缺氧诱导因子1α基因C1772T多态性与2型糖尿病肾病相关性研究

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目录一、中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1二、英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3三、论文正文1、引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯184、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯245、结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯286、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯297、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35四、附录A中英文术语缩略语表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36五、附录B个人简历及发表论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39六、附录C1、综述正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48 缺氧诱导因子1α基因C1772T多态性与2型糖尿病肾病相关性研究中文摘要研究目的：检测汉族人群中缺氧诱导因子1α基因第12号外显子是否存在C1772T多态性，研究其与2型糖尿病肾病是否存在相关性，以探讨糖尿病肾病可能的遗传背景。研究方法：收集2012年6月～2013年5月蚌埠医学院第一附属医院内分泌科244例2型糖尿病住院患者资料，其中糖尿病肾病组患者140例（其中，男性72例，女性68例），糖尿病组（糖尿病无肾脏并发症组）患者104例（其中，男性62例，女性42例）。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术及测序法检测缺氧诱导因子1α基因C1772T多态性，使用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析。研究结果：1、汉族人群中存在缺氧诱导因子1α基因第12号外显子C1772T位点存在C/T单核苷酸多态性,使脯氨酸突变为丝氨酸（Pro582Ser）。2、糖尿病组与糖尿病肾病组相比，缺氧诱导因子1α基因第12外显子C1772T位点“T”等位基因携带率较高（15.38%VS7.14%，P＜0.05），OR值为0.42（95%CI:0.18～0.98）。3、CT型等位基因组与CC型等位基因组相比，CT基因型组血浆肌酐较低，存在统计学差异（P<0.05）,两组间性别、年龄、BMI、血糖、C肽、血脂等指标无明显差异（P>0.05）。4、糖尿病组与糖尿病肾病组比较，糖尿病组血浆甘油三酯、肌酐、尿素氮较低，高密度脂蛋白胆固醇增高，存在统计学差异（P＜0.05）。5、糖尿病肾病相关因素的logistic回归分析表明，高HbA1c、低HDL-c是糖尿病1 肾病的高危因素，C1772T位点基因多态性未进入方程。研究结论：1、汉族人群中存在缺氧诱导因子1α基因第12号外显子C1772T位点C/T单核苷酸多态性。2、缺氧诱导因子1α基因C1772T位点单核苷酸多态性中，“T”等位基因可能是2型糖尿病肾病的保护性因素，仍待进一步探讨。3、糖尿病组与糖尿病肾病组相比较，糖尿病组甘油三酯、肌酐、尿素氮较低，高密度脂蛋白胆固醇增高。4、高HbA1c、低HDL-c是糖尿病肾病的高危因素。关键词：糖尿病肾病；缺氧诱导因子1α；基因多态性2 Thecorrelationresearchbetweenthehypoxia-induciblefactor-1αgeneC1772Tpolymorphismandtype2diabeticnephropathyAbstractObjective：Toexplorethepresencewhetherhypoxia-induciblefactor1αgeneNo.12exonsC1772TlocipolymorphisminChineseHanpopulation,Studieswhetherthereisacorrelationwithtype2diabeticnephropathy，Andtoinvestigatethediabeticnephropathypossiblegeneticbackgroud.Methods：244subjectswithtype2diabeteswererecruitedfromdepartmentofendocrinologyofthefirstaffiliatedhospitalofbengbumedicalcollegefromJune2012toMay2013,Ofwhich140casesofpatientswithdiabeticnephro-pathy（Amongthem,male72cases,female68cases）.Groupof104patientswithdiabetes（Amongthem,62weremales,42females）.Allsubjectsweredivi-dedinto“diabetes”groupand“diabeticnephropathy”group.UsingPCR-RFLPanddire-ctsequencingtodetecthypoxia-induciblefactor1αgeneC1772Tpoly-morphism.UsingSPSS17.0statisticalsoftwaretoanalyzetheexperimentaldata.Results：1Hypoxia-induciblefactor1αgeneNo.12exonsC1772TlociexistC/TsinglenucleotidepolymorphismsinChineseHanpopulation,whichcouldchangeprolinetoserine（Pro582Ser）.2Comparedwith“diabeticnephropathy”group,“diabetes”grouphavehigherrate（15.38%VS7.14%，P<0.05）atHIF-1αgeneexon12C1772Tloci“T”allele,OR=0.42（95%CI:0.18～0.98）.3 3PatientswithCTtypeallelecomparedwiththetypeCC,CTgenotypehavelowerplasmacreatinine,Thereweresignificantdifferences（P<0.05）,Betweenthetwogroupsofgender,age,BMI,bloodglucose,C-peptideandlipidshowednosignificantdifference（P>0.05）.4Comparedwith“diabeticnephropathy”group,“diabetes”grouphavelowertrigly-cerides,creatinine,ureanitrogenandhigherhigh-densitylipoproteincholesterol,Thereweresignificantdifferences（P<0.05）.5ButlogisticregressionanalysisindicatedthathighHbA1candlowHDL-cisariskfactorfordiabeticnephropathy,C1772Tpolymorphismpolymorphismdidnotentertheequation.Conclusion：1Hypoxia-induciblefactor1αgeneNo.12exonsC1772TlociexistC/TsinglenucleotidepolymorphismsinChineseHanpopulation.2Hypoxia-induciblefactor1αgeneC1772Tsinglenucleotidepolymorphisms,"T"allelemaybeaprotectivefactorintype2diabeticnephropathy,pendingfurtherinvestigation.3Comparedwith“diabeticnephropathy”group,“diabetes”grouphavelowertrigly-cerides,creatinine,ureanitrogenandhigherhigh-densitylipoproteincholesterol.4HighHbA1candlowHDL-cisariskfactorfordiabeticnephropathyKeywords：Diabeticnephropathy;Hypoxia-induciblefactor-1α;Polymorphism4 引言糖尿病（diabetesmellitus,DM）目前已经成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三位危害人类健康的慢性非传染性疾病。随着人们生活水平的提高，生活模式的现代化和人口逐渐老龄化，糖尿病患病率呈现出明显的上升趋势。根据国际糖尿病联盟（IDF）估计,全球糖尿病人数已超过3亿。我国的糖尿病流行病学调查表明，中国糖尿病患病率（9.7％）高于全球平均患病率（6.4％），若根据此患病率估算，我国糖尿病患病人数已接近1亿，形势已经非常严峻,控制糖尿病,刻不容[1]缓。我国是人口大国，人口基数庞大，随着经济社会的发展，营养过剩、肥胖等糖尿病高危因素日益突出，预计在不久的将来我国糖尿病的患病人数将会超过[2]印度，成为世界上糖尿病患病人数最多的国家，糖尿病的防控压力巨大。糖尿病的病因和发病机制非常复杂，目前尚未完全阐明。但是“糖尿病是受遗传和环境因素共同影响的疾病”已成为医学界对糖尿病发病机制的基本共识。部分糖尿病患者具有明确的遗传倾向，其他遗传性疾病也往往伴发糖尿病，很多研究也表明糖尿病患者常存在某些基因位点的突变或多态性，这些证据均表示糖尿病是种多基因遗传性疾病。除遗传因素外，环境因素对胰岛β细胞功能具有重要影响，如营养过剩、肥胖、药物等。胰岛β细胞合成和分泌的胰岛素，经血液循环到达体内各组织器官的靶细胞，与其特异受体结合后调节细胞内物质和能量代谢过程，此通路中任何环节出现异常均可引发机体物质和能量代谢的紊乱，甚至引发糖尿病。临床常见的糖尿病类型中，基本都以胰岛素分泌不足或（和）相对不足为核心，胰岛β细胞的功能成为糖尿病发病的关键角色。另外，胰岛α细胞在糖尿病发病中的作用也日益得到重视，一般情况下基础胰高血糖素水平可维持人体50%～70%的葡萄糖产生量，因此胰高血糖素的分泌及信号传导对血糖[3]的调节同样发挥至关重要的作用。糖尿病并发症包括急性、慢性、感染性并发症。糖尿病的急性并发症主要包括酮症酸中毒、高渗性昏迷等；糖尿病的慢性并发症可波及全身重要器官，主要包括大血管病变、微血管病变、神经病变及糖尿病足等，其中微血管病变是糖尿5 病的特异性并发症，典型的病理改变是微血管基底膜的增厚和微循环障碍;糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）作为典型的微血管并发症是影响患者预后的重要因素，也是糖尿病患者致死、致残的主要原因。目前已知DN与高血糖、氧化应激、胰岛素抵抗、遗传易感性等多因素相互作用有关。其中，遗传易感性在DN发生发展中的作用已为人所熟知。另外，缺氧已经被证明是DN发展过程中[4][5]的核心致病机制。糖尿病患者肾脏缺氧的原因是“氧的输送减少”和“氧的消耗[6]增加”，氧耗的增加部分主要是因为呼吸解偶联增加导致的。缺氧诱导因子-1（hypoxia-induciblefactor1，HIF-1）是细胞氧代谢重要的调节因子，它通过调节与细胞能量代谢、糖转运、血管与红细胞生成等相关基因的表达，使细胞易于适[7]应低氧环境。HIF是1992年Semenza等人在研究肝癌细胞核提取物过程中发现的一种蛋白，它能特异地结合在促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）基因增强子的寡[8]核苷酸序列上，在缺氧状态下HIF能使EPO转录活性提高7倍。HIF是由α和β两个亚基组成的异二聚体转录因子，两者均属于碱性螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）-PAS（Per-Arnt-Sim）超家族。HIF的α亚基共有3种，目前研究较多是HIF-1α和HIF-2α，这两种亚基在结构和功能上具有相似性，HIF-3α由于缺乏羧基末端的转录活化结构，可能对缺氧诱导的基因表达调节起负[9][10]性作用。而HIF-1α和HIF-2α的调节也并不完全相同。HIF-1活性主要是依赖HIF-1α亚基的降解实现精密调节，其降解的分子基础是氧依赖的两个脯氨酸残基羟化。HIF-1α包含两个转录激活区（transactivationdomain，TAD）和一个氧依赖的降解区（oxygenDependentdegradationdomain，ODD）。TAD对转录活性发挥重要调节作用，而ODD区中存在的两个脯氨酸是HIF-1α降解限速酶的作用靶点,[11]限速酶即所谓的HIF-脯氨酰羟化酶（prolylhydroxylase,PHD）。在常氧情况下，ODD区中的两个脯氨酸被PHD羟化为脯氨酸残基，使其能够与希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白（vonHippel-Lindautumor-suppressorprotein，pVHL）结合，并被E3泛[7，12]素连接酶识别结合，使HIF-1α通过泛素依赖的蛋白酶体降解和失活。PHD的活性在缺氧的条件下被抑制，使得HIF-1α的ODD区中的两个脯氨酸羟化受阻，最终导致HIF-1α降解受阻和HIF-1α积聚，HIF-1激活并转移到核缺氧反应元件（hypoxicresponsiveelements，HRE）上，通过上调一系列至关重要的靶基因转6 [7，13]录，进一步增强组织对缺氧的适应。HIF-1是细胞氧平衡的关键中介物，有利于机体适应缺氧环境，通过影响基因的表达参与细胞能量代谢、葡萄糖转运、血管生成和红细胞生成的调节，并促进了无氧代谢等缺氧应答反应。HIF-1α的基因位于14q21-24，由15个外显子和14个内含子组成，编码826个氨基酸;HIF-1β基因位于1q21，在其5’端基因内含有一个编码15个氨基酸的45bp可变外显子，编码774或者789个氨基酸。目前已发现HIF-1的下游靶基已有上百种，主要包括血红素氧化酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）、糖酵解酶、诱生型NO合酶（iNOS）、结缔组织生长因子（CTGF）、内皮素-1（ET-1）、促红细胞生成素（EPO）、环氧合酶（COX）、基质金属蛋白酶（MMP）、血栓素合酶（TXS）、基质金属蛋白酶抑制物（TIMP）、肾上腺髓质素（ADM）、I型纤溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）等基因，有研究[14]表明，人类动脉内皮细胞内2％的基因均受HIF-1基因调节，可见其影响范围之广泛。各种因子对机体功能的调节都存在组织特异性，同一种因子可作用于不同的细胞类型中，即使是相同的基因也可能存在下调、上调甚至无变化等情况，这为明确HIF-1的作用增加了难度。有研究证实HIF-1α基因外显子存在多个单核苷酸多态性位点（single[15]nucleotidepolymorphisms,SNPs）,并且其基因多态性与机体缺氧损害时不同的[16]反应密切相关。在冠状动脉病变中，HIF-1α基因多态性可影响患者的临床结局[17][18]和并发症，此外，急性肾损伤的预后也与HIF-1α基因多态性密切相关。但是，HIF-1在不同疾病中具有不同的临床意义，在肿瘤中其通过调节肿瘤细胞能[19]量代谢、促进癌床血管生成，以利于肿瘤细胞适应缺氧环境并促进转移。通过DN动物模型发现，HIF-1α主要在DN小鼠肾小管上皮细胞和肾间质细胞中表[20]达，HIF-2α主要在肾小管周围细胞、足细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞中表[21][22]达。糖尿病对HIF-1α的稳定性、转录活性具有复杂的抑制作用，从而阻碍[23]HIF-1α调节人体至适应缺氧的最佳状态。在HIF-1α多种SNPs中，在其第12号外显子C1772T（rs11549465）的单核苷酸发生了替换，即HIF-1α氨基酸序列中582位的脯氨酸（proline，Pro）变成了丝氨酸（Serine，Ser）（Pro582Ser），[15]这种改变可明显提高细胞低氧、高糖环境下HIF-1α的表达水平。综上所述，找出DN保护性或危险性的基因，不但能为DN的发病机制提供7 有用的信息，还能为这种致死性的并发症提供新的治疗方法。最新研究表明缺氧诱导因子1α基因C1772T多态性（rs11549465）可能与1型糖尿病肾病具有关联[15]性，但与2型糖尿病肾病的关系仍不清楚。本研究对2012年6月～2013年5月入住蚌埠医学院第一附属医院内分泌科的244例2型糖尿病患者外周血白细胞应用PCR-RFLP及基因测序技术，研究缺氧诱导因子1α基因C1772T多态性与2型糖尿病肾病及病情发展的关系，探讨DN易感性的预测方法。8 材料和方法1材料1.1实验对象选取对象为2012年6月～2013年5月入住蚌埠医学院第一附属医院内分泌科2型糖尿病患者，入选2型糖尿病患者244例，均为汉族人群（三代以上均是汉族），糖尿病病史均在10年以上；其中，男性134例，女性110例，平均年龄（54.70±14.82）岁。糖尿病诊断标准（根据1999年WHO糖尿病的诊断标准）：“糖尿病症状（如多饮、多尿、多食、体重减轻）加上任意时间血浆葡萄糖≥11.1mmol/L,或空腹血糖（FPG）≥7.0mmol/L,或OGTT2hPG≥11.1mmol/L”；需重复确认一次，诊断才能成立。根据尿白蛋白排泄率（urinaryalbuminexcretionrate,UAER）进行分组，UAER<20µg/min为糖尿病组（即糖尿病无肾脏并发症组，DM组）共104例，男性62例，女性42例，平均年龄（54.63±14.92）岁；UAER≥20µg/min，为糖尿病肾病组（DN组）共140例，男性72例，女性68例，平均年龄（54.76±14.79）岁。排除因肝脏、心脏及其他全身疾病引起的蛋白尿患者，原发泌尿系统疾病和应用影响肾功能药物者,所有患者均知情并签署了同意书。1.2主要试剂和药品（1）EDTA抗凝剂：采用含有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝剂的血常规管（自备）；（2）血液基因组DNA提取试剂盒（BloodGenomeDNAExtractionKit），包括：GenTLESolutionI、GenTLESolutionII、GenTLESolutionIII。（购自宝生物工程（大连）有限公司）；（3）DL500DNAMarker（购自宝生物工程（大连）有限公司）；2＋（4）PCRMasterMix（2X），包含：TaqDNA聚合酶（含10×Buffer及Mg）、dNTP；（5）限制性内切酶HphI；（6）PCR引物；9 （7）异丙醇；（8）100％无水乙醇；（9）1×TEBuffer；（10）5×TBEBuffer；（11）溴化乙锭溶液（10mg/ml）；（12）上样缓冲液溴酚蓝；（4）～（12）均购自上海生工生物技术股份有限公司；（13）琼脂糖粉：购自Sigma公司；（14）双蒸水：蚌埠医学院科研中心组织移植安徽省重点实验室提供。1.3主要仪器（1）电热恒温水温箱：H.SWX-60085，上海新苗医疗器械制造有限公司；（2）高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司；（3）核酸蛋白测定仪：BioPhotometerPlus，艾本德中国有限公司；（4）梯度PCR扩增仪：EOC-810，东胜国际贸易公司；（5）全自动凝胶成像系统：Tanon3500，上海天能科技有限公司；（6）数显恒温测速磁力搅拌器：金坛市岸头良友实验厂；（7）空调：美的集团；（8）涡旋混合器：QL-861，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；（9）掌上型迷你离心机：LX-400，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；（10）超低温冰箱：ULTRALOW，日本三洋电器集团；（11）电子分析天秤：BSA224S,赛多利斯科学仪器厂；（12）冰箱：西门子（中国）有限公司；（13）精密数显酸度计：PHS-3（0.01级），上海天达仪器公司；（14）微波炉：Midea，美的集团；（15）分析实验室专用纯水机，北京群光科技发展中心；（16）双人单面净化工作台：苏州净化设备厂；（17）稳压稳流电泳仪：上海天能科技有限公司；（18）多功能暗箱式紫外透射仪：ZF-90型，上海顾村电光仪器厂；（19）制冰机；10 （20）Tips管：0.1～10µl，0.5～10µl,200µl,1～1000µl等若干；（21）Eppendorf管：0.2ml、0.5ml、1.5ml各若干；（22）BBI精密弹道可调移液器：1～10µl、2～20µl、100～1000µl；（23）刻度塑料烧杯：50ml、100ml；（24）塑料漏斗：50mm、35mm；（25）一次性注射器：5ml、20ml各若干；以上设备均由蚌埠医学院科研中心组织移植安徽省重点实验室提供。2.实验方法2.1标本的采集与保存登记并记录DM患者的姓名、性别、年龄、病程；要求每位患者脱鞋及穿薄衣测量身高、体重，计算体重指数（bodymassindex,BMI），体重指数（BMI）22＝体重（kg）/身高（m），早晨空腹抽取静脉血液，检测血清肌酐（serumcreatinine，Scr）、尿素氮（bloodureanitrogen，BUN）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（totalcholestrol，TC）、低密度脂蛋白胆同醇（lowdensitylipoproteincholesterol,LDL-c）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoproteincholesterol,HDL-c）、糖化血红蛋白（hemoglobinA1c,HbA1c），血压应在患者至少休息10min-15min后测量。所有患者均留取24h尿液，应用竞争性放射免疫分析法检测微量白蛋白（micro-albumin，mALB）。隔夜空腹10小时后,晨8:00行OGTT或标准馒头餐试验,取静脉血,测定空腹葡萄糖（fastingplasmaglucose，FPG）及餐后2小时葡萄糖（2hourpostprandialplasmaglucose，2hPG）（葡萄糖氧化酶法），空腹C肽（fastingC-peptide，CP）及餐后2小时C肽（2hourpostprandialC-peptide，2hCP）（放射免疫法）。另外使用EDTA-2K抗凝管留取患者肘静脉血液约5ml，放置在-80℃环境下保存，用于提取基因组DNA。2.2外周血基因组DNA的提取与保存（根据TaKaRaCode：D9081血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作）2.2.1提取前准备（1）打开水温箱，加入适量水，将温度调节至50℃，为下一步准备水浴。（2）取70ml无水乙醇与30ml纯水加入烧杯中，使用磁力搅拌器混匀，制成70％乙醇备用。11 （3）将抗凝血从-80℃冰箱中取出，并在冷水中充分解冻。（4）GenTLESolutionII较易出现沉淀，如果出现此现象，勿取沉淀，离心后取其上清液。（5）GenTLESolutionI具有烧灼的危害，如若不小心进入眼睛或接触到皮肤，立即用清水清洗。（6）GenTLESolutionI保存于20℃以下时，有时可能会出现沉淀，此时其粘度也较大，较难吸取，请于20℃以上保存。如果出现沉淀，可在50℃水浴中加热1.5小时，待其沉淀完全溶解后使用，水浴温度请勿大于60℃。（7）防治试剂被污染，请使用灭菌的Tip分装。（8）上下游引物稀释配制：将装有上下游引物的EP管在离心机上离心后，上游引物加入40µl的去离子水，下游引物加入44µl的去离子水，震荡后混匀，制成100µmol/L的引物原液，再各取两个Tip管做好标记，用移液器各吸取4µl分别加入相应Tip管，在各加入16µl的去离子水，混合均匀，制成0.01mmol/L的引物浓度，备用。（9）取100ml的5×TBE缓冲液原液，加入400ml的双蒸水，混匀后，制成1×TBE缓冲液备用，常温保存。2.2.2DNA的提取与保存（1）取数只灭菌的1.5ml离心管，并根据标本做好标记，依次加入GenTLESolutionI500µl。（2）将解冻的血液轻轻混匀，用移液器取100µl血液，按顺序加入到装有GenTLESolutionI的离心管中，立刻放在振荡器上震荡数秒钟。（3）震荡混匀后在室温条件下放置15分钟以上，随后在室温条件下12000rpm离心5分钟。在离心机里摆放离心管时，请将离心机里的离心管摆放一致，离心管的小耳朵均朝向外侧，目前还看不到DNA。（4）使用移液枪小心去除管中溶液，此时沉淀仍看不清，紧贴在离心管外侧的内壁上，吸取溶液时，请注意一定不要让枪头碰到离心管外侧的内壁，将枪头插到离心管内侧的底部，注意不要将沉淀物吸走。（5）依次向离心管中加入1ml的GenTLESolutionII。注意加入GenTLESolutionII时应该沿着离心管内侧的内壁加入到离心管中。12 （6）轻柔地上下颠倒离心管数次，在室温下12000rpm离心2分钟，使用移液枪小心地移除上清溶液。注意请勿剧烈震荡，否则影响纯度及收取量。（7）依次向离心管中加入GenTLESolutionIII500µl，轻微振荡10秒钟充分混合。（8）室温12000rpm离心5分钟，吸取上清溶液并移到新的离心管中，依次标记。（9）加入500µl的异丙醇，上下轻柔地颠倒离心管数次，使其均匀混合。（10）在4℃温度条件下，12000rmp离心5分钟，小心移除上清溶液。（11）加入1ml的70％乙醇清洗沉淀，4℃、12000rmp离心5分钟，小心除去上清溶液。（12）干燥沉淀，勿干燥过度，如果沉淀变白，说明干燥过度。（13）根据下一步实验需要，加入10µlTE缓冲液溶解沉淀。（14）将溶解的DNA溶液置于-20℃冰箱中保存。2.2.3DNA浓度的检测（1）核酸蛋白测定仪开机预热10分钟，选择dsDNA键。（2）将上述步骤所提取的DNA原液从-20℃冰箱中取出，充分解冻。（3）用双蒸水充分清洗比色皿，用吸水纸将其吸干，加入76µl1×TEBuffer，将比色皿放入样品室的池架上，按下blank键调零。（4）吸取待测样品4µl，加入比色皿中，轻轻混匀，按下sample键，测定显示230nm、260nm、280nm、340nm波长时的OD值，并记录OD260/OD280,OD260/OD230值。（5）OD260/OD280比值一般在1.8±0.1，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.6则可能有蛋白质、酚等污染。（6）浓度范围为0.2～0.8µg/µl，OD260/OD280在1.6～2.0之间，纯度可达到1.7～1.9。2.3PCR-RFLP实验原理：PCR-RFLP分析技术是建立在PCR技术基础上发展而来的。当DNA碱基置换位置恰巧发生在某种限制性内切酶识别位点上时，使得酶切位点消失或者增加，利用酶切这种性质的改变，PCR特异性地扩增包含碱基置换的这段DNA，经其特异限制性内切酶切割，使用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常产物比较可确定是否变异。13 2.3.1PCR扩增2.3.1.1引物的设计与合成使用Genebank查找HIF-1α对应基因序列，应用Premier5.0软件设计上下游引物，由上海生工生物工程有限公司合成。（见表1）。表1HIF-1α基因PCR反应引物序列及扩增长度基因位点引物序列长度HIF-1αC1772TForward5’-AAGGTGTGGCCATTGTAAAAACTC-3’346bpReverse5’-GCACTAGTAGTTTCTTTATGTATG-3’2.3.1.2PCR扩增体系：（1）总反应体积为（25ul）包含以下：见表2表2PCR反应体系PCR反应体系试剂浓度体积（ul）终浓度2×PCRMasterMix12.5TaqDNA聚合酶0.05U/µl0.025U/µlMgcl24mmol/l2mmol/ldNTPs0.4mmol/l0.2mmol/l上游引物0.01mmol/l10.4μmol/l下游引物0.01mmol/l10.4μmol/lddH2O9.5DNA模板100ng/µl14ng/µl加好试剂后，混合均匀，低速离心。（2）PCR反应条件：94℃预变性4min循环35次：94℃变性30s，57℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，72℃再延伸7min。14 2.3.2限制性酶切反应（1）反应体系：（31μl）PCR反应混合物10μlddH2O18μl10×BufferB2μlHphI1μl充分混匀后低速离心15s。（2）反应条件：37℃水浴中过夜酶切（4-16小时）。（3）酶切充分后将反应管放于65℃恒温箱20分钟，使限制性内切酶HphI失活，终止酶切反应，将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。2.3.3PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳（1）将梳子、凝胶板、凝胶槽清洗干净，静置干燥。（2）将梳子插入凝胶板并放入相应的凝胶槽制备好胶模。（3）用电子天平准确称量琼脂糖粉0.625g，倒入锥形瓶中，加入1×TBEBuffer25ml，摇匀置于微波炉中用中火加热2min（中途观察是否有结晶产生），待琼脂糖颗粒完全溶解，锥形瓶中溶液清澈透明。（4）待瓶中溶液冷却至50～60℃,加入溴化乙锭2.5µl，充分混匀。（5）将温热的琼脂糖溶液倒入已制备好的胶模中，凝胶厚度在3-5mm左右，同时避免产生气泡（如有气泡产生可用移液枪小心吸掉），室温静置30-45min。（6）待胶凝固后，小心垂直向上拔出梳子，取PCR产物3µl与1µl上样缓冲液充分混合后，加入凝胶的样品孔中，其中外侧一个点样孔加入DNAMarker3µl。（7）将加好样的凝胶放入电泳槽中，加入缓冲液（1×TBE）高出凝胶表面约1～2mm。（8）盖上电泳槽盖接通电源，调节电压至约100V，电泳约30min，可见到上样缓冲液的蓝条带由负极向正极移动。（9）关闭电源，电泳过的胶板放置于紫外透射检测仪上，在紫外分析仪下观察结果，并用凝胶成像系统进行摄像并存储于计算机中。HIF-1α基因PCR扩增目的片段为346bp，-20℃保存有目的片段的PCR扩增产物，留待酶切。2.3.4酶切产物琼脂糖凝胶电泳15 取酶切产物3µl与上样缓冲液1µl混匀后加样于含溴化乙锭的2.5﹪琼脂糖凝胶的样品孔中，其中一个点样孔加入DNAMarker3µl，以1×TBE为电泳缓冲液，在电压100V，电流120A的条件下电泳约30min,并在凝胶成像系统下观察结果，摄像并存储于计算机中。2.4PCR产物基因测序将PCR-RFLP法检测的携带“T”等位基因及部分“CC”基因型的样品送至生工进行常规测序，DNA测序样品要求：PCR产物需超过200bp；提供30µl以上的PCR扩增产物；取2-3µl样品能够清晰的检测出目的条带；引物浓度不低于5µmol/L,体积20-50µl，冷藏运输。3统计学方法运用统计软件SPSS17.0对实验数据进行统计学分析。计量资料以X±s表示，组间比较采用独立样本t检验；Hardy-Weinberg遗传平衡检验、DN组与非DN2组等位基因频率及性别构成比采用χ检验；采用logistic回归分析DN高危因素。P<0.05时表示统计学差异有意义。4质量控制4.1资料收集收集标本后核对患者信息及联系方式，统一编号登记，并于当日贮藏标本前再复核一遍，对缺少的信息尽可能补全。4.2数据整理将全部原始数据录入计算机并建立Excel数据库，再次核对保证正确录入，并纠正逻辑错误，发现问题后立即与原始资料核对并校正，保证研究资料的正确性和完整性。4.3PCR检测注意事项（1）影响PCR检测质量的影响因素包括PCR仪和紫外凝胶成像系统以及微量移液器等。蚌埠医学院科研中心组织移植实验室实验员定期对仪器进行效验和保养，确保所有仪器处于正常的工作状态。（2）实验所有试剂选择质量和信誉优良的厂商，选定后不再轻易改换，并严格按照产品说明书贮藏试剂。（3）提取的DNA原液，及时进行DNA浓度和纯度的检测，避免因DNA提取16 失败或是浓度过小或过高导致扩增阶段无法得到目的片段，妥善贮藏DNA原液并尽快进行PCR扩增，避免放置过久而失效。（4）对实验所用的全部枪头和各种型号离心管进行高压灭菌消毒，每次加样均更换枪头，保证一次性使用避免污染标本和试剂。（5）引物设计遵循引物设计原则，合成的引物根据说明书配制溶解后按剂量小量分装，避免反复冻融影响实验结果。（6）进行PCR检测时，需要设立阴性对照和阳性对照品样品。阴性对照品检测为阴性时，表明实验全部过程的试剂未受到污染；当阳性对照样品检测为阳性时，提示DNA提取、扩增和电泳鉴定工作体系均正常。在以上结果成立的基础上，可对检测样品进行判定，保证实验结果的成立。17 结果1Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验DN组、DM组HIF-1α基因1772位点基因型实测值与预测值之间差异均无统计学意义（P>0.05），两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。见表3.表3遗传平衡检验2组数例数基因频率等位基因XPCCCTTTCTDN组140实测值13010027010预测值129.029.640.170.18P>0.05DM组104实测值8816019216预测值88.6214.770.620.16P>0.052PCR产物及酶切电泳结果“图1”所示为HIF-1α目的基因经PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后电泳图,图示为346bp的目的基因条带。“图2”所示为HIF-1α目的基因PCR产物经其限制性内切酶HphI酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，其中，“1”～“3”为HIF-1α基因第12号外显子1772位点野生型“CC”，该位点存在限制性内切位点，两条带均能能被酶HphI特异性切开，故电泳呈228bp及118bp两个片段；“4”为“CT”杂合子基因型，因HIF-1α基因第12号外显子1772位点存在“C”及“T”两种等位基因，只有一条带能被酶HphI切开，另一条带因突变为“T”不存在限制性内切位点，不能被酶HphI切开仍是一条带，故呈现出酶切后的228bp、118bp片段及完整的346bp片段共三条片段；“5”为HIF-1α目的基因PCR产物，作为参照，呈346bp的一条片段；纯合变异型（TT）因为两条带均失去酶切位点，呈一条346bp的片段（本研究未见该种变异型）。查询遗传密码子可知，HIF-1α基因1772位点C→T的多态性使该位点编码的氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸，即Pro582Ser。18 图1目的基因PCR产物电泳图均为HIF-1α目的基因PCR产物在346bp.图2目的基因PCR产物酶切电泳图1、2、3为CC纯合子基因型，4为杂合子CT基因型，5为未进行酶切的PCR产物作为参照.19 3PCR产物测序结果将所有携带“T”等位基因样本及部分野生“CC”基因型PCR产物进行基因测序（图3）。图3基因测序结果图HIF-1α基因1772位点存在C→T的多态性，所测样本未见TT基因型.20 4HIF-1α基因1772位点不同基因型患者一般临床资料比较。本研究将具有CT型等位基因的患者与CC型相比，CT基因型患者血浆肌酐较低，存在统计学差异（P<0.05）,两组间性别、年龄、BMI、血糖、C肽、血脂等指标无明显差异（P>0.05）。见表4.表4不同基因型患者资料比较项目CC（n=218）CT（n=26）P值性别（男/女）118/10015/110.60病程（年）13.06±3.0612.42±2.630.31年龄（岁）54.64±15.1455.19±12.020.86SBP（mmHg）133.52±19.37137.7±17.840.30DBP（mmHg）82.60±14.3584.23±14.290.592BMI（kg/m）23.49±3.3123.70±2.600.73FPG（mmol/L）8.83±3.909.12±3.400.712hPG（mmol/L）15.26.13±7.9315.67±5.020.80FCP（ng/ml）1.46±1.211.57±1.560.682hCP（ng/ml）3.67±3.034.07±3.890.54TG（mmol/L）1.77±1.442.41±3.690.97TC（mmol/L）4.75±1.504.82±2.220.83LDL-c（mmol/L）3.01±1.312.7±1.000.36HDL-c（mmol/L）1.17±0.521.03±0.450.20HbA1c（%）10.4±7.19.90±2.500.84BUN（mmol/L）8.14±7.067.17±5.820.50Scr（μmol/L）131.1±62.10102.20±55.210.02*注：“*”表示差异有统计学意义（P<0.05）。21 5DN组与DM组一般临床资料比较糖尿病肾病组与糖尿病组相比较，糖尿病肾病组患者甘油三酯、肌酐、尿素氮较糖尿病组高，高密度脂蛋白胆固醇较糖尿病组低,存在统计学差异（P＜0.05）。见表5.表5DN组与DM组一般临床资料比较项目DN组（n=140）DM组（n=104）P值性别（男/女）72/6862/420.20病程（年）13.21±3.1212.71±2.860.21年龄(岁)54.76±14.7954.63±14.920.95SBP（mmHg）135.58±20.87131.80±16.600.13DBP（mmHg）82.7±14.6082.9±14.030.912BMI（kg/m）23.17±3.4123.97±2.950.06FPG（mmol/L）9.01±3.818.65±3.860.472hPG（mmol/L）16.13±8.8514.21±5.580.06FCP（ng/ml）1.56±1.311.35±1.160.212hCP（ng/ml）4.02±3.393.31±2.700.08TG（mmol/L）2.12±2.501.64±1.010.04*TC（mmol/L）4.74±1.694.76±1.450.92LDL-c（mmol/L）3.06±1.302.87±1.250.25HDL-c（mmol/L）1.06±0.341.22±1.600.01*HbA1c(%)11.33±10.049.67±2.440.06BUN（mmol/L）9.47±8.646.10±2.47＜0.01**Scr（μmol/L）131.5±40.5669.51±28.70＜0.01**注：“*”表示差异有统计学意义（P<0.05）,“**”表示差异有显著统计学意义（P<0.01）。22 6DN组、DM组HIF-1α基因1772位点基因型对比DN组与DM组患者HIF-1α基因1772位点“T”等位基因携带率的差异。DM组患者携带“T”等位基因的比例高于DN组（15.38%VS7.14%，P<0.05）。以HIF-1α基因1772位点基因型为自变量，“CT”基因型与“CC”型相比，糖尿病肾病比值比（OR）为0.42（95%CI:0.18～0.98）。见表6.表6两组患者“T”等位基因携带率对比分组例数基因型P值OR值（95%CI）CCCTDN组140130（92.86%）10（7.14%）DM组10488（84.62%）16（15.38%）0.04*0.42（0.18～0.98）注：括弧内为不同基因型所占的百分比，“*”表示差异有统计学意义。7糖尿病肾病（DN）相关因素的logistic回归分析。根据表5的结果，将P<0.1的资料以糖尿病患者是否发生DN为分类变量进行logistic回归分析，结果显示：高HbA1c、低HDL-c是糖尿病肾病的高危因素。表7糖尿病肾病相关因素logistic回归分类变量自变量βP值OR值（95%CI）DNHbA1c0.130.02*0.88（0.98～0.78）HDL-c-0.790.01*2.21（4.08～1.19）T等位基因-0.800.060.45（0.19～1.06）BMI0.040.671.04（0.86～1.23）2hPG0.010.871.01（0.92～1.11）2hCP-0.050.630.95（0.77～1.17）TG0.110.681.11（0.67～1.85）HDL-c-1.240.110.29（0.07～1.29）HbA1c0.020.731.02（0.91～1.15）BUN0.030.701.03（0.90～1.18）Scr0.080.710.93(0.91～0.95）注：“*”表示有统计学意义（P<0.05）。23 讨论糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是终末期肾病的主要的病因，目前其发病机制尚未完全阐明，但是研究表明DN可能是遗传因素和环境因素等综合作用的结果。当前，DN的遗传易感性研究成为热点，以期望为DN的诊治带来新的曙光。其中，多部分着眼于对DN发病过程具有重要调节功能的蛋白质编码基因的研究，例如HIF-1α。在DN发展的早期，可通过磁共振探测到糖尿病动物模型的肾脏外髓质存在[24]显著缺氧，提示缺氧可能是DN的重要致病因素，另外，还有研究表明肾小管[25]间质慢性缺氧可能是各种肾小球疾病进展为终末期肾病的共同通路，因此“缺[4]氧”可能是DN发生发展过程中的核心致病机制。肾脏长期处于缺氧状态后，导致肾脏局部发生炎症反应、纤维化、细胞凋亡、上皮细胞向间质细胞转化[26]（epithelialcellstomesenchymalcelltransformation,EMT），其中HIF表达的上调不但是肾脏缺氧后的适应性反应，而且对细胞凋亡、EMT过程具有重要的调[27]节作用。肾脏慢性缺氧后的这些继发性病理生理学改变又可能进一步加重了[28]肾脏的缺氧，最终发展为终末期肾病。HIF-1是细胞氧平衡的关键中介物，是细胞氧代谢和能量代谢过程中重要的调节因子，它通过调节与细胞能量代谢、葡萄糖转运、无氧代谢、血管生成与红[7]细胞生成等相关基因的表达，使细胞易于适应低氧环境。HIF-1促进细胞对低氧环境耐受的作用在不同疾病中具有不同的临床意义。在肿瘤组织中，其可通过调节肿瘤细胞能量代谢、促进癌床血管生成，以利于肿瘤细胞适应低氧环境并促[19]进癌细胞转移，和患者的不良预后有关。在缺血性心肌病中，HIF-1和心肌组织微血管的生成有关，通过促进微血管的生成和调节心肌的代谢，改善心脏的氧[29]供，是缺血性心肌病重要的保护性因子。机体在缺血、缺氧后会做出代偿性反应如HIF的表达增高，其下游的靶基因HO-1、VEGF、糖酵解酶等表达增加使细胞适应缺氧状态，减少缺氧损伤，促进细胞增生，HIF介导的这一系列适应[30-32]性调节过程对肾脏具有保护作用，使得肾脏更适应缺氧环境，延缓了慢性肾[33,34]脏病（chronickidneydisease，CKD）的进展；糖尿病肾病时，血管紧张素24 Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）生成增多，使肾脏血管长期处于收缩状态使肾脏组织的缺血、缺氧加重，又进一步促进了HIF的表达，增强对缺氧环境的适应。但是，另外一些学者发现肾脏慢性缺氧后HIF长期的高表达可促进肾脏纤维化[35,36]。糖尿病患者的肾脏长期暴露于高血糖、缺氧状态，HIF持续高表达，并激活其下游靶基因内皮素-1（endothelin，ET-1）、VEGF的表达。VEGF、ET-1和[37,38][39]AngII是重要的致炎及纤维化因子，并在功能上存在致纤维化协同作用。AngII和ET-1两者的生成可相互调节，AngII能诱导“内皮素转化酶”的活性增加，[40]使前内皮素原mRNA转录活性增加，最终使ET-1合成增多；而ET-1同样能[41]增加“血管紧张素转换酶”的活性，从而促进血管紧张素I向AngII的转化；另[42]外一方面，二者效应的发挥还可通过二者之间存在的共用受体实现。但是也[43]有研究表明，糖尿病进展过程中HIF-1α在肾脏并不是持续高表达，后期表达[44]的下调可能与持续高血糖等诸多因素有关。总之，HIF、ET-1及AngII相互之间存在紧密联系，共同参与糖尿病肾病及肾间质纤维化（renalinterstitialfibrosis，RIF）进程。在DN的发病过程中，一方面，HIF的高表达增强了肾脏组织及细胞对缺氧的耐受，对肾脏发挥保护作用；另一方面，HIF也诱导了肾小管上皮细胞过度凋亡、导致肾脏的纤维化，加重肾脏损害。因此使得HIF适度表达对DN的防治意义重大。有研究证实HIF-1α基因外显子存在多个SNPs,并且其基因多态性与机体缺氧损害时不同的反应密切相关，在HIF-1α多种SNPs中，C1772T基因多态性[15]（Pro582Ser）可明显提高细胞低氧、高糖环境下HIF-1α的表达水平。在冠状动脉病变中，HIF-1α基因多态性虽然无改善心血管疾病风险的作用，但与冠状[45]动脉侧支循环的形成和临床表现有关。有研究报道HIF-1α基因C1772T基因[46]多态性（rs11549465）“T”等位基因突变可能使女性宫颈癌的患病风险增加；TT纯合子突变使得男性患前列腺癌的风险较CC纯合子增加，并且突变型使得[47]外周血白细胞HIF-1αmRNA表达水平显著增高；此外，急性肾损伤的预后也[18]与HIF-1α基因多态性密切相关。有研究表明，在缺氧状态下，糖尿病小鼠肾髓质中HIF-1α处于被抑制状态，表达下降，但是和对照组对比，HIF-1α基因[15]C1772T多态性减弱了高浓度葡萄糖对HIF-1α的抑制效应。常氧状态下，通过RT-PCR技术发现HIF-1α在大鼠DN模型肾组织中的表达较25 [48]正常对照组明显上调，这表明HIF-1α可能参与了DN的病理生理过程；另外，在缺氧和高血糖同时存在的情况下，人胚肾细胞的CT和TT基因型较CC野生型的HIF-1α基因转录水平明显增高。进一步研究提示HIF-1α基因C1772T多态性可能是通过干扰HIF-1α的降解或改变其转录活性调节DN肾组织HIF-1α水平，从而影[15]响其对下游基因的调节参与DN的发病过程。但此前研究多局限于基础研究，目前尚无缺氧诱导因子1α基因C1772T多态性与2型糖尿病肾病相关性的临床研究。在本研究中，我们对伴有和不伴有DN的2型糖尿病患者进行了HIF-1α基因多态性的研究，进一步证实HIF-1α基因外显子1772位点存在C/T单核苷酸多态性（SNPs），该位点C→T的多态性使脯氨酸变为丝氨酸（Pro582Ser）,即存在CC基因型、CT基因型，但本研究未发现纯合子TT基因型;有研究表明，在中[49][50]国北方汉族人群及日本人群HIF1α基因C1772T多态性研究中也未发现TT基因型，研究结果和本实验是一致的，但这不代表无纯合子突变存在，可能是由于TT基因型频率较低、样本量少等原因造成的。本研究表明，糖尿病患者与糖尿病肾病患者相比，HIF-1α基因1772位点“T”等位基因携带比例较高（15.38%VS7.14%，P<0.05），提示“T”等位基因可能是2型糖尿病肾病的保护因素，根究相关文献推断这种影响可能是通过HIF-1α基因C1772T多态性在缺氧状态下抵抗[15]高血糖对HIF-1α的抑制效应来实现的。目前已知HIF-1α基因C1772T多态性“CT”或“TT”等位基因型的转录活性强于“CC”基因型，使其调节下游HO-1、EPO[50-52]等保护性基因转录的能力增强，进一步支持了“T”等位基因可能是糖尿病肾病的保护性因素。但是在理论上HIF-1α的高表达同样也是加重肾脏纤维化和缺氧的有害因素。本实验进一步的多因素logistic回归分析发现，HIF-1α基因多态性（rs11549465）并没有进入方程。可能在DN的不同阶段，HIF-1α的C1772T多态性对DN的发展扮演着不同甚至相反的角色，比如，DN早期HIF-1α的上调可能通过提高对低氧环境的适应性，延缓病情的进一步恶化；当DN病情发展到一定阶段后，出现较广范围的微血管病变，微循环出现障碍，HIF-1α对低氧的调节出现失代偿，其上调反而加速了肾间质纤维化使病情恶化。近期研究表明，在DN动物模型中，Rho激酶抑制剂“法舒地尔”通过上调脯氨酰羟化酶（PHD）的表达加快了HIF-1α的降解，从而减少了HIF在肾脏的积累，抑制了HIF下游26 [53]促纤维化靶基因的转录，延缓了DN的进展。因此，HIF-1α基因C1772T（Pro582Ser）多态性与2型糖尿病肾病遗传易感性的关系仍需大样本、肾脏病分期、多民族研究的进一步探讨。从研究结果可看出，DM组与DN组相比较，DM组甘油三酯（TG）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）明显较低（存在统计学差异，P＜0.05），高密度脂蛋白（HDL-c）是呈升高趋势（存在统计学差异，P＜0.05）。HbA1c能反映患者近1～2个月间平[54]均血糖水平，本实验就糖尿病肾病相关因素的logistic回归分析表明，HbA1c是糖尿病肾病的高危因素（β=0.13，P<0.05），可在一定程度上反映肾脏微血管损伤的情况，应积极有效的控制HbA1c稳定在一定范围。另外，logistic回归分析还表明HDL-c是糖尿病肾病的保护因素（β=-0.79，P＜0.01），因此，高HbA1c、[55]低HDL-c作为DN的危险因素参与了DN发生发展。所以，积极控制血糖、提高HDL-c、降血脂可减少DN的发生，对2型糖尿病及DN的临床治疗具有一定价值。27 结论1、汉族人群中缺氧诱导因子1α基因第12号外显子1772位点存在C/T单核苷酸多态性。2、缺氧诱导因子1α基因1772位点单核苷酸多态性中，“T”等位基因可能是2型糖尿病肾病的保护性因素，但仍待进一步探讨。3、糖尿病肾病患者高密度脂蛋白胆固醇较低，甘油三酯、肌酐、尿素氮较高。4、高HbA1c、低HDL-c是糖尿病肾病的高危因素。28 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附录A中英文术语缩略语对照表英文缩写英文全称中文对照angiotensinⅡAngⅡ血管紧张素ⅡbHLHbasic-helix-loop-helix碱性螺旋-环-螺旋BMIbodymassindex体重指数BUNbloodureanitrogen尿素氮CKDchronickidneydisease慢性肾脏病CPfastingC-peptide空腹C肽DMdiabetesmellitus糖尿病DNdiabeticnephropathy糖尿病肾病EMTepithelialcellstomesenchymalcell上皮细胞向间质细胞transformation转化EPOerythropoietin促红细胞生成素ET-1endothelin1内皮素-1FPGfastingplasmaglucose空腹葡萄糖36 HO-1hemeoxygenase-1血红素氧化酶-1HIF-1hypoxia-induciblefactor1缺氧诱导因子-1HDL-chighdensitylipoproteincholesterol高密度脂蛋白胆固醇HbA1chemoglobinA1c糖化血红蛋白HREhypoxicresponsiveelements缺氧反应元件2hPG2hourpostprandialplasmaglucose餐后2小时葡萄糖2hCP2hourpostprandialC-peptide餐后2小时C肽LDL-clowdensitylipoproteincholesterol低密度脂蛋白胆同醇mALBmicro-albumin微量白蛋白ODDoxygenDependentdegradationdomain氧依赖的降解区Proproline脯氨酸PHDprolylhydroxylase脯氨酰羟化酶pVHLvonHippel-Lindautumor-suppressorprotein希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白RIFrenalinterstitialfibrosis肾间质纤维化Serserine丝氨酸SNPssinglenucleotidepolymorphisms单核苷酸多态性位点37 Scrserumcreatinine血清肌酐TADtransactivationdomain转录激活区TCtotalcholestrol总胆固醇TGtriglyceride甘油三酯urinaryalbuminexcretionrateUAER尿白蛋白排泄率VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子38 附录B个人简历及发表论文张琴，女，生于1988年2月，安徽省亳州市利辛县人；主要学习及工作经历：2002年9月-2005年7月利辛二中；2005年9月-2006年7月利辛一中；2006年9月-2011年7月蚌埠医学院临床医学；2011年9月-2014年7月蚌埠医学院第一附属医院内分泌及代谢病专业；研究生期间发表论文：1、缺氧诱导因子1α（HIF-1α)Pro582Ser基因多态性与2型糖尿病肾病相关性研究.《实用医学杂志》，已录用；2、糖尿病视网膜病变合并糖尿病肾病的高危因素分析.《浙江临床医学杂志》，已录用。39 附录C：综述缺氧诱导因子在糖尿病慢性并发症进展中的作用张琴综述，毕娅欣审校糖尿病（diabetesmellitus,DM）目前已经成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三位危害人类健康的慢性非传染性疾病。随着人们生活水平的提高，生活模式的现代化和老龄化，糖尿病患病率也呈现明显的上升趋势。根据国际糖尿病联盟（IDF）估计,全球糖尿病人已超过3亿，近期，我国的糖尿病流行病学调查表明，中国糖尿病患病率（9.7％）高于全球平均患病率（6.4％），若根据此患病率估算，[1]我国糖尿病患病人数已接近1亿，形势已经非常严峻,控制糖尿病,刻不容缓。由于我国是人口大国，人口渐趋老龄化、生活水平提高等因素的影响，我国糖尿病[2]的患病人数预计将会超过印度，成为世界上患糖尿病人数最多的国家，糖尿病的防控压力巨大。糖尿病的病因和发病机制非常复杂，目前尚未完全阐明。糖尿病是受遗传和环境因素共同影响的疾病。胰岛β细胞合成和分泌的胰岛素，经血液循环到达体内各组织器官的靶细胞，与特异受体结合并引发细胞内物质代谢过程，此过程中任何环节出现异常，均可引发糖尿病。糖尿病并发症包括急性、慢性、感染性并发症。糖尿病的慢性并发症可波及全身重要器官，发病机制非常复杂，至今未完全阐明，目前已知与高血糖、氧化应激、胰岛素抵抗、遗传易感性等多因素相互作用有关。糖尿病慢性并发症主要包括大血管病变、微血管病变、神经病变及糖尿病足等，其中微血管病变是糖尿病的特异性并发症，典型的病理改变是微血管基底膜的增厚和微循环障碍。缺氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor，HIF）作为缺氧的标志物，是细胞氧代谢重要的调节因子，它通过调节与细胞能量代谢、糖转运、血管与红细胞生成等相关基因的表达，使细胞易于适应[3]低氧环境。HIF简介HIF是1992年Semenza等人在研究肝癌细胞核提取物过程中发现的一种蛋白，它能特异结合在促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）基因增强子的寡核[4]苷酸序列上，在缺氧状态下HIF能将EPO转录活性提高7倍。HIF是由α和β两个亚基组成的异二聚体转录因子，两者均属于碱性螺旋-环-螺旋40 （basic-helix-loop-helix，bHLH）-PAS（Per-Arnt-Sim）超家族。HIF的α亚基共有3种，目前研究较多是HIF-1α和HIF-2α，这两种亚基在结构和功能上具有相似性，HIF-3α由于缺乏羧基末端的转录活化结构，可能对缺氧诱导的基因表达调节起负[5][6]性作用，而HIF-1α和HIF-2α的调节也并不完全相同。HIF活性是主要依赖于HIF-1α亚基的降解精密调节，其降解的分子基础是氧[7]依赖的两个脯氨酸残基羟化。HIF-1α包含两个转录激活区（transactivationdomain，TAD）和一个氧依赖的降解区（oxygenDependentdegradationdomain，ODD），TAD对转录活性发挥重要。ODD区中存在的两个脯氨酸是HIF-1α降解的限速酶的作用靶点，限速酶即所谓的HIF-脯氨酰羟化酶（prolylhydroxylase,PHD）[7，8]。在常氧情况下，ODD区中的两个脯氨酸被PHD羟化为脯氨酸残基，使其能够与希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白（vonHippel-Lindautumor-suppressorprotein，pVHL）结合，并被E3泛素连接酶识别结合，使HIF-1a发生泛素依赖的蛋白酶体[3，9]降解和失活；PHD活性在缺氧的条件下被抑制，HIF-1α的ODD区中的两个脯氨酸羟化受阻，HIF-1α降解进一步受阻，HIF积聚，HIF激活并转移到核缺氧反应元件（hypoxicresponsiveelements，HRE）上，并上调了一系列至关重要的靶[3，10]基因转录，进一步增强组织对缺氧的适应。HIF是细胞氧平衡的关键中介物，有利于适应缺氧环境，通过调节基因产物的表达即参与细胞能量代谢和葡萄糖转运，血管生成和红细胞生成，无氧代谢等低氧应答反应。HIF-1α的基因位于14q21-24，由15个外显子和14个内含子组成，编码826个氨基酸。HIF-1β基因位于1q21，在其5’端基因内含有一个编码15个氨基酸的45bp可变外显子，编码774或者789个氨基酸。有研究报道，人类动脉上皮细胞内的2％基因受HIF基因调节[11]。目前已发现HIF的下游靶基已有上百种。其下游基因包括血红素氧化酶-1（HO-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、糖酵解酶、诱生型NO合酶（iN-os）、结缔组织生长因子（CTGF）、内皮素1（ET-1）、促红细胞生成素（EPO）、环氧合酶（COX）、基质金属蛋白酶（MMP）、血栓素合酶（TXS）、基质金属蛋白酶抑制物（TIMP）、肾上腺髓质素（ADM）、I型纤溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）[12]等基因。各种因子对机体功能的调节都存在组织特异性，同一种因子作用于不同的细胞类型中，即使是相同的基因也可能存在下调、上调甚至无变化等情况[13]，这为明确HIF的作用增加了难度。41 [14]有研究证实HIF-1α基因外显子存在多个SNPs,并且其基因多态性与机体缺氧损害时不同的反应密切相关。在冠状动脉病变中，HIF-1α基因多态性可影响患[15][16]者临床结局和并发症，此外，急性肾损伤的预后也与HIF-1α基因多态性密[17]切相关。但是，HIF促进细胞对低氧环境耐受的作用在不同疾病中具有不同的临床意义，其通过调节肿瘤细胞能量代谢、促进癌床血管生成，以利于肿瘤细胞[18]适应低氧环境并促进转移。在HIF-1α多种SNPs中，C1772T基因多态性[14]（rs11549465）可明显提高细胞低氧、高糖环境下HIF-1α的表达水平。HIF在糖尿病肾病中的作用糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，又称肾小球硬化症，其病理特点为肾小球基底膜增厚、系膜区扩张伴或不伴肾小管一间质纤维化。由于糖尿病肾脏早期的改变很大程度上与肾脏微血管结构改变[19,20]有关，可通过磁共振（MRI）探测到糖尿病动物模型的肾脏外髓质和慢性肾[21,22]脏疾病（CKD）患者均存在缺氧，提示缺氧可能是DN的主要致病因素。HIF-1α[23]主要在DN鼠肾小管上皮细胞和肾间质细胞中表达，HIF-2α主要表达于肾小管[24，25]周围细胞、足细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞。实验发现糖尿病进展过程[26]中HIF-1α和HO-l在肾脏并不是持续高表达的，后期表达下调可能与持续高血[27]糖等诸多因素有关。机体在急性缺血、缺氧后会做出代偿性反应如HIF的表达[25]增高，其下游的靶基因HO-1、VEGF、糖酵解酶等表达增加使细胞适应缺氧状[28-30]态，减少缺氧损伤，促进细胞增生，对肾脏具有保护作用，使得肾脏更适应[31,32]缺氧环境，延缓了慢性肾脏病（CKD）的进展；可另外一些学者发现HIF长[33,34]期高表达促进了肾脏纤维化，机体长期处于高血糖、缺氧状态下，HIF持续高表达，并激活其下游靶基因致纤维化因子ET-1，糖尿病肾病时，AngII生成增多，使肾脏血管长期处于收缩状态，导致组织的缺血、缺氧，并且血管紧张素（Ang）Ⅱ又进一步促进了HIF的表达，血管紧张素（Ang）Ⅱ和内皮素1（ET-1）[35]是重要的致炎及纤维化因子，并在功能上存在致纤维化协同作用；AngII和ET-1两者的生成可相互调节，AngII能诱导“内皮素转化酶”的活性增加，使前内皮素原mRNA转录活性增加，最终使ET-1合成增多；而ET-1同样能增加“血管紧张素转换酶”的活性，从而促进血管紧张素I向AngII的转化；另外一方面，二者效应[36]的发挥还可通过二者之间存在的共用受体实现。总之，AngII、ET-1及HIF相互42 之间存在紧密联系，共同参与糖尿病肾病（DN）肾间质纤维化（RIF）进程。有实验证实缬沙坦降低了AngII、ET-I及HIF-1α在DN肾组织中的表达，延缓了RIF[37]的进展，对DN肾间质纤维化的防治起积极的作用。虽然HIF-1α的高表达促进了细胞代谢，增强了肾脏组织及细胞对缺氧的耐受，对肾脏发挥保护作用；但是它也会诱导细胞凋亡，使肾小管上皮细胞过度凋亡，加重肾脏损害，因此使得HIF-1α适度表达对DN的防治意义重大。最新研究表明HIF-1α基因外显子存在多个SNPs，并且其基因多态性与机体缺氧损害时不同的反应密切相关，其中急性[17]肾损伤的预后也与HIF-1α基因多态性密切相关，缺氧诱导因子1α基因C1772T[14]多态性（rs11549465）还可能与1型糖尿病肾病具有相关性。HIF在糖尿病视网膜病变中的作用糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy，DR）也是糖尿病主要微血管病变[38]之一，多发生在病史10年以上的患者，是导致患者失明的主要原因。典型的组织病理学改变是内皮细胞、足细胞的丢失和基底膜的增厚。目前DR分为六期：Ⅰ期-微血管瘤、小出血点；Ⅱ-出现硬性渗出；Ⅲ-出现棉絮状软性渗出；Ⅳ-新生血管形成，玻璃体积血；Ⅴ-纤维血管增值、玻璃体机化；Ⅵ-牵拉性视网膜脱离、失明。Ⅰ-Ⅲ期为背景性视网膜病变，Ⅳ-Ⅵ期为增殖性视网膜病变（proliferativediabeticretinopathy,PDR），当患者出现PDR时，常合并糖尿病肾病和神经病变。DR是多种致病因素共同作用的结果，包括慢性缺血缺氧、氧化应激反应、热休克应激、蛋白质的非酶糖基化、自由基的产生等。由于高糖血症可导致红细胞内2，3-二磷酸甘油酸下降，红细胞携氧能力减弱；而血红蛋白中糖基化血红蛋白的比例升高，使其对氧的亲和力高于正常血红蛋白，氧的释放能力减弱，不易扩散至组织细胞中；使毛细血管基底膜增厚、血液凝固系统亢进、纤溶系统减[39]弱等，进而导致视网膜组织慢性缺血缺氧、血液渗漏。由此形成视网膜中的无灌注区，视网膜缺氧、缺血，使得刺激因子和血管生成抑制因子原有平衡被打破，刺激新生血管生成。HIF-1α既促进细胞代谢，使得细胞对缺氧适应能力增强，对于细胞免受缺氧损伤具有积极的保护作用，也会调控缺氧诱导相关基因的表达，使得多种细胞因[40]子异常表达，如促进VEGF表达增加，进而改变了局部正常的功能和微环境结构。由于微血管超微结构的改变减少了局部血供，缺血缺氧的状况加重，与HIF-1α43 [41]的异常表达互相促进，两者的先后和因果关系尚待进一步研究。邓爱军等研究发现缺氧可以促进体外培养的视网膜血管内皮细胞HIF-1α的表达，在正常大鼠中我们观察到，视网膜中并不表达HIF-1α，而在DR组中却出现明显的表达，证明了缺氧在DR发病机制中的重要作用，也说明HIF-1α在DR的发生发展过程中可能起一定作用；HIF-1α的表达随着DR病程的发展呈进行性增强，显示视网膜的缺氧严重程度是伴随着DR的发展而逐渐加重，与DR的病理生理发展过程相符[42]。HIF-lα随着病程的发展出现表达增强而随后又减弱的一过性反应，提示视网膜的缺氧随着DR发展而逐渐加重。VEGF作为HIF的下游靶基因，对DR的发生发展起重要作用，HIF-1α和VEGF在早期糖尿病视网膜神经细胞中呈瞬时高表达，可能是早期糖尿病视网膜神经细[43]胞损害的主要原因。有研究证实DR与HIF-1α、VEGF活性表达增强呈正相关，同时二者表达与DR的发生、发展存在时效和空间性联系，在糖尿病大鼠视网膜出现超微结构形态学改变之前，二者即被激活，且其活性均随着病变发展而呈增[44]强。研究发现糖尿病视网膜病变中HIF-1α和VEGF在视网膜前膜的表达明显，研究证实：VEGF既与糖尿病微血管病变发生相关，也和病变的程度具有密切相[45]关性。HIF-1α的表达对DR的发生发展起着重要作用，虽然HIF-1α促进细胞了代谢，增强细胞适应缺氧环境的能力，对保护细胞免受缺氧损伤发挥积极的作用；但是在PDR前膜血管内皮细胞中HIF-1α与VEGF表达并无直线相关。视网膜、晶体、红细胞等的能量主要来自糖酵解,DM由于高血糖引起糖酵解异常进而引起视网膜代谢紊乱。HIF通过调节6-磷酸果糖-2-激酶和果糖-2，6-[46]二磷酸酶的基因表达，进而调控糖酵解。同时也调控丙酮酸激酶（PK）、GRP94（人内皮细胞葡萄糖调节蛋白）增量表达，使机体对缺氧应激的耐受能力增加[47,48]。丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt/PKB）与HIF在诱导血管生成、糖酵解、葡萄糖[49]摄取等过程中共同发挥重要作用。[50]视网膜细胞凋亡需要P53，它同时也能抑制HIF-1的转录活性。缺氧诱导了抑癌基因P53表达，而去磷酸化的HIF-1对P53起稳定作用，轻度缺氧不能引起P53积聚，在较严重的缺氧条件，才可引起P53积聚。HIF-1和P53对缺氧诱导的迟发[51]性神经元死亡起关键作用，可共同控制缺氧诱导性神经元死亡。热休克应激也参与了DR的发生发展，热休克蛋白的表达也受HIF-l的调控，44 HIF-1诱导物氯化钴增强Hsp27基因表达，保护体外培养的视网膜细胞免受缺氧的[52][53]损伤。同时HIF-1也受Hsp90调控,后者与HIF-1的bHLH-PAS区域相结合，对[54]缺氧诱导HIF-1表达起重要作用。[55]经研究发现低氧可通过HIF-lα刺激大鼠视网膜产生EPO、VEGF等因子，[56]EPO表达增强可作为内源性神经保护因素。EPO定位于视细胞的信号通路需EPO受体参与，视网膜光损伤后给予治疗，EPO仍可穿过血-视网膜屏障从而抑制凋亡，EPO通过抑制凋亡可有效地治疗不同类型的视网膜病变。内皮素-1（endothelin1，ET-1）作为HIF的下游基因在DM病程中的表达变化[57]表明其可能与视网膜组织的损伤有关，并在DR的发生、发展中发挥重要作用。HIF-lα和高糖共同调节了ET-1的表达，但随病程逐渐延长，ET-1表达增强，引起血管收缩，局部血供减，加重了缺血缺氧的严重性，破坏了局部正常的微环境结构和功能。有效地调节HIF-1α和ET-1的合理表达对于DR的防治发挥重要意义。在DR发展过程中，白细胞和血管内皮细胞的黏附是造成血管内皮细胞损伤的早期原因，白细胞和血管内皮细胞之间的黏附主要依赖于白细胞表面的黏附分子β2整合素CDl8表达，目前发现不同临床阶段的DR患者CDl8的表达水平随DR[58]的临床分期升高逐渐升高。在早期DR阶段，目前尚不清楚HIF-1α是否具有调节CDl8表达的作用，但HlF-1α具有下调糖尿病动物外周血中性粒细胞CDl8表达[59]和视网膜白细胞聚集的作用。HIF-1α诱导多种细胞因子的异常表达改变了局部正常的微环境，进而改变了正常的组织结构和功能，导致病变的进一步恶化。因此，如何调节HIF-1α的适度表达对于PDR的防治具有重要意义，有待进一步研究。有学者认为细胞凋亡是糖尿病大鼠视网膜神经元损害的主要形式，说明HIF-1α在糖尿病状态下适应性地升高，但这种适应性反应是不充分的，不能提供足够的新生血管形成因子以减少组织的损伤，这种不充分的反应可能是高糖引起的。以HIF-la为靶点的基因治疗有可能成为有效抑制糖尿病视网膜病变的新手段。HIF在糖尿病足病中的作用糖尿病足（Diabeticfoot，DF）是糖尿病的重要并发症，其发病机制是神经营养障碍、代谢紊乱、氧化应激、周围血管病变等多因素相互作用的结果，是截肢、致残的主要原因。糖尿病周围血管病变最常见的是下肢血管，由大血管病变45 和微血管病变组成。机体长期在高血糖与蛋白质的非酶糖化状态，血液的高凝，脂代谢紊乱以及下肢血液循环障碍等多因素作用下使患者的下肢动脉容易发生血管病变，管腔狭窄、管壁增厚，微血管和微循环发生障碍，下肢供血液供应减少，易发生组织损伤。有些学者认为，动脉粥样硬化性患者缺血的下肢VEGF表达量明显高于糖尿病患者下肢血管表达量，并提出是高血糖抑制了机体对缺氧的正常反应，建议给予外源性VEGF基因治疗糖尿病、动脉粥样硬化等导致的下肢[60]动脉狭窄或闭塞。也有研究表明糖尿病足病足下肢血管HIF-1α与VEGF随着病[61，62]程的发展进行性表达增强，并与糖尿病足的发生发展密切相关，HIF-1α是通过其下游基因VEGF来调控的。HIF-1α和VEGF对糖尿病足发生发展起重要作用，虽然促进细胞代谢，增强细胞对适应缺氧能力，保护细胞免受缺氧损伤；但却诱导多种细胞因子的非正常表达，使得局部正常的微环境发生改变，正常局部的组织结构和功能也相应的发生改变，加重了病变的恶化。如何调控VEGF和[63]HIF-1α基因治疗糖尿病足还需进一步研究。HIF在心血管系统疾病中的作用冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病（coronaryarterydisease,CAD）,是指冠状动脉粥样硬化，使血管狭窄或阻塞，和（或）因冠状动脉功能性改变（痉挛）导致心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病。糖尿病可使冠心病的患病风险大大增加，同时冠心病也是糖尿病的合并症和并发症。在缺血性心肌病中，HIF-1和心肌组织微血管的生成有关，通过促进微血管的生成和调节心肌的代谢，改善[64]心脏的氧供，是缺血性心肌病重要的保护性因子。多项研究表明，HIF-1α基因多态性C1772T和G1790A对其蛋白质活性有明显影响；在冠状动脉病变中，HIF-1α基因多态性虽然无改善心血管疾病风险的作用，但与冠状动脉侧支循环的[65]形成和临床表现有关。前景展望综上所述，HIF在不同组织的表达量不同，所引起的结果也不尽相同，并且和心血管疾病及DM多种并发症有关。DN作为糖尿病微血管病变的特征性并发症和HIF的关系较为密切。HIF-1α基因C1772T多态性能提高细胞低氧、高糖环境下HIF-1α的表达水平，导致HIF在组织中聚积。在DN的不同阶段HIF所起的作用也不相同。在糖尿病的早期，肾组织内HIF的上调能够调节一系列基因的表达对抗46 高糖和缺氧对肾脏的损害，从而延缓DN的发生和进展；随着DN病情的进一步加重，DN患者肾脏逐渐出现纤维化，肾脏组织学发生明显改变肾功能受到较严重的影响，此时HIF抵抗缺氧的角色逐渐弱化，而通过调节ET-1等基因的表达促进纤维化的作用逐渐显现，进而促进DN的进展。因此，研究HIF在DN不同时期的精确调控具有重要意义，而HIF-1α基因C1772T多态性与DN的关系仍需要进一步行大样本、多种族、多阶段的研究。47 参考文献[1]钱荣立.控制糖尿病,刻不容缓-2010联合国糖尿病日:中国蓝光行动[J].中国糖尿病杂志,2010,18（12）:881-882.[2]YangW,LuJ,WengJ,etal.PrevalenceofdiabetesamongmenandwomeninChina[J].NEnglJMed,2010,362（12）:1090-1100.[3]SemenzaGL.Oxygenhomeostasis[J].WileyInterdisciplinaryReviews:SystemsBiologyandMedicine,2010,2（3）:336-361.[4]SemenzaGL,WangGL.Anuclearfactorinducedbyhypoxiaviadenovoproteinsynthesisbindstothehumanerythropoietingeneenhanceratasiterequiredfortranscriptionalactivation[J].Molecularandcellularbiology,1992,12（12）:5447-5454.[5]MakinoY,KanopkaA,WilsonWJ,etal.InhibitoryPASdomainprotein（IPAS）isahypoxia-induciblesplicingvariantofthehypoxia-induciblefactor-3αlocus[J].JournalofBiologicalChemistry,2002,277（36）:32405-32408.[6]GunaratnamL,BonventreJV.HIFinkidneydiseaseanddevelopment[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrology,2009,20（9）:1877-1887.[7]IvanM,KondoK,YangH,etal.HIFαtargetedforVHL-mediateddestructionbyprolinehydroxylation:implicationsforO2sensing[J].Science,2001,292（5516）:464-468.[8]JaakkolaP,MoleDR,TianYM,etal.TargetingofHIF-αtothevonHippel-LindauubiquitylationcomplexbyO2-regulatedprolylhydroxylation[J].Science,2001,292（5516）:468-472.[9]KimHO,JoYH,LeeJ,etal.TheC1772TgeneticpolymorphisminhumanHIF-1αgeneassociateswithexpressionofHIF-1αproteininbreastcancer[J].Oncologyreports,2008,20（5）:1181-1187.[10]KaelinJrWG.ThevonHippel–Lindauprotein,HIFhydroxylation,andoxygensensing[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2005,338（1）:627-638.48 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