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１０４３分类号：Ｑ４３２．１授予学位单位代码：４２０１４１１０３３８研究生学号：山东農業大學硕士学位论文内生解淀粉芽孢杆菌ＹＴＢ１４０７在马铃薯上的定殖和增强晚疫病致病性分析ＣｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｅａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｎｓＹＴＢ１４０７ｏｎＰｏｔａｔｏａｎｄＩｔｓＰｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅＰａｔｈｏｅｎｉｃｉｔｆｏｒｇｙＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ研究生宋彦宏学科专业植物病理学研究方向分子植物病理学学院植物保护学院指导教师储昭辉２０８年６月８日１ 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，，是在导师指导下独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研宂期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文屮明确说明Ｄ本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入冇关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他Ｍ制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：曰期Ｍ／ｎ义 论文提交日期：2018年4月论文答辩日期：2018年5月学位授予日期：2018年6月学科门类：农学答辩委员会主席：孙文献教授 符号说明缩略词英文名称中文名称ddH2ODistilledwater无菌去离子水DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸HalfmaximalinhibitoryIC50半抑制浓度concentrationITSInternaltranscribedspacers内转录间隔区LBLuria-bertanimediumLB培养基ODOpticaldensity光密度PALPhenylalanineammonialyase苯丙氨酸解氨酶PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PDAPotatodextroseagarmedium马铃薯葡萄糖培养基pHHydrogenionconcentration氢离子浓度指数PODPeroxidase过氧化物酶PPOPolyphenoloxidases多酚氧化酶bpBasepair碱基对Hexadecyltrimethylammonium溴化十六烷基三甲基胺CTABbromideqRT-PCRQuantativeReverseTranscription荧光定量PCRRyeARyeagarmedium黑麦培养基RNARibonucleicAcid核糖核酸rpmRevolutionsperminute每分钟转数QTLQuantitativetraitlocus数量性状基因座 目录符号说明.............................................................................................................................4目录...............................................................................................................................5中文摘要.............................................................................................................................1ABSTRACT........................................................................................................................21．引言...............................................................................................................................41.1马铃薯的产业发展.......................................................................................................41.1.1马铃薯的栽培历史...................................................................................................41.1.2马铃薯的地位...........................................................................................................51.1.3马铃薯的主粮化战略...............................................................................................61.2马铃薯晚疫病...............................................................................................................71.2.1马铃薯晚疫病病原菌的相关生物学特性................................................................71.2.2马铃薯晚疫病发病规律...........................................................................................81.2.3马铃薯晚疫病危害症状...........................................................................................91.2.4马铃薯晚疫病的流行因素......................................................................................101.2.5马铃薯晚疫病防治方法..........................................................................................101.3解淀粉芽孢杆菌.........................................................................................................161.3.1解淀粉芽孢杆菌生物学特性..................................................................................161.3.2解淀粉芽孢杆菌抗性机制......................................................................................161.3.3解淀粉芽孢杆菌生防的优势和应用......................................................................181.4本实验的目的和意义................................................................................................192．材料与方法.................................................................................................................192.1实验材料....................................................................................................................192.2实验方法....................................................................................................................202.2.1菌株YTB1407的培养...........................................................................................202.2.2马铃薯脱毒苗的繁殖和种植.................................................................................202.2.3马铃薯晚疫病菌株的活化及提高孢子囊生长量.................................................20 2.2.4HLJ1孢子悬浮液制备............................................................................................212.2.5马铃薯晚疫病病情统计..........................................................................................212.2.6解淀粉芽孢杆菌YTB1407对晚疫病的抑菌效果...............................................212.2.7YTB1407生长曲线绘制.........................................................................................222.2.8马铃薯叶片内超氧化物歧化酶活性染色.............................................................222.2.9马铃薯光合特性的测定.........................................................................................222.2.10马铃薯叶片光合色素含量的测定.......................................................................232.2.11基因组DNA的提取............................................................................................232.2.12RNA的提取..........................................................................................................232.2.13第一链CDNA合成和定量RT-PCR...................................................................243．结果与分析.................................................................................................................253.1内生解淀粉芽胞杆菌在马铃薯上的定殖.................................................................253.1.1YTB1407能在马铃薯体内定殖.............................................................................253.1.2内生解淀粉芽孢杆菌在非喷施部位的定殖.........................................................263.2内生解淀粉芽孢杆菌对马铃薯促生作用的调查结果............................................263.2.1YTB1407促进马铃薯的生长.................................................................................263.2.2YTB1407能改良马铃薯光合特性.........................................................................283.3内生解淀粉芽胞杆菌对晚疫的抗病效果的调查.....................................................293.3.1解淀粉芽孢杆菌YTB1407对马铃薯晚疫病菌菌丝生长具有拮抗作用.........293.3.2YTB1407促进马铃薯感晚疫病.............................................................................303.3.3提前喷施YTB1407促使马铃薯抑制ROS信号促进感晚疫病.........................303.3.4YTB1407抑制马铃薯抗病相关基因的表达......................................................313.3.5YTB1407菌株内生定殖受晚疫侵染过程的影响..............................................334.讨论................................................................................................................................344.1内生解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上定殖..................................................344.2内生解淀粉芽孢杆菌YTB1407对马铃薯的促生作用...........................................354.3内生解淀粉芽胞杆菌YTB1407对晚疫病的抗病效果...........................................354.4下一步研究计划.........................................................................................................36 5.结论................................................................................................................................37主要参考文献...................................................................................................................38附录...................................................................................................................................47附录I实验所用培养基、缓冲液配方...........................................................................47附录II常用化学试剂、所属公司..................................................................................48附录III实验室常用仪器及所属公司............................................................................48致谢...................................................................................................................................49 山东农业大学硕士学位论文中文摘要马铃薯晚疫病是重要的作物病害，生产上每年用于防治该病所需的施用农药次数多，量大。生物防治有望减少化学农药用量和次数，从而节省相关生产成本和降低相关的农业污染，使之在未来发展中一度成为产业需求。本研究以烟台农科院从西洋参中分离的内生芽孢杆菌菌株YTB1407为研究对象，探讨其在马铃薯上应用潜力。本研究通过叶面喷施法，调查了菌株YTB1407在马铃薯（荷兰15）上的定殖、促生以及对晚疫病菌的抗性。通过喷施法将解淀粉芽孢杆菌YTB1407菌株喷施于马铃薯（荷兰15）植株上，采用平板稀释法检测喷施叶片中细菌的数量，从而确定最佳喷施浓度为OD600=0.01。在最佳喷施浓度下检测新出叶，茎，和根中的菌含量，明确内生解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖情况。幼嫩马铃薯叶面喷施YTB1407可以改良叶片数、叶面积、叶层结构、叶绿素含量、光合速率等光合相关特性从而促进马铃薯生长，但在温室幼苗灌根实验以及大田结薯期没有明显促生效果，我们认为YTB1407对马铃薯促生效果的实现需要叶面喷施幼嫩叶片的作用环境。利用平板对峙实验法检测了YTB1407对晚疫病菌株HLJ1具有一定的抑菌效果。进而开展了对体外喷施抗性检测，意外发现提前喷施YTB1407菌株不仅不能提高马铃薯对晚疫病的抗性，反而使病情指数增大。为解释相关现象，对喷施YTB1407及接种晚疫病菌株HLJ1前后的马铃薯叶片进行氮蓝四唑（NBT）染色和病程相关基因（PR）的定量表达分析。发现相比较喷施水做对照，预喷施YTB1407后接种HLJ1菌株1天的马铃薯叶片超氧化物歧化酶活性显著降低，多个PR基因的表达量显著降低，说明预喷施YTB1407可以帮助晚疫病菌更好的抑制马铃薯基础免疫抗性反应。综上所述，虽然内生芽孢杆菌菌株YTB1407此前在果树、蔬菜上具有良好的促生和生防作用，但针对马铃薯和晚疫病菌互作系统而言，该菌株具有一定的促生效果，但不具有生防效果。也暗示内生解淀粉芽胞杆菌在跨物种应用中具有一定的风险，需要提前进行个例分析，谨慎使用。关键词：解淀粉芽孢杆菌；马铃薯晚疫病；生物防治；促生；病程相关基因。1 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析ColonizationofBacillusamyloliquefaciensYTB1407onPotatoandItsPromotingthePathogenicityforPhytophthorainfestansAbstractPotatolateblightisoneofthemostdevastatingcropdiseases.Tocontrolthisdisease,manytimesandlargeamountofpesticideshadbeenusedannuallyinpotatoproductionseason.Biologicalcontrolbecomesthedemandofpotatoproductionwhichisexpectedtoreducetheamountandfrequencyofchemicalpesticides,thusreducingproductioncostsandagriculturalpollution.Inthisstudy,theendophyticBacillusamyloliquefaciensYTB1407,isolatedfromPanaxquinquefoliumLwithYantaiAcademyofAgriculturalScience,wasselectedasstudyobjecttoinvestigatethepotentialapplicationonpotato.Inthisstudy,thecolonization,growthpromotionandpromotingresistancetolateblightofstrainYTB1407onHooland15wereinvestigatedbyfoliarspraying.First,differentconcentrationofYTB1407strainwassprayedonHooland15plantsbysprayingmethod,andthebacterialquantityinsprayedleaveswasdetectedbyplatedilutionmethod.Basedonthebacterialgrowthcurve,theoptimumsprayingconcentrationwasdeterminedasOD600to0.01.Also,thecolonizationofB.amyloliquefaciensYTB1407innewleaves,stemsandrootswasdeterminedatthebestsprayingconcentrationcondition,suggestingthesuccessfulcolonizationforYTB1407inpotatovarietyofHooland15.Secondly,sprayingYTB1407onyoungpotatoleavescanimprovethephotosyntheticcharacteristics.However,therewasnoobviouseffectofpromotinggrowthingreenhouseseedlingwithirrigationexperimentandleavesprayingattuberformingstageinthefield.ItsuggestthattheeffectofYTB1407onpotatogrowthneedtheenvironmentofleavessprayedontheyoungleaf.Third,byusingplateconfrontationexperiment,theinhibitioneffectofYTB1407toP.infestansHLJwastestedandidentified.Accidentally,aftersprayedtheYTB1407onpotatoleaves,wenoticed2 山东农业大学硕士学位论文thatthepre-sparyingcouldnotonlyimprovetheresistanceofpotatotolateblight,butalsoincreasethediseaseindex.Inordertoexplaintherelatedphenomena,theleavesofpotatobeforeandaftersprayingYTB1407andinoculatingwithHLJwerestainedwithnitrobluetetrazoliumandthequantitativeexpressionofpathogenesis-relatedgenewasanalyzedwithqRT-PCR.Comparedwithpre-sprayeddistilledwater,theresultsshowedthattheactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andtheexpressionofseveralPRgenesweresignificantlydecreasedinpotatoleavesinoculatedwithHLJstrain1dayafterpre-sprayingwithYTB1407.Itissuggestedthatpre-sprayingwithYTB1407canhelpP.infestanstoinhibitpotatobasalimmunitybetter.Ingeneral,althoughtheendophyticB.amyloliquefaciensYTB1407hadgoodgrowthpromotionandbiocontroleffectsonfruittreesandvegetablesaspreviouslyreported.Butinpotato-lateblightsystem,thestrainhadacertaingrowthpromotingeffect,butnobiologicalcontroleffect.Itcaughtwithcautionandimpliedthattheapplicationofendophyticbacillushascertainrisksincross-species,whichneedtobeanalyzedcase-by-caseinadvance.Keywords:Bacillusamyloliquefaciens;potatolateblight;biologicalcontrol,growth-promoting;pathogenesisrelatedgenes.3 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析1．引言1.1马铃薯的产业发展1.1.1马铃薯的栽培历史马铃薯（SolanumtuberosumL.）来自于南美洲西部的全长约8900余千米的安第斯山脉，其主要栽培品种为同源四倍体种。据史料记载，马铃薯最先由相关国度的人们于十六世界三十年代至七十年代间号衣秘鲁后带回欧洲，于同世纪八十年代的英国人打败西班牙，从南美收集到马铃薯等植物种子并带回英国（蔡兴奎和谢从华等，2016）。马铃薯喜好低温，其生长的最适温度，茎叶为15℃~25℃，块茎为16℃~18℃，这使得马铃薯成为非常适宜于欧洲种植的作物。马铃薯作为产量位居世界前列的粮食作物，其单位面积所能够产出的最多的干物质可以提供的最大的热量（以卡路里计算）是水稻、玉米的近2倍之多；且营养养分非常丰富的粮食作物，块茎中蕴含大概2%的蛋白质成分，并在薯干中的含有量最为丰富，最高能够达到8%~9%，且其质料不差于鸡蛋的卵白，其中包含了人体自身不能合成的多种必需氨基酸，因此成为广大消费者所青睐的健康美食。据相关调查结果显示，马铃薯中所含有的营养元素维生素B的量大约是水果的5倍，维生素C含量大约是水果的近11倍。马铃薯具有十分合理的营养构成，营养物质种类齐全。除此之外，与各种粮食作物相比较而言，马铃薯可能含有独一无二备受人们青睐的健康成分--胡萝卜素，若能做到频繁地使用马铃薯，可以有效降低高血压，对降低患结肠癌及心脏病的几率也有辅助作用，对人的身体健康都十分有利。马铃薯中的丰富的抗氧化成分对保持其原有色泽起到了十分巨大的作用，即使经过高温油炸等物理化学处理，其原有的色泽依然可以不为所动。因此，自传入欧洲后，马铃薯很快就被发展为欧洲人的主粮之一，得到广泛的种植和发展，在1750-1850年间发展成欧洲农业的中心地位（Kamounetal.,2015）。16世纪后期100多年的时间里，欧洲军事上不断扩大，马铃薯又从西班牙和英国随着殖民地的开发传播到其他国家和地区。马铃薯大约在明代万历年间明神宗朱翊钧时期传入我国，其引入的路径分为海路传入和陆上传入两种之说，不管是哪一种说法，都是沿着我国当前提出的“一带一路”传入4 山东农业大学硕士学位论文进来的（蔡兴奎和谢从华，2016）。因此，我国的马铃薯在有的地区被称之为荷兰薯、有的地区被称之为爪哇薯、还有的地区称之为洋芋等，标识其外来引入者的身份。按照栽培区域，我国马铃薯可分为四大栽培地域：朔方第一植作区、华夏第二植作区、西混合植作区和南方第二植作区（孙慧生，2003）。相关研究人员根据我国马铃薯在我国所有种植地区的总产量、在全国各地区统计分析的播种面积以及相应的单产革新，将1960年以后我国马铃薯的生产发展大致分为了缓慢发展期（1960-1984年）、快速发展期（1985-2007年）、全面发展期（2008年至今）三个时期。1.1.2马铃薯的地位马铃薯为解决严重的食品短缺和贫困问题发挥了重要作用，其总产量有近4亿吨之多，播种的总面积达到1920.50万公顷（李文华等，2018），产量和产值均占全世界的全部粮食作物的13%左右，成为位于主要粮食中位列第四的粮食作物，如此数量之庞大，作用之显赫，令世界人民叹为观止。马铃薯具有很强的适应能力，具有十分广泛的散布范围，全世界上总共有大约为158个国家和地区种植马铃薯作物，其分布区域之广位列玉米之后，其分布地域不胜枚举，号称第二大粮食作物（谢从华,2012;李文华等，2018）。作为高产和耐贫瘠农作物，马铃薯的种植和推广对于有人口压力的发展中国家有着重要意义，年均产量增长预测为1.5%（蒋晨晨和胡继连,2015）。最近几年，亚洲地区马铃薯的生产总值增长迅速，已经成为全世界范围内促进马铃薯产业发展的重要支柱（Liuetal,2014）。为强调马铃薯在世界保护粮食安全方面的重要地位，2008年，联合国给予马铃薯“国外马铃薯年”称谓，进一步将马铃薯界说成“地球未来的粮食”这一称号。马铃薯也是我国保障粮食安全和社会保障的重要支柱之一，粮菜兼用，成为我国贫困山区的重要粮食组成和脱贫农作物（柳俊,2011）。我国人口数量的不断增加、同时面临着水资源严重不足、耕地面积逐渐减少、防御自然灾害的能力较弱、粮食生产基础非常薄弱等一系列问题，导致了中国的粮食自给存在许多潜在的危机。而在水资源相对比较缺乏的地区，例如，干旱、半干旱地区，马铃薯的产量以及水分利用率，皆优于其它粮食作物。屈冬玉（2005）等研究发现马铃薯对于我国食物安全作出的贡献远远高于其它的经济作物。我国的马铃薯在全国的平均种植面积和产量，据调查一直呈现稳定增长趋势，从1961年-2014年，种植面积从130.08万公顷发展到564.70万公顷，总产量5 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析由1290.7万吨增长到9613.63万吨，种植面积和产量分别增长了4.34倍和7.45倍，分别占世界的29%和25%，成为全球最大的马铃薯生产国（蔡兴奎和谢从华,2016；李文华等,2018）。尤其是，近年来薯类加工业的快速成长和发展，加工技术显著提高，延长了马铃薯产业的增值链条，提升了整体产业能力（谢从华,2012；蒋晨晨和胡继连,2015）。1.1.3马铃薯的主粮化战略马铃薯种植面积和产量稳居世界第一，同时还存有诸多的产品行业问题。与欧洲育种时间相比，我们和世界强国荷兰的育种水平存在显著的不足，尽管产量是荷兰的约36.3倍，但品种数量不及别人的1/2，且种植品种类型单一，多为鲜食菜用（李文华等，2018）。我国的马铃薯育种起于上世纪30年代末期，直到50年代之后展开马铃薯育种协作，才真正地算得上起首育种工作，从前苏联和波兰等地引进种质资源开始针对晚疫病和病毒病开展抗病品种培育，截止到1983年，累积育成品种约93个，包括至今仍在生产上推广面积大的克新1号，但遗传背景非常单一（孙慧生,2003；蔡兴奎和谢从华,2016）。上世纪80年代以后，对外交流的扩大增进了引种资源的多样化，涉及的国家已逐步地扩大到北美洲等四个国家等的国际马铃薯中心等，针对高淀粉、抗晚疫病和高产育成一批新品种；同时育种方式也进行了调整，重点开始了专用品种的选育，育成了中薯、鄂薯、陇薯等系列品种约125个（蔡兴奎和谢从华.，2016）。2001年时至今日，中国马铃薯在这段时期内的育种工作处于一段高速成长时期，针对专用品种的高质量的候选育种工作，我国已经选择产生了300多个新进品种，其中包含早熟新品种，如中薯3号、5号等、炸片加工专用品种中薯10号等（徐建飞和金黎平,2017）。不仅遗传资源背景趋于多样化，育种技术的不断进步和充实有赖于马铃薯基因组测序技术的逐步完成（ThePotatoGenomeSequencingConsortium,2011），涵盖了古代传统育种技术、倍性育种技能、标记辅助采取育种技术、基因工程育种技术和基因组选择育种技术等（徐建飞和金黎平,2017）。此外，我们在种薯认证体系直到近年才初步建立，检测机构尚不够健全，也缺乏有效的监管，脱毒种薯的普及率有待提高；机械化水平低，管理粗放，生产效率低下，导致成本高、资源浪费、品质低，严重影响效益；消费结构单一，深加工和出口比重低；产业经济研究缺乏等问题（蒋晨晨和胡继连,2015;李文华等,2018）。6 山东农业大学硕士学位论文为贯彻马铃薯由副食消费产品转向主食消费产品为宗旨（余欣荣，2015）,符合国家“十三五规划”推进农业供给侧改革，改善供给侧农产品的产量及质量，马铃薯产业需要更加重视（樊晓迪等，2016）。在2015年1月时，我国农业部确定开启并公布了马铃薯的主粮化政策，推进把马铃薯加工成馒头、面条、米粉等主食的工作，期望不断推动马铃薯的消费方向由副食品消费逐渐变为主食消费，进一步促进产业的发展。1.2马铃薯晚疫病由致病疫霉引发的马铃薯晚疫病为具有极其毁灭性的马铃薯病害之一，给该农作物生产造成巨大经济损失。据有关记录的数据，马铃薯晚疫病最早1843年发现在美国费城（Philadelphia）和纽约城（NewYorkCity），并随风传遍美国种植区（Nowicietal.,2012）。约1845年，病薯通过船运突破大西洋屏障，传到欧洲比利时，随后传播到爱尔兰并造成知名的“爱尔兰大饥荒”（Nowicietal.,2012）。至今，该病害仍然位于马铃薯病害之首，我国平均每年为此减产在10%~15%（谢从华等,2012），直接经济损失约10亿美元（于耀华等,2013），全球年均损失约在67亿美元左右（Haasetal.,2010）。1.2.1马铃薯晚疫病病原菌的相关生物学特性由致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.)deBary]引发的马铃薯晚疫病为具有极其毁灭性的马铃薯病害之一，给该农作物生产造成巨大经济损失。该病原菌致病疫霉归属于疫霉属（Kamounetal.,2015）。菌丝体呈现无色状态，无隔膜，主要寄生在相应的寄主细胞间隙，分支亦较为发达，通过将吸器伸入到寄主细胞来吸收营养成分（佚名，2014）。存在两种交配型A1和A2（Brasier,1992）的致病疫霉菌在2000年以前分别在不同时期占据着重要地位，最早是A1交配型起主导地位，自上世纪50年代在墨西哥首次发现以后，A2交配型取代A1成为主导菌株，随后在全世界马铃薯种植区均被鉴定，包括我国的各马铃薯产区，很多时候会成为优势交配型（Nowicietal.,2012；王腾等,2018）。早在十九世纪四十年代，马铃薯贸易就促进了致病疫霉病原体的长距离迁移（Kamounetal.,2015）。具有典型马铃薯晚疫病病斑的植物，当孢子着落到植株上，随环境条件和时间推移开始萌发时，便开始发生了感染过程。芽管形成附着胞并且新萌7 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析发的吸器刺入表皮细胞，寄生寄主细胞（Kamounetal.,2015）。致病疫霉通过无性生长繁殖可以产生孢囊梗和孢子囊。孢子囊有极度鲜明的脚胞着生于基部，顶部具有乳状样的突起。有性生殖产生的A1和A2两种特定的交配型通过异宗或同宗配合的生殖方式产生卵孢子（Brasieretal.,1992）。卵孢子呈圆形。由卵孢子萌发而产生的芽管，顶端可以产生孢子囊。游动孢子以及孢子囊只有在水环境中才可以进行萌发，孢子囊在10～13℃的环境下可以产生游动孢子，芽管在4—30℃环境下由孢子囊可直接萌发（王合松、王培红等，2004）。菌丝生长的温度范围在13-30℃，最适的生长温度大约在20-23℃。孢子囊的产生温度大约在7-25℃。相对湿度到达85％以上的时期，病原菌能够从气孔向外伸出来形成孢囊梗，当湿度达到95-97％时，是形成大量孢子囊的必要条件。孢囊梗包括2~3丛，可以从寄主的气孔进行伸出，纤细，无色，含有1~4个小分枝，孢子囊由各个分枝顶端膨大而生出。致病疫霉以休眠菌丝体在染病种薯内越冬作为主要侵染来源，发病种薯播种后，染病轻者可萌发成幼苗，作为田间中心病株。温度和湿度适宜时，孢子囊通过风雨传播至健康植株叶片上，经由气孔或角质层侵入，形成病斑产生孢子囊致使再侵染，最终形成田间大面积发病。致病疫霉可以编码约17797个基因，其中两类重要的致病因子RXLR效应蛋白和CRN蛋白分别为563个和196个（Haasetal.,2009），它们在参与致病性上发挥着重要的作用，是当前的研究重点之一。1.2.2马铃薯晚疫病发病规律病原菌在病薯中主要以两种方式度过寒冷的冬季：菌丝体或卵孢子的形式，亦可以卵孢子的形式在泥土中越冬，自生苗产生的病菌可以成为第二年的初侵染源。病原菌产孢量大，无数的孢子囊在每个病斑中心快速产生（Cohenetal.,1997）。由孢子囊直接发生形成的芽管需要在较高的温度环境下实现，一般要高于15℃。芽管侵染署块一般分为两大途径：从角质层、气孔侵入到叶片的内部，或者从皮孔、伤口或者是芽眼表面的鳞片侵染。病原菌的孢子囊可以借助气流、雨水在温度高于159℃的环境中迅速的传播，孢子囊可以直接萌发形成芽管。孢子囊或者游动的孢子还可以通过雨水渗透到土中从而侵染近地面的薯块（弓贵明、姬青云等，2012）。借助气流到处传播的中心病株上的孢子囊，在产生之后可以经由植物表皮的孔径直接进入其周围的植株，构成多次的附加感染，最终引发植株较大程度的病发。病株上的孢子囊还可以被自然降水和人工施水8 山东农业大学硕士学位论文带入泥土中，进一步从从植物表皮的孔径处浸入到植物茎部组织，产生新的病薯，尤其以地面下5cm之内的孢子囊数量为最多。病原菌可以从嫩芽茎的基部朝上方发展，进一步形成通向地上的茎上条斑。在病薯产生的大量孢子可以借助泥土中水分的散开作用在泥土内被移动，除此之外，病菌还可在健薯和病薯上进行大量繁殖。在低温高湿的环境下，吸水后的孢子囊可以间接萌发，其中的内含物可以进一步分裂成6～12个具有双鞭毛的游动孢子，放大侵染源，使得侵染能力更强（WalkerandvanWestetal.,2007），游动孢子可在水中游动，侵染能力更强，进一步的收缩鞭毛，从而长出被膜，形成球形的休止孢，然后生长出芽管。1.2.3马铃薯晚疫病危害症状马铃薯晚疫病可以侵染几乎所有的植物组织，叶片、茎、叶柄和块茎成为马铃薯晚疫病的主要侵害部位。其侵染模式属于典型的兼性营养型（Hemibiotrophs），包含早期的活体营养型和后期的坏死营养型（Nowicietal.,2012;Kamounetal.,2015）。在症状上看，发病早期，马铃薯的下部位的叶片迅速发病，位于叶片的叶缘或者叶尖等部位的病斑呈现一种水渍状，是晚疫病在初期的典型病斑，叶片颜色失绿。病斑扩大后叶片的颜色通常变为暗绿色，形状呈圆形，但是在病健的交界处现象却不太明显。当在阴雨天气的环境下，空气的湿度较大，病斑可以从叶尖和叶缘向叶片的中部进行迅速的蔓延，严重的可蔓延至大半叶片甚至是整个叶片（弓贵明、姬青云等，2012）。在叶片的反面，一层白色的稀疏状的霉层经常伴随在病斑的边沿，在潮湿环境中这种现象尤为严重，然而，在天气晴朗干燥时，霉层变的很薄甚至肉眼观察不到，被除此之外，植株的叶片变干枯，同时变薄，呈现暗褐色。当马铃薯晚疫病主要危害植被的茎部时，病斑呈现褐色的条斑，在湿度大的环境中，茎部也会产生白色的霉层，但是，相较于叶片稀疏处，被侵染的部位常常发生叶片坏死甚至是整株崩解的现象，导致相应的营养成分无法通过相应组织输送至茎部（弓贵明、姬青云等，2012）。植被上部的叶片全都干枯死亡。当病原侵害薯块时，病斑的初期呈现为不规则的病斑，颜色表现为褐色或者是紫褐色，稍微存在凹陷，植被的下部组织表现一定程度的坏死，但是，病健的交界处这种现象并不明显。通常在晚疫病发生后，植被的发病部位容易遭受其他病菌二重感染，薯块发生快速的腐烂，随后引起变质。如果为非常干燥的土壤，则发病的部位会变硬，呈现一种干腐9 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析状。1.2.4马铃薯晚疫病的流行因素马铃薯晚疫病的病原菌主要以菌丝体的形式在薯块内越过冬季，其带菌自发苗经常成为重要的初次侵染源。病原菌可以经风雨流体传播，还可以经皮孔芽眼外面的鳞片、伤口或者是表皮被侵染，经由叶片和块茎进行传播侵染。如果播种带有致病菌的薯块，将会使薯块无法正常的发芽，甚至是在发芽后出土立即死亡。然而，一些薯块在发芽出土之后会形成中心病株，其发病的部位能够生产大量的游动的孢子囊，该孢子囊可以借助风力甚至是气流等方式进行迅速的传播，之后再侵染并形成发病中心，成为该病害由点到面地迅速蔓延的原因。除此之外，当外部环境的温度以及湿度适宜的条件下，病叶上的孢子囊产生和积累非常迅速，完成一个完整的侵染循环只需要5-7天（WalkerandvanWestetal.,2007）。因此，马铃薯晚疫病能发展为为典型的流行性病害，其中的气候条件发挥了重要作用，当处于多雾、阴雨，以及忽冷忽暖的气候条件下可以促进植被发病，并且，在多雨季节或者年份中容易发成中大灾害。病菌的孢囊梗和孢子囊的形成以饱和湿度为最适，萌发则需要在水滴或水膜中才能进行，而萌发方式主要取决于温度，当条件适宜迅速暴发病害。影响马铃薯晚疫病的流行的因素还包括菌源量、品种抗性和防治因素（Nowicietal.,2012）。菌源量影响了初次侵染的程度和次级侵染的强调，也是病害流行的重要因素；不同马铃薯品种因抗/耐病性差异而表现不同抗性也是决定优势菌群的产生和发生程度，包括寡基因控制的小众专化抗病性（或质量抗性）和多基因控制的非小种专化抗病性（或水平抗性）。此外，耕作与栽培措施也会影响到晚疫病的流行，偏施氮肥，土壤贫瘠、缺氮等情况均有利于病害发生。黄冲和刘万才（2016）分析了2012年和2013年全国马铃薯晚疫病偏重发生的流行因素，认为气候是影响马铃薯晚疫病流行的最重要因素，这与很多病害尤其是真菌性病害的流行因素相同。1.2.5马铃薯晚疫病防治方法晚疫病的防治是马铃薯生产上必不可少的环节，核心内容是马铃薯的综合防治技术，包括栽培措施、化学药剂的防治和抗病品种的种植等（Nowicietal.,2012）。10 山东农业大学硕士学位论文1.2.5.1抗病品种种植种植抗病品种无疑是综合防治晚疫病优先考虑的策略。马铃薯作为同源四倍体的植物，具有生殖隔离障碍的特性，因此，培育马铃薯抗病品种的方法与其他常规育种方法存在差异。马铃薯的培育方法包括：与野生品种杂交培养、基因工程以及细胞工程等培育方式（孙慧生,2003）。在早期的研究中，国际上主要利用的是质量抗性基因资源，主要包括从野生种S.demissum鉴定的R1-R11基因，其中R1、R2、R3a/R3b、R4和R10都被导入到栽培种之中（vanderLeeetal,2001;vanderVossenetal,2005;Parketal,2009）。同时，长期种植马铃薯抗病品种后已经多次出现品种抗性减弱的现象，当前，这些品种在田间已经丧失对晚疫病的抗性。东欧以及我国在2001年前后也将野生种S.phureja中的抗晚疫病基因Rpi-phu1导入到栽培种，培育了很多的抗晚疫病马铃薯品种，在生产上防治晚疫病起着非常重要的作用（蔡兴奎和谢从华等,2016;Śliwkaetal.,2013）。研究表明，S.phureja中的Rpi-phu1基因实际上与已经从野生种S.verurii中克隆的广谱抗晚疫病基因Rpi-vnt1.1属于等位基因（或同源基因），遗传位点和抗病谱完全相同（Fosteretal.,2009）。近年来，随着基因工程技术方便打破马铃薯野生种和栽培种之间的生殖隔离的兴起，从不同马铃薯野生种质，如S.bulbocastanum、S.edinese、S.hjertingii等7种野生资源中克隆和鉴定了Rpi-blb1、Rpi-sto1、Rpi-mcq1等多达26个主效抗病基因（徐建飞和金黎平,2017；Aguilera-Galvezetal.,2018）。最近从马铃薯野生种质中克隆的晚疫病抗病基因Rpi-mcq1、Rpi-vnt1.1等获得美国发明专利(US8367893B2)，转化美国辛普劳（J.RSimplot）公司培育出多个经过FDA批准的转基因新品种X17、Y9和W8（BNFNo.000146/000153），推动了抗马铃薯晚疫病基因工程育种的进程（Jonesetal.,2010,2014）。由于单个的主效基因抗性容易丧失，利用当前已经克隆的众多基因资源采用基因聚合（或cisgenestacking）策略导入多基因控制晚疫病也得到高度重视（Joetal.,2014）。受转基因作物的限制，截止到目前，多基因联合抗性的马铃薯抗病品种在我国市场上非常缺乏。一些观点认为，利用数量抗病基因介导的水平抗性为培育持久抗性的抗晚疫病马铃薯品种会更加有效（Oberhagemannetal.,1999）。CIP通过对水平抗性的遗传研究，从栽培种和野生种杂交群体中定位了多个重要的QTL位点（Meyeretal.,1998;Collinsetal.,1999;Oberhagemannetal.,1999）。通过和CIP的合作，利用其水平抗性资源和杂交组11 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析合资源，我国科学家也育成了近20个晚疫病抗性较持久的品种，如华恩1号等（吴承金等,2010;蔡兴奎和谢从华.2016）。对于马铃薯晚疫病水平抗性机理的认识大致有两种观点：由一些特殊的抗病相关基因异常表达引起；或一些尚未完全被打败的植物抗病基因决定。Trognitz等（2002）通过差异表达分析和QTL位点的连锁分析发现10个抗病相关基因定位于抗晚疫病QTLs位点上，可以解释S.phureja×DihaploidS.tuberosun杂交组合的水平抗性。Wang等（2005）通过对一中抗水平抗性的马铃薯材料进行接种晚疫病原后的差异表达分析，也鉴定了348个存在差异表达的抗病相关基因。针对持久抗病的马铃薯栽培品种SarpoMira的精细分析，发现其晚疫病抗性受4个主效抗病基因R3a、R3b、R4、Rpi-Smira1和数量抗病基因Rpi-Smira2共同提供，虽然尚未克隆Rpi-Smira2基因，但发现其对应识别的无毒基因AvrSmira2同属于RXLR类效应分子，暗示Rpi-Smira2基因与质量抗性基因相同，属于NBS-LRR类型抗病基因（Rietmanetal.,2012）。1.2.5.2化学防治在现阶段，化学防治依然是防治马铃薯晚疫病较为有效的方法之一，在不适环境中，特别是大规模爆发的情况下，使用化学药剂防治晚疫病的效果较为显著。内吸性和触杀性杀菌剂是防治马铃薯晚疫病的两类化学药剂（李灿辉，2004；Nowicietal.,2012）。触杀性杀菌剂具有快速，准确，瞬间触杀的特点，主要杀灭植物叶片表面的病菌。不利之处，由于受到环境中雨水、露水冲刷等原因，需要进行多次反复喷施药剂，以达到有效杀菌的作用。常见的触杀类药剂主要包含：肉桂酸衍生物、含铜化合物、二硫代氦基甲酸酯类、邻苯二甲酰亚胺类、苯甲腈类、吡啶胺类、有机锡杀菌剂等，其中，含铜化合物药剂是最早用于防治马铃薯晚疫病的无机杀真菌剂。由于植株无法吸收这类药剂，因此，该类型杀菌剂不能杀灭侵入到植株体内的病原菌。我们实验室近期的研究发现，含铜化合物不仅可以直接抑制病原菌的生长，低浓度铜离子还可以通过乙烯和水杨酸路径激发植物的先天性免疫反应，刺激植物产生抗病性（Liuetal.,2015;Zhangetal.,2018）。内吸性杀菌剂主要包括恶唑烷酮、苯基酰胺类的甲霜灵(杀毒矾主要成分)、甲呋酰胺和benahrxyl，乙酰胺类的霜脲、烷基磷，以及酸盐类的乙磷铝、氰氨基甲酸酯类的霜霉威，氟吗啉等。内吸性药物对已经侵染到植体内的致病菌具有一定的杀灭作用，但该类药物在使用方法上具有一定的局限性，不仅生产成本及售价非常高，而且作用位12 山东农业大学硕士学位论文点单一，因此可以促进晚疫病菌快速产生抗药性株系（Nowickietal.,2012）。以使用最为广泛的苯酰胺类甲霜灵、精甲霜灵为例，大规模长期的使用该药剂导致产生大量的抗药性菌株，欧洲在上世纪90年代就发现甲霜灵抗药性菌株（Gisietal.,2011），我国2013-2014年对北方5省的调查发现75.6%-82.7%的致病疫霉菌株对甲霜灵具有中等的抗药性，16.3%的菌株成为高抗菌株（沙海天等,2016）。同时，内吸性药物对于不同毒性基因型的生理小种具有不同的选择性杀灭作用，将会进一步导致小种群体遗传基因及结构发生改变（Gisietal.,2011）。组合循环式使用两种不同类型的的杀菌剂防治马铃薯晚疫病是主要的防治策略（Fry,2008;Bozkurtetal.,2012），也是国内外生产马铃薯主要应用方法之一。陈爱昌等（2015）通过不断的组配和开发新的杀菌剂防治病害的发生，其实践发现72%霜脲•锰锌（1950g/hm2）+23.4%双炔酰菌胺（450mL/hm2）+250g/L醚菌酯（280mL/hm2）+687.5g/L氟菌•霜霉威（980mL/hm2）等两个配方在甘肃田间防治晚疫病效果达到85%。广谱杀菌剂氟啶胺、80%烯酰吗啉、25%双炔酰菌胺、丁字香酚和银法利等都在田间或库存期间得到很好的防治效果（陈亚兰和张健,2017；张心宽,2017）。进一步开发高效能、安全并且经济实用的杀菌剂仍然是晚疫病防治策略的重要发展趋势和产业需求(Bozkurtetal.,2012)。1.2.5.3农业防治马铃薯晚疫病的初侵染源大多来自于存活在土壤中的病薯和越冬卵孢子。土壤中包含各种各样十分的复杂的理化因素，使用化学农药来处理土壤的效果一般差于地上植被部分的喷施，而且大量的使用药物制剂，产生了严重的环境污染问题。所以，农业措施对于植物疫病的控制也具有举足轻重的影响和作用(孟艳等,2009）。农业措施的采用可有效的改变病原菌以及寄主的生活环境，因此可以直接的抑制病害的产生。这包含两个方面：其一是通过改变寄主植物的生存环境，提高植物生存能力，例如有效的提高或者来降低寄主对病原菌的抵抗力；其二是通过栽培措施影响病原菌的存活、繁衍、传播以及侵染途径。利用农业措施的调节可有效的形成有利于寄主但是不利于疫霉菌生长的环境，进而减轻植被病害的发生程度。还可以通过加强田间管理以及改良植被栽培技术：扩大植被的行距，缩小株距，亦可以在花蕾期通过喷施90ppm的多效唑进而有效的控制地上部分植被的生长，降低田间的湿度(Adrienneretal.,2010)。种植马铃薯应当选择13 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析干燥且沙性强的土壤，做好培土工作，同时通过中耕培土，可有效的抑制病原菌侵染块茎，从而降低薯块的感染率；进行合理的配施氮、磷肥，以及增施钾肥，可有效的提高植被的抗病能力；如果是在低洼容易积水的地方，必须要注意开沟来排出多余的灌溉水，降低田间湿度，有效的抑制病害的产生和发展。病害的防治方法为：当中心病株出现后，应该及时的喷施或者灌溉25％的甲霜灵500-800倍液；如果是土壤湿度大或者遇到小雨天，也可使用l：4的甲霜灵与细干土或煤灰拌匀后施于植株的根部进行防治；及时的消灭中心病株，一旦发现中心病株要及时将其清除，并进行集中烧毁，减轻植被发病程度。1.2.5.4生物防治生物防治主要以“菌”治“菌”，现在也发展了包括植物提取物在内的防治病害的技术。柳俊（2011）等对生物拮抗菌开展了大量研究，其研究成果已被广泛的应用到食品保鲜的抑菌方法中，成为一种非常具有发展前景并且不含有任何化学药剂残留的新型食品保鲜方法。在当前作物病害防治过程中，研究和开发应用较多的微生物主要集中在生防细菌，包括芽胞杆菌、假单胞杆菌、土壤放射杆菌。应用最好的主要是芽胞杆菌，尤其是枯草芽胞杆菌，不仅广泛应用，并成功进行了大量商业化生产（李红晓等,2016）。芽胞杆菌多属于植物根际微生物，不仅产生的抗菌物质种类多、抗谱广，还有良好的根际定殖能力，较强的抗逆性和繁殖力，以及适应环境变化的能力强等优点。拮抗作用机制是主要的生防机制，可以与病原菌直接相互作用从而产生良好的抑制作用，抗生作用可导致病原菌的细胞畸形并且可产生大量的泡状物，除此之外，还可以破坏细菌的细胞壁，导致细胞内的物质外溢，最后可通过作用于植株从而抵抗病菌入侵（Jiaetal.,2011）。同时，芽胞杆菌还可以产生植物促生物质，能显著促进作物的产量。在马铃薯晚疫病生物防治上，大量的实验表明枯草芽胞杆菌在田间防效可以达到70%以上，并且能增产10%左右（黄保全等,2016;李国志等,2016）。截止到现在，在农业生产方面对于生物药剂的需求量逐渐增多，相关的研究者同时也陆续进行了与防治病害相关的生物技术的科学研究(Adrienneretal.,2010)。结果发现，Penicilliumaurantiofriseum的抑制效果最为明显。Filippov将Pseudomonasputida和Bacillussubtilis应用于马铃薯晚疫病的防治中，生物制剂ImmtmofitM的防治效果与化学药剂相当。在我国，最近在马铃薯晚疫病生物防治方面研究同样有大量报道，主要包14 山东农业大学硕士学位论文括微生物及代谢产物分离物，植物源杀菌剂等(CaoandFerror,2001a)。杨秀芬等(2000)报道了嗜线虫致病杆菌发酵液可有效的抑制对马铃薯晚疫病，50mL/L的发酵液对晚疫病害防治效果与20mL/L25%甲霜灵效果相似。李玉华（2002）报道嗜线虫致病杆菌对于马铃薯晚疫病的防治也展示出较好的应用潜力，防治效果显著。用于防治马铃薯晚疫病的最佳浓度为40倍稀释液，防治效果约等同于58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂500倍稀释液。然而嗜线虫致病杆菌代谢物在增加马铃薯块茎产量的作用上优于58％甲霜灵锰锌。要想起到完全抑制晚疫病菌生长时，需要的发酵液是稀释80倍即可，此外，稀释640倍的发酵液仍然具有有明显防控效果。曹静等（2006）也发现嗜线虫致病杆菌YL001菌株也对卵菌病原菌存在显著的抑制作用，可以作为生防菌株。黄武仁等（2005）通过对嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株的抗菌组分鉴定，发现其对马铃薯晚疫病原等有显著抑菌效果的代谢产物主要为3,4-二氢-8-羟基苯并吡喃衍生物。YL001菌株也可以产生两种主要的抑菌物质亚苄基丙酮(benzylideneacetone)和3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺(Nematophin)，其对番茄灰霉病菌等真菌和细菌效果显著（许鹏,2016），尚不清楚对晚疫病菌等卵菌病害的抑制效果。此外，假单胞杆菌菌株HC5、地衣芽孢杆菌和地丝菌属真菌Geomycessp.WZJ及其代谢物对马铃薯晚疫病菌也具有非常好的抑制活性，可以作为潜在的生防菌使用防治马铃薯晚疫病害（李玉峰,2009;李奥兰,2015;张艳萍等,2018）。植物源杀菌剂同样展现出较好的应用价值，研究表明，大蒜、木贼提取物以及生物洁净剂对马铃薯晚疫病菌的孢子萌发、叶片侵染及菌丝生长均有一定的阻止作用（CaoandvanBruggen,2001b）。曹静(2005)等人报道了九种对孢子囊萌发具有明显抑制作用的植物提取物，除此之外，还发现了6种植物提取物可以显著抑制孢子囊的产生，4种提取物的抑菌成效与化学药剂“Ridomil”3000倍液水平相当。知母提取物对马铃薯晚疫病菌的各个生长事情都表现出一定程度的抑制作用，除此之外，盆栽试验结果显示同样也有一定的抑制效果(王树桐等，2006)。洋葱浸出液可有效抑制马铃薯晚疫病菌游动孢子萌发和附着胞的形成(蒋继志等，2000)。上述的研究显示，植物提取物、知母提取液、洋葱浸出液中均含有抑制或者杀灭马铃薯晚疫病菌的物质。此类研究结果为马铃薯晚疫病的生物防治技术提供理论基础，同时也展现了长远的应用前景。15 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析1.3解淀粉芽孢杆菌1.3.1解淀粉芽孢杆菌生物学特性早在1943年，日本科学家Fukumoto就发现了解淀粉芽孢杆菌，随后在1967年Welker根据解淀粉芽孢杆菌具有很高的淀粉水解能力这一特点将它从枯草芽孢杆菌中正式分离出来（李红晓等,2016）。该菌不仅产生芽胞，还可以大量的产生表面物质以及多种抗菌产物，具有潜在的应用价值。解淀粉芽孢杆菌属于细菌界(Subkingdom)，细菌门(Bacteriophy),芽孢亚门(Bacillussubph[…]，其拉丁名为Bacillusamyloliquefaciens。赵容彬（2016）等通过发酵培养法证实了解淀粉芽孢杆菌的生物学特性，发现该菌需氧，革兰氏染色为阳性，呈现短杆状，菌落表面光滑，边缘有不完整突起，呈黄色。芽孢作为解淀粉芽孢杆菌（细菌）的重要细胞器，可以为细菌度过不利生长环境发挥重要功能(Xuetal,2014)。当观察活染色的芽孢时，芽孢通常显现于侧面，在黑色背景下显得非常明亮。经过组织样式，物质组成等方方面面的一系列繁杂的变化过程，芽孢才可以最终产生。在细胞生长以及分裂阶段不会产生芽孢。芽孢的发生必须经过的过程囊括其各个组成部分的产生，从轴丝的产生，到隔膜，前孢子，皮层，包子外壳的最终构成，直至芽孢的长大及其开释。处于休眠状态的成熟芽孢，一般检测不到代谢活动，因此称作是隐生。1.3.2解淀粉芽孢杆菌抗性机制解淀粉芽胞杆菌广泛分布在土壤、植物表面、体内，经常可以被分离和检测到。解淀粉芽孢杆菌的抑菌谱广，抑菌作用明显，能产生丰富的抗菌代谢物质，主要包括对真菌和细菌的两大抑菌作用（李红晓等,2016）。植物的根系不仅分泌有利于有益微生物生长的营养物质，还分泌一些化学趋化信号分子，吸引解淀粉芽胞杆菌等有益微生物向根部移动和形成生物膜，从而促进有益菌细胞的生长和增强其抗逆性（Zhangetal.,2015）。解淀粉芽孢杆菌作为芽孢杆菌的一类，其抗病机制主要表现在：（1）产生抑菌物质，如脂肽类化合物，有机酸，大分子，水解酶类等。根据抑菌物质的合成方式，可以16 山东农业大学硕士学位论文将这些抑菌物质分为核糖体途径合成的抑菌物质和非核糖体途径合成的抑菌物质两大类（刘昆昂等,2017;闫小妮等,2018）。核糖体途径合成的抑菌物质可以进而分成两类：小分子环肽类细菌素，如羊毛硫细菌素，它主要通过和细菌膜外受体蛋白互作，致使细胞膜失去稳定性从而达到对其他细菌的抑菌作用（Sutyaketal.,2008）；分泌的抗菌蛋白类，如几丁质酶和糖苷水解酶类，可降解其他菌的细胞壁从而抑制菌丝生长、孢子萌发等（Cantwelletal.,1983;闫小妮等,2018）。非核糖体途径合成的抑菌物质包括许多具有抗菌活性的小肽，在解淀粉芽胞杆菌菌体生长后期，依赖非核糖体多肽合成酶合成，多为7~10个氨基酸和1个长链脂肪酸（C13-C18）形成闭合环脂肽类分子，通常包括表面活性素、伊枯草杆菌素和芬荠素等（Walsh,2004），他们通过影响细胞膜的稳定性或通透性造成其他细菌或真菌细胞质渗漏从而达到抑菌效果。非核糖体途径合成的抑菌物质还包括由聚酮合成酶（PKS）催化合成的聚酮化合物，如Difficidin、Macrolactin和Bacilliaene（刘昆昂等,2017）。有趣的是，当解淀粉芽胞杆菌识别到来自灰霉病等病原信号后，可自动增强产生抑菌性物质的合成（Cawoyetal.,2015）(2)激发植物诱导抗性途径。诱导系统抗性（inducedsystemicresistance,ISR）主要由非病原微生物处理植物后，激活植物自身免疫系统，提高植物对其他病原物产生抗性，主要依赖于茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号途径。解淀粉芽胞杆菌FZB42分泌的环脂肽类物质处理莴苣后再接种立枯丝核菌，莴苣体内的茉莉酸途径和乙烯途径标志基因PDF1.2的转录水平显著升高（Chowdhuryetal.,2015）。枯草芽胞杆菌也可以激活烟草细胞防御相关基因的表达增强，激发ISR反应，且ISR反应强调与所产Surfactin水平正相关（Cawoyetal.,2014）。虽然目前尚未鉴定到解淀粉芽胞杆菌激发寄主抗性机制的详细物质和具体机制，但其在与宿主植物相互作用中诱发植物产生抗性，从而限制其他病原菌的生长的观点被广泛接受（刘昆昂等,2017）。一些研究还发现，芽胞杆菌还可以产生挥发性抗菌物质从而介导抑菌效应，枯草芽胞杆菌NCIMB12376中最早就发现能产生挥发性抑菌物质（FiddamanandRossall,1994)。陈奕鹏等(2017)从香蕉中分离了一株B.amyloliquefaciensBEB17，其挥发物对8种真菌的抑制率在34%~68%之间，利用GC-MS技术从中鉴定了一些多达10类的候选挥发物。从棉田分离的甲基营养型芽胞杆菌BacillusmethylotrophicusAL7，其产生的挥发物对棉花黄萎病菌抑制效率可达59.2%（刘海洋等,2018）。张晓云等（2017）对枯17 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析草芽胞杆菌BAB-1菌株抑制番茄灰霉病菌的挥发性物质分析表明，二甲胺、甲酸、丙酸、丙胺和二甲基二硫均有一定的抑制效果。1.3.3解淀粉芽孢杆菌生防的优势和应用多数解淀粉芽胞杆菌主要定殖在根际的周围，少数可以在植物体内内生。不同的菌株在施加根际土壤后，菌株初始都会表现一定数量的降低，随后可以形成稳定的定殖群体发挥作用。利用荧光蛋白标记GFP标记菌株X5-GFP、BQA2-GFP与番茄互作，可以观察到在定殖30天后，番茄根际周围的荧光菌株群体稳定在103CFU/g数量级，体现了解淀粉芽胞杆菌具有较强的适应环境的能力。同时，枯草芽胞和解淀粉芽孢杆菌的生物安全性基本得到认可，美国食品药品管理局（FDA）、欧盟以及我国农业部均将某些种类的芽孢杆菌定位为环境安全菌株。首个完成基因组测序的菌株FZB42（Chenetal.,2007），很早就被德国AbitepGmbH公司以及美国的Taensa公司分别开发为商品化植物促生生长剂以及枯萎病和根腐病的防治药剂，诺维信公司2013年在加拿大将该菌株登记为Taego产品，用来防治小麦赤霉病、番茄晚疫病等（李红晓等,2016）。2014年，SummitAgro公司将另外一个解淀粉芽胞杆菌菌株D747在墨西哥登记为商品Nickel55Double,广泛用于水果和大田作物促生和病害防控；随后，2015年，AndermattVital42公司将另一种广谱抗菌解淀粉芽胞杆菌菌株登记为商品名为RhizoMH71的生物肥料（李红晓等,2016）。我国学者也进展迅速，筛选鉴定了一大批不同来源的解淀粉芽胞杆菌菌株、抗性物质的鉴定、合成调控和施用方案优化。申莉莉等（2010）鉴定Ba33菌株对烟草有较显著的促生作用并且增强抗烟草花叶病毒的作用；张荣胜等（2013）发现Lx-11菌株产脂肽类抑制物质并对水稻细菌性条斑病菌有较强的抑菌作用；罗晶等（2013）鉴定Ba-168菌株对小麦全蚀病有较好预防作用；杨洪凤等（2014）发现CC09菌株在小麦根部定殖并对镰刀菌引起的小麦赤霉病有高达90%以上的预防效果；卢彩鸽等（2014）分离MH71菌株并发现其对甘蓝枯萎病菌和番茄灰霉病菌有很强的抑制作用，抑菌作用主要为脂肽类物质和抗菌蛋白（李红晓等,2016b）；陈奕鹏等(2017)从香蕉中分离的内生菌株BEB17对镰刀菌等8种真菌具有较强的抑菌作用；段海明等（2018）发现gfj-4菌株发酵液对玉米纹枯病菌（R.solani）有82%的抑制效率。总体而言，上述的研究表明，不同的解18 山东农业大学硕士学位论文淀粉芽胞杆菌针对不同的病害存在较好的抑菌效果和防治效果。除了在生防菌分离和抑菌物质鉴定上取得成果之外，在施用方案优化上，也取得较好的进展。张荣胜等（2018）对解淀粉芽孢杆菌Jt84进行了加工剂型的研究，发现其对稻瘟病的防治效率可达79.3%，与常用化学药剂三环唑相当。谷春艳等（2018）发现解淀粉芽胞杆菌WH1G可以和化学药剂咪鲜胺混配，防治草莓炭疽病效果更优。1.4本实验的目的和意义马铃薯是我国第四大粮食作物，已成为农业开发和产业结构调整的优势作物。马铃薯晚疫病由致病疫霉（Phytophthorainfestans(Mont.)deBary）引起，是导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的一种毁灭性病害，位居马铃薯病害之首，平均每年造成马铃薯减产10%~15%，直接经济损失约10亿美元。2018年全国农业技术推广服务中心推出的马铃薯重大病虫害防控技术仍被列为首位防控技术，主要的防控药剂仍是化学药剂。对马铃薯晚疫病生物防治作用的研究比较少，解淀粉芽胞杆菌FZB42菌株和BEB17对同属卵菌番茄晚疫病菌和烟草黑胫病菌均有抑菌作用（陈奕鹏等,2017），崔月贞等（2016）也从高寒草地牧草中分离到三种芽胞杆菌对晚疫病菌存在抑菌效果，有一定的生防潜力，但并没有进行植物上的效果测定。解淀粉芽胞杆菌菌株YTB1407是烟台农科院王英姿研究员团队从西洋参根内分离的内生生防细菌，经测试对苹果轮纹病、葡萄霜霉病等多种植物病害均有明显拮抗作用，并对小麦产量及发芽率有明显促进作用（于晓丽等,2016）。YTB1407能在红薯上定殖，并促进红薯生长和提高其对2种真菌性病害的抗性（王翠娟等,2018）。但菌株YTB1407能否在马铃薯体内定殖、促生以及是否有生防的效果还并不明确，本研究对此进行了分析，为相关菌株在马铃薯生产上的应用提供指导意见。2．材料与方法2.1实验材料菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）菌株YTB1407分离自西洋参19 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析根（烟台农科院王英姿研究员惠赠）；马铃薯晚疫菌株PhytophthorainfestansHLJ1（简称HLJ1）由本实验室分离保存。植物材料：马铃薯（荷兰15）脱毒苗和微型薯由实验室保存。2.2实验方法2.2.1菌株YTB1407的培养解淀粉芽胞杆菌菌株YTB1407在LB平板上划线，挑取单克隆菌落在30℃、200rpm培养8小时，室温离心收集菌体，重悬于无菌水，并在分光光度计上测定OD600值，使用无菌水调整所需浓度，使用前加1滴Tween20。采用塑料喷壶喷施马铃薯盆栽苗叶片，直至充分湿润。2.2.2马铃薯脱毒苗的繁殖和种植在超净工作台中，剪取生长3~4周生长健壮的马铃薯无毒苗的带腋芽的茎段，剪口朝下，插入灭菌的含有约40mL生根培养基（MS）的200mL广口组培瓶中，每瓶植12株茎段，做好标记后放于22℃生长室组培架中，12h光照培养。8cm×8cm口径的塑料培养钵内填充进口营养松针土，充分吸水保持湿润，将培养2周左右的健壮脱毒苗移植钵内，黑暗培养1天。然后转到人工气候室，20℃~23℃下12h光照培养，每2周施一次冲施肥，直至使用。2.2.3马铃薯晚疫病菌株的活化及提高孢子囊生长量按照董冉（2016）描述的方法，将已筛选保存优质的马铃薯晚疫病菌株HLJ1，转接至黑麦培养基（RyeA）中，于提前调好的18℃培养箱中黑暗培养。由于长时间的培养箱培养，使得马铃薯晚疫病的孢子生长量下降。在超净工作台中，用灭菌的镊子刮取培养好的马铃薯晚疫病菌株的菌丝，涂布到培养瓶的感病材料Desiree无菌脱毒苗的叶片及茎上，放于18℃培养箱中培养一段时间至菌丝成功侵染苗子，将被侵染的茎段或叶片放在黑麦培养基中，18℃培养箱中黑暗条件下再度培养，以提纯菌株致病力，强化菌丝孢子囊的生长量。20 山东农业大学硕士学位论文2.2.4HLJ1孢子悬浮液制备参照实验室董冉（2016）的方法制备HLJ1菌株的孢子悬浮液。取活化好的马铃薯晚疫病HLJ1菌株，在RyeA培养基上生长10天左右时，选取3平皿无污染的培养菌株，分别加入10mL的灭菌ddH2O，并用涂布器刮取菌丝以辅助释放孢子囊。将无菌水转移到直径9cm无菌一次性塑料培养皿，然后放于冰上孵育2~2.5h，促使孢子囊破裂并释放游动孢子。将游动孢子转移至50mL的离心管中，离心机内设置转速2500rpm，低速离心10min后，弃掉上清液，保留200μl管底液并重悬沉淀，加ddH20定容至2ml，混匀后平均分装到3个离心管。按照1：10的比例，用无菌水稀释10μl的孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板计数，调节孢子悬浮液的浓度在3~6×105个/mL之间，备用接种。2.2.5马铃薯晚疫病病情统计参照李金徽等(2018)方法，采用离体叶片接种法接种晚疫病菌菌株HLJ1。在25×25cm的方形培养皿内铺上裁剪尺寸相同的滤纸，无菌水充分浸润，选取生长状况相似的各处理植株完全展开叶10片，放置在滤纸上，叶背面朝上。每片叶延中脉两侧各接种一个点，每滴接种上述孢子悬浮液各20μl，保持湿度90%以上，空间温度18℃，光照16h/黑暗8h交替培养3~5d观察并统计叶片发病情况。根据发病情况我们将叶片发病面积分为五级进行统计计数：完全不发病为0级；发病面积小于等于25%为1级；发病面积大于25%，小于等于75%为2级；发病面积大于75%，小于等于100%为3级；水渍溃烂严重者为4级。根据公式[病情指数=100×∑（各级病叶数×各级代表值）/(调查总叶数×最高级代表值)]计算病情指数。2.2.6解淀粉芽孢杆菌YTB1407对晚疫病的抑菌效果选取18℃黑暗预培养5~8天的马铃薯晚疫病菌和培养12h的解淀粉芽孢杆菌，用直径7mm的打孔器打取菌落边缘菌块，在直径90mm的黑麦培养基上对称放置马铃薯晚疫病菌株菌块和解淀粉芽孢杆菌菌株菌块，间距30mm。进而以接种马铃薯晚疫病菌菌块和黑麦培养基块作为对照实验，共两个处理，每次5皿重复，进行两次实验。21 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析18℃黑暗培养8d后分别测量两菌块中心间距以及菌落对侧菌块中心到菌落边缘的距离（r）。依据相关公式分别计算菌株的抑制百分率，公式如下：菌落增长半径（mm）=菌块中心间距（mm）-菌落对侧菌块中心到菌落边缘距离（r）（mm）。抑制率（%）=[对照组中菌落增长半径（mm）-对峙组中菌落增长半径（mm）]/对照组中菌落增长半径（mm）×100。2.2.7YTB1407生长曲线绘制每次从不同时间点处理的三个独立单株上用打孔器取2.355cm2叶片，用75%乙醇表面消毒1min，无菌水漂洗三次后置于1.5mL离心管中充分研磨至匀浆，将匀浆进行10倍系列梯度稀释后根据预试验经验选择4个连续梯度在LA培养基进行菌落计数，每个梯度在三个培养基中各设三个重复，经28℃培养16h后进行菌落计数，以每组叶片上菌落数的Log值进行统计分析并绘制生长曲线。2.2.8马铃薯叶片内超氧化物歧化酶活性染色基蓝四氮吟(nitrobluetetrazolium,NBT)作为底物，参照文献说明检测叶片中超氧化物歧化酶的含量(Jabsetal.,1996;Thordal-Christensenetal.,1997)。剪取各处理长势相似马铃薯叶片立即用1%叠氮化钠溶液浸泡抽真空30min，于沸腾的95%乙醇中脱色15min。转入NBT（1mg/ml）溶液中抽真空30min，再用95%乙醇脱色观察。2.2.9马铃薯光合特性的测定参照仪器说明应用LI-6400XT便携式光合作用测量系统(Li-Cor,USA)，对各处理单株生长点以下第三、四、五完全展开叶的光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（C2）及蒸腾速率（Tr）等光合特性进行测定。测量过程以液态CO2钢瓶为气源，以LED红/蓝（6400-02B）为稳定光源，光合有效辐射强度设为800μmol/m2s，叶室温度25℃，气流速度500nm/s，测定时间为9:30-11.30。22 山东农业大学硕士学位论文2.2.10马铃薯叶片光合色素含量的测定采用分光光度法，在各处理单株生长点以下第三片伸展完全的展开叶中各选取0.1g叶片作为样品，随后加入20ml96%乙醇，并置于黑暗处处理40h后取浸提液，于665,649,470nm处利用分光光度计比色，并使用Ca=13.95D665-6.68D649，Cb=24.96D649-7.32D665，C×c=(1000D470-2.05Ca-114.8Cb)/245三个公式计算光合色素含量。2.2.11基因组DNA的提取取一小片叶片置于研钵中，取700μl1.5倍的CTAB抽提液加入其中，研磨至匀浆。匀浆转入1.5ml离心管，置于65℃水浴30min，每隔5min摇匀一次。迅速添加700μl的氯仿/异戊醇(24:1)，注意盖好盖子，轻摇离心管30min。在室温条件下，调节离心机至10000转/min，离心10min，离心后用移液器小心吸取上清液转入一个新的1.5ml离心管。提前冷冻无水乙醇，添加两倍体积的无水乙醇置于－20℃冰箱静置1h。在室温条件下，10000rpm离心10min，离心后弃上清。加1ml的75%乙醇放置2min，弃上清，离心管置于室温风干。小心添加100ul的双蒸水至膜上溶解沉淀，完成DNA提取。用紫外光谱法对提取的DNA样品进行浓度测定，一般浓度在100ng-200ng之间即可用于实验。2.2.12RNA的提取样品经液氮速冻处理后利用E.Z.N.APlantRNAKit试剂盒(OMEGABio-tek,USA)按照试剂盒说明书提取RNA。取用液氮充分研磨的叶片组织100mg，立即加入添加β-巯基乙醇的500μlRCLBuffer，涡旋振荡混匀并于55℃孵育1-3min；10000×g离心5min后转移上清液至gDNA过滤柱离心过滤；去过滤液与1倍体积RCBBuffer涡旋振荡混匀后转移至RNA吸附柱12000×g离心1min；分别利用400μlRWFWashBuffer，500μlRNAWashBuffer洗涤吸附柱去除杂质；晾干吸附柱后加入50-100μlDEPC水洗脱RNA，在NANODrop1000上测定RNA浓度和A260/A280比值。23 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析2.2.13第一链cDNA合成和定量RT-PCRRNA反转录利用试剂盒ReverTraAceqPCRRTMasterMixwithgDNARemover（TOYOBO,Japan）进行1stcDNA合成。1μgRNA在65℃变性5min；加入2μl的4×DNMasterMix(已添加gDNARemover,DNaseI)，用Nuclease-free水补足到8μl，轻弹试管底部混匀并离心，在37°C条件下温育5min消化在提取过程中可能残留的基因组DNA。冰上冷却后加入2μl的5×RTMasterMixII混匀离心后在PCR仪上运行如下程序：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min；4℃，hold。完成1stcDNA合成，加入40μlNuclease-free水稀释模板。表1本研究所用引物序列Table1Primersusedinthisstudy引物名称基因序列号引物序列（5’→3’）NamesAccessionNumberSequenceofPrimer(5’to3’)StEF-FGGTCTACCAACCTCGACTGGTACStEF-RGGGTTTGTCTGATGGCCTCTTGGStChtA-FU49970.1TTCTGGATGACAGCACAGGATAAStChtA-RGGCGTCCATTGCCCAATStPAL2-FX63104GGTCACTGCCTCGGGTGATStPAL2-RCCTGCCAGTGAGCAAACCAStLOX-FY18548.1CAGATCAGGCCCCGTTAATGStLOX-RCCTGTAAGTCCACCTTCACTTGTTGStPR2-FU01902.1GTGAAGCTGGTTTGGGGAAATGStPR2-RTTGCCAATCAACGTCATGTCTAC取2μl作为DNA模板，采用KODSYBR®qPCRMix(QKD-201,TOYOBO,Japan)进行定量PCR分析。反应总体系为20μl：2μl稀释反转录产物，10μlKOD®qPCRMix，0.5μlForwardPrimer(10μm)，0.5μlReversePrimer(10μm)，7μl去离子水。PCR反应在qTOWER3G仪器（Analytikjena,Germany）进行，反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸30s，进行40个循环；融解曲线根据仪器固定分析，反应程序为：95℃15，60℃1min，95℃15s，60℃15s。以内参基因StEF为对照，采用2—△△Ct的方法计算其相对表达量。所用定量引物序列见表1，引物均在上海生工生物科技有限公司合成。24 山东农业大学硕士学位论文3．结果与分析3.1内生解淀粉芽胞杆菌在马铃薯上的定殖3.1.1YTB1407能在马铃薯体内定殖解淀粉芽胞杆菌菌株YTB1407据报道能在果树等多种植物上内生并具有对真菌性病害的抵抗作用（于晓丽等,2016）。为调查YTB1407对马铃薯晚疫病的防治效果，围绕YTB1407能否在马铃薯上内生定殖，以及最适喷施浓度开展了研究。利用打孔法采集马铃薯叶片，以梯度稀释法涂布LB平板进行YTB1407菌落数量统计，如图1所示。在喷施0.5h时，YTB1407在马铃薯内可检测到的数量与接种浓度呈正相关；4d时，0.01OD及以上浓度定殖细菌数量相比较0.5d均呈现减少趋势，在4-7d的过程中，0.01OD喷施量内生细菌数量呈现上升趋势，为参比浓度中最佳状态，其他高浓度喷施量内生细菌数量则呈继续减少趋势；14d时，包括0.01OD喷施量在内，其他高浓度喷施后内生细菌数量进一步减少。多次重复实验呈现相似趋势，说明针对YTB1407和马铃薯（荷兰15)的互作而言，YTB1407能在马铃薯上形成一定量的内生，0.01OD喷施接种在所测定的几种浓度中为最适喷施浓度，并可用于后续的测试中（图1）。图1不同喷施浓度下YTB1407在马铃薯植株的内寄生的菌量变化Fig.1EffectofYTB1407ontheamountofendophytobioticsinpotatoplantswithsprayingdaysatdifferentsprayingconcentrations.25 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析3.1.2内生解淀粉芽孢杆菌在非喷施部位的定殖由于喷施过程中虽然主要位于叶片部位，但还是有少量可以接触茎和土壤，为调查该菌株在马铃薯不同部位的定殖情况。基于3.1.1实验的结果，在接下来的两次重复实验中，依据最佳喷施浓度OD600=0.01，采用平板稀释法检测新出叶、茎（上部和下部分开）、根中的菌含量。如图2所示，在第8d时，根茎叶中菌含量达到最大，并且0-8d内菌含量分布呈现为：根中>茎中>叶中。图2YTB1407在马铃薯非喷施部位的定殖.Fig.2YTB1407colonizationinpotatonon-sprayingsites.3.2内生解淀粉芽孢杆菌对马铃薯促生作用的调查结果3.2.1YTB1407促进马铃薯的生长解淀粉芽孢杆菌是一类植物根围促生细菌，Idriss等发现具有肌醇六磷酸酶活性的FZB45能在缺磷的环境下刺激植物生长（Idrissetal.,2002）。为调查YTB1407能否促进马铃薯生长，我们选取组织培养3周，移栽培养2周，长势基本相同的盆栽马铃薯苗作为实验材料，于叶面喷施OD600为0.01的YTB1407悬3浮液两周后进行调查，发现处理组植株与清水处理对照相比平均鲜重提高0.62倍，平均根鲜重提高1.53倍，鲜重根冠比降低35.73%（图3D），植株叶色更加浓绿，叶片展开程度更高，根系生长更加繁茂健壮且小薯块发生时间提前（图3A、C）。我们尝试对温室内结薯期马铃薯进行叶面喷施实验，发现YTB1407悬浮液对马铃薯并无明显促进生长的作用（图3B）。我们将为OD600=0.01的菌悬液以15mL/棵的量在生长前期的马铃薯根周2cm均匀环绕灌根，26 山东农业大学硕士学位论文出乎我们意料的是灌根处理后不仅没有与叶面喷施一致的促生效果反而使得植株生长延迟，叶片无法伸展，根系生长不发达，鲜重降低（图3-A，C，D）。结果表明YTB1407能促进马铃薯生长早期叶冠早发快长且能降低马铃薯生长后期根冠比从而促进光合产物向地下部分的运输和积累。另外我们发现灌根方法与对照相比会抑制马铃薯生长，灌根方法是通过植物的根系吸收，经过维管束输送到植株各部位，与对照相比灌根方法利用率低、作用期长，马铃薯生长前期没有及时发挥作用促进茎叶生长，在生长后期需要光合产物向根部转移的阶段却开始发挥效用，打乱马铃薯生长节奏。同时我们发现在马铃薯生长后期叶面蜡纸叶片角质层厚度增加、蜡质晶体增多、叶片气孔和非腺毛的密度增加，叶面喷施的YTB1407受到的物理阻隔作用较强不利于定殖。因此在马铃薯生长前期通过叶面喷施方法施加YTB1407菌悬液为最适合马铃薯的施用方法。27 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析3C图3在马铃薯生长前期进行叶面喷施YTB1407可以促进马铃薯生长dA:叶面喷施YTB1407促进马铃薯生长，灌根抑制生长B：YTB1407对成薯期马铃薯生长无明显促进作用potatoP≤0.0026rootP≤0.0153C:叶面喷施YTB407促进马铃薯根系生长，灌根抑制生长D:叶面喷施YTB1407增加马铃薯生物量，灌根抑制Fig.3YTB1407promotesthegrowthofpotatoA:IrrigationmethodappliedYTB1407toinhibitpotatogrowth.B:SprayingYTB1407promotespotatogrowth.C:SprayingYTB1407makesforlushwhiterootsystemsofpotato.D:SprayingYTB1407increasethefreshweightofpotatoes(p≤0.01)andtheirroots(P≤0.01).3.2.2YTB1407能改良马铃薯光合特性取YTB1407、水叶面喷施处理两周马铃薯各四株分别测量叶片数，各叶层叶片大小（以主茎长代替），叶片光合色素含量以及光合速率。结果发现YTB1407处理组叶片平均光合速率高出对照组31%，叶绿素a、叶绿素b和叶绿素c含量分别高出对照组19.49%、16.10%及12%。处理组上中下三叶层平均主叶脉长度分别高出对照组21.98%、13.95%及35.55%，叶片数增加17.61%（表2）。由此，我们发现叶面喷施YTB1407可以通过增加叶片数目、增大叶面积和改良叶层结构扩大光合面积；提高叶片叶绿素含量挖掘光合能力从而提高马铃薯光合速率，促进马铃薯光合产物合成积累；提前结薯，推动源库流流畅运转，反馈促进光合作用。暗示YTB1407促生作用的实现与马铃薯光合特性的改良是相关的。28 山东农业大学硕士学位论文表2马铃薯光合特性测定结果Table2YTB1407promotesthephotosynthesisofpotato3.3内生解淀粉芽胞杆菌对晚疫的抗病效果的调查3.3.1解淀粉芽孢杆菌YTB1407对马铃薯晚疫病菌菌丝生长具有拮抗作用在甘薯上的研究表明，解淀粉芽孢杆菌YTB1407相较于根系内生菌具有更强的促生效应和生防能力（王翠娟等,未发表数据）。取18℃预培养8天的马铃薯晚疫病菌和培养3天的解淀粉芽孢杆菌YTB1407，用直径7mm的打孔器打取菌落边缘菌块，在直径9cm黑麦培养基平板上，将马铃薯晚疫病菌和解淀粉芽孢杆菌菌块对称放置，使得两菌块相距30mm（方羽生等,2011）。以黑麦培养基块代替解淀粉芽孢杆菌YTB1407作为对照，设置每个处理三次重复试验，其他条件相同，设置两组平行重复实验如图4，观察对峙实验结果，均出现明显的抑菌区域，测量结果并求得平均值，最终抑菌率为54.1%。初步证明，YTB1407对马铃薯晚疫病菌具有一定的抑制作用。图4YTB1407对马铃薯晚疫病的抑制作用Fig.4TheinhibitionofPhytophthorainfestansHLJ1withYTB140729 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析3.3.2YTB1407促进马铃薯感晚疫病为调查喷施内生解淀粉芽胞杆菌对马铃薯抗病性的影响，以叶面喷施YTB1407悬浮液一周马铃薯为处理组，以叶面喷施清水一周马铃薯为对照组。每组各取生长状况相似植株的倒数第三片完全展开叶20片，背面朝上置于湿润双层滤纸，每侧接种两滴HLJ1孢子悬浮液（20uL/滴）并保持湿度90%以上，光照时间16h，黑暗时间8h交替培养，温度设置18℃培养3d至发病后统计接种结果。喷施YTB1407后叶面水渍状病斑面积明显变大，叶片水烂速度更快，晚疫病情明显加重。按照侵染面积划分病情等级统计分析，叶面喷施YTB1407后病情指数为72.22，对照组病情指数为57.77(p<0.01)，与发病表型结果一致。前后3批的实验数据虽然病情指数不同，但处理组发病高于对照组的趋势相同，证实YTB1407在马铃薯活体环境下会加重马铃薯晚疫病情。图5YTB1407喷施促进马铃薯晚疫病的发生A,感病表型(左边预喷施YTB1407，右边为喷施水对照）；B,病情指数Fig.5Promotingthediseaseoflateblightbypre-sprayingtheYTB1407.ADiseaseSymptom(left,Pre-sprayingtheYTB1407;right,mock);BDiseaseindex.3.3.3提前喷施YTB1407促使马铃薯抑制ROS信号促进感晚疫病植物对于病原物的响应需要一系列信号的转导来协调转录表达谱到生理反应整个过程。其中活性氧簇ROS信号体系最为活跃，且参与控制植物生长发育、生理应激等过程（Mittleretal.,2011），马铃薯受到晚疫病原胁迫也能发生氧爆破，产生ROS信号介导抗病反应。本实验以叶面喷施YTB1407悬浮液一周马铃薯为处理组，以叶面喷施清水一周马铃薯为对照组。分别在未接种、喷施接种HLJ1孢子悬浮液瞬时、接种1天30 山东农业大学硕士学位论文三个时间点进行取样。每组各取生长状况相似健康展开叶5片进行离体NBT染色。如图6所示，对照组叶片ROS信号随着晚疫侵染上调表达，表明中抗马铃薯荷兰15的叶片在晚疫入侵时能激活ROS信号介导的基础抗性。处理组仅在接种瞬时有信号出现，接种一天ROS信号基本消失。本实验证明YTB1407在马铃薯体内环境下会钝化ROS信号，影响马铃薯在晚疫侵染初期的抗病应激反应，从而加重马铃薯晚疫病情。同时我们利用DAB染色监测马铃薯叶片内过氧化物酶活性，因马铃薯（荷兰15）叶片本底水平过高，未检测到YTB1407对相关信号有明显抑制作用。但本结果可以部分暗示YTB1407能部分屏蔽马铃薯ROS信号，解淀粉芽孢杆菌YTB1407能增强马铃薯对晚疫病的感病程度。ABCCKCKCabcYTB140YTYBT1B4104707efg图6预喷施YTB1407干扰马铃薯响应晚疫病菌的ROS信号a喷施清水7天的叶片;b接种HLJ1当天的叶片;c接种HLJ1后1天的叶片.e喷施YTB1407菌株7天的叶片;f接种HLJ1当天的叶片;g接种HLJ1后1天的叶片.Fig.6Pre-sprayingofYTB1407interferestheROSburstinducedbyPhytophthorainfestansHLJ1ThepotatoleaveswerestainedwithNBTin7d(a);inoculatingHLJ1(b)andonedayafterinoculation(c).ThepotatoleaveswerestainedwithNBTwhenYTB1407succeedsincolonizingfor7d(e);inoculatingHLJ1(f)andonedayafterinoculation(g).3.3.4YTB1407抑制马铃薯抗病相关基因的表达解淀粉芽胞杆菌通常可以通过系统诱导抗性（ISR）帮助植物提高对另外的病原微生物介导的抗性，其信号途径主要依赖茉莉酸(JA)和乙烯（ET）途径（刘昆昂等,2017），而植物自身抗性系统获得性抗性(SAR)则需要水杨酸（SA）介导。SA和JA均能参与晚31 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析疫病原致病疫霉（Phytophthorainfestans）的PAMPS介导的抗病信号途径(Haasetal,2009)。马铃薯在受到晚疫入侵时会激发上述激素网络进行信号传递交流从而诱导抗病反应发生，近来也有证据表明，病原菌能劫持寄主植物的生长素代谢，积累生长素偶联物，进而促进病原物的侵染(Goetal,2012)。图7预喷施YTB1407抑制马铃薯水杨酸信号抗病相关基因的表达AChatA基因的定量；BPAL-2基因的定量；CLOX基因的定量；DPR2基因的定量.Fig.7Pre-sprayingYTB1407suppressedtheexpressionofpathogenesis-relatedgeneassociatedwithSAsignalingpathwayinpotato.A:therelativequantitativeexpressionofChtA;B:therelativequantitativeexpressionofPAL-2;C:therelativequantitativeexpressionofLOX;D:therelativequantitativeexpressionofPR2.我们观察到预处理YTB1407与之前的增强植物抗病效果不同，其对晚疫病菌具有一定的抑菌性，但喷施后反而更加敏感，暗示其可能对马铃薯的免疫系统形成了反向的影响。我们以水处理为对照，在YTB1407接种前、接种瞬时、接种1天、接种2天四个时间点取样，针对在晚疫入侵时显著上调的抗病相关基因进行了表达分析。包括SA信号相关的ChtA、PAL-2和PR2，JA合成相关的Lox等马铃薯抗病相关基因进行实时32 山东农业大学硕士学位论文荧光定量分析。发现预喷施YTB1407能显著的抑制SA信号途径相关基因的表达（图7），在对照水处理组中，ChtA、PAL-2和PR2在接种晚疫病菌后能显著受到上调表达，然后进入2天后呈下降趋势，与之前的报道相符；而在预喷施YTB1407菌株组中，3个基因受晚疫病菌诱导能力显著降低，表达受到了明显的抑制（图7A,B和D）。相比较而言，LOX基因的表达受到的影响较小（图7C）。3.3.5YTB1407菌株内生定殖受晚疫侵染过程的影响我们观察到预处理YTB1407马铃薯在接种HLJ1后病斑面积变大，更加感病。相关感病的表型是马铃薯晚疫病菌株单独繁殖的结果，还是同时影响到YTB1407从内生菌向致病菌的转变？为回答该问题，我们调查了在晚疫病侵染过程中YTB1407在叶片内的数量变化。取叶面喷施YTB1407一周后生长状况相似马铃薯单株数株，以清水为对照喷施适量HLJ1孢子悬浮液。选取喷施瞬时、喷施一天、喷施两天、喷施三天四个时间点取样，按照前面描述的平板稀释法统计了不同时间点的细菌数量。如图8，与对照不接种晚疫病菌的YTB1407定殖材料相比，接种晚疫病菌组叶片中YTB1407菌落数目随着侵染时间延长呈现递减趋势，说明在发病过程中，YTB1407菌株自身并没有大量增殖，演化成为致病菌直接参与致病性，而是通过前期调控马铃薯的免疫信号，为晚疫病的侵染提供了帮助。图8YTB1407菌株在马铃薯接种HLJ1后的定殖分析Fig.8AnalysisofthecolonizationofYTB1407postinoculatedtheHLJ1onpotato33 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析4.讨论4.1内生解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上定殖解淀粉芽胞杆菌广泛分布于环境中，经常可以被分离和检测到，但对植物而言，分为根际和内生两类，前人的研究表明，不同寄主植物对不同解淀粉芽胞杆菌菌株的亲和力不同，在根际形成不同的定殖群体，影响抗病防治效果（薛松等,2017）。以菌株FZB42开发出来的产品Taego，存在一定的宿主范围，主要用来防治小麦赤霉病、番茄晚疫病等（李红晓等,2016）。对内生芽胞杆菌的生物防治效果研究的比较少，多数还停留在菌株分离和抑菌物质鉴定的层面。谢兰芬（2016）等研究发现解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2在玉米叶际可以进行有效定殖，证明此菌株能较好的适应玉米叶际的微生态环境，成为有效防治玉米叶斑病的重要原因之一。我们实验室在VA菌根的研究中就发现，生物防治玉米纹枯病和棉花黄萎病与品种和菌根真菌间的共生效率相关（张霞，2016；Zhangetal.,2018）。从西洋参中分离得到的解淀粉芽孢杆菌YTB1407虽然在抑菌实验中表现出较好的效果，但作为内生细菌，其定殖寄主范围的大小对其生产开发利用潜力的相关分析也非常重要。因此，先后开展了在果树、小麦、甘薯和马铃薯等不同物种上的调查。本研究揭示该菌株能在马铃薯品种荷兰15（山东省栽培面积最广的马铃薯品种）上稳定的定殖（图1，图2），结合同期亓超（2015）、王翠娟（2018）在果树、小麦和甘薯上的研究发现，该菌株寄主范围可能非常广泛。同时，对于施用策略的研究，前人多将解淀粉芽胞杆菌通过灌根的方法施用，展现出对土传性病害良好的生物防治效果（杨洪凤等,2014）。烟台农科院发现，将YTB1407菌株分别以灌根法和喷施法施加在小麦和甘薯上，结果灌根处理促生效果优于喷施处理效果（亓超,2015；王翠娟等,2018）。并且本研究发现在马铃薯上灌根处理反而抑制植物的生长（图3），暗示对于菌株的利用，不同物种植物应该采用针对性的施用方法。另外，我们的实验也发现，对于内生解淀粉芽胞杆菌YTB1407，在马铃薯内定殖的效率与喷施浓度并没有相关性，同时我们发现OD600值为0.01时，7天后能达到最大定殖量，成为优选的方案。我们观察到，喷施高浓度的处理在12h的时候能检测到比较高的定殖量，随后下降。我们推测，这可能与解淀粉芽胞杆菌通过气孔进入细胞内有关，34 山东农业大学硕士学位论文高浓度的菌促进了短时间内菌在气孔的积累，逃避了体表杀菌的处理而存活下来，尚未在叶片中形成稳定的定殖。4.2内生解淀粉芽孢杆菌YTB1407对马铃薯的促生作用B.amyloliquefaciens的研究比较深刻，是芽孢杆菌属中研究相对较多的种，其革兰氏染色呈阳性，具有明显的生防效果，在生防菌界其作用仅次于枯草芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌在自然界中的分布十分广泛，因其具有丰富的自身代谢产物，可以分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽类物质等，生物防治效果良好而得名。目前，解淀粉芽孢杆菌主要应用于蔬菜保鲜、工业酶生产及环境保护等众多领域。因此，研究解淀粉芽孢杆菌对抑制果蔬上病原菌机理、分离鉴定其抑菌物质具有十分重要的意义。相关研究发现解淀粉芽孢杆菌Bass对烟草具有促生作用，同时对TMV具有抑制作用（申莉莉等，2010）。本实验发现叶面喷施YTB1407菌悬液处理的马铃薯植株，其叶片鲜重和根系鲜重明显增加。说明解淀粉芽孢杆菌YTB1407是一种可以在马铃薯中定殖的内生菌，它可以促进马铃薯生长但是会加重晚疫病病情。我们发现它可以使植物叶片数、叶面积、叶层分布、叶绿素含量等光合相关参数趋向合理化，同时也会从抗病相关各激素信号响应通路抑制多个马铃薯抗病相关基因的表达过程。虽然YTB1407在马铃薯生产中的感病表型使它在马铃薯产业上有应用的风险，但根据马铃薯产业的需求特点，我们可以建议在马铃薯微型薯生产及科研实验过程中尝试使用该菌。该环节封闭运行，晚疫病发生的风险较小，且对苗期促生的需求较高，所以该菌株有望得到更好的应用，在无菌环境中既可以缩短马铃薯生长周期促进结薯，又可以在无菌环境中将YTB1407的短处回避。4.3内生解淀粉芽胞杆菌YTB1407对晚疫病的抗病效果随着科学技术不断发展进步，保护人类生态环境减少化学农药对环境的污染已经成为国内外植物保护科学工作者研究课题的重中之重。目前，如何充分发挥生物防治优势，使之在农业生产中发挥更大的作用是我们亟待解决的问题。随着人们对芽孢杆菌抗菌，抑线虫和杀虫作用的深入研究，芽孢杆菌在生物防治中的地位越来越不容忽视。国内35 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析在相关的菌株分离中已经开始关注解淀粉芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌防治马铃薯晚疫病的问题（崔月贞等,2016）。然而，本研究的新颖之处在于YTB1407与植物病理学对内生菌研究的主流认识相左，在促进植物生长过程中反而会降低植物对病原微生物的抗性，为此类研究提供新的探索方向。YTB1407在果树、甘薯中都表现促生且抗病，因此内生菌的开发利用要逐项地，具体地分析。前期平板对峙实验中YTB1407对晚疫病具有抑菌效果，但在马铃薯体内实验中HLJ1反而居于优势地位，因此在不同的病原菌与植物互作系统中应特殊情况个别分析，不能一概而论。本研究发现在平板对峙实验和活体实验，其结果恰恰相反，这说明平板实验与活体实验不可一概而论。根据目前针对解淀粉芽孢杆菌功能基因的研究层次，发现其在酵母表达系统中的研究有待提高，就此限制了其作为生防菌的工业化生产进程。随着工业上对分子研究技术需求的不断提高，解淀粉芽孢杆菌的基因功能应该更多地被了解，以增加其应用的可行性。4.4下一步研究计划YTB1407促进植物生长与增强植物抗病的过程在马铃薯中的表现是拮抗的，这种对立的模型也十分有趣，同时大部分抗病相关信号的表达都被削弱，我们怀疑植物将大部分精力放到快速生长，IAA等植物生长相关激素的表达，所有物质能量被集中调配，当病原菌入侵时抗病路经相关信号无法及时应激从而导致病情加重。通过对菌株改良施加诱变育种、原生质融合及基因工程转化的技术，可增强其竞争能力，抑菌能力，拓展其防治范围。例如添加生防和化保相结合的低毒的化学农药、植物源或其他增效因子（如壳聚糖、氯化钙、水杨酸、碳酸氢钠等），培育抗病工程植物，将芽孢杆菌的抗性基因转入植物体内，选育抗性转基因植物，经过多代选择后，即可获得稳定的抗病和抗虫植物。有效克服芽孢杆菌的作用效果迟缓、不稳定、残效期短等缺点，实现优势互补、减少用量、仿效增强的目的，作为今后研究的一个重要发展方向，其潜在的应用前景值得拭目以待。36 山东农业大学硕士学位论文5.结论为了解内生解淀粉芽孢杆菌菌株YTB1407在马铃薯促生和晚疫病防治上的应用潜力，本研究通过叶面喷施法，调查了其在荷兰15上的定殖、促生以及对晚疫病菌的抗性。得到如下几点结论：1.内生解淀粉芽孢杆菌菌株YTB1407可以在马铃薯叶、茎和根中稳定定殖，OD600=0.01的喷施浓度是最优选择。2.喷施YTB1407可以改善马铃薯（荷兰15）的叶层结构，显著增加叶片数、叶面积、叶绿素含量、光合速率等光合相关特性，从而促进马铃薯的生长，在促生上有一定的应用潜力。3.提前喷施解淀粉芽孢杆菌YTB1407菌株不仅不能提高马铃薯对晚疫病的抗性，反而会加重晚疫病病情。我们推测这可能是因为在YTB1407的定殖过程中帮助晚疫病菌更好的抑制了马铃薯基础免疫抗性。4.解淀粉芽孢杆菌YTB1407可能是通过抑制马铃薯SA信号途径来帮助提高晚疫病菌早期的活体营养时期的侵染。37 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析主要参考文献白生才,杜希东,李军.BGA土壤激活剂在民勤干旱沙区梭梭上的应用试验研究初报[J].甘肃科技,2011,27(3):136-137.蔡兴奎,谢从华.中国马铃薯发展历史、育种现状及发展建议[J].长江蔬菜,2106,12:30-33.陈爱昌,魏周全,孙兴明,王文慧.不同药剂组合对马铃薯晚疫病的防治效果分析[J].中国马铃薯,2015,29(6):365-367.陈沧桑,李跃建,蒋馨.以国际合作为重要抓手,促进农业科技事业发展[J].农业科技管理,2014,33(4):36-40.陈亚兰,张健.不同杀菌剂对马铃薯晚疫病的防治效果[J].中国马铃薯,2017,31(6):359-363.陈奕鹏,杨扬,桑建伟,蔡吉苗,徐春华,黄贵修.拮抗内生芽胞杆菌BEB17分离鉴定及其挥发性物质抑菌活性分析[J].植物病理学报,2017,20(3):10-13.丁新华.水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定[D].华中农业大学,2008.段海明,余利,申仕惠,黄伟东,余海兵.玉米纹枯病菌Rhizoctoniasolani拮抗菌gfj-4的鉴定及其发酵上清液抑菌特性[J].浙江农业学报,2018,30(1):106-116.樊晓迪,何蒲明.马铃薯主粮化的必要性和可行性研究[J].农业经济,2016(3):12-14.冯延江.马铃薯晚疫病及其综合防治[J].中国马铃薯,2002,16(5):302-303.弓贵明,姬青云.马铃薯晚疫病的危害、发病条件和防治措施[J].种子科技,2012,30(1):46-48.谷春艳,苏贤岩,杨雪,臧昊昱,陈雨,王学峰.解淀粉芽胞杆菌WH1G与咪鲜胺协同防治草莓炭疽病[J].植物保护,2018,44(2):184-189.郭素敏,张哲.马铃薯晚疫病的综合治理[J].现代农业,2010(10):32-33.郝卫宁，李辉，胡美英，等.柑橘绿霉病拮抗细菌的筛选、鉴定及其抑制效果[J].中国生物防治学报,2011,27(2).胡忠亮,郑催云,田兴一,李警保,樊奔,韩正敏.解淀粉芽孢杆菌在环境保护和农业生产中的应用[J].现代农药,2016,55(04):241-245.38 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山东农业大学硕士学位论文附录附录I实验所用培养基、缓冲液配方LB液体培养基:在dH2O中加入10g氯化钠，5g酵母提取物（Yeastextract），10g胰蛋白胨（Tryptone）溶解后，定容至1000mL，PH值调为7.0。分装每500mL锥形瓶中加250mL，封口后，高压蒸汽灭菌20min，保存备用。LA固体培养基：在1L的LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉。MSmax母液(10×)：在dH2O中加入16.5g的NH4NO3，19.0g的KNO3；1.7g的KH2PO4，3.7g的MgSO4∙7H2O以及4.4g的CaCl2∙2H2O或CaCl23.32g混合均匀，在每一种固体粉末充分溶解后再加入下一种固体粉末，然后加蒸馏水定容至1000mL。MSmin母液(100×)：在dH2O中加入0.083g的KI，0.62g的H3BO3，2.23g的MnSO4∙4H2O或MnSO4∙H2O1.69g，0.86g的ZnSO4∙7H2O，0.025g的Na2MoO4∙2H2O，0.0025g的CuSO4∙5H2O以及0.0025g的CoCl2∙6H2O。需要注意的是，Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。然后加入蒸馏水定容至1000mL。Fe2+-EDTA(100×)：在一个烧杯中加入300ml的dH2O以及2.78g的FeSO4∙7H2O充分溶解，于另外一个烧杯中，加入300ml的dH2O加热至70℃后，加入Na2EDTA∙2H2O3.73g充分溶解，然后将二者混合均匀，70℃条件下保温2hr，然后加蒸馏水定容到1L，并于4℃冰箱中保存。维生素(100×)：向dH2O中加入0.1g的Nicotinicacid，0.1g的PyridoxineHCl(VB6)，0.1g的ThiamineHCl(VB1)，0.2g的Glycine以及10gInositol，充分溶解后，加入蒸馏水定容至1000mL，置于4℃条件下保存备用。MS培养基：将MS大量元素、MS微量元素、维生素、铁盐混合，用HCL和NaOH调节PH=5.7-5.8，并加入琼脂8g/L。生根培养基：MS培养基中加入500mg/L的cefotaxime，25mg/L的kanamycin，琼脂粉8g/L，调节pH为5.7-5.8。黑麦培养基：取黑麦种子60g，用蒸馏水覆盖，黑暗中浸泡一天后，使其发芽，用豆浆机打碎，放于68℃条件下水浴加热，时常搅拌，1h后过滤滤掉残渣，加蒸馏水定容至1000mL后，加入20g蔗糖以及15g琼脂粉溶解，分装并封口，经过高温蒸汽灭菌后置于常温备用。47 解淀粉芽孢杆菌YTB1407在马铃薯上的定殖和晚疫病致病性的分析附录II常用化学试剂、所属公司常用化学试剂所属公司琼脂糖（Agarose）SIGMA焦碳酸二乙酯（DEPC）SIGMANBT（Nitrotetrazoliumbluechloride）附录III实验室常用仪器及所属公司常用仪器所属公司台式mini离心机基因有限公司台式离心机SIGM台式高速离心机德国Sartorius斡旋震荡仪基因有限公司多重控温PCR仪基因有限公司普通PCR仪基因有限公司凝胶成像系统GE分光光度计美国Thermo人工气候培养箱宁波江南仪器厂-80℃冰箱Jouan平板电泳槽及电泳仪北京六一仪器厂恒温振荡培养箱HZQ-F160A型宁波仪器厂光照培养箱宁波仪器厂磁力搅拌器国华电器电子天平梅特勒托利多仪器有限公司显微镜Leica制冰机SIM公司48 山东农业大学硕士学位论文致谢研究生的学习光阴转瞬即逝，研究生生活给予我更多的是磨练、成长和反思，对此心存感激。本研究是在储昭辉和丁新华两位教授的共同指导下完成的。从课题设计、实验开展，到论文撰写和文章修改，每一个环节都倾注了两位导师大量的心血。两位老师严谨的治学态度，开拓进取的科研风范以及敏锐的学术洞察力、勇于创新的魄力，都将使我受益终生，更是我以后工作中学习的典范。在研究生期间，导师在学习上耐心细致的指导和生活上无微不至的关怀及思想上的教诲，令我终生难忘，在此表示衷心的感谢。实验室像是一个大家庭一样，在实验和生活上，总会有师兄师姐师弟师妹们的不吝帮助。感谢师姐王娇总是从实验的一点一滴耐心且细心的给我讲解，感谢师妹薛晓婧，师弟李龙也会时常给我提供帮助，除此之外，感谢实验室马铃薯团队的高存刚师弟、和朱美君师妹也都在实验中提供过各种帮助。除此此外，刘海峰、张霞、王继鹏、尹军良、汪少丽、巨延虎、张宝刚、吴涛、张强、左丽萍、贾茹、赵长保、李贝贝等实验室的师兄师姐师弟师妹都在实验过程中提供过各种帮助，在此一并感谢。感谢我的家人，他们一直以来都默默地支持我，在生活和学习上给予我最大的理解和包容，这些无私的奉献，让我铭记于心，同时也给我了前进的动力！感谢国家自然科学基金（31171836）和山东农业大学“筑峰人才”计划项目提供的经费资助；感谢作物生物学国家重点实验室提供的科研仪器设备平台。最后，向参加本论文评阅和答辩专家、教授致以最诚挚的谢意！再次向大家表示衷心的感谢！49
