《虾肝肠胞虫的流行病学及其致对虾生长缓慢机理的探索》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码：10264研究生学号：M140104153上海海洋大学硕士学位论文题目：虾肝肠胞虫的流行病学及其致对虾生长缓慢机理的探索英文题目：TheepidemiologyofEnterocytozoonhepatopenaeiandmechanismofretardedgrowthinshrimp专业：临床兽医学研究方向：水产动物疾病控制与流行病学姓名：程东远指导教师：黄倢研究员二O一七年五月二十七日 上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注孙黎中国科学院海洋研究所研究员主席张晓华中国海洋大学教授委员张士璀中国海洋大学教授委员战文斌中国海洋大学教授委员曲凌云国家海洋局第一海洋研究所研究员委员中国水产科学研究院黄海水李晨工程师秘书产研究所中国水产科学研究院黄海水2017年5月答辩地点答辩日期产研究所1号楼3楼会议室19日14:00 虾肝肠胞虫的流行病学及其致对虾生长缓慢机理的探索摘要近些年来，东南亚的养殖场对虾生长缓慢的现象被越来越多的报道出来。在这些生长较为缓慢的对虾肝胰腺中检测到了虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性。目前认为EHP是影响对虾生长缓慢的最主要的病原，成为对虾养殖的最大威胁之一，严重影响了对虾养殖业的产量增长，造成了严重的经济损失。本研究通过流行病学调查，不同组织EHP载量与对虾生长参数分析，血淋巴ATP含量测定、蛋白质浓度测定，原位杂交等技术手段，旨在了解EHP的流行情况及在对虾体内的分布情况，探索EHP导致凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长停滞或缓慢的机制。对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾群体进行了对虾生长参数测量，用TaqManqPCR检测了各群体对虾的肝胰腺组织中和RZ群体对虾的多种组织中的EHP感染载量。结果表明，在主要生长相关参数上RZ群体最优，该群体EHP量也最低。不同群体的样本数-EHP对数直方图的模式存在差异，HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布，而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布，代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关性。在群体水平上EHP显著增加体重指数的变异系数。为进一步了解凡纳滨对虾EHP阳性个体中，EHP的分布情况，对来自山东日照的一批凡纳滨对虾共48尾，解剖对虾后分别对肝胰腺、肠道、肌肉、血淋巴和鳃五种组织进行了EHP的Taqman实时荧光定量检测，检测结果显示群体中各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺>中肠>血淋巴>鳃>肌肉。肝胰腺、中肠和鳃三个组织中EHP对数相互间的相关性呈99.9%的极显著水平(P<0.001)；除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外，其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)水平。在肠道和鳃组织中EHP拷贝数对数与对虾体重指数(Ponderalindex,Pi)有一定的负相关性，并且肌肉中EHP平均载量最低。I 通过对血淋巴和肌肉组织进行蛋白质含量、血淋巴ATP含量的测定，及与EHP载量和对虾生长参数的相关性的分析，可见肌肉蛋白含量与血淋巴、肌肉EHP载量对数达到95%的负相关水平。血淋巴中的ATP浓度与血淋巴中和肝胰腺中的EHP载量均呈现出显著的负相关性，与5种组织EHP载量之和对数达到99.5%的负相关性水平。经过SigmaPlot12.0回归分析，得到血淋巴ATP含量与所有组织中EHP载量之和对数的关系式为：ATP浓度=-(0.060±0.019)Log(EHP载量)+(2.326±0.238)。证明EHP的确通过截取宿主的ATP而影响对虾的生长的机制，并从一定程度上影响了对虾肌肉蛋白的积累。为寻找EHP在对虾体内分布的直接证据，依据GenBank中公布的EHPSSUrDNA序列(KF362129)，设计了一对原位杂交探针的PCR扩增引物，用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示，肝胰腺是主要的EHP感染组织，其他组织中杂交信号较弱，但各组织中有少数细胞的EHP感染。本研究通过qPCR获得了EHP在凡纳滨对虾不同群体和不同组织中感染量的准确数据，观察到群体中不同个体的EHP感染发生在较接近的时间点时，其EHP载量与对虾的生长参数呈显著的负相关性，群体内的EHP感染会显著增加体重指数的变异系数；EHP能在多组织中检出，肝胰腺和中肠中分布最多，原位杂交显示EHP在其他组织中的存在是因为在其他组织中存在一定水平的感染的原因。同时，证明了EHP的确可以通过截取宿主的ATP而影响对虾的生长的机制，影响了对虾肌肉蛋白的积累。通过本研究阐明了EHP在对虾群体和体内的感染和分布情况，为该病的诊断和预防研究提供了基础数据。关键词：凡纳滨对虾，虾肝肠胞虫，生长参数，组织分布，ATPII TheepidemiologyofEnterocytozoonhepatopenaeiandmechanismofretardedgrowthinshrimpABSTRACTInrecentyears,lotsofretardedgrowthinshrimphasbeenreportedinSoutheastAsia.Enterocytozoonhepatopenaeiwasdetectedintheseslow-growingshrimps.ItisbelievedthatEHPisoneofthemostimportantpathogenswhichcausedtheslow-growinginshrimpinaquacultureindustry.EHPhasseriouslyaffectedtheyieldofshrimpaquacultureindustryandcausedseriouseconomiclosses.Inthisstudy,throughtheperspectiveofseveraldifferentorganizations,epidemiologicalsurvey,analysisingtherealatinshipbetweendifferenttissue’sEHPloadingandgrowthparametersofshrimp,hemolymphATPandproteincontentdetermination,insituhybridizationandothertechnicalmeans,aimedattosearchtheepidemicsituationofEHPinshrimp,andthemechanismofretardedgrowthinshrimp.GrowthrelatedparametersoffourpopulationsofLitopenaeusvannameifromHuanghuaofHeibeiProvince(HH),PingduofShandongProvince(PD),WujiangofJiangsuProvince(WJ),andRizhaoofShandongProvince(RZ)weremeasured.Enterocytozoonhepatopenaei(EHP)inhepatopancreasofallpopulations,andinmultipletissesofpopulationRZwerequantitatedwithTaqManbasedquantitativePCR.ResultsshowedthatpopulationRZhadtheoptimalgrowthrelatedparametersandlowestEHPloadamoug4populations.Thehistogramsofcases-logarithmicEHPofthe4populationshaddifferentmode.ThecasedistributionsoflogarithmicEHPofpopulationHHandPDshoweddoublepeaks,whilethatofpopulationWJandRZshowedsinglepeak.ThedifferentmodesofdistributionmayindicatedifferentEHPspreadindifferentpopulations.ThepopulationwithasinglepeakmodeorthehigherlogarithmicEHPsubpopulationisolatedfromthepopulationwithmultiplepeakmodehadasignificantnegativecorrelationinshrimpbodylengthorbodyweighttologarithmicEHP.EHPsignificantlyincreasedthevariablecoefficientofponderalindex.InordertofurtherresearchthedistributionofEHPininfectedshrimp,atotalof48I LitopenaeusvannameithatcollectedfromRizhaoofShandongProvince.Hepatopancreas,gut,muscle,hemolymphandgillwastakenout.EHPwasdetectedbyTaqmanqPCR,TheresultsshowedthatthepositiveratesofEHPwere94%,79%,40%,67%and38%respectively,ThelogarithmofEHPcopieswas1.26±0.72,1.06±0.65,0.19±0.16,0.96±0.50and0.79±0.47,respectively.TheregressionanalysisbetweentheEHPloadandPiofLitopenaeusvannameishowedthatthelogarithmofEHPcopiesinthehepatopancreasandhemolymphshowedapositivecorrelationwiththebodymassindexofshrimp.TheEHPloadindifferenttissuesofpopulationRZrankedfromgreattosmallasfollows:hepatopancreas,midgut,haemolymph,gillsandmuscle.ThelogarithmicEHPinhepatopancreas,midgut,andgillshadverysignificantcorrelationlevelabove99.9%significance(P<0.001),whilethecorrelationleveloflogarithmicEHPofothertwotissueshadverysignificant(P<0.01)orsignificant(P<0.05)levels,exceptmidgut-hemolymphandhepatopancreas-hemolymph.TherewasanegativecorrelationbetweenthelogarithmofEHPloadandPioftheshrimpinthegutandgilltissues.Resultsoftheproteincontentinhaemolymphandmuscletissue,andtherelationshipbetweenEHPloadingandshrimpgrowthparametersshowedthatproteininmusclehadanegativecorrelationwithEHPloadinhemolymphandmuscle,upto95%level.TherewasasignificantnegativecorrelationbetweentheconcentrationofATPinhaemolymphandtheEHPloadinthehepatopancreasandthelogarithmofthesumofEHPloadinthefivetissues.ThoughtheanalysisusingSigmaPlot12.0,therelationshipbetweentheATPcontentinthehaemolymphandthelogarithmoftheEHPloadinallofthe5tissueswasthatATPconcentration=-(0.060±0.019)Log(EHPloading)+(2.326±0.238).ItisprovedthatEHPdoesaffectthegrowthmechanismofshrimpbyinterceptinghostATP,andformedacertainextentthatEHPaffectedtheaccumulationofmuscleproteininshrimp.InordertoverifythatEHPdistributioninshrimp,aPCRprimersweredesignedaccordingtotheEHPSSUrDNAsequence(KF362129)publishedinGenBank.In-situhybridizationofDIGlabeledEHPinhepatopancreas,muscle,gills,andmidgutshowedthathepatopancreasisthemajortargettissueofEHPinfection.MinorandweakhybrizationsignalswereobservedinothertissuesindicatedafewcellsinthosetissuewerealsosuseptibletoEHP.Inthisstudy,weobtainedtheaccuratedataofEHPloadindifferentpopulationsanddifferenttissuesofLitopenaeusvannameibyTaqmanqPCR.ItwasobservedthatthereII wasasignificantnegativecorrelationbetweenEHPloadandthegrowthparametersofshrimpwhenEHPinfectingdifferentindividualsatthenearesttimepoint.ItwillsignificantlyincreasethecoefficientvariationofPonderalindexwhenEHPinfectedthegroup.Besides,EHPcanbedetectedinmultipletissues,whichhasthelargestdistributioninhepatopancreasandmidgut.InsituhybridizationshowedthatEHPexistedinotherorganizations,soEHPcannotonlyinfectinghepatopancreas.Also,itprovedthatEHPcouldaffectthegrowthofshrimpbyinterceptingATPofhost,andaffectedtheaccumulationofproteininmuscleinshrimp.ThisstudyexpoundedtheinfectionanddistributionofEHPinshrimppopulationsandindividual,itprovidedthebasicdataforthediagnosisandpreventionofthisdisease.KEYWORDS:Enterocytozoonhepatopenaei,growthparameters,tissuedistribution,ATPIII 目录第一章引言................................................................................................................11.1微孢子虫的发现、分类和侵染机制................................................................11.1.1微孢子虫的发现......................................................................................11.1.2微孢子虫的分类地位..............................................................................11.1.3微孢子虫的形态和侵染机制..................................................................21.2影响凡纳滨对虾生长的主要因素....................................................................21.2.1养殖环境对对虾生长的影响..................................................................21.2.2影响对虾生长的病原..............................................................................31.3肠道上皮细胞微孢子虫的研究进展................................................................31.3.1虾肝肠孢虫的发现..................................................................................31.3.2虾肝肠孢虫的检测方法..........................................................................51.3.3虾肝肠孢虫的传播方式..........................................................................51.3.4虾肝肠孢虫的防治方法..........................................................................61.4本研究的目的和意义........................................................................................6第二章虾肝肠胞虫的流行病学....................................................................................82.1材料与方法........................................................................................................82.1.1样品的采集..............................................................................................82.1.2样品处理..................................................................................................82.1.3核酸提取..................................................................................................92.1.4EHP载量的TaqmanqPCR检测...........................................................102.1.5数据处理................................................................................................122.2实验结果..........................................................................................................132.2.1样品信息................................................................................................132.2.2凡纳滨对虾群体表征............................................................................242.2.3标准曲线的绘制....................................................................................252.2.4对虾样品的实时荧光定量检测............................................................262.2.5各群体EHP的分布特征.......................................................................312.2.6不同群体EHP与生长参数的相关性...................................................33I 2.2.7多群体间EHP与对虾生长的关系比较...............................................352.3讨论..................................................................................................................36第三章感染EHP的凡纳滨对虾分组织定量检测.....................................................383.1材料方法..........................................................................................................383.1.1实验动物来源........................................................................................383.1.2样品处理................................................................................................383.1.3EHP的TaqmanqPCR检测...................................................................383.1.4血淋巴ATP浓度测定...........................................................................393.1.5蛋白浓度测定........................................................................................403.2结果..................................................................................................................413.2.1对虾的生长和体重指数........................................................................413.2.2对虾血淋巴和肌肉的蛋白含量............................................................423.2.3对虾血淋巴中的ATP含量...................................................................423.2.4不同组织EHP的TaqManqPCR检测.................................................423.2.5体长与体重指数的相关性....................................................................433.2.6血淋巴和肌肉蛋白含量与体长和体重指数的相关性........................443.2.7血淋巴和肌肉蛋白含量与血淋巴ATP含量的相关性.......................453.2.8血淋巴ATP含量与体长和体重指数的关系.......................................463.2.9不同组织间EHP载量的关系...............................................................463.2.10EHP载量与对虾生长参数间的相关性...............................................493.2.11血淋巴和肌肉蛋白含量与EHP载量的关系.....................................503.2.12血淋巴ATP含量与EHP载量的关系...............................................513.3讨论..................................................................................................................53第四章原位杂交实验..................................................................................................554.1材料方法..........................................................................................................554.1.1探针合成................................................................................................554.1.2试剂配制................................................................................................564.1.3组织固定................................................................................................584.1.4样品脱水处理........................................................................................584.1.5组织复水处理........................................................................................584.1.6原位杂交................................................................................................584.1.7显微镜观察............................................................................................594.2实验结果..........................................................................................................60II 4.2.1合成DIG标记探针...............................................................................604.2.2原位杂交实验结果................................................................................604.3讨论..................................................................................................................62参考文献........................................................................................................................64致谢..............................................................................................................................71III 上海海洋大学硕士学位论文第一章引言1.1微孢子虫的发现、分类和侵染机制1.1.1微孢子虫的发现微孢子个体微小，是一种专性寄生的真核生物，主要寄生于细胞内部。传统的光学显微镜很难观察清楚。电子显微镜的使用，使得越来越多的微孢子虫内部结构变得清晰。微孢子虫主要7部分结构组成。最外层为由三层结构组成的孢壁，包裹着核糖体、细胞核、极胞体，极管与固定盘相连接，附着在孢壁上。用电自显微镜观察时可以清晰的观察到有高密度电子的孢壁[1]。目前，微孢子虫引起的对虾疾病已经严重影响了对虾的产量，造成了一定的损失。家蚕微孢子虫是首次被鉴定命名的微孢子虫[2]，于1857年，由Nageli成功观察到根据该寄生虫在家蚕体内的形态特征[3]。家蚕微孢子虫可以引起家蚕的微粒子病，该病引起的主要症状有体色暗黑、发育迟缓、体型瘦小、常出现小蚕等症状[2]。分别在1909年和1994年，西方蜜蜂和中华蜜蜂体发现了微孢子虫。2006年和2007年间，出现了大规模的蜂群崩溃综合症[4]，该病的研究越来越多，陆续在在西班牙和台湾蜜蜂中发现微孢子虫，微孢子虫的宿主呈现转移的趋势。目前已发现并命名的微孢子虫种类超过了1400种，被分为了约160个属[4]。1.1.2微孢子虫的分类地位微孢子虫的传统分类越来越不合理，随着分子生物学相关技术的发展，和在分类学中的应用，微孢子虫应该进行新的分类和划分，部分学者认为更应该归属于真菌[5]。微孢子虽为真核生物，但其在进化过程中缺乏了过氧化物酶体和高尔基体等作为真核生物主要特征的细胞器，尤其是线粒体的缺失，使得其在细胞内寄生[6]。有研究发现了家蚕微孢子虫表面的ADP/ATP转运蛋白，进一步验证了微孢子虫可以从宿主体内搬运能量，供自己的生长发育[6]。因此，传统分类中微孢子虫被划为原生动物界(Protista)、微孢子虫门(Microspra)、微孢子虫纲(Microsprea)、微孢子虫目(Microsporida)[7]。近些年来，分子生物学手段被用在了分类方法中。依靠分子序1 上海海洋大学硕士学位论文列测序技术和进化树的构建，其拥有和真菌类更近的亲缘关系。Cavalier-Smith提出了六界分类法，跟据亲缘关系把微孢子单独划分分为一个门，归类到真菌界[8]。1.1.3微孢子虫的形态和侵染机制微孢子主要寄生于细胞内部，因其结构特殊无法在宿主细胞外繁殖，只能专性的寄生在细胞内部。微孢子虫能够感染自然界中的几乎所有的动物。随着微孢子虫分离纯化技术的不断进步，各种研究手段也不断完善。各种种属的微孢子虫寄生的宿主不同，但它们的寄生机制却十分相似[9,10]。在微孢子虫表面发现了很多种类的蛋白分布在孢壁表面，普遍认为这些蛋白可能参与了微孢子虫感染宿主细胞的过程[11]。其中极管成为了研究的热点，普遍认为极管[12]是微孢子虫感染宿主细胞的主要结构[13]。极管呈中空状，是具有弹性的蛋白质结构，在感染宿主细胞的过程中，像注射器注射的方式类似将内部物质注射到宿主细胞中。1894年，Thelohan等[10]观察到了微孢子虫中的极管的清晰结构，在后续研究成果中发现，极管呈螺旋状缠绕在细胞内部[14]。极管由几种极管蛋白组成，并且在孢子内部，不同分类的微孢子虫中的极管的缠绕圈数也各不相同，也成为分类的一种证据[11]。在感染宿主之前，极管缠绕在孢子细胞内，在接触到宿主细胞时，微孢子虫的胞外环境发生了变化，孢子可以感知这些变化，在环境合适时某些机制被触发，此时极管从孢子中穿出，冲破细胞膜，将孢内的物质注射进细胞内部。其遗传物质在宿主细胞内复制，从而实现微孢子虫遗传物质的复制和孢子的繁殖。[15]。微孢子虫的感染宿主氛围十分广泛[16]，常见的家蚕[7]、蜜蜂[4]、鱼类[17-19]、蟹类[1]、果蝇[20]、人[21]等。并且通过对家蚕微孢子虫的研究和微孢子虫蛋白分析[22]，发现病原在不同宿主间水平转移的现象[20,22]。目前部分微孢子虫实现了人工培养[23]。1.2影响凡纳滨对虾生长的主要因素1.2.1养殖环境对对虾生长的影响目前，工厂化养殖已经成为对虾养殖的主流，随之而来的是养殖手段及对虾疾病等因素影响了对虾的产量。其中养殖过程养殖水体的盐度水平[24,25]，从一定水2 上海海洋大学硕士学位论文平上影响了对虾的对虾的成活率，同时也会对对虾的生长率产生一定的影响。杨雯等通过不同盐浓度下的对虾养殖效果发现[25]，盐度为20时，是对戏生长的最佳盐度，在这种环境下，可以实现对虾生长率的最大化[26]。饲料中蛋白组分的含量影响着对虾的生长[27]，但大量蛋白质的添加使得饲料的价格变得较为昂贵。因此近些年来，饲料成分的替代物和添加剂成为了各位学者的研究热点。如张海涛等人尝试用棉粕替代饲料中的鱼粉，发现可一定程度上改善对虾的生长速率和提高对虾的免疫力和抗病能力[28]。饲料中不同添加剂的使用也从一定程度上影响了对虾的生长，比如添加不同的锌源[29]、钾、钙[30]、镁[31]等或添加一定比例的虾粉[32]等均对对虾的生长起到一定的促进作用。以至于不同饲料的投喂，对对虾生长的促进作用也有很大的差异[33]。同时对虾养殖的额工厂化，使得对虾的养殖密度较高从一定程度上影响了对虾的生长速度[34]。甚至养殖水体中泡沫的含量，都对对虾的生长产生一定的影响[35]。此外温度、光照[36]等因素对对虾生长的影响都较为明显[37]。1.2.2影响对虾生长的病原对虾传染性皮下及造血组织坏死(IHHNV，又名矮小残缺综合症)，在对虾养殖中是一种比较常见的疾病，是养殖对虾常见病之一，其对幼虾的影响较大，严重影响了对虾养殖行业的产量增长[38]。部分研究表明凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)感染后的载量，与对虾的体长、体重、体质指数(BMI)[39]和对虾的劳雷尔体重指数[40]均呈现一定的相关性。表现为对虾体内EHP的感染载量与对虾的体长、体重呈现一定的负相关性。同一批次不同对虾样品表现为，个体较大的对虾，其EHP载量明显低于较小的个体。同时对虾偷死野田村病毒也被认为可以导致对虾的生长缓慢[41]。1.3肠道上皮细胞微孢子虫的研究进展1.3.1虾肝肠孢虫的发现肠道上皮细胞微孢子虫，又“虾肝肠胞虫”，被认为是引起对虾生长缓慢的主要病原之一。对虾感染该寄生虫后，会导致对虾出现生长缓慢或生长停滞，并有时3 上海海洋大学硕士学位论文会出现白便等症状，但其不影响对虾的摄食和存活率。这种疾病在对虾的仔虾期直至养成期均有感染的迹象。并且该疾病有大规模爆发的趋势。然而，虾肝肠胞虫的第一次被报道之前，在2001年，发现了生长缓慢的幼虾对虾，在研究试图确定生长缓慢的原因时尝试了培养他们。通过光学显微镜观察到了微孢子虫，通过原位杂交确认了微孢子虫的存在，但没有通过统计手段关联到对虾生长缓慢现象[42]。虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)是2009年泰国Tourtip等描述的微孢子虫新种，其成熟的孢子为卵形，大小在0.7–1.1μm，包含单一核，5–6圈极丝、后端液泡、与极丝相连的锚定盘和电子致密的厚壁[43]。属于真菌界(Fungi)、微孢子虫门(Microsporidia)、单倍期纲(Haplophasea)、壶孢目(Chytridiopsida)、肠胞虫科(Enterocytozoonidae)、肠胞虫属(Enterocytozoon)[44,45]，严格细胞内寄生[18,46]。自2003年以来，泰国养殖斑节对虾出现生长缓慢综合征(MSGS)，造成了严重的经济损失[47]。Tourtip等在生长缓慢的斑节对虾肝胰腺中检测到EHP，但EHP感染在组织病理学上难以诊断，重度感染的对虾肝胰腺在常规的苏木精-伊红(HE)染色下很难观察到特征性的病理变化[43]，而通过原位杂交则能显示凡纳滨对虾感染EHP后其肝胰腺小管上皮细胞中存在明显杂交信号[45]。感染EHP的凡纳滨对虾肝胰腺、粪便及养殖对虾水体能经PCR检测检出EHP[19,48,49]，其肝胰腺、鳃、血淋巴、肠、心脏、肌肉组织也均可检测到EHP阳性[49-51]，但不同组织中EHP量的差异及相互关系还不明确。本实验室检测发现，在我国养殖凡纳滨对虾中自2013年起有很高的EHP阳性率，刘珍等根据GenBank中已公布的SSUrDNA序列建了EHP的SYBRGreenI实时荧光定量检测方法[39]。对3批不同区域的凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织中的EHPSSUrDNA进行实时荧光定量检测，结果显示EHP与对虾生长率呈一定的负相关关系，肝胰腺中EHP在103copiesng-1DNA以上可能代表较高的风险。而EHP载量较低时，则EHP感染与对虾生长的相关性尚不明确，需要更多验证。DominicWireduBoakye等人利用微孢子虫基因组学的研究发现，在整个进化过程中失去了合成ATP的功能[52]。因此其生长繁殖、能量代谢过程只能利用宿主细胞的ATP，从而影响宿主的能量代谢。自2009年开始，东南亚多数国家如中国、印度[48]、越南、印度尼西亚、马来西亚[42]、泰国[47]、澳大利亚[53]等国家的养殖对虾中发现。虽然不会造成对虾的大量死亡，但感染对虾表现出的生长缓慢或生长停滞的情况，仍需得到重视。病原的大规模扩散必定造成巨大的经济损失[54,55]。4 上海海洋大学硕士学位论文1.3.2虾肝肠孢虫的检测方法微孢子虫的常规的染色方法有用抗酸三色染色法[21]、高锰酸钾甲基紫法[56]、韦伯氏染色法[57]、荧光染色剂CalcofluorM2R、Uvitex2B[58]等。但由于微孢子虫个体较小，随着研究的进一步深入越来越多的手段被用于EHP的检测。一些学者运用常规PCR法[49,57,59]、LAMP[60]、qPCR[18]法对EHP进行检测。为实现EHP的定量检测，刘珍等基于SSUrDNA序列建立了基于SYBRGreenI的qPCR方法[39]。骆云慧等建立了Taqman的qPCR方法[51]，本实验室刘雅梅建立了EHP的Taqman的qPCR方法[40]。同时，原位杂交、组织病理学、电子显微镜观察等手段同样被应用与EHP的检测[45,52,61]。目前已经通过组织病理学在肝胰腺上皮细胞中发现了EHP不同阶段的孢子[50]。1.3.3虾肝肠孢虫的传播方式EHP感染方式与其他疾病的重要区别是，EHP可以通过同类间的残食实现水平传播[59]。这使得控制养殖池中的疾病扩散变得尤为困难，EHP是否能够通过对虾粪便扩散到水体中实现疾病的传播成为一项新的课题。图1-1对虾混养感染模式图(摘自PaulVinuSalachan)Fig.Schematicdrawingofthesetupforthecohabitationchallengeexperiment.(fromPaulVinuSalachan)5 上海海洋大学硕士学位论文Salachan等人通过建立对虾感染模型的方法，将感染EHP的对虾和未感染的对虾混合感染，成功的实现了EHP的混合感染[61]，在混养14天是从混养前未感染的对虾体内，通过PCR检测和H&E染色观察到了EHP的感染。其实现养殖感染的感染模型见下图1-1。Santhoshkumar等人通过向正常对虾注射感染EHP的对虾肝胰腺提取物，和投感染EHP对虾肝胰腺的方式，在感染实验后的第30天，分别取肝胰腺、心脏、鳃、肠、血淋巴肌肉在第二腹段等对虾组织。感染对虾的经过检测从实验对虾的肝胰腺、心脏、鳃、肠、血淋巴肌肉在第二腹段和取样肌肉在第六腹节中均检测到了EHP的阳性[50]。对虾感染虾肝肠胞虫后，生化等参数如总蛋白、血淋巴中的天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶等参数明显高于未感染虾肝肠胞虫的对虾。1.3.4虾肝肠孢虫的防治方法由于EHP是细胞内寄生，截止到目前还没有治疗该疾病的药物。因此养殖过程中需要认真关注重要的易感染环节，应该作为重点控制的对象。从苗种的检测、饲料的检测、饵料的控制、水体及对虾的疫情检测方面控制EHP的传播和发病。吴兴泰[62]通过改善养殖水体的水质，并投喂一些维生素、中药类成分，对凡纳滨对虾的微孢子虫感染有一定的防治效果。在于育种、养殖和病原传播方向，提出了亲虾和种苗的无疫病概念。对虾养殖池体的消毒可采用生石灰和2.5%的NaOH溶液处理。同时注意限制鲜活饵料的使用，或者增加对鲜活饵料的处理，避免因为鲜活饵料携带病原，从而引起养殖对虾的感染[54]。此外，有益微生物被各位学者大量应用在对虾养殖中进行研究[63]，益生菌的添加从一定程度上提高了对虾个体的免疫力[64,65]，对虾血淋巴中的免疫蛋白含量有了很大程度的提升[66]，提高了对虾的抗病能力[67]，降低了对虾感染病原的风险，从一定程度上有助于提高对虾产量[66]生物絮团的在水产养殖中的应用也有利于控制水体病原微生物种类和数量[68]。益生菌在改善水体环境的同时，还有助于改善对虾肠道环境，优化肠道中细菌种类，抑制病原微生物的繁殖[65]。6 上海海洋大学硕士学位论文1.4本研究的目的和意义南美白对虾是目前养殖规模最大的对虾种类之一，是典型的低脂肪高蛋白食品，饱受人们的喜爱[69]。但是，自2003年以来，泰国的对虾养殖业一直饱受对虾缓慢生长综合征的困扰，患有对虾缓慢生长综合征的养殖池中的对虾生长速度明显低于正常对虾，造成了重大的经济损失[47]。虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)是目前造成对虾生长缓慢的主要病原之一。对虾感染该寄生虫后，会导致对虾出现生长缓慢或生长停滞，但其不影响对虾的摄食和存活率。并且已经有大规模爆发的趋势，严重影响了养殖对虾的成虾产量，损害了养殖户的经济效益。近年来，对虾的大规模、高密度养殖逐渐成为趋势。疾病的预防治疗尤其重要，对虾肝肠孢虫的影响逐渐加剧。但目前，虾肝肠孢虫的详细感染机制还不清晰，还没有筛选出相关药物来预防和治疗该疾病。因此虾肝肠胞虫的防治成为一项较为艰难的课题。目前，关于虾肝肠孢虫的检测技术还不够完善，急需简便、高效的检测方法及时的检测到疾病，为疾病的预防和治疗提供充足的时间。在以后的研究工作中，虾肝肠孢虫的详细感染机制还有待更加深入的研究，以便为相关药物的筛选提供足够的理论依据。同时，急需完善相关的定量检测方法，为药物效果实现更直观的评价和分析。这些技术的建立将会是对虾养殖业的又一技术保障，将会提高对虾养殖业的经济效益和产品质量。对于科学研究、对于虾养殖业的健康、快速的发展具有非常重大的意义。EHP的检测多以肝胰腺为目标组织，其他组织中EHP的检出率及其定量关系不明，难以确定以其它组织为样品的EHP检测结果的有效性。因此，本研究对不同自然感染水平的凡纳滨对虾群体的EHP与生长相关性开展进一步研究，并对不同组织EHP量的差异进行定量检测和原位杂交验证，通过ATP浓度测定，蛋白浓度测定等技术手段。阐明EHP感染对凡纳滨对虾生长的影响，为后续研究奠定一定的理论基础。7 上海海洋大学硕士学位论文第二章虾肝肠胞虫的流行病学2.1材料与方法2.1.1样品的采集2.1.1.1样品采集材料的准备将95%酒精、分装至15mL或50mL离心管中，确保酒精体积为采集的对虾样品体积的3倍以上，以达到最佳的保存效果。准备一次性培养皿、一次性医用刀片、一次性橡胶手套、数码相机、标签纸、样品采集表等物品，将所有的取样用品放置在专用采样包内。2.1.1.2样品采集方法赴对虾养殖场，从对虾养殖虾池中随机捞取对虾，用吸水纸吸除虾体表面海水，将每尾对虾分别单独保存于事先准备好的装有95%乙醇的离心管中，做好标记并记录样品采集信息，带回实验室。将装有对虾的离心管置于-20℃冰箱或-80℃冰箱中低温保存，防止核酸降解。等待后续进行样品的处理和核酸提取及EHP感染载量的实时荧光定量检测。本论文中将采集河北黄骅(HH)、青岛平度(PD)、江苏吴江(WJ)、日照小海(RZ)四个地区的四个养殖场，对虾放苗时间各不相同，四个地区的对虾群体样本量分别为54尾、42尾、132尾、48尾，共274尾凡纳滨对虾。2.1.2样品处理用一次性镊子将凡纳滨对虾从离心管中取出，用灭菌海水冲洗虾体，以除去虾体表面残留的酒精。将虾体冲洗干净后，用吸水纸尽量吸除虾体表面的海水。用刻度尺逐尾测量对虾的生物学体长(对虾眼柄基部至尾节末端，精确至0.1cm)，并做好记录。分别用电子天平称量对虾的生物学体重(精确到0.01g)，对应每尾对虾的8 上海海洋大学硕士学位论文生物学体长，计算对虾的生长参数。用一次性培养皿代替解剖盘，将对虾置于一次性培养皿上，用一次性刀片从虾体中部划开南美白对虾的头胸甲，解剖并取对虾整个肝胰腺，将整颗对虾肝胰腺放于离心管中，用研磨棒充分研磨、混匀。防止因为EHP感染对虾肝胰腺时，在肝胰腺中的分布不同造成的实验误差。解剖过程所用的培养皿、刀片、研磨棒等物品均为一次性使用，防止对虾个体间的交叉污染。最后，取适量研磨并混匀后的肝胰腺组织用于核酸提取。2.1.3核酸提取使用购买自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生物，上海)提取处理好样品样品的DNA。提取步骤参考试剂盒中的说明书，具体提取步骤见下方。1)取2.1.2中处理过的肝胰腺组织约30mg到1.5mL离心管中，用移液枪加入200μlGA缓冲液，涡旋震荡15sec；2)加入20μl蛋白酶K溶液，涡旋震荡混匀15sec，简短离心。56℃孵育约1h，至组织完全裂解，孵育期间每十分钟颠倒混匀3至5次，促使组织尽快完全裂解；3)加入200μl的缓冲液GB，颠倒混匀后进行简短的离心，70℃孵育10min，溶液变清；4)加入200μl无水乙醇，颠倒混匀后进行简短的离心，离心管中可能出现白色的絮状沉淀；5)将上步操作中的液体完全转移至已经安装好的吸附柱中，在低速离心机中13400g离心30sec，取下管中的吸附柱后，去除管中的废液，再将CB3放回到已经清理干净的收集管中；6)加入500μlGD缓冲液，可以稍微静置一会，再13400g离心30sec，取下管中的吸附柱后，去除管中的废液，再将CB3放回到已经清理干净的收集管中；7)加入600μlPW缓冲液13400g，离心30sec，取下吸附柱后倒掉废液，一定注意清理收集管外侧的废液，防止造成离心机的污染。再将CB3放回到处理干净的收集管中；8)重复一次操作步骤7)，再次漂洗；9)将收集管和吸附柱置于离心机中13400g空离2min，以除去吸附柱中残留9 上海海洋大学硕士学位论文的液体，丢掉收集管。轻轻打开吸附柱CB3管盖，置于室温中3-5分钟，使吸附柱中残留的液体完全挥发，以免影响qPCR效果；10)将CB3吸附柱放置在新的1.5mL离心管中，向吸附柱CB3中轻轻加入100μlTE缓冲液，室温静置3-5min，使膜片上的DNA完全溶解在TE中。13400g离心2min，除去吸附柱CB3，即得到所需的DNA样品。完成DNA提取后，用核酸分析仪(Nanodrop2000c,Thermo)测定提取的样品的DNA浓度，并观察提取的DNA质量，根据DNA浓度的不同，做适当的稀释后，将DNA样品置于-20℃或-80℃冰箱保存。2.1.4EHP载量的TaqmanqPCR检测2.1.4.1标准质粒的提取取实验室中由刘雅梅等制作的在-80℃冰箱中保存的EHPTaqmanqPCR检测方法的标准重组质粒菌株[40]，接种到配制好的LB液体培养基中(AMP浓度为100μg/mL)，进行菌株的复苏。菌株复苏后，按照培养基体积的1%的量，吸取所得到的的菌液，接种到装有新鲜的LB培养基中的锥形瓶中。置于37℃恒温培养箱中培养约12-14h。标准质粒的提取采用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0(TaKaRa，大连)质粒小提试剂盒，详细的提取过程见下方。1)将SolutionⅢ放于4℃冰箱中预冷，ElutionBuffer于60℃恒温水浴锅中预热；2)吸取5mL菌液到10mL离心管中，室温下12000rpm低速离心2min后出去上清培养基；3）加入250μlSolutionⅠ充分悬浮菌体；4)加入250μlSolutionⅡ，上下轻轻地颠倒5次，千万不可剧烈震荡；5)加入350μlSolutionⅢ，上下轻轻地翻转混匀6次，置于室温中静置，处理时间为2min；6）室温下12000rpm离心10min，将上清转移至组装好的SpinColumn中；7）12000rpm离心1min，弃废液；8)加入500μlWA缓冲液，12000rpm，离心30sec，弃废液；9)加入700μWB缓冲液，12000rpm，离心30sec，弃废液；10)重复步骤9)一次；10 上海海洋大学硕士学位论文11)将SpinColumn和CollectionTube空离2min，以除去管中残留液体；12)将SpinColumn转移至新的离心管中，加入50μlElutionBuffer于SpinColumn中的膜上，静置1min，使核酸完全溶解在ElutionBuffer中；13)12000rpm离心1min，即得到标准质粒溶液。用核酸分析仪(Nanodrop2000c,Thermo)测定提取的质粒样品的核酸浓度，并观察提取的质粒质量，测定三次后计算出平均值，用于质粒拷贝数的计算。将标准质粒样品置于-20℃或-80℃冰箱冷冻保存备用。2.1.4.2标准品的稀释标准质粒浓度的计算采用以下公式：6.02×1023×质粒浓度质粒拷贝数(copies)=(2-1)2860×660其中标准质粒用核酸分析仪(Nanodrop2000c,Thermo)测定三次，取平均值作为质粒浓度；公式中的28060为重组质粒碱基数；660为四种碱基的平均分子质量；6.02×1023为阿伏伽德罗常数。将标准质粒的质粒提取液，用移液枪按照10倍梯度进行稀释，为防止核酸的降解，选用无核酸酶的DEPC水作为稀释液，每个梯度梯度稀释过程中，用移液枪吹吸30次左右，涡旋震荡15sec，置于低速离心机上，简短离心后，在进行下一个梯度稀释。质粒拷贝数选择在108-100九个梯度作为TaqmanqPCR的标准品。为防止核酸污染，使用的所有器具需要单独处理。2.1.4.3标准曲线的制作将2.1.4.2中处理好的标准品溶液，进行实时荧光定量检测，以判断标准品的稀释质量，并得到EHP拷贝数与荧光信号强度RFU的标准曲线，用来计算检测的样品中EHP载量拷贝数，详细的操作步骤见2.1.4.4。2.1.4.4EHP载量的TaqmanqPCR检测EHP载量的TaqmanqPCR检测所用的定量方法采用刘雅梅建立的方法[40]。定量所用引物和探针序列分别为F168(5'-AGTAAACTATGCCGACAA-3')、R16811 上海海洋大学硕士学位论文(5'-GCGTTGAGTTAAATTAAGC-3')和探针(5'-FAM-TCCTGGTAGTGTCCTTCCGT-TAMRA-3')。引物和探针均由上海(生工)生物工程有限公司合成，2×PremixExTaq™ProbeqPCR购自宝生物(TaKaRa,大连)。反应体系的配制见下表2-1。表2-1实时荧光定量体系配制表Table2-1ThesystemofqPCR项目体积/μlCompositionVolume/μl2×PremixExTaq™ProbeqPCR(TaKaRa,大连)10186-F(10μM)(生工生物，上海)0.8186-R(10μM)(生工生物，上海)0.8TaqmanProbe(10μM)(生工生物，上海)0.4RNasefreewater(Promaga，北京)7TemplateDNA1Total20扩增反应在实时荧光定量PCR仪(CFX96，BIO-Rad)中进行，反应扩增程序为95℃30s预变性后，95℃5s和60℃30s，进行40个循环后终止反应。2.1.5数据处理对虾的体长体重数据运用MicrosoftExcel进行处理分析，分别计算每尾对虾的体重指数(Ponderalindex,Pi,㎏/m3)。体重指数(Ponderalindex,Pi，㎏/m3)的计算公式见下方。𝑊𝑃𝑖=(2-2)𝐿3其中Pi为劳雷尔体重指数(Ponderalindex,Pi)，单位为㎏/m3；W为对虾的生物学体重，单位为㎏；L为对虾的生物学体长(对虾眼病基部到对虾尾剑末端)，单位为m。根据对虾体重指数(Pi，㎏/m3)对对虾进行正态分布。判断感染EHP后对虾的体质指数分布情况。并分别对应每尾对虾的EHP载量的TapmanqPCR定量数据，分析EHP载量拷贝数与对虾体重指数Pi的相关性。经过回归分析得出对虾体重指数Pi与对虾感染EHP程度的相关性，通过以上的分析，寻找EHP的感染影响对12 上海海洋大学硕士学位论文虾生长的直接证据。为了对不同放苗时间的各群体进行生长比较，根据各群体放苗后的养殖天数(T)，假定平均放苗时体长(L–30)为1cm，并用体重指数Pi=W·L的关系估计放苗时平均体重(W0)，推算各群体的体长日增长率(DGL)和体重的日增长率(DGW)。DGL(%d-1)=(L–L–10)·(L0·T)·100%(2-3)DGW(d-1)=(W–W–10)·(W0·T)(2-4)根据李玉虎等报道的凡纳滨对虾生长曲线Logistic函数y=A·[1+B·Exp(–K·T)]–1及相关的体重和体长拟合参数，推算各群体生长极限(A)、瞬时生长率(K)和拐点时间(T[70]50)等生长参数。A=y·[1+B·Exp(–K·T)](2-5)K=–Ln[(A·y–1–1)·B-1]·T–1(2-6)T–1–150=Ln(A·y–1)·K+T(2-7)其中，对于体长生长参数，y为体长L(cm)，A=14.8886cm，B=6.613，K=0.020d-1；对于体重生长参数，y为体重W(g)，A=18.991g，B=133.231，K=0.039d-1。2.2实验结果2.2.1样品信息于2016年6月26日、7月20日、9月14日和9月20日自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾养殖场分别采集放苗养殖40–80d的凡纳滨对虾样品共274尾。上述HH、PD和WJ群体样品在现场取样，保存于3倍体积的95%乙醇中，带回实验室进行体长(L)和体重(W)测量(图2-2)。RZ群体凡纳滨对虾装于塑料袋中，充纯氧后运送至实验室，暂养7天。暂养期间，暂养期间连续充气。保持水温为26–28℃，盐度29–31。每天投喂正大0号配合饲料3次，每天换水量为1/3。根据采样记录表、采样笔记及后续试验中记录的数据，将所有采样信息汇总成以下几个表格，详细信息见表2-2、表2-3、表2-4、表2-5、表2-6。13 上海海洋大学硕士学位论文表2-2采集样品信息表Table2-2Theinformationofsamples对虾群体abcd样品来源河北黄骅青岛平度江苏吴江日照小海OriginofsampleHuangHuaPingDuWuJiangXiaoHai放苗时间/天54604080Feedingtime/day样本量/尾544213248Number/tail体长范围/cm3.0-6.93.2-8.81.2-3.66.2-10.0Length/cm体重范围/g0.16-3.410.2-6.050.04-0.62.54-9.67Weight/g表2-3河北黄骅样品体长体重信息Table2-3ThelengthandweightinformationofsamplesfromHuangHuaofHeBeing样品编号体长/cm体重/g体重指数/kg/m3NumberLength/cmWeight/gPi/kg/m3DL201606240016.83.109.86DL201606240026.93.4110.38DL201606240035.52.0912.56DL201606240045.21.309.52DL201606240054.40.849.86DL201606240064.20.7910.66DL201606240074.30.9111.85DL201606240083.20.247.32DL201606240094.40.475.52DL201606240104.70.666.36DL201606240113.10.3612.08DL201606240124.50.717.79DL201606240135.41.408.89DL201606240143.10.279.06DL201606240143.70.356.91DL201606240164.20.425.67DL201606240173.50.163.73DL201606240183.20.319.46DL201606240193.60.449.4314 上海海洋大学硕士学位论文DL201606240203.60.459.65DL201606240214.00.578.91DL201606240223.60.4710.07DL201606240233.40.4411.19DL201606240243.00.3613.33DL201606260254.20.567.84DL201606260264.00.609.38DL201606260274.20.557.70DL201606260284.50.9210.10DL201606260293.60.6413.72DL201606260306.22.209.23DL201606260314.71.1711.27DL201606260323.70.5611.06DL201606260334.50.808.78DL201606260345.01.3010.40DL201606260355.61.729.79DL201606260365.51.509.02DL201606260375.31.057.05DL201606260384.50.859.33DL201606260394.10.7611.03DL201606260405.41.338.45DL201606260414.81.109.95DL201606260425.01.169.28DL201606260436.12.3110.18DL201606260445.01.5112.08DL201606260456.12.139.38DL201606260465.41.7210.92DL201606290015.21.9213.65DL201606290025.51.9511.72DL201606290035.21.6011.38DL201606290044.51.1512.62DL201606290054.91.169.86DL201606290064.91.058.92DL201606290074.20.608.10DL201606290084.51.0010.97表2-4青岛平度样品体长体重信息Table2-4ThelengthandweightinformationofsamplesfromPingDuofQingDao样品编号体长/cm体重/g体重指数/kg/m3NumberLength/cmWeight/gPi/kg/m3201607200016.82.808.9015 上海海洋大学硕士学位论文201607200026.93.059.28201607200038.86.058.88201607200045.01.6313.04201607200057.84.649.78201607200066.53.0511.11201607200076.12.099.21201607200085.81.959.99201607200094.51.0311.30201607200105.81.598.15201607200116.22.5710.78201607200125.51.609.62201607200136.02.039.40201607200146.82.096.65201607200158.04.608.98201607200165.11.309.80201607200175.72.1411.56201607200187.12.807.82201607200195.11.6012.06201607200206.42.108.01201607200214.70.959.15201607200225.51.7010.22201607200235.61.589.00201607200245.01.3811.04201607200256.11.807.93201607200265.71.578.48201607200276.52.8010.20201607200286.22.269.48201607200295.51.488.90201607200305.41.6310.35201607200315.01.4111.28201607200326.22.5410.66201607200335.51.418.4716 上海海洋大学硕士学位论文201607200345.21.5511.02201607200354.10.202.90201607200365.51.7010.22201607200373.20.6419.53201607200386.83.009.54201607200395.21.228.68201607200405.92.0610.03201607200415.51.237.39201607200427.53.147.44表2-5江苏吴江样品体长体重信息Table2-5ThelengthandweightinformationofsamplesfromWuJiangofJiangSu样品编号体长/cm体重/g体重指数/kg/m3NumberLength/cmWeight/gPi/kg/m3201609140013.10.279.06201609140023.20.3310.07201609140032.60.2313.09201609140043.20.3310.07201609140052.80.2210.02201609140062.70.2814.23201609140072.50.2214.08201609140092.20.1615.03201609140102.20.1715.97201609140112.00.1215.00201609140122.70.189.14201609140132.10.1010.80201609140142.10.1212.96201609140151.90.1116.04201609140162.10.1314.04201609140172.20.1110.33201609140181.70.0510.18201609140192.40.2014.4717 上海海洋大学硕士学位论文201609140202.60.2413.65201609140212.70.2613.21201609140222.30.2419.73201609140232.60.2413.65201609140242.50.2415.36201609140253.20.3811.60201609140262.10.1314.04201609140273.10.3311.08201609140283.20.329.77201609140292.30.1512.33201609140302.30.1310.68201609140313.00.269.63201609140322.60.2715.36201609140332.50.1710.88201609140342.30.1411.51201609140352.60.179.67201609140362.50.1912.16201609140372.40.139.40201609140382.20.1211.27201609140392.60.2514.22201609140402.30.2520.55201609140412.70.2512.70201609140422.10.1516.20201609140432.50.1610.24201609140443.20.3911.90201609140452.30.1310.68201609140462.20.2119.72201609140472.60.1910.81201609140481.40.0725.51201609140491.80.0915.43201609140501.90.1623.33201609140512.50.1811.5218 上海海洋大学硕士学位论文201609140522.40.2719.53201609140531.90.068.75201609140542.70.2211.18201609140551.50.0514.81201609140562.40.1510.85201609140571.80.1017.15201609140581.80.1118.86201609140591.70.0714.25201609140601.60.0614.65201609140613.10.3411.41201609140621.90.1116.04201609140633.00.3312.22201609140642.20.1413.15201609140652.30.1814.79201609140663.00.3011.11201609140672.30.2016.44201609140682.20.2119.72201609140692.00.1316.25201609140702.20.1413.15201609140712.20.1615.03201609140722.40.2014.47201609140732.90.3815.58201609140743.10.5117.12201609140752.30.1713.97201609140762.70.2713.72201609140772.50.2113.44201609140782.10.1920.52201609140792.30.2520.55201609140802.10.2324.84201609140811.90.1420.41201609140822.60.2614.79201609140832.20.1615.0319 上海海洋大学硕士学位论文201609140842.00.1417.50201609140851.70.1020.35201609140862.20.1715.97201609140873.10.4515.11201609140881.80.1525.72201609140892.50.2314.72201609140903.20.5416.48201609140923.60.6012.86201609140932.50.2817.92201609140942.20.1715.97201609140952.70.2512.70201609140961.80.1017.15201609140972.50.2012.80201609140982.80.2310.48201609140992.50.2012.80201609141002.40.2215.91201609141012.00.1215.00201609141022.80.2511.39201609141032.20.1715.97201609141041.90.1116.04201609141052.30.1915.62201609141061.70.0714.25201609141072.00.1113.75201609141081.60.0717.09201609141092.30.2318.90201609141102.30.2016.44201609141112.00.1215.00201609141122.60.2715.36201609141132.40.2215.91201609141142.50.2012.80201609141152.40.1913.74201609141161.70.0612.2120 上海海洋大学硕士学位论文201609141172.00.1113.75201609141182.10.1516.20201609141192.40.1913.74201609141201.80.1017.15201609141212.50.2616.64201609141223.10.3612.08201609141232.80.3114.12201609141242.70.2412.19201609141252.00.1518.75201609141262.40.2115.19201609141272.20.1816.90201609141281.80.0915.43201609141291.20.0528.94201609141301.40.0621.87201609141311.40.0414.58201609141322.80.3515.94表2-6日照小海样品体长体重信息Table2-6ThelengthandweightinformationofsamplesfromXiaoHaiofRiZhao样品编号体长/cm体重/g体重指数/kg/m3NumberLength/cmWeight/gPi/kg/m3201609200017.33.849.87201609200028.56.5910.73201609200037.74.5810.03201609200048.86.229.13201609200057.24.5012.06201609200069.27.529.66201609200078.26.3011.43201609200088.15.3610.09201609200097.74.8410.60201609200107.94.509.13201609200117.84.8710.2621 上海海洋大学硕士学位论文201609200127.23.9310.53201609200138.15.029.45201609200147.95.3210.79201609200156.73.6812.24201609200167.84.709.90201609200176.83.9312.50201609200188.35.8210.18201609200198.66.9910.99201609200209.17.7310.26201609200217.24.0710.90201609200227.84.719.93201609200237.13.8110.65201609200246.73.5111.67201609220016.22.5410.66201609220027.84.609.69201609220037.95.0110.16201609220049.07.5210.32201609220058.66.4810.19201609220068.56.6210.78201609220078.77.3311.13201609220088.56.4810.55201609220098.55.709.28201609220108.55.749.35201609220117.84.339.12201609220127.03.8111.112016092201310.09.679.67201609220149.17.499.94201609220157.23.439.19201609220168.35.439.50201609220179.98.678.94201609220188.86.209.10201609220197.13.389.4422 上海海洋大学硕士学位论文201609220206.52.709.83201609220219.07.4510.22201609220227.23.8110.21201609220237.03.6210.55201609220246.93.4110.38根据表2-3、表2-4、表2-5、表2-6四个表格种的对虾体长、体重及对虾的体重指数，运用MicrosoftExcel将四个批次的样品的体重指数进行正态分布处理。其正态分布图见下方图2-1。15a0.25b250.20.2200.1510/Count0.15/Count150.1100.050.15500.05对虾尾数对虾尾数0-0.05005.57.810.112.4体重指数Pi㎏/m3体重指数Pi㎏/m340c0.1515d0.5300.40.110/Count200.3/Count0.050.21050.1对虾尾数0000对虾尾数体重指数Pi㎏/m3体重指数Pi㎏/m3图2-1四批对虾群体体重指数正态分布图a：河北黄骅；b：青岛平度；c：江苏吴江；d：日照小海Fig2-1Fourbatches’normaldistributionofPonderalindexa:HuangHuaofHeBei;b:PingDuofQingDaoofShanDong;c:WuJiangofJiangSu;XiaoHaiofRizhaoofShanDong.根据表2-3、表2-4、表2-5、表2-6四个表格中的数据及正态分布图可见，河北黄骅、青岛平度、江苏吴江、日照小海四个地区的对虾群体体长范围分别为3.0-23 上海海洋大学硕士学位论文6.9cm、3.2-8.8cm、1.2-3.6cm、6.2-10.0cm，体重范围分别为0.16-3.41g、0.2-6.05g、0.04-0.6g、2.54-9.67。表现为对虾体长体重差距较大，反应到对虾群体表现为对虾个体大小参差不齐。根据图2-1中的正态分布图，可见感染EHP后对虾群体体重指数分布呈现出不同的模式，除河北黄骅群体外，其余群体均表现出体重指数分布偏小的趋势，反应到对虾群体中呈现为对虾个体偏瘦。2.2.2凡纳滨对虾群体表征先后自河北黄骅、山东平度、江苏吴江和山东日照采集了4个凡纳滨对虾群体。其中河北黄骅群体(HH)养殖时间为54d，主要表现为生长缓慢，个体大小差异较大；山东平度群体(PD)养殖时间为60d，主要表现为个体大小差异非常大，较正常情况生长缓慢；江苏吴江群体(WJ)养殖时间为40d，在4个群体中养殖期最短，同样表现为个体差异较大；山东日照群体(RZ)养殖时间80d，在四个群体中养殖期最长，生长接近正常。表2-7对虾群体样品生物学信息Tab.2-7Thebiologicalinformationofsamplesfromshrimppopulations对虾群体HHPDWJRZShrimppopulation体长/cm4.59±0.935.90±1.052.35±0.467.95±0.88Bodylength体长日增长率/d-1(6.6±1.7)%a(8.2±1.8)%b(3.4±1.2)%c(8.7±1.1)%bLengthdailygrowthrate体重/g1.06±0.712.09±1.090.20±0.105.29±1.63Bodyweight体重日增长率/d-12.0±1.4a3.6±1.9b0.32±0.18c6.4±2.0dWeightdailygrowthrate体重指数/×10-3gcm-39.67±2.04a9.67±2.30ac14.72±3.64b10.26±0.84cPonderalindex注：标注相同小写字母表示无显著差异(P>0.05)，标注不同小写字母表示有显著差异(P<0.05)。Note:Datamarkedwithsamelowercasemeannosignificantdifference(P>0.05);datamarkedwithdifferentlowercasesmeanssignificantdifference(P<0.05).24 上海海洋大学硕士学位论文对各群体进行体长和体重测量(表2-7)。数据表明，HH群体体长变异系数为20.3%；PD群体体长变异系数17.8%；WJ群体体长变异系数为19.5%；RZ群体体长变异系数为11.1%。从体长变异系数来看，4个群体体长差异从大到小差异依次为HH>WJ>PD>RZ，体长日增长率从小到大依次为WJ
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