《温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号Ｒ２学校代号１０５７２ＵＤＣ６１０密级公开学号２０１５１１１３６２８广神丨十４秃太嗲ＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ硕士学位论文“”温病湿热证湿热交蒸实质的实验研究学位申请人谢婧指导教师姓名骆欢欢专业名称中医临床基础申请学位类型科学学位论文提交日期２０１８年３月 广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工￣作所取得的成果。除文中己经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。＂４＾学位论文作者签名日期：年月曰关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名论文导师签名曰期：年月曰 中文摘要目的：岭南地域具有东南亚季风海洋性的气候特色，高温、湿润多雨为主要气候特征，饮食以甘脂厚腻之物为主，易伤脾胃。《湿热病篇》中提及：“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”，膏粱厚味皆是提供脾胃酝酿湿热的条件，加之岭南地区特有的自然气候，使该地区脾胃湿热证患者较为常见。湿热证始终以阳明（胃肠）和太阴（脾）为病变中心，“太阴内伤”是湿热证发病的内因和基础，是湿热证模型复制需要模拟的关键环节之一。本组实验尝试以此为切入点，采取全封闭式主动调温调湿式造模人工气候箱升高室内温度和湿度模拟外湿因素，给予小鼠肥甘饮食、酒伤、劳役等方法模拟内湿热因素，采取复合多因素造模法以建立湿热证小鼠模型，探讨温病湿热证动物模型的肠道菌群组成变化情况、体内炎症因子与水通道蛋白的含量的变化规律。方法：采用“饮食+湿热环境+外来生物因子”复合多因素造模法，建立岭南温病湿热证小鼠模型，“高蛋白+猪油（高脂）+白酒+跑步30min”模拟内湿热因素，全封闭式自动调温调湿人工气候箱提高温度和湿度，模拟岭南特有湿热外环境，使用腹腔注射LPS模仿外来戾气入侵的条件。造模思路以“内外夹湿”为特点，湿大于热组模型小鼠给予高蛋白饲料喂养且进入人工气候箱[T：（32±0.15）℃，HR：90%～95%]每天12h，同步单日灌服猪油0.3ml，双日灌服29.5度白酒0.3ml且在跑步机上连续跑30min；热大于湿组模型小鼠在适应性喂养结束后给予高蛋白饲料喂养且进入人工气候箱，于造模结束前一天腹腔注射1mg/kg剂量的LPS完成造模。观察小鼠日常活动以及体征,测量小鼠每周体重变化，采用HE染色检测舌根部病理形态学变化；用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中LPS、TNF-α的浓度；RT-PCR法检测结肠组织TNF-α、CD14、AQP1、AQP8的表达水平变化；免疫组化法检测小鼠结肠组织中NF-κBp65、TLR4、AQP3和AQP4的蛋白阳性表达。结果：湿热证模型小鼠在造模后出现的湿热证症候，表现为体重降低、嗜卧懒动、纳呆、大便黏腻肛周污秽严重等，舌根部HE染色结果显示湿大于热组角质层厚度明显高于热大于湿组症状；本实验中整体造模结束，两组温病湿热证模型小鼠肠道菌群丰富度降低，湿大于热组出现拟杆菌门含量的上升，厚壁菌门、梭菌纲含量下降，热大于湿组则出现拟杆菌门含量的下降，厚壁菌门、梭菌纲含量上升，提示拟杆菌门、厚壁菌门、梭菌的变化可能是小鼠湿热证中湿热偏重的相关性指标。PCR结果显示与正常组相比，热大于湿组、LPS组小鼠TNF-αmRNA转录水平升高（P＜0.05），脾虚组小鼠CD14mRNA表达水平增高；湿大于热组、热大于湿组LPS、TNF-α、NF-κbp65、TLR4I 的含量较正常组相比明显升高（P＜0.001），湿大于热组LPS、TNF-α的浓度较热大于湿组水平增高（P＜0.05），湿热模型组结肠组织NF-κbp65、TLR4的蛋白表达变化无明显差异；提示使用此种造模方式，湿大于热组炎症程度高于热大于湿组，两组湿热模型组小鼠结肠中AQP3的含量较正常组相比明显增高而AQP4的含量水平降低，与湿大于热组比较，热大于湿组AQP3、AQP4的表达含量升高（P＜0.05）。本次实验发现NF-κbp65、TLR4与AQP3表达呈正相关，与AQP4表达呈负相关，由此推测，LPS通过NF-κbp65与水通道蛋白AQP相关，推测湿热模型组血清炎症因子的差异可能与湿大于热组肠道菌群移位的机制有关，其变化可能更为复杂和丰富，超越了LPS的影响，导致了其炎症水平的增高。湿大于热、热大于湿组水通道蛋白的差异可能与注射LPS相关，前面提及两组小鼠NF-κbp65之间的表达无统计学差异，推测可能是NF-kbp65在中间起均衡作用，而AQP决定其最终的变化趋势，炎症因子和水通道蛋白紊乱可能是湿热证动物模型中量化标准之一。结论：根据中医温病湿热证的造模方法,通过复合因素造模法建立湿大于热、热大于湿两种湿热证小鼠模型，造模结束后模型组小鼠均出现近似临床湿热症型体征、症状；肠道菌群结果表明，两组温病湿热证模型小鼠肠道菌群丰富度降低，拟杆菌门、厚壁菌门、梭菌的变化可能是小鼠湿热证中湿热偏重的相关性指标；温病热证动物模型存在内毒素-TLR4通路诱导的炎症介质反应和水通道蛋白的紊乱，其改变可能对湿、热的量化,判断湿、热的偏重具有重要的作用。关键词：湿热证动物；炎症因子；16srRNA；水通道蛋白II Experimentalstudyontheessenceof"Dampheatsyndrome"Specialty:ClinicalBasisOfTraditionalChineseMedicineAuthor:XieJingTutor:LuoHuanhuanAbstractPurposelingnanregionwithsoutheastAsiamonsoonmaritimeclimatecharacteristics,hightemperatureandhumidenvironmentasthemainclimaticcharacteristics.Dietofhighproteinrelatetodeficiencyofspleenandstomach,combinedwiththelingnanareauniquenaturalclimate,thefibrilediseaseDanmp-HeatSyndromeiscommoninpatientswiththeheatandhumidfactorsandspleenasthecenterandtheinternalinjuries.Isthebasisandinternalcauseofthedisease,hotandhumidfactorsisoneofthekeypointlinksit'smodelreplication.usingtheautomaticartificialclimatecabinettomaintaintemperatureandhumidityconditions.Toestablishmodelsofdamp-heatsyndromeratsbycompoundfactorstoestablishthemousemodelservingforFibrileDiseaseDamp-HeatSyndrome,thisaimistoexplorecompositionofintestinalflora,inflammatorystatusandthechangeofaquaporinsintheFebrileDiseaseDanmp-HeatSyndrome.MethodsUsinghightproteindietwithhumidityandheatenvironmentandotherbiologicalcompoundfactors,toestablishthemousemodelofDamp-heatsyndrome.Wetfactorstotallyenclosedautomatictemperaturecontrolofartificialclimateboxraisethetemperatureandhumidity.Tomantainlingnanuniquethermalandhumidenvironment,usingintraperitonealinjectionofLPSsimulationtorageinvasionwetasthecharacteristic.Weestablishthedamp-heatmodeltomonitordailyactivitiesandsigns,measuringmicebodyweightchangeseveryweek,usingHEstainingtodetecttonguepathomorphismchanges;SerumLPSTHF-αconcentrationwasdetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).ImmunohistochemicalmethodwasusedtodetecttheproteinpositiveexpressionofNF-kbp65TLR4AQP3andAQP4inmousemodelcolontissues.ResultsSymptomsofdampheatsyndromeofdampsyndromemodelweremanifestedinIII thesymptomsofweightloss,sleepinglaziness,anorexiaandstickyperianalfilthofthestool.Colonpathologyresultsshowthatthethicknessoftonguecoatingofdampness-heatsyndromewithpredominantdampnessgroupissignificantlyhigherthandampness-heatsyndromewithpredominantheatgroup;thefourkindsofmousemodelscontentishighterthanthenormalgroup,theserumlevelofLPS,THF-α,NF-kbp65,TLR4indampness-heatsyndromewithpredominantheatgroupincreasedsignificantlycomparedwithnormalgroup(P<0.001),comparedwithgroupLPSmousemodel,thelevelofLPS、TNF-αindampness-heatsyndromewithpredominantheatgroupisgreaterthanthedampness-heatsyndromewithpredominantdanmpgroup(P<0.05),theNF-kbp65andTLR4proteinexpressionintwokindsofdamp-heatsyndromemousemodelhadnosignificantdifference;Comparedwiththedampness-heatsyndromewithpredominantdampgroup,theexpressionofAQP3andAQP4increasedinthedampness-heatsyndromewithpredominantdampgroup(P<0.05).Itwassuggestedthattheinflammationdegreeinthedampgroupwashigherthanthatoftheheatgroup.Itwaspresumedthatitmayberelatedtotheinfluenceofalcoholonthepermeabilityoftheintestineandthedampandhotenvironment,andtheinflammatoryfactorsandtheaquaporin.Proteindisordermaybeoneofthequantitativecriteriainanimalmodelsofdampheatsyndrome.Testreportofmanure16srRNAshowthatthedominantbacteriagroupintwogroupsofdampheatsyndromeanimalisBacteroidetesandFirmicutes;resultsofPCAmicrobialcommunitiesaresimilar,thediversityofAlpharesultssuggestthatthetwoheatmodelgrouprichnessdecreased.ConclusionAccordingtothemodelingmethodofthesyndromeofdampheatsyndromeoftraditionalChinesemedicine,twomousemodelsofdampheatsyndromewereestablishedbythecompositefactormodelingmethod.Afterthemodelwascompleted,themiceinthemodelgroupshowedsimilarsignsofclinicaldampheatsyndromeandsymptoms;Intestinalmicrofloraresultsshowedthattheintestinalmicroflorainthemiceofthetwogroupsofdamp-heatsyndromeswithmildillnessesdecreased,andthechangesinBacteroidetes,Firmicutes,andClostridiamaybethecharacteristicsofmoistheatinmicewithdamp-heatsyndromes;animalmodelsoffebrileillnesssyndromeexistinflammatorymediatorsinducedbytheendotoxin-TLR4pathwayanddisturbancesofaquaporins,IV whichmayplayanimportantroleinthequantificationofdampandheat,andinthedeterminationofdampandhotstress.Keywords:Dampheatsyndromeanimal;inflammatoryfactor;16srRNA;aquaporinV 目录中文摘要................................................................IAbstract..............................................................III目录...............................................................VI引言................................................................1第1章文献研究........................................................21.1温病湿热证研究....................................................21.1.1温病湿热证概论................................................21.1.2温病湿热证的病机特点..........................................21.2现代医学对温病湿热证证型实质的研究................................21.2.1湿热证与炎症因子..............................................21.2.2湿热证与水通道蛋白............................................41.3肠道微生态及其研究进展............................................51.3.1肠道微生物群..................................................51.3.2肠道微生物与相关疾病研究......................................51.3.3湿热证模型研究进展............................................7第2章小鼠湿热证模型造模及相关病理检测...............................102.1实验材料.........................................................102.1.1实验动物.....................................................102.1.2实验饲料.....................................................102.1.3实验试剂.....................................................102.1.4实验仪器.....................................................102.2实验方法.........................................................102.2.1实验动物分组.................................................102.2.2LPS注射液的配置..............................................102.2.3实验造模方法.................................................102.2.4取材.........................................................112.2.5一般观察.....................................................112.2.6检测指标.....................................................112.2.7统计学处理...................................................112.3实验结果.........................................................112.3.1各组小鼠一般生理情况.........................................112.3.2各组小鼠体重变化情况.........................................12VI 2.3.3湿热证小鼠相关病理学检测.....................................132.4讨论.............................................................14第3章岭南温病湿热证小鼠16SRRNA肠道菌群检测.........................173.1实验材料.........................................................173.1.1实验动物.....................................................173.1.2实验饲料.....................................................173.1.3实验试剂.....................................................173.1.4实验仪器.....................................................173.2实验方法.........................................................173.2.1实验动物分组.................................................173.2.2LPS注射液的配置..............................................173.2.3实验造模方法.................................................173.2.4粪便标本的收集及保存.........................................183.2.5小鼠肠道菌群16sRNA的检測....................................183.2.6统计学分析...................................................183.3实验结果.........................................................183.3.1各组小鼠肠道菌群物种注释分析.................................183.3.2各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析.............................193.3.3各组小鼠肠道菌群OUT丰富度的PCA分析.........................213.4讨论.............................................................21第4章岭南温病湿热证小鼠炎症因子检测.................................244.1实验材料.........................................................244.1.1实验动物.....................................................244.1.2实验饲料.....................................................244.1.3实验试剂.....................................................244.1.4实验仪器.....................................................244.2实验方法.........................................................254.2.1实验动物分组.................................................254.2.2实验造模方法.................................................254.2.3取材.........................................................254.2.4血清LPS、TNF-αELISA检测....................................254.2.5结肠组织NF-κbp65、TLR4免疫组化检测........................254.2.6Trizol法提取组织RNA.........................................264.2.7RNA逆转录....................................................263.2.8实时荧光定量PCR检测结肠CD14、TNF-α表达.....................26VII 4.2.9统计学处理...................................................274.3实验结果.........................................................274.3.1各组小鼠血清TNF-α、LPS含量比较.............................274.3.2各组小肠结肠组织NF-κbp65、TLR4免疫组化检测................284.3.3各组小鼠结肠组织PCR相对定量TNF-α、CD14结果................294.4讨论.............................................................30第5章岭南湿热证小鼠与水通道蛋白.....................................325.1实验材料.........................................................325.1.1实验动物.....................................................325.1.2实验饲料.....................................................325.1.3实验试剂.....................................................325.1.4实验仪器.....................................................325.2实验方法.........................................................335.2.1实验动物分组.................................................335.2.2实验造模方法..................................................335.2.3取材.........................................................335.2.4结肠组织AQP3、AQP4免疫组化检测..............................335.2.5统计学处理....................................................335.3实验结果.........................................................345.3.1各组小肠结肠组织AQP3、AQP4免疫组化检测......................345.3.2各组指标相关性分析...........................................345.4讨论.............................................................35结语...............................................................38参考文献...............................................................39附录...............................................................45致谢...............................................................47VIII 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究引言岭南地区是中国一个特定的区域，指中国南岭（五岭）之南的地区，地属东亚季风气候区，大部分地区夏长冬短，常年高温多雨为其主要气候特征，环境潮湿炎热，易致地湿上蒸，天湿地热，温高湿重是其基本的气候特征，正如《岭南卫生方》讲到:“岭南号炎热，而又近海，地卑而土薄…近海地卑，故阳湿之气长盛”，故暑湿温热病为岭南常见的多发病。岭南地区不仅地理环境相近，人民生活习性也有很多相似之处。岭南地区毗邻大海，海产品丰富，岭南人多喜食鱼虾海鲜等生冷之品，加之喜饮凉茶，可致脾气受损，阳气阻遏，湿邪内生。诸多饮食不节因素可诱发脾胃湿热证的形成，正如薛生白《湿热论》所云:“太阳内伤，湿饮停聚，客邪再致，内外相引，故病湿热”。本实验中通过根据岭南气候及起居情况，构建两种湿热证模型：湿大于热、热大于湿组；“实则阳明，虚则太阴”，湿大于热组通过设立“湿热外环境+高蛋白饮食+饮食失节及劳役（高脂、白酒之饮食失节+被迫跑步劳役之脾虚）”复合因素造模；热大于湿组使用湿热外环境+高蛋白饮食+LPS复合因素造模；脾虚组采用饮食失节（饥饱失常+白酒）+被迫跑步劳役造模，构建符合岭南膳食结构特色的湿热证小鼠模型。肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor，TNF-α）是由巨噬细胞分泌的一种多功能小分子蛋白，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，TNF-α可作为内源性热原质使机体体温升高，可通过刺激下丘脑体温调节中枢而引起机体发热。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是脂质和多糖的复合物，为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要成分，LPS时放入血液循环称为内毒素，是激起机体非特异性免疫功能的主要分子，可直接释放炎症因子而诱导免疫细胞凋亡，抑制机体免疫功能。Toll样受体4(TLR4)是一类天然免疫受体，可直接识别结合某些病原体进而导致炎症介质的释放。TLR4作为高敏感性LPS受体，是目前研究最多的与LPS跨膜信号转导有关的胞内受体，参与免疫反应并诱导核转录因子κBp65(NF-κBp65)的激活和移位，从而使效应细胞合成和释放大量炎症介质。内毒素-TLR4通路诱导的炎症反应是湿热证“热”发生发展中的活跃机制之一，也是今年来研究的热点。水通道蛋白（AQP）是近年来研究发现的与水液代谢相关的一族细胞跨膜蛋白孔道，介导水的跨膜转运参与水的分泌、吸收等，是平衡地维持体内水代谢的分子学基础，而水通道蛋白的异常表达可能与中医中的“湿邪”密切相关。本研究的研究目的主要根据岭南地区高蛋白饮食，湿热外环境的特点，构建两种湿热证小鼠模型，为岭南湿热证的中医学临床基础研究提供新模型。探讨湿热证中，“热”与炎症因子，“湿”与水通道蛋白的相关性及中医湿热证中免疫炎症反应机制与AQP之间是否存在相互递进或交叉的关系。1 广州中医药大学2018届硕士学位论文第1章文献研究1.1温病湿热证研究1.1.1温病湿热证概论中医湿热病，见于《温热经纬·薛生白湿热病篇》，“热得湿而热愈炽,湿得热而湿愈横”，湿邪与热邪交合则病情缠绵。湿热病一年四季内均可发生，且以夏秋较为多见，临床以胸满痞闷、身重体倦、身热缠绵、小便短赤、苔黄腻、脉濡数等临床表现为主。随着现代人们生活水平的提高,饮食结构及作息习惯的改变,由于过食肥甘、多逸少劳者增多,这些可致脾气受损,阳气阻遏,湿邪内生的情况日益普遍,与湿热有关的疾病更呈明显上升趋势。湿热胶结表现出“湿阻、热蕴、气滞、血瘀、气虚”为[1]温病湿热病证之综合病理变化,且其致病具有广泛性、病机复杂、病程长、缠绵难愈、治疗困难的特点。岭南地区特有的地理环境、气候因素及人民的生活饮食习惯，导致湿热证有着鲜明的地域特点。外邪入里，里湿为合，导致脾胃不能运化水谷之湿，与热邪相合，发为湿热病，故其治疗当从祛湿和清热两方面入手。湿热证始终以脾胃为病变中心，“太阴内伤”是湿热证发病的内因和基础，是湿热证模型复制需要模拟的关键环节之一。1.1.2温病湿热证的病机特点脾胃湿热证主要由脾胃功能受损而以脏腑功能失调为主的一类病证,在外诱因[2]为湿热邪气，其主要的发病机理以脾胃功能失调为主。脾胃湿热证发病,可因湿热外环境使脾胃受损运化不利;长期饮食不节,嗜食肥甘厚味,损伤胃肠,致宿食所化之热与中焦停聚之湿相合而成。《素问·经脉别论》曰：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺”，脾主运化，脾气在水液在机体升降布散运动中起着核心作用，可将水谷精微转输至全身各个脏腑，湿邪困脾，导致水湿内生而又阻碍脾胃运化功能[3]。湿热之邪蕴结脾胃，脾胃运化水谷精微物质的功能受损，出现院腹痞闷，食欲降低、四肢困着等症状；湿热下注则小便短赤，大便黏滞不成型;红质红苔黄腻，心烦、脉弦滑数均为湿热内盛之征。1.2现代医学对温病湿热证证型实质的研究1.2.1湿热证与炎症因子炎症细胞因子是反应机体感染的敏感指标，致炎因子激活后，中性粒细胞和单核巨噬细胞可释放氧自由基、细胞因子磷脂代谢产物、溶酶体酶促进炎症反应和参与组织损伤。丁书文等发现清热解毒中药复方合剂有一定抗动脉粥样硬化内皮细胞损伤作用，且对不稳定型心绞痛患者静脉血中TNF-α、IL-1、P选择素(Ps)等炎症因子有调[4]节作用，该研究初步显示了炎症因子与热毒之间的相关性。吴智兵等发现湿热环境可使大鼠肠道内毒素向血液迁徙，引起机体分泌内生致热原TNF-α、IL-1细胞因子分泌增加,导致体温升高，并产生身蜷倦怠、呃逆、大便粘滞不爽等温病湿热证样表2 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究[5]现。肿瘤坏死因子TNF-α主要由单核－巨噬细胞分泌种小分子蛋白，在LPS等抗原刺激后产生的前炎症细胞因子，在炎症的发生发展中起重要作用。研究发现湿热外环境不仅可以强化内毒素的致病力，而且可以通过上调TNF-α的基因表达以产生更多[6]的细胞因子来激发炎症连锁反应，这可能正是湿热证形成的一个重要环节。采用复合因素复制新西兰兔温病湿热证模型，结果发现研究发现湿热环境不但可以增强内毒素的致病力，而且可以通过上调TNF-α的基因表达，使机体产生更多的细胞因子从[7]而加重炎症反应。这可能正是造成湿热证的一个重要环节。王婷等发现，在湿热外环境加高蛋白饲料、蔗糖水喂养的湿热组模型小鼠血清INF-γ、TNF-α水平增高（P[8]＜0.05），提示湿热模型组具有温病湿热证血清炎症因子相关表现。CD14是一种髓样单核细胞的分化抗原,主要存在于单核细胞、巨噬细胞和中性白细胞的表面,为脂多糖/脂多糖结合蛋白(LPS/LBP)复合物的受体蛋白。CD14在机体免疫系统的病理反应中起关键作用,以CD14依赖及非依赖方式诱导产生细胞因子,可导致或参与炎症反应引[9]起组织器官损伤。若能够完全封闭CD14的功能，特异性的阻断CD14与LPS及LPS/LBP复合物结合，就能够防止或中止LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应[10]的发生，对于临床治疗内毒素血症、内毒素休克等有重要意义。郑锋玲等发现湿热证流感患者炎症反应更为强烈，血清中LBP、CD14、TLR4水平较流感温热病组明显升高。Toll样受体（Toll-likereceptors,TLR）是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，TLR4是最早发现的哺乳动物TLRs,成为联系天然免疫与获得性免疫的纽带。存在于胞内区、跨膜区和[11]胞外区的糖蛋白。LPS首先与CD14结合，形成LPS-LBP-CD14配体，该配体与辅助因子复合物后，TLR4信号通路激活，TLR4、CD14与髓样分化蛋白2（MD-2分子）相互作用和结合，三者形成高亲和力和具有信号转导功能的“LPS识别受体复合物”，共同介导对LPS的识别。TLR4/NF-κB信号通路是近年来研究发现与抗炎免疫机制紧密相关的信号传导通路，在炎症发生发展中起关键作用。根据接头蛋白的结构不同，TLR4对LPS识别的胞内信号转导途径分为有髓样分化因子88(myeloiddif-ferentiationfactor88,MyD88)依赖的信号通路和MYD88非依赖的信号通路：一、MyD88依赖途径是信号转导的经典途径，TLR4则通过MAL与MyD88作用，通过NF-κB二聚体与I-κB（inhibitor-κB）结合,,向下游传递信号,调控IL-1、IL-6和TNF-α等炎症[12]。因子的转录二、MYD88非依赖的信号通路：TRAM-TRIF信号通路，首先TLR4在质膜上诱导TIRAP-MyD88信号，然后再进入并激活早期核内体的TRAM-TRIF信号,产生[13][8]IFN-β。王婷等发现，温病湿热证小鼠模型结肠中TLR4、CD14mRNA的转录水平较正常组相比明显升高，而通过茵陈蒿汤治疗后，发现茵陈蒿汤能下调TLR4、CD14mRNA的转录水平，并降低TNF-α的含量，提示了温病湿热证随着自然进程的发展，能明显激活TLR4信号通路。NF-κB是一种具有多向性转录作用的核蛋白因子，广泛存在于各种组织内,在肠道免疫系统中起关键作用，调控促炎症细胞因子、细胞表面受体、3 广州中医药大学2018届硕士学位论文[14]转录因子以及与肠炎症有关的粘附分子的转录活性，是细胞激活的标志。程方平等[15]采用多因素复合造模的大鼠湿热证模型，结果发现TLR4mRNA、NF-κBp65在肝巨噬细胞中的表达显著增强(P<0.01)，推测湿热证的致病机理是通过单核-巨噬细胞介导的内毒素转导信号相关蛋白分子(如LBP、CD14TLR4等)间的相互作用,最终导致核转录因子NF-κB的活化促使细胞表面受体和多种细胞因子基因的表达，引起机体多种炎症介质的失控性释放，而TLR4mRNA在肝组织中的表达及NF-kB激活既是湿热病证的主要致病机理,又是湿热病证的客观性指标。1.2.2湿热证与水通道蛋白水通道蛋白(aquaporin．AQP)是庞大的跨膜通道蛋白(majorintrinsic[16]protein．MIP)家族中的一种，由一系类内在膜蛋白组成。至今为止，在哺乳动物中已经发现并确认了13种具体不同功能的水通道蛋白，即AQP0~AQP12，统称为水通道蛋白(AQPs)家族，目前已报道至少有多种水通道蛋白在消化系统中有广泛表达。在维持机体水液代谢的正常生理情况下,AQP始终保持激活状态,水由低渗区向高渗区移动，通过介导水的生物膜转运参与水的分泌、吸收，对机体保持平衡及细胞内外环境的稳态起核心作用，是保持机体水代谢平衡的分子学基础。目前为止已知在哺乳类动物体内出现结构和功能相似的水通道蛋白至少有13种，包括其中六种在人体肾脏中的表达。AQPs的调节机制可以总体来说可分为两种:1)通过调节AQP的活性来影响其功能，目前这种调节机制主要来自对植物α-TIP和NOD26的相关研究。2)经过改变细胞膜上膜蛋白的数量来调节水的跨膜流动，细胞可以通过改变水通道蛋白的合成速率[17]来实现(基因水平调控)此类调节。温病湿热证是湿邪和热邪同时侵袭机体邪而致病，均由各脏腑（主要是肺脾肾三脏腑为主）输布排泄水液功能而导致，在湿热证的病理的病理状态下，AQPs的改变，可作为“湿热”之邪存在于机体的重要病理机制之一。[18]文小敏等发现，脾胃湿热模型组大鼠尿液AQP2的含量与正常组相比明显减少，推测机体向外利水的作用受到抑制，导致“湿邪”的积累，提示AQP2对“湿邪”的形成、湿的量化具有重要的作用。许多学者认为，大肠内AQPs的异常表达可能与结肠对水分的重吸收功能密切相关，AQPs可影响结肠肠液的分泌而影响大便的排便功能，由此推测水通道蛋白在胃肠道蠕动和传导功能中起着一定作用。外湿过盛和饮食不节导致脾胃转运水谷精微物质受损是湿困脾胃证的主要病因，病位主要在脾胃二脏，病性上以“湿”为主，治疗以清热祛湿或化湿和胃为原则。温病湿热证大鼠模型舌组织AQP5的表达较正常组明显升高，推测AQP5的过度表达可能与模型组的腻苔形成有关[19]。AQP2是抗利尿激素敏感型水通道，其表达作用及调节的机制揭示了很多肾脏水调[20]节的生理及病理生理现象，提示AQP2在调节机体水平衡中起着至关重要的作用。[21]吴仕九等发现，采用湿热型加高糖高脂、大肠杆菌灌胃建立的大鼠湿热证模型，尿液中AQP2蛋白的排出量与肾脏AQP2蛋白的含量有着显著的相关性，湿热证组AQP2的表达水平较正常组明显降低，提示模型组大鼠肾脏AQP2的数量的变化可影响湿热4 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究证的进程，湿热模型组尿液中AQP2的含量可反应大鼠肾内髓AQP2蛋白的水平。研究发现，在温病湿热证动物模型中，舌、胃组织中AQP1表达明显升高，且与组织炎症水肿程度密切想，使用清热祛湿的药物治疗后，舌、胃组织中AQP1的表达有不同程[22][23]度的下降，提示AQP1参与了湿热证的发生发展过程。张诗军等在临床上观察慢性浅表性胃炎脾胃湿热证患者，发现大部分患者AQP3表达呈阴性，推测可能是AQP3的低表达导致胃内水液代谢障碍而形成脾胃湿热证，小部分患者的AQP3的高表达可能是因为内湿导致的渗透压变化，而两者之差别可能在于对“湿”或“热”的程度的更精准的定量。1.3肠道微生态及其研究进展1.3.1肠道微生物群肠道是人体正常微生物群最集中的部位之一，具有相当可观的数量的动态微生物混合群体，包括细菌、病毒、真菌和一些单细胞生物等，是人体内的最为庞大、复杂的消化吸收场所。人体体内的微生物多达到100万亿个细胞，是人类细胞数量的10倍，而肠道定植着大量细菌，是人类最庞大的菌库，微生物群种重约1000g,数量高达1014个，个体间微生物群落的结构性和多样性有差异，而杆菌门和厚壁菌门是较为常[24]见的菌种。而宿主-微生物的相互作用的最大场合主要在肠粘膜，人类肠道上的微生物数量远远超过人体细胞和生殖细胞的总数，对黏膜免疫系统的正常结构和功能发[25]育有重要影响。肠道微生物有大量的生化反应，被称作为“微生物器官”，可降解许多难以消化的食物，肠道肠道内数以亿计的微生物及其代谢产物在人体免疫、胃[26]肠道消化吸收以及营养物质代谢方面起重要作用。了解人体肠道菌群的复杂组成关系以及调节方法对人体健康具有重要的意义。寄居在肠道中的各种微生物根据与宿主[27]的关系主要分为三类：第一，互利共生，即宿主和肠道寄生物之间协同进化，共生中不损及对方，且双方受益；第二，同食共生，人体向微生物提供了适宜的生长环境，包括营养物质，PH值等，而微生物的代谢产物反过来可影响人体的免疫功能、胃肠道[28]的生理功能等，是双方在长期的相互选择和适应的结果；第三，致病作用，少量菌群在生理平衡状态下不会产生危害，但如果超过一定的量，会产生致病作用。1.3.2肠道微生物与相关疾病研究肠道作为“微生物器官”，从根本上影响人体的健康与基本。人体肠道微生物群的改变可影响机体免疫功能、肠道消化吸收代谢功能，而肠道菌群的差异也使个人对[29]疾病的抵抗力各有不同。当肠道生物群落结构失衡时，即会诱发多种疾病。大量研究发现，肠道微生物菌群可通过促进抗肿瘤免疫和加强抗癌药物的药效发挥这两方[30]面来对抗肿瘤治疗产生疗效。宿主的遗传因子与肠道菌群之间的协同作用决定了疾病的易感性，小鼠对结直肠癌的形成是随着肠道微生物菌群的减少而增强的，AIM2[31]免疫球蛋白的表达对肠道菌群有一定的调控能力，可预结直肠癌。肠道微生物可通过影响人体群落水平，改变机体能量的平衡从而导致肥胖，而拟杆菌对人体糖代谢的5 广州中医药大学2018届硕士学位论文[32]影响是肥胖的因素。不同的肠道微生物对机体能量代谢有着不同的作用，肠道共生微生物在人体能量平衡中起着重要作用营养过剩的情况下，可引起肠道菌群的病理转[33]变，肠道微生物与宿主生理和病理的关系可能是导致肥胖及肥胖并发症的关键因素。[34]王怀山等通过益生菌调节肠道微生态对肥胖大鼠的影响，发现肥胖与肠道微生物有密切的联系，大鼠肥胖后肠道厌氧菌活性增高，菌群总菌量升高，通过给模型组大鼠灌服芽孢杆菌悬液后，大鼠体重降低，肠道总菌群的多样性明显升高，肠杆菌的多样性和数量明显增加且有新的势菌群出现，肥胖大鼠模型组建模前后菌群结构变化差异非常明显，推测芽孢杆菌可以控制肠道菌群结构而影响大鼠体重，肥胖对肠杆菌的影[35]响比较明显。BajzerM等发现肥胖小鼠肠道中Firmicutes(厚壁菌门)的数量多于Bacteroidetes(拟杆菌门)，而消瘦小鼠肠道中，拟杆菌门数量高于厚壁菌门，在一年之内，肥胖小鼠的体重减轻时，厚壁菌门的比例就会接近消瘦小鼠的肠道厚壁菌门比例，并推测小鼠的肥胖程度可影响小鼠肠道的菌群组成而进一步影响小鼠体重。肠道微生物紊乱影响肠-脑轴的正常生理功能而导致肠道通透性异常性增加和血脑屏障功能受损，通过影响胃肠道运动感觉功能引起病原微生物的感染而加重中枢神经系统[36]炎症，影响大脑功能和行为，增加患阿尔茨海默病的危险性。研究发现，1型糖尿病大鼠肠道拟杆菌门含量较未患病的大鼠明显升高，通过抗生素调节肠道菌群后，可[37]有效的降低糖尿病的发病率，说明肠道免疫系统与糖尿病的密切相关。经过16SrDNAV3－DGGE测序分析发现，糖尿病鼠类肠道菌群总基因组发生改变，可能是高血糖破坏了肠道菌群微环境有关，导致肠道环境的氧化应激水平上升，模型组小鼠的双歧杆菌数量较正常小鼠比较明显降低，而拟杆菌、梭菌、双歧杆菌的群落结构未见明显[38]差别。肝脏和肠道大量接触细菌成分和机体代谢产物，菌群的变化可影响机体免疫系统和细胞之间相互作用影响肝炎症活动度、纤维化程度，从而导致肝脏相关疾病如[39]酒精性肝病（ALD）、非酒精性肝病（NAFLD）等。小肠细菌过度生长(SIBO)肠道内微生物群紊乱，导致厌氧菌过度增长而产生消化不良的症状，通过呼吸测试发现，H2氢气浓度和CH4甲烷浓度(分别为56%和64%)的患者肠道内细菌过度生长的发生率较高，通过肠道厌氧菌培养发现，小肠细菌过度生长(SIBO)的诊断率与乳糜泻密切相关，[40-41]乳糜泻患者SIBO明显高于无反应性乳糜泻患者。研究发现干预人体肠道菌群，可[42]预防和治疗相关疾病，余英等发现，老年慢性传输型便秘患者肠球菌、乳酸杆菌、梭杆菌等的数量与正常人群有明显差异，给便秘患者给予双歧杆菌三联活菌片调整肠道菌群，可有效缓解患者便秘的症状。通过口服益生菌制剂干预后，可通过调整肝硬[43]化患者的肠道菌群失调而降低内毒素，改善肝功能。肠道菌群失调可引起胃肠功能[44]紊乱，吴瑞丽等应用ERIC-PCR技术分析溃疡性结肠炎UC患者与正常对照组的粪便标本发现，UC活动期患者肠道多样性较缓解期、正常组肠道菌群多样性明显降低，而正常组与UC缓解期无显著差异，且UC活动期出现不常见的菌属，推测肠道菌群失调可能是UC发病的一个重要激发因素。6 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究1.3.3湿热证模型研究进展1.3.3.1温病湿热证动物模型研究“湿热证”是一直中医临床及基础研究领域研究的热点，通过模拟中医病因病机[45]复制温病湿热证动物模型，对中医症候实质研究有着重要意义。王新华较早建立了以湿热气侯环境,饮食不节（猪脂板蜂蜜喂饲）及内毒素因素（耳缘静脉推注大肠杆菌肉毒素）等综合因素复制的家兔温病湿热证动物模型的方法,模型动物出现诸如发热、大便溏泄、体重降低、舌苔白腻等表现，且笔者在临床观察温病湿热证患者多患有内毒素血症，推测脾胃虚损可影响机体免疫力而形成温病湿热证“湿邪”停留的状[46-47]态。吴仕九等以“湿热外环境+高脂饮食+致病生物因子（灌服鼠伤寒沙门氏菌）”复合因素建立温病湿热证动物模型，认为此种造模方法较为接近中医湿热证症状与体征，造模成功后运用清热利湿法的清香散对其治疗，结果发现清香散可改善湿热证模[48]型大鼠湿热证症状。常丽萍等通过设立不同湿热外环境的试剂和不同剂量的大肠埃希菌的条件，对比不同条件对模型质量的影响。采用“高脂饲料+湿热外环境+大肠埃希氏菌灌胃”建立SD湿热证大鼠模型，造模结束后移出至自然环境，普通饲料喂养并观察3天完成早哦，结果发现外来致病菌低剂量组在体温升高方便表现得最为明显，而湿热外环境最长的模型组（28d）饮食量、饮水量减少情况最为明显，舌苔厚度的出现和各方面症状总体评估较其他组有明显优势，28天湿热外环境+低剂量致病[49]菌灌胃可建立体征症状有明显优势的温病湿热证大鼠模型。佟丽等给予大鼠高脂、高糖饲料的饲养条件，探讨湿热外环境和外在病原微生物对大鼠免疫功能的影响，发现在以上几种复合条件下建立的温病湿热证大鼠模型，其大鼠体内红细胞免疫功能显[50]著降低，更为符合中医临床湿热证病情缠绵难愈、抗病能力低下的表现。汤朝晖等从不同的致病因子观察两种小鼠温病湿热证模型的特征，使用肥甘饮食+人工气候仓+外来生物致病因子的复合造模因素，温病湿热病毒组使用腹腔注射MHV—A59，温病湿热肠菌组则使用大肠杆菌灌胃的方法，两组不同的模型小鼠血清中TNF-α与TG水平较正常组显著增高，而病毒组血清TNF-α的浓度较肠菌组升高更为明显，TG水平变化无差别，提示“内湿”因素与肥甘饮食与湿热外环境关系较为密切。1.3.3.2大肠湿热证动物模型研究多数学者采用采综合因素造模法(饮食不节+湿热外环境+外来生物因子)复制大[51]肠湿热证大鼠动物模型。慕澜等以高糖高脂饲料喂养10天后将大鼠置于湿热人工仓[温度35℃,相对湿度85%）8h/d，连续3天后以大肠杆菌灌胃完成大鼠大肠湿热证造模，在注射大肠杆菌4h后肛温升至39.7℃后随之下降，模型组血清IL-1、IL-2、IL-6浓度的较正常组浓度显著升高，推测白介素1、2、6的含量升高可能为大肠湿热[52]证显著客观指标，且大肠湿热证与免疫炎症关系密切。王丽红等使用上述造模方法，发现随着造模时间延长，造模组大鼠出现毛发枯槁、饮食量减少、倦怠、嗜卧懒动等体征，给予葛根素治疗后，发现模型组动物状态转为良好，体温恢复正常，大便成形。7 广州中医药大学2018届硕士学位论文[53]李学等使用“高糖高脂+高温仓+侵袭性大肠杆菌”的复合造模法观察大肠湿热证动物造模前后大鼠肠道的病理变化，实验结果表明“高糖高脂+湿热外环境”的因素不足以形成湿热证的主症，进一步感染外来生物因子模仿“外来疫气”才能形成典型的大肠湿热证的症状，大肠湿热证组肠组织出现粘膜明显充血且水肿，局部有小的出血[54]点，大肠湿热证的炎症病理变化可能是此模型的最典型客观指标之一。冯贵仁等检测大肠湿热证模型组大鼠血清相关炎症指标的浓度变化发现，血清IL-1β、IL-6和SIgA的水平明显升高，使用化湿收涩的中药煎剂治疗后可发现大肠湿热证模型[55]大鼠的相关症状和体重、免疫炎症因子有一定改善。文艳巧等在上述造模基础上增加饥饱失常+白酒的饮食条件，造模大鼠前10d禁食并自由饮用蜂蜜水，之后喂食饲料与灌服猪油隔日交替禁食，5d后灌服白酒并置于高温高湿环境，两次腹腔注射大肠杆菌完成造模，模型大鼠在造模结束后胃肠道运动功能紊乱，出现体重减轻、嗜睡、食欲减退、大便稀溏等情况，血清中胃肠相关激素因子血浆胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）、SP和VIP含量水平升高，而生长抑制素含量含量降低，说明胃肠激素的改变可调节胃肠道的运动而影响大肠湿热证的进程。1.3.3.3脾胃湿热组动物模型研究脾胃湿热证是中医湿热证中的常见证候之一，多数学者都是从“太阴内伤”的角[56]度建立脾胃湿热组动物模型，翁一洁等使用饮食不节、过食肥甘的方法损伤脾胃，阻碍脾胃运化以模拟内湿因素，模型组小鼠在普通饲料的喂养基础上，自由饮用200g/L的蜂蜜水，隔日灌服15g/kg油脂，并与油脂间隔10d、20d、30d灌服20ml/kg的白酒，并分别设置为模型I组、模型Ⅱ组小鼠、模型Ⅲ组。结果发现模型Ⅱ组、Ⅲ组胃动素、胃泌素较正常组均正常对照组出现明显增高，但两组数据无统计薛差异，而白酒灌胃高的模型Ⅲ组结肠黏膜受损严重，故选择20d间隔时间的白酒灌胃作为内[57]湿因素造模时间。张一帆等用内湿合外湿的造模方法建立大鼠脾胃湿热证模型，以高脂高糖饮食并饲以20%蜂蜜水，灌服2%水杨酸钠溶液并隔天灌服2g/200g的比猪油，同步置于湿热外环境[温度(30±1)℃,相对湿度(90±5)%，该复合因素造模法的湿[58]热证大鼠细胞免疫呈亢进状态，免疫调节功能减弱。吕冠华等等使用湿热外环境[(32±2)℃,相对湿度为95%]+高脂高糖饮食+白酒灌胃的内外因的造模思路维综合造模方案，建立了更符合中医学病因病机的脾胃湿热证大鼠模型，造模结束后，内外因湿热证模型大鼠出现体重减轻、适量较少、大便时干时溏等症状，且大鼠血清胃泌素GAS水平明显升高，长期高脂高糖的饮食并灌服白酒，影响大鼠脾胃运化功能，而胃泌素水平的改变，一定程度上与脾胃湿热证患者胃肠部消化不良的症状相类似。以高脂高糖+白酒+湿热造模箱+外来病原微生物（灌服大肠杆菌的）复合造模因素建立脾胃湿热证动物模型，发现模型组大鼠存在下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴的亢进的病理改变，肾上腺素、血清GC的含量与正常组相比明显增高，推测HPA轴功能紊[59][60]乱与湿热证的形成有一定相关性。文小敏等发现在饮食不节、白酒、湿热人工气8 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究候箱、外来微生物（伤寒沙门氏菌）综合因素建立的脾胃湿热证大鼠模型，其湿热证的形成过程可诱导产生CD8+，CD8+的数量明显增加而CD4+的数量减少，模型组大鼠外周T淋巴细胞亚群紊乱而影响细胞免疫功能，使机体排除抗原性异物的功能低下，[61]这可能是脾胃湿热证的客观指标之一。曾常春等运用OCT技术检测脾胃湿热组模型大鼠舌苔显微成像，发现模型组大鼠舌苔厚度明显高于正常组，而量化性分析光衰减率结果发现模型组社体的含液量低于正常对照组，这可能与湿邪影响了津液的正常输布代谢有关。1.3.3.4湿热证动物模型湿热偏重相关研究温病湿热证在病变过程中有湿热偏重的差异，湿大于热组多使用寒凉药物损伤脾胃运化功能，使机体呈现湿偏重的症候体征，而热大于组则多以温热性药为组成的方[62]剂。郭明阳等采用脾虚模型的造模方法，采用大黄煎剂灌胃方法在湿重于热的动物模型上模拟中气虚的状态，再制造“内外湿”的因素条件，具体方法如下：以200%大黄煎剂3ml/次连续灌胃10d后置于湿热箱，高脂高糖饲料喂养，给予鼠伤寒沙门氏[63]菌灌胃，建立温病湿热证湿重于热动物模型。张俊英等以脾气虚的基础，结合多种复合因素造模调节制作湿重于热、热重于湿的大鼠模型，湿重于热组以高脂饲料灌服两周，同步第一周每天用2g/ml/200g的小承气汤灌胃一次，连续7d,第三周开始放入人工恒温恒湿气候箱（T：25℃；HR：95%;8h/d）共13天，灌服大肠杆菌10~9/ml/200g,随后4h后再次灌服以增加刺激，热重于湿组使用大黄附子汤灌胃，人工气候箱条件为T：35°；HR75％，其余条件同湿偏重模型组一样，造模结束发现热偏重模型组体温平均维持在较高温度，且高于湿大于热组，两组模型组症状体征基本符合湿热偏重的特点，模型组大鼠血清和肝组织TNF-α、IL-1β、NF-κB水平显著升高，且热大[64]于湿组含量较湿大于热组水平增高（P＜0.05）。谭永振等使用高糖高脂+高温高湿气候箱+大肠杆菌的符合因素造模法建立湿热证动物模型，湿大于热组在以上基础上增加白酒灌胃，热偏重组增加附子干姜煎剂，造模后两组湿、热偏重动物模型尿液存在AQP2的表达增高，而湿偏重组较热偏重组相比，尿液AQP2的含量增加更为显著(P[65]<0.05)，水通道蛋白2的改变可能是湿热量化的客观指标之一。田杰等建立湿重于热模型组的方法与郭阳明的造模方法相一致，此种以中气虚的思路复制的湿偏重组大鼠模型，检测结果表明血液中血脂较湿热模型组明显升高，推测血脂升高可能与“湿邪”的停留有关系，TC,TG与TNF-α含量的变化可能是温病湿热偏重变化的本质之一。9 广州中医药大学2018届硕士学位论文第2章小鼠湿热证模型造模及相关病理检测2.1实验材料2.1.1实验动物SPF级雄性BALB/c小鼠50只，质量为18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证明编号44005800005042。2.1.2实验饲料[66]高蛋白饲料由广东省医学实验动物中心加工，配方比例参考相关文献。普通饲料由广州中医药大学动物中心提供。2.1.3实验试剂30°九江双蒸酒（广东省九江酒厂有限公司）脂多糖冻干粉（sigma）2.1.4实验仪器RXZ-158A-LED型人工气候箱（宁波江南仪器厂）亚都YC-D205型超声波加湿器（北京亚都环保科技有限公司）ZH-PT动物实验8跑道跑台（安徽正华生物仪器设备有限公司）Bio-TEKELX808酶标仪（美国宝特公司）DMIL荧光生物显微镜（德国LEICA公司）BK-DM500型数码显微镜（重庆奥体光学显微镜有限公司）LEICA2015-RM型切片机（德国徕卡有限公司）长协电子CX2000小鼠电子秤（东莞市水葫芦商贸有限公司）MIKRO200R型高速冷冻离心机（德国Hettich公司）2.2实验方法2.2.1实验动物分组小鼠在SPF级实验室里适应性喂养14天，用随机数目表法将小鼠分为5组：正常对照组、脂多糖（LPS）组、湿大于热组、热大于湿组、脾虚组，每组10只小鼠，造模时间一共56天。2.2.2LPS注射液的配置用0.9%NACL生理盐水将大肠杆菌内毒素-LPS稀释成1mg/ml，按0.2ml/20g体重，[8]经小鼠腹腔注射，按1mg/kg的剂量给小鼠进行腹腔注射。2.2.3实验造模方法正常对照组：①正常组在SPF级环境下正常喂养；②LPS组（L组）：正常饮食56天，在第57天以1mg/kg的剂量给予小鼠腹腔注射一次LPS；③脾虚组：单日禁食，双日正常喂食且跑步30min+灌服0.3ml白酒；④湿大于热组：给予高蛋白饲料喂养且进入人工气候箱[T：（32±0.15）℃，HR：90%～95%]每天12h，同步单日灌服猪油0.3ml，10 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究双日灌服29.5度白酒0.3ml且在跑步机上连续跑30min。⑤热大于湿组：适应性喂养结束后给予高蛋白饲料喂养且进入人工气候箱（条件同上），在第57天以1mg/kg的剂量给予小鼠腹腔注射一次LPS完成造模；所有小鼠造模结束6小时后，进行相关样本的收集和相关指标的检测。2.2.4取材所有小鼠禁食水后，釆用摘眼球取血，4℃离心10min(3000r/min)，取血清-20℃低温保存，处死动物后立即取距肛门处8-10cm结肠组织5cm,分为两等分，一份放入Rnase-free的离心管中于-80℃冰箱保存，另一份结肠组织放入盛有多聚甲醛的容器中，待HE染色及扫描电镜检查；取小鼠胃组织、舌组织和放入4%多聚甲醛固定。2.2.5一般观察在实验过程中，观察并记录各组小鼠毛色、精神状态、粪便情况、活动度、体重等的变化情况。2.2.6检测指标造模结束后取小鼠舌根部组织、结肠组织石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察各组小鼠舌根部、结肠病理改变；结肠组织做电镜扫描。2.2.7统计学处理利用SPSS20.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示（x±s）。数据满足方差齐性，采用One-WayANOVA分析进行比较；数据不满足方差齐性，采用非参数检验分析，组间多重比较用LSD法检验。P<0.05，即存在统计学差异。2.3实验结果2.3.1各组小鼠一般生理情况如图2-1所示正常组小鼠在饲养期间，精神状况良好，毛色光泽，活动敏捷，活动量、饮食饮水量均正常，大便成形，体重呈正增长；LPS组在腹腔注射LPS后，出现喜贴边及扎堆、嗜卧懒动、纳呆、倦怠畏冷的情况，呈水泻样粪便，肛周污秽严重，个别有黏液便；脾虚组出现明显的蜷缩、倦卧、扎堆、眯眼、四肢不收等现象，大便基本成形；湿大于热组、热大于湿组模型小鼠在进入造模箱后，出现反应迟钝、倦怠、饮食减少、毛发疏松粗糙，晦暗无光泽，阴囊松弛下垂、大便不成形且黏腻症状加重，渐见肛周污秽，体重降低；且热大于湿组大便更为黏腻。11 广州中医药大学2018届硕士学位论文图2-1各组小鼠粪便观察2.3.2各组小鼠体重变化情况如图2-2所示，正常组、LPS组小鼠随着造模时间延长体重呈上升趋势，造模开始后，模型湿大于热组、热大于湿组、脾虚组与正常组相比均出现不同程度的体重减轻。造模结束后，湿大于热组平均体重明显低于热大于湿组、脾虚组，P＜0.05，存在统计学差异。图2-2各组小鼠体重变化趋势图12 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究2.3.3湿热证小鼠相关病理学检测2.3.3.1小鼠舌组织HE染色本实验湿热箱造模结束后，模型组小鼠出现典型的湿热证证候，HE病理染色切片可见正常组小鼠舌黏膜结构清晰，舌苔厚度适中，舌黏膜表面可见丝状乳头，黏膜下未见明显的炎性细胞浸润；LPS组小鼠舌黏膜表面可见丝状乳头且较低平，黏膜下有明显炎性细胞浸润；脾虚组见丝状乳头，粘膜下可见有明显炎性细胞浸润；湿热组角质层厚度增加且出现明显的角质化突起，热大于湿组舌黏膜表面为轮廓乳头，湿大于热组舌黏膜表面可见丝状乳头，舌苔厚度明显高于热大于湿组。a．正常组；b.LPS组；c.脾虚组；d.湿大于热组e.热大于湿组图2-3各组小鼠舌根部HE染色（100×）2.3.3.3小鼠结肠组织电镜扫描如图2-4所示，电子透射电镜下观察正常组小鼠结肠黏膜表面较完整排列整齐、大小一致、连接紧密，间隙未见增宽；LPS组、脾虚组黏膜表面损伤最为严重，向下出现许多纵行且排列不规则、较深的间隙，部分黏膜融合或消失，可见空化现象；湿大于热组、热大于湿组黏膜表面与对照组相比，黏膜上皮间隙增大，黏膜上皮有部分融合模糊不清。13 广州中医药大学2018届硕士学位论文a.正常b.LPS组组c.脾虚d.湿大于组组热e.热大于湿组a．正常组；b.LPS组；c.脾虚组；d.湿大于热组e.热大于湿组图2-4各组小鼠结肠电镜扫描（500×）2.4讨论中医湿热证是临床常见症型，也是中医临床及基础结合领域研究的热点，临床上以脘腹胀满，恶心纳呆，口中粘腻不爽，身重体倦，大便粘滞或秘结，小便短赤，舌红苔黄腻,脉弦滑数或缓为主症，整体辩证观在岭南特有的湿热证中得到充分表现。温病湿热证具有病程较长、湿雨气候病情加重、病情缠绵难愈等特点，且邪气易留连于气分。脾为湿土，为“受湿之区”；吴又可在《瘟疫论》中谓:“南方卑湿之地,更14 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究遇久雨淋漓,时有感湿者”。而岭南地属于亚热带季风气候，太阳辐射强烈，温差较小，常年炎热、潮湿，易致地湿上蒸，人体极易感受外来湿邪的侵袭，温高气湿是岭南地区的主要气候特征。“饮食自倍，脾胃乃伤”，岭南地区海产品丰富，饮食偏重高蛋白，贪食生冷之品，且以甘脂厚腻之物为主。《素问·奇病论》中提及：“肥者令人内热，甘者令人中满”，肥甘厚味之品易损脾胃而运化失司可助湿生热。脾气受损，阳气阻遏，湿邪内生，再加上岭南地区特有的自然气候，使得该地区湿热证极为常见，内外夹湿是其致病的主要特点。岭南湿热证的形成，虽有多种病因，但脾胃功能的状态是其决定性因素，脾、胃共为中土，生理上相互协调合作，共同完成共同完成纳食、消化、吸收与转输等一系列生理功能，而病理上也相互影响，脾胃受损，脾气虚弱，使得脾脏运化水谷功能不能正常发挥,水反为湿，谷反为滞，湿和滞郁久可化热，形成湿热。湿热证始终以阳明（胃肠）和太阴（脾）为病变中心，素问·经脉别论篇第二十一》：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾。脾气散精，上归于肺。通调水道，下输膀胱。水精四布，五经并行”，中医学认为，津液代谢离不开脾的运化、肺宣发肃降的功能及肾的蒸腾气化功能，其中任何一个环节出现功能异常都可导致水液代谢障碍的发生，其中又以脾的承上启下、沟通运化功能为主。而“太阴内伤”是湿热证发病的内因和基础，是湿热证模型复制需要模拟的关键环节之一。本实验以此为切入点，湿热模型组小鼠采用全封闭式自动调温调湿式造模气候箱提高温度和湿度，改变小鼠生活环境，使湿浊邪气氨氢薰蒸，模拟岭南特有的湿热外环境而制造外湿。饮食不节因素则采用高蛋白饲料＋猪油灌胃（高脂）的方法，长期嗜食肥甘厚味导致脾气受损,脾失健运，水谷精微物质不能正常输布而停滞于内,日久聚湿生热。现代研究发现，高脂饮食可能通过影响肠道菌群、破坏肠黏膜屏障功能以及改变固有免疫，进而诱发肠道炎性反[66]应，使湿热造模组具有温病湿热证血清炎症因子的相关表现。酒性本身即“气热而质湿”，《本草衍义补遗》中曰：酒“湿中发热近于相火”，提示长期饮酒导致酿湿生热，导致湿热内蕴。相关研究发现，长期慢性的酒精摄入，酒精及代谢产物引起肠道通透性增加，导致肠道屏障功能受损，促使肠道细菌及其代谢产物机内体循环，激活[68]肝脏及其他器官的炎症反应。长期摄入酒精，可引起肝脏和神经系统的损伤，酒精的代谢产物可产生大量的氧化应激产物，使线粒体氧化受损，进一步影响酒精在体内[69]的代谢，加剧炎症反应。《素问·举痛论》曰：“劳则气耗”，指的是过劳而导致正气、精气的耗损，《素问·本病论》更有“劳倦伤脾”之说。劳倦过度是引起脾气虚证的重要原因之一，其根本原因在于劳役过度、耗伤元气。本实验采用饮食不节，过食肥甘，被迫劳疫等复合因素，运用“高蛋白+猪油（高脂）”模拟内湿热因素。湿大于热组使用“湿热箱+高蛋白饲料+单日灌服猪油+双日灌服白酒且跑步30min”的造模方法。LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，能引起多种免疫细胞发生非特异性改变，导致宿主细胞因子失控性的表达，导致促炎因子的大量分泌进而导致炎症的持15 广州中医药大学2018届硕士学位论文[70][53]续发生和发展。李学等发现，采用以“高脂高糖+高温高湿+侵袭性大肠杆菌”复合因素造模湿热证与湿热的气候环境、病原微生物的侵入及人体易感性体质有关，感染生物因子能更好的体现湿热证这一类具体特殊性规律的疾病，这进一步证明了“内外合邪”是湿热病症的发病特点。薛生白云:“太阴内伤,湿饮停聚,客邪再至,内外相引,故病湿热,此皆先有内伤,再感客邪”，而热大于湿组则使用“湿热箱+高蛋白[8]饲料”加造模结束前按1mg/kg的比例注射LPS，完成造模。饥饱失常,易致脾胃受[71-72]伤，中气下陷。参考相关文献，采用劳倦过度与饮食失节复合因素，单日禁食，双日正常喂食且跑步30min+灌服0.3ml白酒，建立脾气虚证动物模型。LPS组则在正[73]常环境、普通饲料喂养下，于造模前一天腹腔注射LPS完成造模。WangT等用“湿热箱＋高蛋白饲料”等复合因素造模，构建模型通过HE染色发现：湿热模型组小鼠舌质降红、与正常组相比舌苔明显变厚，且通过粪便观察发现小鼠大便总量及含水量增加。这次造模舌根部HE染色发现，湿热模型组黏膜下层有明显炎性细胞浸润，湿大于热组舌黏膜表面舌苔厚度明显高于热大于湿组，提示“湿热箱+饮食因素”等复合因素造模法确实能改变小鼠体内环境，病理结果显示与上述结果相一致。16 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究第3章岭南温病湿热证小鼠16sRrna肠道菌群检测3.1实验材料3.1.1实验动物SPF级雄性BALB/c小鼠50只，体质量为18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证明编号No.44005800005042。3.1.2实验饲料[66]高蛋白饲料由广东省医学实验动物中心加工，配方比例参考相关文献。普通饲料由广州中医药大学动物中心提供。3.1.3实验试剂30°九江双蒸酒，（广东省九江酒厂有限公司）脂多糖冻干粉（sigma）小鼠TNF-αELIS试剂盒(批号CSB-E04741小鼠LPSELISA试剂盒（批号CSB-E13066m）均购自武汉华美公司Sigma2.0ml可立外旋冻存管（SIAL0659）3.1.4实验仪器同第二章3.2实验方法3.2.1实验动物分组小鼠在SPF级实验室里适应性喂养14天，用随机数目表法将小鼠分为5组：正常对照组、脂多糖（LPS）组、湿大于热组、热大于湿组、脾虚组，每组10只小鼠。造模时间一共56天。3.2.2LPS注射液的配置用0.9%NACL生理盐水将大肠杆菌内毒素-LPS稀释成1mg/ml，按0.2ml/20g体重，[8]经小鼠腹腔注射，按1mg/kg的剂量给小鼠进行腹腔注射。3.2.3实验造模方法正常对照组：①正常组在SPF级环境下正常喂养；②LPS组（L组）：正常饮食56天，在第57天以1mg/kg的剂量给予小鼠腹腔注射一次LPS；③脾虚组：单日禁食，双日正常喂食且跑步30min+灌服0.3ml白酒；④湿大于热组：给予高蛋白饲料喂养且进入人工气候箱[T：（32±0.15）℃，HR：90%～95%]每天12h，同步单日灌服猪油0.3ml，双日灌服29.5度白酒0.3ml且在跑步机上连续跑30min。⑤热大于湿组：适应性喂养结束后给予高蛋白饲料喂养且进入人工气候箱（条件同上），在第57天以1mg/kg的剂量给予小鼠腹腔注射一次LPS完成造模；所有小鼠造模结束6小时后，进行相关样本的收集和相关指标的检测。17 广州中医药大学2018届硕士学位论文3.2.4粪便标本的收集及保存抓取实验小鼠，单独放入已灭菌的动物容器中，待新鲜粪便排出后，尽快用镊子夹取收集，放入做好标号的无菌冻存管中：A（湿大于热组）、B（热大于湿未注射LPS）、C脾虚组、D正常组、L、LPS组、F、（热大于湿组已注射LPS）;每份小鼠粪便样品保证新鲜粪便3粒以上，采集好的样品放入干冰中暂时保存，待所有小鼠个体样品全部采组小鼠粪便（大于２ｇ）于无菌冻存管中/于-80℃保存，放入-80度冰箱保存。3.2.5小鼠肠道菌群16sRNA的检測分别观察各组小鼠粪便变化情况，根据实验分组，每组小鼠的粪便按要求采取后送至深圳华大基因科技服务有限公司，完成相关测序分析。3.2.6统计学分析利用SPSS20.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示（x±s）。数据满足方差齐性，采用One-WayANOVA分析进行比较；数据不满足方差齐性，采用非参数检验分析，组间多重比较用LSD法检验。P<0.05，有统计学差异。3.3实验结果3.3.1各组小鼠肠道菌群物种注释分析如图3-1所示，从物种门分类水平来看，小鼠肠道菌群主要组成为：Bacteroidetes（拟杆菌门）Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)，疣微菌门（Verrucomicrobia）和其他细菌，其中拟杆菌门和厚壁菌门是优势菌门，A（湿大于热组）、B（热大于湿未注射LPS）模型小鼠中拟杆菌门/厚壁菌门的比值大于正常组小鼠，模型B组注射LPS后，F（热大于湿组已注射LPS）组厚壁菌门的丰富度增高，拟杆菌门/厚壁菌门的比值降低；疣微菌门在A（湿大于热组）、B（热大于湿未注射LPS）、F（热大于湿组已注射LPS）三个模型组有少量出现；变形菌门在各组中有少量分布，其中脾虚组含量最少。如图3-2，从样品纲分类水平来看，其主要组成为：Bacteroidia(拟杆菌纲)、Clostridia(梭菌纲)、Bacilli(芽孢杆菌纲)和其他细菌；A（湿大于热组）、B（热大于湿未注射LPS）模型小鼠中拟杆菌纲/梭杆菌纲的比值大于正常组，B（热大于湿组已注射LPS）组小鼠在注射LPS后，梭菌纲含量升高，拟杆菌纲/梭杆菌纲的比值降低；芽孢杆菌纲在A、C、D三组中有出现，其中C（脾虚组）含量最多。如图3-3种分类水平所示，主要组成为：Bacteroidesacidifaciens(拟杆菌纲属)、Desulfovibrio（脱硫弧菌属）、Akkermansiamuciniphila（Akk菌），而A（湿大于热组）、B（热大于湿未注射LPS）、F（热大于湿组已注射LPS）三个模型组出现AKK菌。18 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究图3-1样品门分类水平中物种profiling柱状体图3-2样品纲分类水平中物种profiling柱状图3-3样品种分类水平中物种profiling柱状体3.3.2各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析Alpha多样性（alphadiversity）是指对单个样品中物种多样性的分析，能反应特定区域或生态系统内的丰富度或均匀度，包括observedspecies指数、Chao指数、Ace指数，Shannon指数以及Simpson指数等。其中，observedspecies指数、Chao指数和Ace指数可反映样品中群落的丰富度（speciesrichness），简单指群落中物19 广州中医药大学2018届硕士学位论文种的数量，而不考虑群落中每个物种的丰度情况。而Shannon指数反应群落的多样性（speciesdiversity）；Simpson指数反映群落中优势种的集中程度。Shannon、Simpson指数与物种丰富度和物种均匀度相关，在相同物种丰富度的情况下，群落中各物种具有越低的均匀度，则认为群落具有较低的物种丰富度。Chao指数、Ace指数和Shannon指数越大，Simpson指数越小，说明样品中的物种越丰富多样。从Chao、Ace指数中可以得出，脾虚组(C组)、正常组（D组）的群落丰富度明显高于湿大于热组（A组）、热大于湿组（B组：未注射LPS）（P＜0.05），而热大于湿组注射LPS前后Chao、Ace无显著性差异；各组小鼠肠道菌群的Shannon、Simpson数值均无统计学差异（P＞0.05）。表3-1小鼠肠道细菌Alpha多样性指数统计ChaoAceShannonSimpsonD（正常组）218.53621.716216.006±26.714.070±0.2730.034±0.014L（LPS组）225.49024.382178.09022.7563.989±0.3130.044±0.022C（脾虚组）210.88220.918217.41926.5063.992±0.2470.036±0.011A(湿大于热组)188.32535.456187.48633.0643.880±0.3700.044±0.030B（热大于湿组未注射LPS）175.35622.363180.98121.9513.827±0.2730.042±0.012F（热大于湿组组注射LPS）176.90823.126230.659313.3764.011±0.3520.036±0.007图3-4组间Alpha多样性盒形图多样性盒形图(按Description分组结果)20 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究3.3.3各组小鼠肠道菌群OUT丰富度的PCA分析PCA分析（PrincipalComponentAnalysis），即主成分分析法，是一种广泛应用以分析与简化数据集为主的技术，主成分经常用于降低原始数据的维数，同时保持数据方差矩阵最小的特征,PCA可初步反映出不同环境处理下的样品之间分散和聚集的[74]分布情况，从而可以判断在相同的环境处理的样本组成是否具有类似之处。PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在坐标轴上，纵标轴取能够最大程度反映方差值两个特征值。横坐标表示第一主成分，其括号中的百分比表明第一主成分对各组样本差异的贡献值，纵坐标表示第二主成分，其括号中的百分比则表示第二主成分对样品差异的贡献率；如图所示，在多元统计分析中，不同颜色的点分别代表不同的模型组，如两点之间距离越接近，则表明两组之间组成成分越相似，也表明微生物群落之间的差异较小。如图四可见，A（湿大于热组）、B（热大于湿组未注射LPS）、F（热大于湿组注射LPS）三组小鼠微生物群落较相近，C（脾虚组）、D（正常组）、L（LPS组）三组小鼠微生物群落较接近。湿热模型组和正常组、脾虚组、LPS组之间肠道内菌群构成差异明显，各组样本在空间中显现出潜在的分类趋势。图3-5基于OUT丰富度的PCA分析（按Description分组）3.4讨论16srRNA（16SribosomalRNA）所有原核生物蛋白质合成必需的1种核糖体RNA，存在于所有细菌的基因组中，是原核核糖体30s小亚基的组成部分之一，具有高度保[75]守性和特异性。“S”代表沉降系数，反映生物大分子在离心场受力情况及下沉速度，其指标数值越高，则说明分子越大。16srRNA测序首先是通过基因组提取DNA，从DNA中提取16srRNA基因片段，然后进行16srRNA基因序列的分析。16SrRNA基因内部结构由可变区和保守区组成，具有科、属、种等的特异性，保守区是所有细菌所共有，可反映出各物种之间的亲缘关系，高变区在不同细菌之间存在不同的差异，揭示了生21 广州中医药大学2018届硕士学位论文[76]物物种的特征核酸序列。16srRNA基因较为稳定，丰富度高且易于提取，已广泛应用于微生物生态学研究中，是高通量测序依赖的肠道微生物研究方法之一。本实验通过模拟岭南湿热外环境，再加上“内伤湿热”等因素复制小鼠湿热证模型，五组小鼠的68个样品在16SrRNA测序后，得到了399个OTU,9个门、14个纲、[77]15个目、24个科、27个属、12个种。刘雪姬等研究发现，高脂饮食使小鼠肠道菌群中乳酸杆菌、双歧杆菌及肠球菌的数量明显降低,提示高脂饮食能显著改变健康小鼠肠道通透性及菌群的组成从而引发长期低度炎症。连续3周摄入高酪蛋白，结果发[78][66]现高蛋白饮食可改变细菌代谢物的产生以及直肠粘膜中基因表达。谷莉等研究不同饮食结构对大鼠肠道菌群的影响，结果发现主要以厚壁菌门和拟杆菌门为主要优势菌，高脂饮食组厚壁菌门丰富度较高，而拟杆菌门在高蛋白组的相对比例高于高脂饮食组。郑烈等对溃疡性结肠炎大肠湿热证患者、脾虚湿蕴证患者和健康正常人群肠道菌群分布特征进行研究发现，脾虚湿蕴证UC患者拟杆菌门的含量最高，大肠湿热证[79][8]UC患者厚壁菌门的含量最高。王婷等通过“湿热外环境+内伤湿热+生物因子致病”的思路模拟岭南温病湿热证模型，发现湿热证组小鼠模型大肠杆菌属、肠球菌属、梭菌属三种致病菌与正常组相比明显增高;而双歧杆菌属、乳杆菌属等益生菌的数量的差异可能与湿热证的发病密切相关，温病湿热证存在肠道菌群结构失调。胃肠道作为人体重要的消化器官，也是最大的细菌及内毒素储存库，肠道黏膜的生理屏障可使机[80]体免受各种致病因子的侵袭金鹏锋等发现，脂多糖（LPS）刺激下产生的大量炎症介质可对机体细胞及组织产生损伤作用，影响肠道屏障功能导致肠道菌群紊乱。本实验发现，A（湿大于热组）、B（热大于湿未注射LPS）模型小鼠肠道菌群物种较接近，出现拟杆菌含量的增加，厚壁菌、梭菌含量的降低；而热大于湿组注射LPS完成造模后，出现拟杆菌含量的降低，厚壁菌、梭菌含量的增加。提示本实验采用的多因素复合造模方法建立的温病湿热证小鼠模型，肠道菌群存在差异，而注射LPS后，两组小鼠肠道菌群物种差异明显，提示可能与肠道抗炎性免疫微环境有关，LPS破坏肠道屏[81]障进而改变肠道微生态平衡，导致肠道菌群紊乱。王和平等在临床上收集湿疹患儿和健康儿童粪便样本，通过高通量测序发现湿疹患者中Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)的含量高于健康对照组，湿疹患者中Akkermansia菌含量高于正常组（P＜0.05）。Akkermansiamuciniphila（Akk菌）属于门Verrucomicrobia细菌属，在人类肠道中发现的粘蛋白降解细菌，定植于人体肠道黏液层，它既是肠道黏蛋白降解菌的营养来源，又可作为保护性屏障抵抗病原微生物入侵肠上皮细胞，可调节由多种因素引起的肠道菌群紊乱。现代研究发现，Akk菌与炎症的发生发展呈负[82]相关，可改变肥胖小鼠的脂肪代谢，在肠道微生物群中发挥关键作用。AKK菌与肥胖、糖尿病、炎症和代谢紊乱呈负相关可能是因为其数量的增多可使肠道黏膜增厚，[83]可阻碍相关物质从肠道进入血液，从而减少细胞对这些物质的过度吸收。研究发现酒精的摄入可导致小鼠肠道微生物的丰富度降低，使菌落组成发生改变，疣微菌门22 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究[84]（Verrucomicrobia）丰度升高。本实验结果表明，Akk菌和疣微菌门只在A（湿大于热组）、B（热大于湿组未注射LPS）、F（热大于湿组已注射LPS）这三组小鼠肠道菌群中出现，提示Akk菌和疣微菌门的特征性出现可能与动物饲养环境即湿热外环境及高蛋白饮食有关。综上所述，本实验通过“内湿+外湿”复合因素整体造模结束，湿大于热组出现拟杆菌门含量的上升，厚壁菌门、梭菌纲含量下降，热大于湿组则出现拟杆菌门含量的下降，厚壁菌门、梭菌纲含量上升，提示本实验造模法建立的湿大于热、热大于湿小鼠模型肠道菌群存在差异，而拟杆菌门、厚壁菌门、梭菌可能是湿热证中肠道菌群变化的客观指标。从小鼠肠道细菌Alpha多样性指标Chao、Ace指数来看，湿大于热组（A组）、热大于湿组（B组：已注射LPS）的群落丰富度明显低于脾虚组(C组)、正常组（D组）（P＜0.05），提示湿热模型小鼠存在肠道菌群丰富度降低的现象,“湿热外环境＋高蛋白饲料”可能与小鼠肠道菌群丰富度有关，而热大于湿组注射LPS前（B组）后（F组）Chao、Ace无显著性差异，各组小鼠肠道菌群的Shannon、Simpson数值均无统计学差异（P＞0.05），各组小鼠肠道微生物菌群多样性指数变化不大，但在菌群结构上发生了一些变化，某些特别的细菌菌属存在显著性的差异。23 广州中医药大学2018届硕士学位论文第4章岭南温病湿热证小鼠炎症因子检测4.1实验材料4.1.1实验动物SPF级雄性BALB/c小鼠50只，体质量为18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证明编号44005800005042。4.1.2实验饲料[66]高蛋白饲料由广东省医学实验动物中心加工，配方比例参考相关文献。普通饲料由广州中医药大学动物中心提供。4.1.3实验试剂30°九江双蒸酒，（广东省九江酒厂有限公司）大肠杆菌055：B5脂多糖冻干粉（sigma）小鼠TNF-αELIS试剂盒(批号CSB-E04741)小鼠LPSELISA试剂盒（批号CSB-E13066m）均购自武汉华美公司氯仿、异丙醇、乙醇（大洋化学试剂有限公司）Toll样受体4(TLＲ4)抗体(批号ab13556)，NF-κBp65抗体（批号ab32536）Trizol(美国Invitrogen公司)GTVisionTMⅢ抗鼠兔通用型免疫组化检测试剂盒（批号GK500711），购自基因科技（上海）股份有限公司TAKARAPrimeScript™RTMasterMix逆转录试剂（批号RR036A），TAKARASYBR®PremixExTaq™IIPCR试剂（批号RR820A）均购自广州瑞真生物技术有限公司4.1.4实验仪器RXZ-158A-LED型人工气候箱（宁波江南仪器厂）亚都YC-D205型超声波加湿器（北京亚都环保科技有限公司）ZH-PT动物实验8跑道跑台（安徽正华生物仪器设备有限公司）Bio-TEKELX808酶标仪（美国宝特公司）震荡器OS-10，购于德国BOECO公司TIANGENOSE系列TGrinder电动组织研磨器,（天根生化科技北京有限公司）MIKRO200R型高速冷冻离心机，购于德国Hettich公司ABI-7500型荧光定量PCR仪，购于美国ABI生物公司DMIL荧光生物显微镜（德国LEICA公司）BK-DM500型数码显微镜（重庆奥体光学显微镜有限公司）LEICA2015-RM型切片机（德国徕卡有限公司）长协电子CX2000小鼠电子秤，（东莞市水葫芦商贸有限公司）24 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究4.2实验方法4.2.1实验动物分组小鼠在SPF级实验室里适应性喂养14天，用随机数目表法将小鼠分为5组：正常对照组、脂多糖（LPS）组、湿大于热组、热大于湿组、脾虚组，每组10只小鼠；造模时间一共56天。4.2.2实验造模方法同第三章4.2.3取材所有小鼠禁食水后，釆用摘眼球取血，4℃离心10min(3000r/min)，取血清-20℃保存低温，处死动物后立即取距肛门处8-10cm结肠组织5cm,先用预冷的生理盐水清洗肠中内容物，清洗后在滤纸中吸掉残余液体，分为两等分，一份放入Rnase-free的离心管中于-80℃冰箱保存，另一份结肠组织放入盛有多聚甲醛的容器中。4.2.4血清LPS、TNF-αELISA检测按说明书稀释血清样本后，按照ELISA试剂盒要求进行LPS、TNF-α检测，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),CurveExpert1.4软件绘制标准曲线,运用拟合公式计算出相应浓度值。4.2.5结肠组织NF-κbp65、TLR4免疫组化检测1.石蜡切片脱蜡和水化后，用蒸馏水冲洗3次，每次5分钟。2.热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）,微波炉加热至沸腾后断电，间隔5分钟后，反复2次，冷却后PBS（pH7.2-7.4）洗涤2次，每次5分钟。3.抗原修复完毕后，取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加过氧化物酶阻断剂与组织上避光孵育10分钟，然后中PBS（pH7.2-7.4）洗涤2次，每次5分钟。取出切片，擦净切片四周的液体，平放于湿盒中。4.滴加100微升一抗工作液与组织上，室温孵育1小时，孵育完毕，将切片置入PBS中洗涤3次，每次5分钟。取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。5.滴加100微升A液于组织上，室温孵育30分钟，孵育完毕，将切片置入PBS中洗涤3次，每次5分钟。取出切片，甩掉并擦干切片上四周边缘的液体，然后置于湿盒中。6.滴加调配好的显色剂DAB工作液100微升与切片上，显微镜下观察5分钟左右，待显色完成后，用蒸馏水冲洗终止显色。7.苏木素复染，自来水冲洗返蓝。8.切片经酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。读片时每张片子选取5个区域拍照，并输入IPP6.0病理图象分析软件，测定各25 广州中医药大学2018届硕士学位论文组织片免疫阳性产物的平均光密度值（OD值），作为该样本的OD值。4.2.6Trizol法提取组织RNA（1）研磨制样：取冻存结肠组织100mg,置于新的2.0mlEP管中，加入300ulTrizol试剂,剪碎后用天根研磨器进行均浆处理，研磨完成后加入700ulTrizol试剂,在室温放置5-10min;（2）加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min，静置分层，4℃，12000rpm离心15min；（3）吸取上清至无酶EP管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，颠倒混匀后室温放置10min，4℃，12000rpm离心15min；（4）离心后管底出现胶状沉淀，移去上清液，加入1ml75%乙醇(DEPC处理水配制)洗涤沉淀，4℃，8000rpm离心5min，弃上清,重复洗涤；（5）室温干燥后,向沉淀中加入25ulRnase-freeH2O溶解所得RNA样品，反复吹打混匀后于-80℃保存；4.2.7RNA逆转录根据表3-1在冰上配制逆转录反应液，轻柔混匀后，在ABI-2720型PCR仪进行反转录反应：（1）37℃，15min（反转录反应）;（2）85℃，5sec（反转录酶的失活反应）;（3）4℃，保存。表4-1反转录总体系（20ul）试剂使用量5×PrimeScriptRTMasterMixPerfectRealTime2ulTotalRNA*RNaseFreedH2OUpto10ul4.2.8实时荧光定量PCR检测结肠CD14、TNF-α表达4.2.8.1相关引物设计参考相关文献[引物设计]，根据引物设计原则,设计Real-timePCR引物及探针。利用PrimerExpress3.0检验引物的基本特征。并在BLAST基因库对设计的引物特异性进行初步验证。PCR引物由上海捷瑞生物公司合成，引物序列如下：β-actin：F-GACGTTGACATCCGTAAAGA,R-GCCGGACTCATCGTACTCC,扩增产物大小约为245bp；TNF-α：F-TGAGCACAGAAAGCATGATCCG，R-GTAGACAGAAGAGCGTGGTGGC，扩增产物大小为150bp；CD14：F-CTCTGTCCTTAAAGCGGCTTAC，R-GTTGCGGAGGTTCAAGATGTT，扩增产物大小约为191bp。4.2.8.2实时荧光定量PCR反应过程SYBRGreen在ABI-7500型7500型高通量荧光定量仪上进行实时荧光定量PCR扩增反应,按表4-2在冰上配置PCR反应液（反应总体积为20ul），反应条件为：95°C，26 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究3min-(95°C，4s--53°C,10s--72°C，32s),反应结束后分析RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线,用ComparativeDelta-deltaCt法进行相对定量分析,每一组应用六个样本检测其基因表达结果。表4-2PCR反应液配置试剂使用量SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×）10ulPCRForwardPrimer0.8ulPCRReversePrimer0.8ulROXReferenceDye（50×）0.4ulDNA模板2ulRNaseFreedH2O6ulTotal20ul4.2.9统计学处理利用SPSS20.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示（x±s）。数据满足方差齐性，采用One-WayANOVA分析进行比较；数据不满足方差齐性，采用非参数检验分析，组间多重比较用LSD法检验。当P<0.05时，有统计学差异。4.3实验结果4.3.1各组小鼠血清TNF-α、LPS含量比较见表4-3,与正常组比较，四个模型组的LPS、TNF-α的含量增高，P＜0.001，差异存在统计学差异。与LPS组相比，湿大于热组、热大于湿组、脾虚组LPS、TNF-α的含量降低，P＜0.001，存在统计学差异；与湿大于热组相比较，热大于湿组LPS、TNF-α的含量水平降低（P＜0.05）。提示湿大于热组体内炎症反应较热大于湿组剧烈。表4-3各组血清LPS、TNF-α含量比较（x±s）分组NLPS（pg/ml）TNF-α（pg/ml）正常组819.81±4.0192.13±13.59*#*#LPS组8307.11±43.09737.38±87.76*#*#脾虚组8175.9±60.40403.22±87.76*#*#湿大于热组8201.23±33.86346.20±75.06*#▲*#▲热大于湿组8133.03±22.15305.6±114.69注：与正常组比较，*P＜0.001；与LPS组相比，#P＜0.001；与湿大于热组比较，▲P＜0.05。27 广州中医药大学2018届硕士学位论文*#*#*#*#▲图4-1各组血清LPS含量比较*#*#*#*#*#*#▲*#*#*#*#图4-2各组血清TNF-α含量比较4.3.2各组小肠结肠组织NF-κbp65、TLR4免疫组化检测如表4-4所示，与正常组相比，其余四组小鼠结肠组织中的NF-κbp65、TLR4的表达明显增高，P＜0.001，差异存在统计学差异。与LPS组相比，模型组：湿大于热组NF-κbp65的表达升高（P＜0.001）；与脾虚组相比，湿大于热组NF-κbp65的表达升高，TLR4的表达降低（P＜0.05）；与湿大于热组相比较，热大于湿组NF-κbp65、TLR4的含量无明显变化（P＞0.05）。28 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究表4-4各组小鼠结肠NF-κbp65、TLR4平均光密度结果比较（OD值）（x±s）分组NNF-κBp65TLR4正常组80.248±0.0100.247±0.074**LPS组80.312±0.0230.302±0.019**#脾虚组80.316±0.0120.311±0.019*###▲*▲湿大于热组80.327±0.1190.301±0.014*##*热大于湿组80.324±0.0150.303±0.022注：与正常组比较，*P＜0.001；与LPS组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001,；与脾虚组相比，▲＜0.05。a．正常组；b.LPS组；c.脾虚组；d.湿大于热组e.热大于湿组图4-3各组小鼠结肠NF-κBp65免疫组化染色4.3.3各组小鼠结肠组织PCR相对定量TNF-α、CD14结果如表4-5所示，与正常组相比，热大于湿组、LPS组小鼠TNF-αmRNA转录水平升高（P＜0.05），LPS组水平升高更明显（P＜0.01）；脾虚组小鼠CD14mRNA表达水平增高；脾虚组小鼠TNF-αmRNA转录水平升高（P＜0.05），存在统计学差异；与LPS组相比，脾虚组、湿大于热组、热大于湿组三个模型组小鼠TNF-αmRNA转录水平降低（P＜0.05），脾虚组转录水平降低更明显（P＜0.01）。表4-5各组PCR相对表达量Riato值分组NTNF-αCD14正常组611**LPS组65.329±2.3781.275±0.234##*脾虚组62.278±0.1272.327±1.335*#湿大于热组63.259±0.0531.479±0.0691##热大于湿组62.389±1.991.089±0.027注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与LPS组相比，P＜0.05，##P＜0.0129 广州中医药大学2018届硕士学位论文4.4讨论湿热是中医学特有的病证且较为复杂，包括外感、内伤湿热之邪、内外之邪同类相召而发病，是中医临床上常见病症。本实验通过复合因素造模法将湿热模型组分为：湿大于热组、热大于湿组。造模思路以“太阴内伤”为基础，根据岭南湿热证“内外夹湿”的致病特点，湿大于热组使用“湿热箱+高蛋白饲料+单日灌服猪油+双日灌服白酒且跑步30min”的造模方法。而热大于湿组则给予高蛋白饲料且进入湿热箱，造模结束前按1mg/kg的比例注射LPS。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分,当机体受到细菌感染时，LPS作为一种病原内毒素,可与宿主细胞相互作用，诱导机体多种细胞合成和释放大量的内源性生物活性因子如炎症细胞因子、趋化因子、生长因[86][87]子等，引起机体炎症反应。KohmanR等发现，在大鼠腹腔注射LPS后，可激活体内toll样受体，可引发全身性的炎症反应，TNF-а、IL-6等炎症因子表达量明显[63]升高。张俊英等对湿热偏重模型指标深入对比研究以筛选出“湿”与“热”的相关性指标,结果发现湿偏重组TNF-α、IL-1β、NF-kB的含量平均高于热偏重组（P＜0.05），[88]而这三个指标可能能部分阐释湿热证的发病及临床特征。胡玲等以热休克蛋白70及NF-κB炎症通路的表达为关键点，探讨脾胃湿热证的发生发展的机制，发现脾胃湿热证患者IL-8、NF-κB、HSP70等炎症细胞因子表达均较脾气虚证显著升高(P＜0.05)，提示NF-κB及其下游一系类炎症因子在胃黏膜的过量表达可能与中医的“湿热之邪”相关。Toll样受体4(TLR4)是Toll受体家族中发现最早并研究最深的模式识别受体,在先天免疫中扮演重要的角色。TLR4主要识别内毒素(LPS),激活其信号通路，释放大量炎症因子。长期的酒精摄入可引起肠道微生物种属和数量变化而引起菌群失衡，破坏肠道的天然屏障的完整性,造成大量内毒素释放至血液,激活肝脏巨噬细[89]胞启动多种促炎因子的表达。酒精及其代谢产物能够直接或间接激活宿主免疫细胞[90]的炎症反应，通过改变体内能量平衡诱导肝脏炎症，推动酒精性肝病的发生及进展。研究发现酒精可使肠道黏膜受损而肠壁的通透性大大增高，从而加重细菌及各种炎症因子的移位。其病理机制可能与内毒素和肠黏膜上皮细胞及乙醛等酒精代谢产物关系[91]密切。武一曼收集临床标本，在脾胃湿热证慢性胃炎患者胃窦组织中发现，与正常组、脾虚组相比，脾胃湿热组组患者胃窦组织中NF-κB和TGF-α的表达明显升高[92]（P＜0.01）。病毒性肝炎湿热证小鼠肝组织中Toll样受体（TLR）2、TLR4以及核因子NF-κBp65的表达水平均显著升高（P＜0.05），而TLR-2、TLR-4、IL-1β可以[93][94]作为温病湿热证辨证的特异性指标之一。巨少华等发现湿热外环境可加重RA模型关节滑膜的病理改变，使模型大鼠血清相关炎症相关因子IL-6、TNF-α、RF、ACPA[95]水平显著升高(P＜0.05)。邓力等研究发现“湿热环境+病毒”的复合因素使Th1/Th2和Th17/Treg比值呈现升高趋势，提示湿热外环境在一定程度上能使抑制炎症的功能减弱，导致炎症反应更激烈。肠道菌群移位(bacterialtranslocation)是指肠道细菌及其产物通过某种途径越过肠黏膜屏障,进入肠系膜淋巴结、门静脉系统,30 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究[96]继而进入体循环以及肝、脾、肺等远隔器官的过程。胃肠道内的细菌正常情况下呈稳定共生的状态，共同组建及维护胃肠道黏膜屏障,以维持肠腔内环境的平衡稳定，而肠道菌群失调可改变肠道内的生理环境，并使肠道内细菌及内毒素经由各种途径进入[97]体循环，可导致一系列并发症,肪饮食使肠道菌群的肠通透性明显增长，导致细菌、脂多糖更易进入肠道淋巴系统、门静脉系统，引起细菌和内毒素移位，从而加重炎症[98]反应。本实验中，湿大于热、热大于湿组血清酶联免疫吸附法观察到LPS、TNF-α的含量较正常组显著升高，与LPS组相比，血清LPS、TNF-α浓度下降。而湿大于热组血清LPS、TNF-α的浓度大于热大于湿组；结肠组织NF-κbp65、TLR4免疫组化的平均OD值较正常组升高，而湿热偏重两组模型组之间无显著性差异（P＞0.05），相关炎症因子的升高说明湿热证模型小鼠具有血清炎症因子相关表现。造模结束后，湿大于热组血清LPS、TNF-α浓度较热大于湿组高，推测湿热模型组血清炎症因子的差异可能与湿大于热组肠道菌群移位的机制有关，其变化可能更为复杂和丰富，超越了LPS的影响，导致其严重表达水平的增高。31 广州中医药大学2018届硕士学位论文第5章岭南湿热证小鼠与水通道蛋白5.1实验材料5.1.1实验动物SPF级雄性BALB/c小鼠50只，体质量为18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证明编号No.44005800005042。5.1.2实验饲料[66]高蛋白饲料由广东省医学实验动物中心加工，配方比例参考相关文献。普通饲料由广州中医药大学动物中心提供。5.1.3实验试剂30°九江双蒸酒（广东省九江酒厂有限公司）5脂多糖冻干粉（sigma）小鼠TNF-αELIS试剂盒(批号CSB-E04741)小鼠LPSELISA试剂盒（批号CSB-E13066m）均购自武汉华美公司QP3抗体（批号ab125219）均购自abcam公司AQP4抗体（批号orb213576，上海玉博生物技术有限公司）GTVisionTMⅢ抗鼠兔通用型免疫组化检测试剂盒（批号GK500711）购自基因科技（上海）股份有限公司5.1.4实验仪器RXZ-158A-LED型人工气候箱（宁波江南仪器厂）亚都YC-D205型超声波加湿器（北京亚都环保科技有限公司）ZH-PT动物实验8跑道跑台（安徽正华生物仪器设备有限公司）Bio-TEKELX808酶标仪（美国宝特公司）震荡器OS-10，购于德国BOECO公司TIANGENOSE系列TGrinder电动组织研磨器,（天根生化科技北京有限公司）MIKRO200R型高速冷冻离心机，购于德国Hettich公司ABI-7500型荧光定量PCR仪，购于美国ABI生物公司DMIL荧光生物显微镜（德国LEICA公司）BK-DM500型数码显微镜（重庆奥体光学显微镜有限公司）LEICA2015-RM型切片机（德国徕卡有限公司）Trizol(美国Invitrogen公司)长协电子CX2000小鼠电子秤，（东莞市水葫芦商贸有限公司）32 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究5.2实验方法5.2.1实验动物分组小鼠在SPF级实验室里适应性喂养14天，用随机数目表法将小鼠分为5组：正常对照组、脂多糖（LPS）组、湿大于热组、热大于湿组、脾虚组，每组10只小鼠；造模时间一共56天。5.2.2实验造模方法同第四章5.2.3取材同第四章5.2.4结肠组织AQP3、AQP4免疫组化检测1.石蜡切片脱蜡和水化后，用蒸馏水冲洗3次，每次5分钟。2.热修复抗原：将甩掉并擦干的切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）,微波炉加热至沸腾后停止加热，间隔5min后，反复2次，冷却后PBS（pH7.2-7.4）洗涤2次，每次5min。3.抗原修复完毕后，取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，置于湿盒中，滴加过氧化物酶阻断剂与组织上避光孵育10分钟，然后中PBS（pH7.2-7.4）洗涤2次，每次5分钟。取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，置于湿盒中。4.滴加100微升配好的一抗工作液于组织上，室温孵育1小时，孵育完毕，将切片置入PBS中洗涤3次，每次5分钟。取出切片，擦净切片四周边缘的液体，平放于湿盒中。5.滴加100微升A液于组织上，室温孵育30分钟，孵育完毕，将切片置入PBS中洗涤3次，每次5分钟。取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。6.滴加调配好的显色剂DAB工作液100微升于切片上，显微镜下观察5分钟左右，待显色完全后，蒸馏水冲洗终止显色。7.苏木素复染，自来水冲洗返蓝。8.切片经酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。读片时每张片子选取5个区域拍照，并输入IPP6.0病理图象分析软件，测定各组织片免疫阳性产物的平均光密度值（OD值），作为该样本的OD值。5.2.5统计学处理利用SPSS20.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示（x±s）。数据满足方差齐性，采用One-WayANOVA分析进行比较；数据不满足方差齐性，采用非参数检验分析，组间多重比较用LSD法检验。当P<0.05时，有统计学差异。33 广州中医药大学2018届硕士学位论文5.3实验结果5.3.1各组小肠结肠组织AQP3、AQP4免疫组化检测如表5-1，图5-1所示，与正常组相比，四个模型组AQP3的蛋白表达增高，AQP4的蛋白表达含量降低（P＜0.001）,差异存在统计学意义。与LPS组相比，热大于湿组、脾虚组中AQP3的含量上升；湿大于热组、热大于湿组、脾虚组AQP4的表达较LPS组相比上升。与湿大于热组比较，热大于湿组AQP3、AQP4的表达含量升高（P＜0.05）。表5-1各组小鼠结肠AQP3、AQP4平均光密度结果比较（OD值）（x±s）分组NAQP3AQP4正常组80.239±0.0120.317±0.024**LPS组80.304±0.0220.225±0.010*#▲*##▲脾虚组80.316±0.0270.242±0.015**##湿大于热组80.305±0.0240.237±0.017*#▲*##▲热大于湿组80.322±0.0180.246±0.009注：与正常组比较，*P＜0.001；与LPS组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001,；与湿大于热组相比，▲P＜0.05。a．正常组；b.LPS组；c.脾虚组；d.湿大于热组e.热大于湿组图5-1各组小鼠结肠AQP3免疫组化染色5.3.2各组指标相关性分析如表5-2所示，AQP3与NF-κbp65、TLR4的表达呈正相关，AQP4与NF-κbp65、TLR4的表达呈负相关，P＜0.001存在统计学差异，NF-κbp65与TLR4与AQP3表达呈正相关，与AQP4表达呈负相关，其中，AQP4与NF-κbp65的相关性表达最高。34 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究表5-2各组指标相关性分析r值AQP3AQP4NF-κbp650.474*-0.722*TLR40.718*-0.685*注：*P＜0.001，|r|≥0.8时，可以认为两变量间高度相关；0.5≤|r|＜0.8时，可以认为两变量中度相关；0.3≤|r|＜0.5时，可以认为两变量低度相关5.4讨论水通道蛋白（AQP）是一族广泛存在于人类各种细胞膜生物系统中，主导水分子的跨膜转运功能的蛋白质，可维持胞内外液环境的的稳态，与生物膜的通透性密切相关。水通道蛋白通过介导水的跨膜转运参与水的分泌、吸收等，是维持体内水代谢平衡的分子学基础，它们对各种离子不具有通过性,水通道蛋白可选择性对物质吸收，[99]且吸收功能不受温度等环境的影响，简单来说，AQP可控制水在细胞的进出。水液代谢宏观而言是水的摄入和排出量的动态平衡，微观而言则是细胞膜的水的通透性。《素问·至真要大论》说：“诸湿肿满，皆属于脾”，脾主运化水液的功能正常，肺脾肾脏腑功能相互协调，机体能完成正常的水液代谢，并能防止水液停滞而产生“湿、痰、水、饮”等病理产物，停留人体可引发多种疾病；反之，如果脾的运化功能失常表现为消化吸收功能减弱和水液代谢失常。水通道蛋白通过调节生物膜的透水性，介导水的跨膜转运，参与水的分泌、吸收等，水通道蛋白AQP的正常表达可使水液输布功能正常进行，也是其基本的分子生物学基础。而水通道蛋白的异常表达可能是湿病[100]形成的客观条件之一，湿邪在体内的停留与水通道蛋白的表达水平密切相关。结肠是消化系统的重要组成部分，主要生理功能是吸收水分、无机盐以及少量糖[101]和其它水溶性物质，贮存食物残渣并形成粪便，在粪便脱水成型中发挥重要的作用。结肠平均每日吸收460mmol钠与350～2000ml水，机体水液的吸收依靠结肠上皮细胞上各组水通道蛋白AQP完成。若结肠生理功能发生紊乱，影响肠吸收功能从而发生腹泻、腹胀、便秘等消化系统症状。湿热证是机体受“湿”与“热”合邪而致病，在湿热证病理状态下，结肠中水通道蛋白（AQPs）的改变，可能与“湿”邪关系密切。Tmjikawa[102]等通过切除大鼠80％小肠后发现，粪便由稀逐渐变稠，结肠中水通道蛋白3的表达水平增高，说明AQP3在肠道水分吸收中担任着重要角色。研究发现温病湿热证小[103]鼠结肠AQP3表达量的改变可能与温病湿热证的“湿邪内停”有相关性。采用“高糖高脂+湿热外环境+大肠杆菌”的造模条件建立脾胃湿热模型组小鼠，肾脏AQP3含量较正常对照组明显升高，推测AQP3的升高使肾脏集合管对水分重吸收功能增强从而导致“湿邪”在体内的停留，而使用清利湿热的三仁汤治疗后，湿热证模型组肾脏AQP3的含量恢复正常水平，提示AQP3含量的变化可视为“湿热”之邪侵袭机体时发[104]生的一种特殊的病生变化。梅武轩等探讨脾胃湿热证患者与胃粘膜水通道蛋白(aquaporin,AQP)3基因表达的相关性，发现脾胃湿热证患者的病程的严重程度与胃组织中水通道蛋白3的表达存在相关性，重度脾胃湿热证组AQP3基因表达水明显高35 广州中医药大学2018届硕士学位论文于轻度脾胃湿热证组(P<0.01)，提示水通道蛋白3的改变随着湿热程度的加重而升105]高[水通道蛋白3在大鼠慢传输型便秘（STC）模型中的表达情况，AQP3在升结肠表达下调是代偿机制，结肠内容物水分减少而导致便秘的产生，而AQP3在升结肠表达[106]下调，可减少水分吸收，促进肠内容物的推进而延缓便秘。与上述学者研究结果一致，提示AQP3的改变与结肠重吸收功能相关。推测AQP3含量的增高，可增加结肠对水分重吸收的功能，导致“湿邪”停留，而热大于湿组小鼠结肠AQP3的含量较湿大于热组增高，结果观察热大于湿组小鼠粪便更为黏腻，与上述推测相一致。水通道蛋白4（AQP4）是一种介导水分子在细胞膜跨膜转运的膜整合蛋白，广泛分布于体内不同组织中，在体内参与并调节多种重要的生理功能,尤其在水液代谢方[107]面起着主导作用。AQP4可能在结肠吸水性方面起着重要作用，其基因表达降低可[108]会导致该区域内的水液吸收不足而引起腹泻。在慢传输型便秘患者中，结肠粘膜细[109]胞膜中AQP4的表达与大便性状和肠内容物通过时间有密切关系。王健等研究发现，便秘模型组小鼠结肠组织中AQP4含量较正常对照组水平升高（P＜0.05），芪榔合剂润肠通便的作用可能与其下调结肠组织内AQP4的含量，降低AQP4在结肠黏膜上的[110][111]表达，影响结肠对水分吸收的功能使排便顺畅从而改善便秘。刘洋等研究五苓散对腹泻模型小鼠水通道蛋白4表达的影响，结果表明：使用中药复合制剂五苓散可提高小鼠结肠组织AQP4mRNA的表达，可能通过增加结肠对水分的吸收使得粪便含水量减少，改善小鼠腹泻功能，来实现“利小便实大便”的作用。研究发现，白芍可影响粪便的含水量较少排便阻力粪便含水率的提高与AQP4在结肠的表达呈负相关，其[112]通便作用可能通过降低结肠AQP4水平，增加肠道内水分并减少粪便下行阻力实现。王晓玲等发现腹泻状态下的大鼠结肠AQP4表达下调，导致结肠对肠腔内水分的吸收减少，引起大便稀薄，含水量增加形成腹泻，由此进一步支持AQP4参与了结肠对肠[113][114]腔内水分的吸收。张六通等通过人工气候箱建立外湿证动物模型发现，结果发现“外湿”有可能通过水通道蛋白含量和分布的变化对脏腑的水液代谢功能而产生影[115]响，模型组肠组织AQP4mRNA水平下降。薛晓倩等通过研究化湿液对湿组证大鼠的胃肠消化吸收功能及水液代谢功能的影响发现，湿热组大鼠出现体重降低、饮食不振、大便溏泄等脾虚症状明显且结肠黏膜AQP4表达较正常对照组明显降低，运用不同剂量的化湿液对大鼠进行治疗后，结果发现高剂量组的化湿液组结肠黏膜AQP4的表达明显增加，提示结肠中AQP4表达水平与湿组证大鼠“湿邪”的停留存在一定相关性。本实验造模结束后发现，湿热模型组小鼠AQP4的表达水平较正常组明显下降，推测AQP4的含量的降低可影响结肠的生理功能而使代谢受阻，导致多于水分停留体内，造成“湿邪”停留。张晓丹通过观察白术、茯苓等中药对脾虚泄泻动物模型胃肠形态及水通道蛋白的影响发现，通过健脾利湿的中药治疗后，模型组大鼠肠组织AQP3均降低，AQP4的表达升高，水通道蛋白的调控作用可促进肠道炎性病理渗出物与渗透性溶[116]质排出,改善肠道水液代谢功能，从反面论证了AQP3、4含量的变化，本次实验造36 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究模结束，湿热模型组小鼠提示结肠组织中AQP3的高表达、AQP4的表达降低可能使肠道细胞对水的通透性增强，使得肠腔内的水分增多，这可能与湿热造模后，湿阻脾胃，不能正常运化水谷精微物质导致“湿邪”的停留，从而使大便黏腻不成型。与湿大于热组比较，热大于湿组AQP3、AQP4的表达含量升高，提示本次采用复合因素造模法建立的温病湿热证小鼠模型，湿大于热组与热大于湿组模型小鼠水通道蛋白存在差别。AQP3、AQP4含量的变化可视为“湿邪”之邪侵袭机体时发生的一种特殊的病生变化。Alice等通过对ICU脓毒血症患者的临床观察，发现ICU脓毒症患者的发作诱导了AQP-1在多形核白细胞上的高表达，并且这一高表达在严重的脓毒症休克的患者更是[117]显著。吉春玲等发现，脓毒症大鼠早期心肌细胞释放大量炎症细胞因子，这些炎症细胞因子又可导致心肌严重受损，从而导致心脏AQP的大量释放，进而加重心肌损伤，[118][119]导致心肌水肿程度的加重，AQP-1与炎症因子变化呈正相关。陈锋等研究发明急性重症胰腺炎（SAP）能够诱导AQP3异常表达，大黄素能够保护SAP的器官功能,降[120]低炎症因子释放,其作用机制可能与下调AQP3表达有关。ZhangW等发现，在血吸虫病感染期间，AQP4在调节CD4+T细胞分化中扮演者重要角色，AQP4敲除小鼠体内Th2细胞分化增加。本文实验中，NF-κbp65、TLR4与AQP3表达呈正相关，与AQP4表达呈负相关，由此推测，LPS通过NF-κbp65与水通道蛋白AQP相关，热大于湿组小鼠AQP3、AQP4表达的增高可能与注射LPS有关，前面提及两组小鼠NF-κbp65之间的表达无统计学差异，推测可能是NF-kbp65在中间起均衡作用，AQP决定其最终的变化趋势，而三者之间的联系及其具体机制尚有待进一步研究。37 广州中医药大学2018届硕士学位论文结语本实验根据温病湿热证湿热偏重的不同特点，通过复合因素造模法建立两种两种温病湿热证小鼠模型，肠道菌群结果表明，两组温病湿热证模型小鼠肠道菌群丰富度降低，湿大于热组出现拟杆菌门含量的上升，厚壁菌门、梭菌纲含量下降，热大于湿组则出现拟杆菌门含量的下降，厚壁菌门、梭菌纲含量上升，提示本实验造模法建立的湿大于热、热大于湿小鼠模型肠道菌群存在差异，而拟杆菌、厚壁菌、梭菌可能是湿热证中肠道菌群变化的相关指标。湿热证的发病机制存在TLR4信号通路介导的炎性反应和水通道蛋白的改变，其变化可能是湿热证中主要致病机理，也可作为湿热偏重的量化指标。本文创新点：1.基于中医学理论，根据湿热证湿热偏重的不同建立湿大于热、热大于湿动物模型，探讨湿热量化的实验指标及湿热证病理改变，使温病湿热证动物模型立更趋完善。2.证实了温病湿热证动物模型出现肠道菌群紊乱，湿大于热、热大于湿组动物模型肠道菌群区别明显；本文的不足之处：1.文实验未设置药物反证组，对湿大于热、热大于湿组小鼠进行“清热”、“祛湿”的药物治疗，未能深入探讨湿热模型中湿热偏重的症状体征和具体客观指标；2.由于客观条件的限制，本实验未设立单一因素建立对照组模型，来进一步对湿热证动物进行深入研究，缺少更明确的对照，因而影响了统计学意义。38 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究参考文献[1]邓添才.温病湿热病证综合病理变化及治疗方法研究[J].天津中医药,2004,21(2):166-168.[2]吕冠华,劳绍贤.脾胃湿热证病因病机及疾病分布规律浅探[J].国医论坛,2005,20(1):15-17.[3]孙广仁．中医基础理论［M］．中国中医药出版社，2002:115.[4]丁书文,李晓,李运伦.热毒学说在心系疾病中的构建与应用[J].山东中医药大学学报,2004,28(6):413-416.[5]吴智兵,彭胜权,舒彤.湿热环境在湿温发病中的作用机理探讨[J].上海中医药杂志,2003,37(12):45-46.[6]施京红,丁辉.湿热环境对内毒素诱导新西兰兔肝脏、结肠肿瘤坏死因子mRNA表达的影响[J].陕西中医学院学报,2014(5):62-65.[7]周燕萍，高清华，李华锋，等.3种温病治法对温病湿热证模型血浆ETX血清TNF-α、IL-1β影响的对比研究[J].中医药学刊，2006，24（8）：1567-1568.[8]王婷,郑锋玲,骆欢欢.岭南温病湿热证小鼠模型的建立及肠道菌群的研究分析[J].中华中医药学刊,2017,35(06):1361-1365.[9]谢金文,万勇,余为一.CD14分子的研究进展[J].安徽农学通报,2006,12(4):35-37.[10]郑锋玲，吴薇，刘叶，李亮，骆欢欢.甲型H1N1流感温病湿热证与温热证患者血清炎症相关因子研究[J].广州中医药大学学报，2015，32（1）：1-3.[11]易世杰,赵礼金.TLR4及其作用的研究进展[J].蛇志,2013,25(2):183-187.[12]吴燕燕,王易.Toll样受体信号通路中MyD88的研究进展[J].免疫学杂志,2012(3):262-265.[13]KaganJC,SuT,HorngT,etal.TRAMcouplesendocytosisofToll-likereceptor4totheinductionofinterferon-|[beta]|[J].NatureImmunology,2008,9(4):361-368.[14]NeurathMF,BeckerC,BarbulescuK.RoleofNF-κBinimmuneandinflammatoryresponsesinthegut[J].Gut,1998,43(6):856.[15]程方平,李家庚,周洁,等.湿热证大鼠模型TLR4mRNA、NF-κBp65表达的对比研究[J].中医药临床杂志,2007,19(6):556-558.[16]NielsenCH.Majorintrinsicproteinsinbiomieticmembrances.AdvExpMed,2010,679:127-142.[17]王卫东.水通道蛋白[J].生物学通报,2002,37(6):24-25.[18]文小敏,谭永振.清香散对脾胃湿热模型大鼠尿液中AQP_2的影响[J].广西中医药,2008,31(2):57-58.[19]常丽萍.温病湿热证大鼠模型复制及加味藿朴夏苓汤作用机制的探讨[D].广西医科大学,2011.[20]刘彦华,才丽平.肾脏AQP2表达及穿梭调节的分子机制[J].临床与病理杂志,2004,24(5):463-466.[21]吴仕九,廖礼兵.湿热证大鼠肾内髓及尿液中水通道蛋白AQP2含量的变化[J].中国中医药科技,2003,10(1):4-5.39 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温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究附录附录1：英文缩略语简写英文全称中文全称TNF-αtumornecrosisfactorα肿瘤坏死因子αTLR4Toll-likereceptor4Toll样受体4LPSlipopolysaccharide脂多糖LBPLipopolysaccharidebindingProtein脂多糖结合蛋白AQPaquaporin水通道蛋白AKKAkkermansiamuciniphilaAKK菌MYD88myeloiddifferentiationfactor88髓样分化因子88PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应ALDAlcoholicLiverDisease酒精性肝病NAFLDNonalcoholicFattyLiverDisease非酒精性肝病SIBOsmallintestinalbacterialovergrowth小肠细菌过度生长H2Hydrogen氢气CH4Andmethane甲烷UCulcerativecolitis溃疡性结肠炎ERICenterobacterialrepetitiveintergenic肠道细菌基因间重复序列consensusTCSerumtotalcholesterol血清总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯TGF-αTransforminggrowthfactor-α转化生长因子NF-κBnuclearfactor-κB核因子-κBIL-4interleukin-4白细胞介素445 广州中医药大学2018届硕士学位论文在校期间发表论文情况发表的论文：[1]谢婧,周祎青，郑锋玲，骆欢欢.温病湿热证动物模型中炎症因子与水通道蛋白表达的实验研究[J].中华中医药学刊已录取，拟见刊于2018年12月46 温病湿热证“湿热交蒸”实质的实验研究致谢行文至此,硕士生涯已至谢幕时刻，回顾三年短暂而充实的研究生生活，有过快乐，有过迷茫，有过坚持，有过徘徊，但更多的是收获。在此感谢的我的导师骆欢欢老师，求学期间，深深受益于骆老师的关心、爱护和谆谆教导，在实验上老师严谨的治学态度、谦逊的为人风范和对学术孜孜以求的精神都深深的影响着我。导师在实验过程中提出许多改善性意见，使我科研思维更为开拓，本篇论文的顺利完成离不开骆老师的细心指点；感谢陈颂老师在实验上给予的指导与帮助。感谢王婷师姐在实验学习中的耐心指导及鼓励，感谢周祎青师妹、郑裕华师妹在实验工作中的帮助，使此部分课题工作能顺利完成。同时也要感谢一起奋斗，一起学习和奋斗的同学和室友，愉快的度过了研究生三年的生活。感谢我的家人在此期间给予我的支持与鼓励，他们在默默的支持是让我专心于学业的精神动力。愿追求卓越之心不被世俗琐事所消磨,愿梦想不因时间而褪色，祝福所有有理想并努力着的朋友。最后,要感谢在百忙之中对论文进行评审和指导的各位专家、老师，谢谢！47 广州中医药大学2018届硕士学位论文48
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