10EID50/羽进行接种；另外10羽接种1mL生理盐水作为对照。每日观察雏鸭临床症状及剖检症状，作好记录。攻毒后定期采集泄殖腔棉拭子进行PCR检测，记录检测结果。2.2.2鸭源新型鹅细小病毒全基因组序列测定分析2.2.2.1引物设计根据GenBank上发表的小鹅瘟病毒全基因组序列设计并合成了新型鹅细小病毒全序扩增引物，引物序列如下表所示：22 山东农业大学全日制硕士专业学位论文表4全序扩增引物Table4Primersusedtoamplifythecompletenucleotidesequence引物名称引物序列（5’-3’）位置扩增长度（bp）PrimersNucleotidesequence（5’to3’）PositionLengthofproducts(bp)P1-FCTTATTGGAGGGTTCGTT1-18176P1-RGCATGCGCGTGGTCAACCTAACA154-176P2-FGCATGCCGCGCGGTCAGCCCAAT171-1931389P2-RAGGGTACAGCATGGACAATAG1539-1559P3-FCACCACCGGGAAGACCAACAT1510-1530962P3-RCAGCTTTCAGATTCCGCCACG2451-2471P4-FTCGTGGCGGAATCTGAAAGC2450-24691752P4-RCATTCCTGGTAAAGCTCCAAGAAC4178-4201P5-FCATACAGATCTGGCAGCACTACAGCA4020-4045835P5-RCTGTTAGGTTGACCACGCGCATGC4831-4854GCATGC为泡区中SphI限制性酶切位点Theunderlinedsequence“GCATGC”meansSphIrestrictionsite,inthe“bubble”regionofITR.2.2.2.2分离株全基因组序列测定分析运用设计的新型鹅细小病毒全序扩增引物扩增SDLC01株全基因组序列，目的基因回收纯化后，连接pMD18-T载体，转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，菌液PCR验证后，取阳性菌液测序，测序由上海生工生物工程有限公司完成。测序完成后用Seqman软件将序列拼接完整，运用MegAlign软件将分离株全基因组序列与GenBank上已发表的GPV和MDPV全基因组、NS2、VP3基因进行比对，进行遗传进化和同源性分析，ITR结构分析，同时用在线软件NetNGlyc1.0Server对分离株序列的潜在糖基化位点进行预测。2.2.3鸭源新型鹅细小病毒地高辛标记核酸探针检测方法的建立2.2.3.1引物设计根据本实验室分离并在GenBank上发表的SDLC01株N-GPV的全基因组序列（GenBank登录号：KT343253），利用Oligo7.0软件设计了一对特异性引物，引物序列如下：上游引物F：F5’-TGCCGGGACCTTCCT-3’23 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析下游引物R：R5’-TTCCACCCTACTCCATTCGT-3’引物由上海生工生物工程有限公司合成，目的片段大小为301bp。2.2.3.2DNA模板的制备按上文所述的方法提取病毒的核酸并进行PCR反应，回收目的片段，进行连接、转化并测序，取测序阳性菌液做模板进行PCR反应，反应采用25μL体系，回收并纯化目的片段，对纯化后的片段进行定量。反应体系如下：PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，进行32个循环；最后72℃延伸10min。2.2.3.3探针标记及标记效率检测按地高辛标记试剂盒说明书进行标记，具体方法为：取10μL（约300ng）目的片段，加入6μL双蒸水使终体积达到16μL。沸水浴10min后立即放入冰水浴中5min，使模板DNA充分变性；加入4μLDIG-Highprimer于变性的模板中，37℃水浴20h；65℃加热10min，终止反应。对标记好的探针进行标记效率检测，按试剂盒说明稀释ControlDNA和标记好的探针，根据测定的标记效率将探针稀释-20℃保存备用。2.2.3.4斑点杂交程序的建立剪取适当大小的硝酸纤维素（NC）膜，划格并标记；吸取1μL样品DNA点于格子中央；将NC膜正面朝上放于已用变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）饱和的双层滤纸上变性10min；再放于已用中和液(0.5mol/LTris-Cl，3.0mol/LNaCl，pH7.5)饱和的双层滤纸上中和5min；将NC膜置于室温下干燥30min，之后放于80℃烘箱内固定2h；将NC膜放入预杂交液中45℃孵育30min，定时摇动NC膜；将探针置于沸水中变性10min，取出后立即放入冰水中5min；将变性后的探针倒入预杂交液中，充分混匀成为杂交液；将NC膜放入杂交液中45℃杂交过夜；杂交结束后将NC膜放于洗液Ⅰ中室温振荡洗涤15min2次；再放于洗液Ⅱ中68℃洗涤15min2次，期间经常摇动NC膜；缓冲液Ⅰ中洗涤1min；缓冲液Ⅱ中反应30min，期间经常摇动NC膜；缓冲液Ⅰ洗涤1min；，将膜置于含4μL抗Digoxiaenin抗体的20mL缓冲液Ⅱ中，37℃浸泡30min；缓冲液Ⅰ洗膜5min5次；缓冲液Ⅲ中反应浸泡2min；在平皿里加入10mL缓冲液Ⅲ和200μLNBT/BCIP混合物，将NC膜放入其中，避光显色0.5~1h；加入TE缓冲液（pH8.0），终止显色反应。2.2.3.5特异性试验24 山东农业大学全日制硕士专业学位论文按Trizol法和酚-氯仿法分别提取H9N2亚型禽流感病毒（AIV）、新型鸭呼肠孤病毒（N-DRV）、新城疫病毒（NDV）、坦布苏病毒（TMUV）、鸭甲肝病毒（DHAV-I）、鹅细小病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭肠炎病毒（DEV）和鸭圆环病毒（DcuV）病料的RNA和DNA，分别取1μL点到NC膜上，按照上述斑点杂交程序进行变性、中和、固定、预杂交、杂交、洗膜、显色，最后观察结果。2.2.3.6敏感性试验将纯化定量的DNA按一定比例稀释成不同的浓度：1000pg/μL、100pg/μL、50pg/μL、25pg/μL、10pg/μL、5pg/μL、1pg/μL，分别取1μL点于NC膜上，按上述斑点杂交程序进行变性、中和、固定、预杂交、杂交、洗膜、显色，最后观察结果。2.2.3.7探针的临床应用用标记的探针对采集的61份发病鸭组织及30份健康鸭组织的DNA进行检测。按照上述斑点杂交程序进行变性、中和、固定、预杂交、杂交、洗膜、显色，最后观察结果，并与病毒分离鉴定结果相比较。3结果3.1鸭短喙侏儒综合征病原的分离鉴定结果3.1.1临床症状患鸭临床主要表现为喙短，舌头外伸；个体发育不良，骨质疏松，患鸭出栏时体重仅为正常鸭的70%~80%，病程较长者体重仅为正常鸭的50%；病程较长的患鸭胫骨和翅部骨骼容易发生骨折且胫骨较正常鸭短粗；排白色稀便（如图1）。图1临床症状Fig.1Clinicalsymptoms25 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析3.1.2剖检变化患鸭剖检变化主要为舌肿大（图2A），胸腺肿大有出血点（图2B），肠道黏膜有轻微出血现象，其余脏器无明显病变。图2剖检病变A舌肿大B胸腺肿大有出血点Fig.2NecropsylesionsATongueenlargementBThymusenlargementandhemorrhage3.1.3病理组织学变化患鸭舌间质炎性细胞浸润，结缔组织基质疏松、水肿（图3A）；胸腺髓质淋巴细胞坏死，炎性细胞浸润，组织间质明显出血、水肿（图3B）；肾小管间质出血，并伴有大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞崩解死亡，肾小管管腔狭小水肿（图3C）；肺间质出血，炎性细胞浸润（图3D）。图3组织病理学变化(100×，HE)A舌呈间质性炎症，结缔组织水肿；B胸腺髓质细胞坏死，间质炎性细胞浸润，出血，组织水肿；C肾小管间质出26 山东农业大学全日制硕士专业学位论文血，并伴有大量炎性细胞浸润；D肺间质出血，炎性细胞浸润Fig.3Histopathologychanges(100×，HE)A：Infiltrationofinflammatorycellsintongueinterstitial,ConnectivetissueedemaB：Infiltrationofinflammatorycellsinkidneyinterstitial,edemaandhemorrhage,medullacellsnecrolysisC：AlargeofinfiltrationofinflammatorycellsinkidneyinterstitialandhemorrhageD：Infiltrationofinflammatorycellsinlunginterstitialandhemorrhage3.1.4细菌分离细菌分离结果多为阴性，仅在部分患鸭肝脏处分离获得4株大肠杆菌。3.1.5病原分离病毒接种鸭胚后，可在接种4~6d后导致部分鸭胚死亡，绒毛尿囊膜增厚变浑浊（图4），胚体轻微出血（图5）；病毒接种鹅胚后无明显病变发生。图4绒毛尿囊膜增厚图5胚体出血Fig.4AllantoicmembranethickeningFig.5Cutaneoushemorrhage3.1.6PCR扩增结果对可能病原进行PCR鉴定，结果显示AIV、NDV、DEV、DHAV-I、TUMV、DcuV、N-DRV、IBV、REV和GAV均无特异性扩增条带出现，仅GPV扩增结果为阳性。3.1.7EID50测定结果-6.16经计算得知病毒EID50为10/0.2mL。3.1.8血凝试验结果鸡、鸭、鹅三种禽类的常规血凝试验结果显示，H9N2禽流感病毒能够使三种禽类的红细胞产生凝集，但SDLC01株病毒不能凝集鸡、鸭、鹅三种禽类的红细胞。27 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析3.1.9动物回归试验1日龄雏鸭攻毒后，泄殖腔棉拭子PCR检测结果均为GPV阳性。攻毒后第12天有3只雏鸭出现喙部发育不良，舌外伸症状（图6A）；通过对比可见攻毒组胫骨明显短于对照组（图6B）；病鸭排白色稀便（图6C）；整个试验过程感染雏鸭未发生死亡。剖杀感染雏鸭可见雏鸭胸腺肿大、出血（图6D），肝脏呈土黄色（图6E），鸭舌肿大，舌尖弯曲变形（图6F）。对照组无明显病变。图6分离株动物回归试验结果A舌外伸；B胫骨短；C白色稀便；D胸腺出血；E肝脏土黄色；F舌肿胀Fig.6TheresultsofanimalregressiontestAProtrudingtongues;BShorttibia;CWhitestools;DThymusenlargementandhemorrhage;ELiverkhaki;FTongueenlargement;3.2鸭源新型鹅细小病毒全基因组序列测定分析3.2.1全序扩增结果提取分离株病毒的DNA，用设计的全序扩增引物SDLC01株全序共计5个片段成功扩增（图7），片段符合预期大小。图7SDLC01株各片段扩增Fig.7AmplificationsforfivefragmentsofSDLC01strainbyPCRM:DL2000DNAMarker;1-5:Fragments28 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.2.2分离株全基因组序列拼接及特征分析运用Seqman软件将扩增的5段序列拼接后，得到了SDLC01株的全基因组序列，全基因组结构如下图（图8）所示。分析结果显示，SDLC01株基因组全长5006bp，基因组两端为反向末端重复序列（ITR），长度均为366bp。中间部分含有左右两个开放阅读框，左侧开放阅读框编码非结构蛋白NS，包含NS1和NS2，其中NS1全长1884bp，编码628个氨基酸；NS2全长1356bp，编码452个氨基酸，NS2被NS1完全包含，它们共用同一终止密码子。右侧开放阅读框编码结构蛋白VP，包含VP1、VP2和VP3三种蛋白，其中VP1全长2199bp，编码733个氨基酸；VP2全长1764个氨基酸，编码588个氨基酸；VP3全长1605bp，编码535个氨基酸，VP1完全包含VP2和VP3，VP2同时包含了VP3的所有序列，VP1、VP2和VP3共用同一终止密码子，其中VP2的起始密码子为非典型的ACG。图8SDLC01株全基因组结构Fig.8GenomestructureofSDLC01strain3.2.3全基因组遗传进化分析用MEGA6.0软件将SDLC01株全基因组序列与已发表的多株GPV和MDPV的序列进行分析，建立系统发育树（图9），可以看出SDLC01株位于鹅细小病毒分支，且与多株欧洲GPV分离株同属一个分支，中国内陆地区GPV分离株与台湾GPV分离株处于另一分支，MDPV则单独处于一个大分支。利用MegAlign软件对SDLC01分离株与GPV和MDPV的核苷酸同源性进行分析（图10），结果显示，SDLC01分离株与鹅细小病毒亲缘关系较近，同源性为92.3%~97.2%，与番鸭细小病毒同源性仅有81.4%~85.5%。29 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析图9SDLC01株全基因系统发育树Fig.9PhylogenetictreeofcompletegenomeofSDLC01strain图10SDLC01株与其他分离株全基因的比较Fig.10ThecompletegenomesequenceofSDLC01straincomparewithotherstrains30 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.2.4非结构蛋白NS2遗传进化分析将SDLC01分离株与多株GPV分离株和MDPV分离株的NS2基因核苷酸序列与氨基酸序列进行遗传进化分析，构建系统进化树（图11），进行同源性比较（图12，图13），结果表明，SDLC01分离株NS2基因与GPV分离株核苷酸序列同源性为93.1%~98.2%，与MDPV核苷酸同源性为79.3%~80.7%。与GPV分离株氨基酸序列同源性为95.6%~97.6%，与MDPV分离株氨基酸同源性为86.5%~87.2%。NS2基因核苷酸系统发育树显示，GPVNS2基因分成了两个独立分支，SDLC01分离株位于第一分支，与台湾82-0321V疫苗株和德国SHM319致病株亲缘关系较近，MDPV则独自处于一大分支。图11SDLC01株NS2基因核苷酸系统发育树Fig.11ThenucleotidesphylogenetictreeofNS2geneofSDLC01strain31 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析图12SDLC01株NS2基因核苷酸同源性分析Fig.12ThenucleotideshomologyanalysisofNS2geneofSDLC01strain图13SDLC01株NS2基因氨基酸同源性分析Fig.13TheaminoacidshomologyanalysisofNS2geneofSDLC01strain3.2.5结构蛋白VP3遗传进化分析将SDLC01株与多株GPV分离株和MDPV分离株的VP3基因核苷酸序列与氨基酸序列进行遗传进化分析，构建系统进化树（图14），进行同源性比较（图15，图16），结果表明，SDLC01分离株VP3基因与GPV分离株核苷酸序列同源性为93.1%~98.5%，与MDPV同源性为81.7%~91.7%。与GPV氨基酸序列同源性为96.6%~98.7%，与MDPV同源性为91.0%~96.8%。核苷酸系统发育树显示，SDLC01分离株VP3基因核苷酸序列32 山东农业大学全日制硕士专业学位论文与几株欧洲GPV分离株和一株台湾疫苗株处于同一大分支上，但与台湾82-0321v疫苗株（EU583389）亲缘关系最近。图14SDLC01株VP3基因核苷酸系统发育树Fig.14ThenucleotidesphylogenetictreeofVP3geneofSDLC01strain图15SDLC01株VP3基因核苷酸同源性分析Fig.15ThenucleotideshomologyanalysisofVP3geneofSDLC01strain33 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析图16SDLC01株VP3基因氨基酸同源性分析Fig.16TheaminoacidshomologyanalysisofVP3geneofSDLC01strain3.2.6末端重复序列分析通过MegAlign软件将SDLC01株的ITR部分与德国VG32-1疫苗株（EU583392）、台湾82-0321V疫苗株（EU583389）、法国番鸭源FM致病株（NC_006147）、匈牙利B致病株（U25749）的ITR进行比对（图17），可见，与致病株相比，SDLC01分离株的ITR存在部分片段缺失和碱基替换现象。与疫苗株比较后可见，SDLC01株的ITR与台湾疫苗株82-0321V非常相似（二者的ITR长度仅相差15bp），但与德国疫苗株VG32-1相比，SDLC01株ITR存在部分片段缺失（二者ITR长度相差77bp）。34 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图17ITR同源性分析Fig.17ThehomologyanalysisofITR3.2.7潜在糖基化位点预测用在线分析软件NetNGlyc1.0Server对SDLC01分离株VP和NS蛋白上的潜在糖基化位点进行预测，结果显示，分离株病毒的VP和NS基因序列上各含有3个潜在糖基化位点，糖基化位点的数目与位置如下表5所示：表5SDLC01株病毒潜在的糖基化位点Table5PotentialglycosylationsitesofSDLC01strain蛋白名称位置预测值ThenameoftheproteinPositionPredictedvalueVP219NASG0.5423331NLTS0.7958703NRTS0.5392NS150NKTV0.7753225NYSN0.5837360NWTN0.786035 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析3.3地高辛标记核酸探针检测方法的建立3.3.1PCR扩增结果按上文所述方法从分离株尿囊液中提取DNA，利用设计的引物进行PCR扩增，得到一条特异性条带（图18），与预期目的片段一致，约为301bp。图18PCR扩增结果（301bp）M：DL2000DNAmarker；1：DPVPCR扩增产物Fig.18PCRamplificationresult:M：DL2000DNAmarker;1：PCRamplificationresult3.3.2PCR产物克隆与测序将目的基因回收纯化后，连接到pMD18-T载体上，转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，菌液PCR扩增，得到与预期大小相符的目的条带。测序结果显示，该片段与分离株序列一致。3.3.3敏感性试验结果敏感性试验结果见图19，从图可以看出，该探针对DPV的最小检出量为25pg。图19敏感性试验结果Fig.19Resultofsensitivityassay1~7：1000pg、100pg、50pg、25pg、10pg、5pg、1pg3.3.4特异性试验结果特异性试验结果见图20，从图可以看出该探针与回收的目的片段发生阳性反应，而与其它九种鸭源病毒核酸的反应结果均呈阴性。36 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图20特异性试验结果Fig.20Resultofspecificityassay1.回收片段；2.GPV;3.MDPV;4.DEV;5.H9N2亚型AIV；6.NDV;7.N-DRV;8.TMUV;9.DcuV;10.DHAV-I.3.3.5探针临床应用及与病毒分离结果比较用标记的探针对61份发病鸭组织及30份健康鸭组织样品进行检测，结果发病鸭检测阳性率为97.0%（59/61），健康鸭阳性率为0（0/30）。病毒的分离鉴定结果为发病鸭检测阳性率为100%（61/61），健康鸭阳性率为0（0/30）。探针检测与病毒分离鉴定结果相符率为98%。4讨论4.1鸭短喙侏儒综合征病原的分离鉴定鸭短喙侏儒综合征自2015年年初出现以来，发病率不断上升，初期仅为零星发生，截至16年年初，发病率最高已可达50%，对肉鸭养殖业的影响愈加严重。本研究为确定该病的病原，采集了不同地区肉鸭养殖场的样品进行了病原的分离与鉴定。对采集的样品进行细菌分离鉴定，仅分离得到4株大肠杆菌。通常若某种疾病由一种病原引起，无论细菌或病毒，应在所有患病机体内分离到该种病原，因此该病绝不会是由大肠杆菌引起，但在分离过程中分离到大肠杆菌也提示我们该病可能会继发大肠杆菌感染，因此在该病的治疗过程中应同时注意配合抗菌药物的使用。PCR鉴定结果显示所有样品均为GPV阳性，表明该病为鹅细小病毒感染引起，遗传进化分析也显示该病毒与鹅细小病毒属于同一分支，因此确认该病为鹅细小病毒感染，但该病与鹅细小病毒感染有较大区别，鹅细小病毒已知仅感染雏番鸭和雏鹅，且能够导致极高的发病率与死亡率，而该病毒能够对肉鸭产生致病性，发病率虽高但几乎不造成患鸭死亡，从患鸭临床症状上看，该病与鹅细小病毒感染症状几乎完全不同，但与曾在法国出现的半番鸭短喙和侏儒综合征（SBDS）症状极为相似，均可导致患鸭喙部变短，生长发育受阻。37 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析Palya等(Palyaetal.,2009)选取了D17/99鹅细小病毒分离株、FM番鸭细小病毒分离株和D176/02半番鸭短喙和侏儒综合征分离株对2周龄和3周龄半番鸭进行攻毒试验，结果显示仅D176/02分离株能引起试验鸭出现短喙和生长发育受阻症状，证明SBDS是由鹅细小病毒变异株引起。而此次发生在我国的鸭短喙侏儒综合征与小鹅瘟的区别也表明该病并非经典鹅细小病毒引起，而是由鹅细小病毒变异株引起，因此将该病病原确定为鸭源新型鹅细小病毒。研究表明，鹅细小病毒能够在番鸭胚和鹅胚内生长繁殖并引起明显的胚体病变，鸭源新型鹅细小病毒接种鸭胚和鹅胚后，鸭胚表现出明显病变，但病毒对鹅胚并未产生明显影响，这里可以产生两个推测：第一，鸭源新型鹅细小病毒可能不感染鹅或感染后对鹅无致病作用，仅对部分鸭类有致病性。第二，目前我国种鹅普遍接种小鹅瘟弱毒苗，鹅胚中含有较高的小鹅瘟母源抗体，鸭源新型鹅细小病毒虽为变异株，但可能会被小鹅瘟抗体所中和，从而不引起明显的致病作用。以上两点均为推测，尚需试验进一步验证。研究证明，鹅细小病毒对多种哺乳类及鸟类动物的红细胞均无血凝性，但可以凝集黄牛精子，此次对鸭源新型鹅细小病毒的血凝性试验显示，鸭源新型鹅细小病毒对常见禽类（鸡、鸭、鹅）的红细胞均无血凝性，其对哺乳动物红细胞和黄牛精子的凝集性有待探索。本次分离鉴定样品采集范围涉及山东、安徽、江苏等地，结果显示这些地区均存在鸭源新型鹅细小病毒感染，说明该病的流行范围较广，且根据水禽细小病毒特征猜测该病的传播速度应该较快，资料显示该病亦可发生于半番鸭、绿头鸭、番鸭、白改鸭以及褐莱鸭，我国南方地区为番鸭和半番鸭养殖密集地区，该病极有可能会在南方地区大面积爆发，应引起广大专家和养殖户足够的重视，积极深入研究该病的发病机理，传播机制，尽快进行相关疫苗的研制等，同时做好养殖场内的饲养管理工作，预防该病的发生。4.2鸭源新型鹅细小病毒全基因组序列分析本研究对SDLC01株鸭源新型鹅细小病毒的全基因组序列进行了测定分析，分析结果显示，SDLC01株鸭源新型鹅细小病毒全长5006bp，基因组两端为366bp的ITR结构，中间区域为左右两个编码区，分别编码NS蛋白和VP蛋白，基因组整体结构与GPV和MDPV相似，根据已有GPV全基因组序列可知我国GPV基因组全长为5050bp或5106bp左右，SDLC01株鸭源新型鹅细小病毒基因组全长相对较短，且基因缺失主要存在于ITR区域。全基因组遗传进化分析显示，SDLC01株与GPV亲缘关系较近，同源38 山东农业大学全日制硕士专业学位论文性可达到97.2%，同时SDLC01株病毒与欧洲GPV分离株处于同一分支，而中国GPV分离株处于另一分支，MDPV分离株单独处于一支，表明SDLC01株病毒与欧洲源GPV亲缘关系较近，与亚洲源GPV分离株亲缘关系较远，提示鸭源新型鹅细小病毒可能由欧洲GPV分离株进化而来，是否有可能在引进种禽时将本属欧洲的病毒带至国内导致病毒扩散，亦或是本土GPV发生变异导致该病发生尚待探讨。VP3是细小病毒主要的结构蛋白，含有细小病毒主要的抗原决定簇，是细小病毒最重要的免疫原性蛋白。VP3基因核苷酸系统发育树显示SDLC01分离株与台湾疫苗株82-0321V处于同一分支，同源性分析显示分离株与GPV核苷酸同源性为93.1%~98.2%，氨基酸同源性为96.6%~98.7%，表明SDLC01分离株VP3基因与GPV抗原差异性较小，在进化过程中并未发生很大变异，因此GPV疫苗可能对该病的感染有一定的保护作用，该病尚未在鹅上发病，可能与雏鹅出壳后接种GPV疫苗有关。目前关于NS2蛋白的研究相对较少，但有研究表明，NS2蛋白与病毒DNA和蛋白质的有效合成以及病毒的增殖有关，它能够促进NS1蛋白的细胞毒性作用。NS2基因核苷酸同源性分析显示，分离株NS2基因与GPV分离株NS2基因同源性很高，二者可能起源于同一祖先，遗传进化显示，分离株与台湾疫苗株82-0321V和德国野毒株SHM319属于同一分支，可以从进化水平上显示NS2基因对细小病毒的毒力无太大影响。ITR分析显示，SDLC01株病毒的ITR明显短于GPV和MDPV野毒株，在部分区域出现了片段的缺失和碱基的替换现象，Shien等(Shienetal.,2008)通过对德国VG32-1疫苗株和台湾82-0321V疫苗株的研究发现这两株病毒与强毒株相比，ITR区域虽然出现了部分缺失和替换现象，但这些变化并不影响病毒发卡结构的正常形成。SDLC01株病毒的ITR与台湾疫苗株82-0321VITR缺失情况相似，但德国疫苗株却未出现类似缺失，中国大陆疫苗株GDaGPV与致病株BITR区域为444bp，并未出现大量缺失和替换现象，因此SDLC01分离株病毒ITR区域的长短与病毒毒力之间可能没有太大关系。糖基化位点与病毒和宿主细胞的吸附有关，是病毒感染宿主的必需区，糖基化位点的差异可能与病毒感染宿主的特异性有关(孔宪刚等,2005)。研究表明，MDPVVP基因有8个糖基化位点，GPV则含有4~6个不等，GPV感染宿主的种类比MDPV多可能跟糖基化位点的减少有关，SDLC01株病毒VP基因糖基化位点的预测结果显示其仅含有3个潜在的糖基化位点，而鸭源新型鹅细小病毒已知可感染多种鸭类，其宿主范围远超GPV和MDPV，因此鸭源新型鹅细小病毒糖基化位点的改变可能改变其宿主范围，通39 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析过人为影响病毒的糖基化位点是否会改变病毒的宿主范围还有待深究。另有研究表明糖基化位点的改变和数目的变化会对病毒的毒力产生影响(VigerustandShepherd,2007)，糖基化位点预测发现SDLC01株鸭源新型鹅细小病毒共有6个潜在糖基化位点。糖基化位点的缺失和插入是否会对鸭源新型鹅细小病毒的毒力产生影响尚不得而知，需试验进一步验证。近年来我国养鸭业发展迅速，各类鸭病不断增多。2015年春季出现的鸭源新型鹅细小病毒感染无疑对肉鸭养殖业造成一定的经济损失，严重挫伤了肉鸭企业和养殖户的积极性。当前针对该病的病原学、流行病学及致病机理等尚不明确，且没有有效的防制措施，因此该病应引起大家的高度重视。为了更有效地防控该病，我们应当加强对疫源地及周边地区肉鸭群的疫情监控，同时，加快疫苗的研制是预防该病极为重要的手段。4.3鸭源新型鹅细小病毒地高辛标记核酸探针的制备番鸭细小病毒对樱桃谷鸭和鹅没有致病性，鹅细小病毒仅可以感染雏鹅和雏番鸭，但对樱桃谷鸭无致病性。鸭源新型鹅细小病毒除对樱桃谷肉鸭致病外，对半番鸭、绿头鸭、番鸭、白改鸭以及褐莱鸭均有致病作用。目前该病的流行范围日益扩大，影响越来越大，快速简便的检测方法的建立至关重要。本研究根据已发表的鸭源新型鹅细小病毒全基因组序列设计引物，扩增特异性片段，建立了地高辛标记核酸探针检测方法。本研究所制备的探针仅与DPV发生杂交反应，与GPV、MDPV的DNA无杂交反应，与DcuV、DEV、DHAV-I、H9N2亚型AIV、N-DRV、NDV、TMUV等鸭源常见疫病的DNA或RNA也无杂交反应。该探针对鸭源新型鹅细小病毒的最低检出量为25pg，对临床样品的检测结果与病毒分离鉴定结果符合率可达到98%，表明本研究制备的核酸探针具有良好的特异性与敏感性，可用于临床检测。应用建立的地高辛标记检测方法对不同地区采集的61份患鸭组织病料和30份健康肉鸭病料进行了检测，结果表明鸭源新型鹅细小病毒在患病鸭群体中的感染率为100%，且在多个地区广泛存在，由于鹅细小病毒和番鸭细小病毒均具有很强的传染性，根据检测结果猜测，鸭源新型鹅细小病毒也可能有较强的水平传播和垂直传播能力，因此该病的流行范围可能会进一步扩大。健康肉鸭的检测结果虽为阴性，但也应注意防止病毒对健康鸭群的感染，在没有有效防控措施的前提下，养殖场应加强管理，防止该病的发生和扩散。40 山东农业大学全日制硕士专业学位论文本研究制备的地高辛标记核酸探针操作简单迅速且不需要特殊设备，可进行大批量样品检测，适合在基层推广使用。为该病的流行病学调查提供了基础技术。5结论1、引起鸭短喙侏儒综合征的病原为鸭源新型鹅细小病毒。2、鸭源新型鹅细小病毒全长5006bp，基因组含两个开放阅读框，分别编码NS和VP蛋白，ITR区域存在缺失，与GPV同源性较高。3、建立地高辛标记核酸探针检测方法，特异性好，灵敏性高，适用于临床检测。41 鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析参考文献Bornholdt,Z.A.,andPrasad,B.V.(2008).X-raystructureofNS1fromahighlypathogenicH5N1influenzavirus.Nature456,985-8.Brister,J.R.,andMuzyczka,N.(1999).Rep-mediatednickingoftheadeno-associatedvirusoriginrequirestwobiochemicalactivities,DNAhelicaseactivityandtransesterification.JVirol73,9325-36.Brown,K.E.,Green,S.W.,andYoung,N.S.(1995).Gooseparvovirus--anautonomousmemberofthedependovirusgenus?Virology210,283-91.Chambers,P.,Millar,N.S.,Bingham,R.W.,andEmmerson,P.T.(1986).MolecularcloningofcomplementaryDNAtoNewcastlediseasevirus,andnucleotidesequenceanalysisofthejunctionbetweenthegenesencodingthehaemagglutinin-neuraminidaseandthelargeprotein.JGenVirol67(Pt3),475-86.ChunHe,W.,Yu,H.,ShaoHua,S.,GuangHua,F.,LongFei,C.,HongMei,C.,QiuLing,F.,CuiTeng,C.,andKaiHui,H.(2016).CompletegenomesequenceofgooseparvovirusisolatedfromAnsercygnoidesinChina.KafkasÜniversitesiVeterinerFakültesiDergisi22,155-158.Cotmore,S.F.,D'Abramo,A.M.,Jr.,Carbonell,L.F.,Bratton,J.,andTattersall,P.(1997).TheNS2polypeptideofparvovirusMVMisrequiredforcapsidassemblyinmurinecells.Virology231,267-80.Dowall,S.D.,Richards,K.S.,Graham,V.A.,Chamberlain,J.,andHewson,R.(2012).DevelopmentofanindirectELISAmethodfortheparallelmeasurementofIgGandIgMantibodiesagainstCrimean-Congohaemorrhagicfever(CCHF)virususingrecombinantnucleoproteinasantigen.JVirolMethods179,335-41.Flotte,T.R.,Afione,S.A.,Conrad,C.,McGrath,S.A.,Solow,R.,Oka,H.,Zeitlin,P.L.,Guggino,W.B.,andCarter,B.J.(1993).Stableinvivoexpressionofthecysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorwithanadeno-associatedvirusvector.ProcNatlAcadSciUSA90,10613-7.Kajigaya,S.,Fujii,H.,Field,A.,Anderson,S.,Rosenfeld,S.,Anderson,L.J.,Shimada,T.,andYoung,N.S.(1991).Self-assembledB19parvoviruscapsids,producedina42 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鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定和全基因组序列测定分析致谢总感觉时间过得如此之快，不知不觉间，两年就过去了，回首两年的研究生生活，有欢声笑语，亦有伤心郁闷，但无论何时，身边总有人伴我度过，陪我开心，给我安慰，在即将离开校园之际，有太多的人需要感谢。首先要感谢的是我的导师刁有祥老师，感谢刁老师两年来的指导与照顾。试验中遇到困难与挫折，刁老师总会给予我悉心的指导，生活上的困难与困惑，刁老师给予了我最无私的帮助。本研究的顺利结束，离不开刁老师的指导与帮助，从课题的选择，到试验的操作，再到论文的写作，处处都有老师的辛勤与汗水。两年的时间，刁老师不仅教会我知识，老师身上那严谨求实，踏踏实实做事的风格更是深深影响了我，让我知道做人做事都应勤勤恳恳，认真仔细，诚实守信。谢谢刁老师，您的关心与帮助，终生难忘!再要感谢的是学院的老师们，谢谢你们研究生阶段的教育与指导，你们热忱的讲课，给予了我很大的帮助，同时也让我知道世界这么大，我懂得还是太少，督促我去不断的学习，不断地提升自己，感谢各位老师，你们是我的榜样！特别感谢博士师兄陈浩，在试验和生活上都给予了我莫大的帮助，使我的研究生生活得以顺利进行，于我而言，你就是“中国好师兄”。感谢已经毕业的师兄师姐李川川、杨国平、张璐、张英、赵丹丹、霍现格、颜敏、冯柳柳、赵立媛曾经的帮助，你们的帮助让我从本科生真正变成了研究生。也感谢其他各位师兄师姐提金凤、王爱华、李秀丽、程冰花、路云建，谢谢你们在我生活和试验中给予的鼓励和无私帮助，马上毕业了，希望你们找到满意的工作！感谢我同级的张敏、张秉乾、窦砚国、张欣，感谢你们陪我走过两年研究生生活，两年里我们一同学习一同成长，这将是一段难忘的记忆。感谢可爱的师弟师妹牛晓宇、杨晶、于相龙、张敏敏、张媛媛，感谢你们对我试验的帮助，愿你们好好努力，继续成长，试验顺利！另外，我必须向我生命中最重要的两个人表示感谢，我的父母，感谢父母从小到大的养育之恩，这么多年，让你们操心了，没有你们的爱和支持，我不可能走到现在这一步，谢谢我最爱的父亲和母亲！最后，我要谢谢我的舍友姜长青、张敏、张文启、张鹏、李宗瑞，谢谢你们两年来的陪伴，让我的生活更加丰富多彩。马上就毕业了，即将走出校园，踏入社会，回顾两年的研究生生活，我学到了很多知识，认识了很多朋友，生活充实而快乐，这是会我铭记一生的宝贵记忆，再一次感谢所有陪伴我的人，这两年麻烦你们了，愿你们所有人幸福快乐！50 山东农业大学全日制硕士专业学位论文攻读硕士期间论文发表情况郑肖强,刁有祥*,陈浩,杨晶,牛晓宇,于相龙,窦砚国.鸭细小病毒地高辛标记核酸探针的制备与应用，中国兽医学报，第一作者（已录用）51
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