抗人肺癌蛋白质肽类药物的研究

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　　抗人肺癌蛋白质肽类药物的研究【关键词】肺癌；蛋白质肽类药物；肽库技术　　　　肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管黏膜上皮，故亦称支气管肺癌，是一种严重威胁人们健康和生命的疾病。近20年来，我国的肺癌发病率以每年11%的速度递增，总患病率已占到男性恶性肿瘤的首位。目前对肺癌患者常见的化疗和放疗手段往往导致严重的副作用，因此寻找高效、低毒的抗肺癌药物是目前的热点之一，而新型的蛋白质肽类药物具备了这些特点。　　1抗肺癌蛋白质肽类药物　　　　近20年来，国外对生物多肽进行了大量的基础和应用研究，并将多种多肽药物推向市场，获得了巨大的经济效益。基因工程、蛋白质工程大大开拓了生物活性多肽的应用范围，提高了它们的价值。我国对活性多肽的研究主要集中在天然多肽分离、纯化，对生物肽库、化学组合肽库的构建、筛选及应用研究才刚刚起步。　　1.1从海洋生物中提取的多肽　　　　海洋生物物种占地球生物的80%以上,具有陆上生物所不具有的化学结构奇特、新颖以及特异的高活性、高药效的生物活性物质，从而成为人们研究的热点。近年来,人们在海洋抗肺癌活性多肽的研究方面已取得很大进展。　　　　1981年Rinehart等［1］首次从海鞘TrididmnumSolidum中分出并测定了环肽DidemninsA、B和C的结构，证实了它们具有抗肿瘤、抗病毒的活性，其中DidemninB的活性最强，既能抑制蛋白质的合成，也能抑制DNA、RNA的合成。易杨华等［2］从棕色海锦（phakelliafuscathiele）的乙醇提取物中获得一个新的Phakellistatins类环肽化合物，为一个环状七肽（Pro1-Gly-Phe-Pro2-Trp-Leu-Thr），该化合物具有抗肿瘤活性，其潜在的应用价值正在评价之中。李祺福等［3,4］从鲎血淋巴中分离提取出一种抗肿瘤肽,它具有显著的抗肿瘤作用,能有效地抑制癌细胞的增殖活动,降低其代谢酶活性,干预相关癌基因及抑癌基因的表达,改变癌细胞形态与超微结构恶性表型特征,因而对癌细胞具有明显的诱导分化作用。裸鼠体内抑瘤实验表明,剂量为60mg/L时,其抑瘤率达42.3 %。小白鼠体内急性毒理实验表明,鲎素肽对正常细胞毒性小。于志洁等［5］考察了鲨鱼软骨提取物SCAE体内抑瘤作用,对S180移植瘤小鼠,剂量为24～72mg/d口服形式给药,抑瘤率达54%～67%,6～18mg/L注射给药,抑瘤率可达67%～82%；对Leg/L注射给药,抑瘤率为62%～76%。从海兔中追踪分离到18个抗癌活性肽Dolastatin1～18,其中研究得比较多的是Dolastatin23、10和15，在抗癌新药开发方面具有巨大的潜力［6］。2002年，美国犹他大学Barronumcuculiferum和Polysyncrantonlithostrotum中发现了一个含有l3个氨基酸的双环肽Vitilevuamide，其结构上与紫杉醇类似物有微小的联系，但其立体构形还未完全清楚，尚在研究之中。试验表明，Vitilevuamide对人肿瘤细胞株有明显的抑制作用。与传统的抗肿瘤药物相比,多肽类药物在有较强药效的同时,对机体正常组织的伤害明显降低。　　1.2从生物毒素中提取的多肽　　眼镜蛇毒的重要活性成分之一细胞毒素(cytotoxin,CTX)是由60～63个氨基酸残基组成的多肽,Mr　6000～7000,是眼镜蛇毒中Mr较小的活性多肽。许云禄等［8］应用凝胶过滤、离子交换柱色谱及疏水柱色谱等方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化得到了不含磷脂酶A2(PLA2)的CTX2F,经过体外实验,证明CTX2F能抑制人肺腺癌A549细胞的增殖。　　　　在中国东亚钳蝎的毒液中分离纯化得到抗瘤止痛肽ANTP,Mr为6280,其N端25个氨基酸序列为:VRDGYIADDKNKAYFLGRNAYCDDG。通过PCR的方法获得了中国东亚钳蝎毒液的抗瘤止痛肽(AGAP)的基因,并在大肠杆菌中获得表达。大部分重组的AGAP以包涵体的形式表达。重组后的AGAP在小鼠体内试验具有抗肿瘤和止痛活性［9，10］。　　1.3从人类自身得到的多肽　　　　麻亚锋等［11］从人尿中分离纯化抗肿瘤多肽,从健康男性尿液中得到了抗瘤多肽UAP,由Glu、Leu、Pro、Tyr、Ala等氨基酸组成,其Mr小于1　000。体内实验表明，UAP对小鼠LEr为846.9。体内抑瘤试验结果表明，ND100对小鼠Leg/kg,当使用高剂量(15　mg/kg)时,对小鼠移植性肿瘤的抑制率达70%以上,且具有量效关系。同时ND100对小鼠红细胞和白细胞的数量均无影响。　　1.4多肽的改造　　 　　抗肿瘤转移肽Arg-Gly-Asp（RGD）和Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg（YIGSR）序列经膜受体与肿瘤细胞黏附,在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥了重要作用。刘丽艳等［13］设计合成了用赖氨酸的2个氨基把Arg-Gly-Asp（RGD）和Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg（YIGSR）连接起来的杂合肽α-精甘天冬氨酰-ε-酪异亮甘丝精氨酰甲酯,该化合物降低了LA795细胞肺转移小鼠的肺重量和肺转移瘤结节数,对LA795小鼠肺腺癌细胞自发性肺转移表现了明显的阻滞作用,具有较强的抗肿瘤侵袭活性,有进一步的应用和开发研究前景。　　　　含有氧肟酸的环肽CHAP1是1种组蛋白去乙酰化抑制剂,可以抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性。Komatsu等［14］合成了一系列CHAP的衍生物,经过构象—活性研究,筛选出了活性和稳定性最强的1个化合物CHAP31。体内实验表明，CHAP31对肺癌DMS114生长有一定的抑制作用,有希望成为新一代的抗肿瘤药物。　　2抗肺癌蛋白质肽类药物的研究方法　　　　组合肽库筛选技术对新肽的发现至关重要。噬菌体肽库是生物肽多样性最主要的例子，利用噬菌体肽库技术筛选到的多肽通过对其结构的测定，利用DNA重组技术，将重组对象的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞)，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达，最后将表达的目的产物纯化并做成制剂，得到重组多肽、蛋白质类药物。现在着重介绍噬菌体肽库技术在这方面的应用。　　2.1噬菌体肽库技术　　　　噬菌体肽库技术是将大量随机合成的肽段与噬菌体外壳蛋白融合表达并展示于噬菌体表面，这种由表面表达有各种外源肽段的噬菌体就构成了随机肽库。用特定的靶分子通过亲和淘洗，能够高效、快速、简便地从噬菌体随机肽库中筛选到与特定靶分子结合的噬菌体肽，大大简化了蛋白质表达的筛选和鉴定。目前该技术用于肿瘤导向治疗研究主要集中在３个方面：一是筛选肿瘤特异性结合肽，与药物耦联后用于肿瘤导向治疗；二是筛选与肿瘤转移有关的黏附分子，为肿瘤诊断和抑制肿瘤转移提供了一个有效的方法；三是筛选肿瘤结合肽后与基因耦联，用于基因治疗。现介绍近年来用于肿瘤及其附属结构的特异性结合肽的筛选及应用。　　 　　人肿瘤相关抗原TAG72是一种上皮细胞的黏蛋白，常与人多种肿瘤相关，可被单抗B72.3所识别。Gui等［15，16］用纯化的TAG72抗原对随机肽库(6肽和10肽)进行筛选，最后筛选到多个具结合活性的噬菌体肽克隆，而且它们与TAG72抗原上的识别位点不同于该抗原与单抗B72.3的位点。进一步发现了其中有1个10肽HYVSIELPDH和1个6肽ARTLRF与TAG72抗原结合活性最强，且能优先结合表达有TAG72抗原的结肠癌组织，具有潜在的开发价值。另外Kupsch［17］等利用细胞ELISA和荧光标记的方法，从噬菌体肽库中成功地筛选到2个肽B3和B4，这2个肽段能够特异性地与黑色素瘤细胞结合，而不与人外周血单个核细胞结合，经免疫组化鉴定与正常组织无交叉反应，而在肿瘤细胞上高水平表达有与B3和B4特异性结合的分子，这使肿瘤导向治疗成为可能。上述实验证明，噬菌体肽库技术能确定已知肿瘤抗原的特异性结合肽，而且筛选到的肽具有生物活性，为新型肿瘤导向治疗药物的发展提供了新的方法，并具有开发成多肽新药的潜在价值。　　大量证据表明，在不同器官和组织中的血管基底膜上表达着各自特异的细胞表面受体，这些受体参与着体内细胞的定向转移，因此确定在一定组织的血管选择性表达的内皮细胞表面的蛋白对诊断和治疗疾病非常有用，而结合到这样的组织选择性的蛋白上的配体可作为特定的定向传递药物的载体［18］。Pasqualini［19，20］和Rajotte［21，22］报道了一个新颖的体内筛选方法，能够在未知靶受体的情况下确认与这些组织或器官的特异性内皮标记物结合的肽。首先把展示有环状随机肽的噬菌体库静脉注射到小鼠体内，几分钟后从各个器官回收噬菌体并在体外进行扩增，然后在体内再进行几轮这样的筛选，通过这种方法最后可以确认出那些与小鼠脑和肾血管特异性结合的肽。这种体内筛选方法有以下几个优点：一是能够提供组织和分子在天然状态下与之结合的多肽序列；二是能够排除血液循环中与配体作用的其他分子的影响。实验结果表明，通过这种方法筛选出的与肺、皮肤、前列腺及子宫等组织结合的肽比未经筛选的肽特异性要高3～35倍，结果肯定了许多器官和组织的血管内皮具有特异结合的位点。利用随机肽库能够筛选出与正常或疾病组织特异性结合的肽，这种肽可以广泛用作疾病诊断或定向传递药物的载体。在肿瘤的治疗过程中将药物定向地转移至特定组织的能力对于改善治疗效果是十分重要的。　　　　肿瘤细胞的迅速增殖以及肿瘤的快速发展是在其中发展了微血管网络 以后才开始的，否则会因为得不到营养的供应而处于静止状态。肿瘤主要是依靠不断地诱发宿主组织毛细血管向内生长而建立并扩张形成自身的微血管网即微循环系统。但当这个系统处于低效和相对不足时可导致肿瘤缺氧和坏死，因此抑制肿瘤血管生成的药物也能抑制肿瘤的生长并使肿瘤退化。在肿瘤血管系统形成过程中会表达一系列分子标记物，这些标记物作为血管生长因子受体起作用。Ruoslahti和Raiotte［23,24］的研究结果表明，利用噬菌体肽库技术在小鼠体内可以筛选到与表达在肿瘤血管上的纤连蛋白结合的噬菌体肽，利用这些肽的定向作用，在动物模型中能将药物特异性地导向到肿瘤上，在肿瘤局部浓缩药物，提高药物效率，减少副作用。噬菌体肽库对于连续、不连续的或非肽表位(即糖蛋白)都具有良好的筛选作用，是研究复杂生物系统有用的工具。通过筛选得到的生物活性肽是构建“生物导弹”的基础，建立在这种基础上的肿瘤导向治疗表现出高效性和高安全性。　　2.2多肽固相合成法　　　　由于肽类药物在生物体内的含量甚微，直接从生物体中提取、分离纯化不能满足需要，且会对生物造成灾难性的影响。目前，解决药源问题有2个重要手段：一是采用转基因表达技术、细胞工程技术等生物技术来解决较大相对分子质量的多肽和蛋白药物的药源问题；二是对于小分子多肽采用固相合成技术来合成。化学合成法具有提高产率、分离纯化过程简单、立体构象位置准确等优越性。另外，有些天然物质毒副作用大，需要进行结构修饰或改造，以提高疗效，减少毒副作用，这些要求可以通过人工合成法来完成。　　　　多肽固相合成法是由美国著名生物化学家Merrifield于1963年发明的。Merrifield利用Boc合成法合成四肽后，Carpino在此基础上进行了改进，于1972年发明了Fmoc多肽固相合成方法。Fmoc合成法具有反应条件温和、副反应少、反应过程易于控制等优点［25］。合成的氨基酸数目正逐渐增加，现在可以合成含有50个氨基酸的多肽，蛋白质结构也越来越复杂。如果将多肽固相合成法与其他方法(如化学选择连接等)结合使用，则能合成更多、更复杂的多肽和蛋白质。如今，既可合成具有“困难序列”的多肽，又可以合成需要修饰的多肽。2004年，张铂等［26］报道Dolastatinl0和Dolastatinl5已经完成全合成，美国正在进行Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等实体瘤的治疗。来自于海鞘Trididenumsp的DideminB，具有很强的抗病毒、抗肿瘤活性，已经完成临床Ⅱ期试验，最有希望成为治疗癌症的新药。它是由7个氨基酸和2个羧酸组成的带有分支的环缩肽，已经能够进行人工全合成［27］。　　3结语 　　　　蛋白质肽类药物作为新一代药物已经成为研究的主流，随着噬菌体展示技术的不断成熟和完善，运用它筛选功能性的多肽已经成为医药领域的研究热点。随着现代分子生物学成为药物化学发展的推动力,对活性蛋白质/肽进行修饰、剪切、模拟和结构改造,使它成为适合于治疗的新一代药物。　　与传统的抗癌药物相比，蛋白质肽类药物有其独特的优势，它直接作用于与肿瘤相关的基因以及对肿瘤产生作用的调控因子具有对因治疗的作用，这是它最大的优势；它具有很强的靶向性，只对肿瘤细胞产生作用，对正常细胞不产生作用，这可以克服现代抗癌药普遍存在的严重不良反应。正因如此，它作为新一代药物已经成为各大制药公司竞相研究的热点，也成为新兴的生物制药公司争夺未来市场的主要筹码。相信不久的将来，此类药物会为广大的肺癌患者带来福音。【参考